Kronisk implantation av flera flexibla Polymerelektroder matriser

Summary

Beskrivs nedan är en metod för implantation av flera polymer elektrod matriser över anatomiskt avlägsna hjärnregioner för kronisk Elektrofysiologisk inspelning i fritt rörliga råttor. Beredning och kirurgisk implantation beskrivs i detalj, med betoning på design principer för att vägleda anpassning av dessa metoder för användning i andra arter.

Abstract

Samtidiga inspelningar från stora populationer av enskilda nervceller över distribuerade hjärnregioner under månader till år kommer att möjliggöra nya vägar för vetenskaplig och klinisk utveckling. Användningen av flexibla polymerelektroder matriser kan stödja långvarig inspelning, men samma mekaniska egenskaper som gör det möjligt för livslängd inspelning göra flera införanden och integration i ett kroniskt implantat en utmaning. Här är en metod som flera polymer elektrod matriser kan riktas till en relativt rumsligt obegränsad uppsättning av hjärnområden.

Metoden använder tunnfilms-polymerprodukter, utvalda för sin biokompatibilitet och förmåga att uppnå långsiktiga och stabila elektrofysiologiska inspelningsgränssnitt. Det resulterande implantatet möjliggör noggrann och flexibel inriktning av anatomiskt avlägsna regioner, fysisk stabilitet i månader och robusthet för elektriskt brus. Metoden stöder upp till sexton seriellt insatta enheter över åtta olika anatomiska mål. Som tidigare visats, metoden kan spela in från 1024 kanaler. Av dessa, de 512 kanalerna i denna demonstration används för Single neuron inspelning gav 375 enstaka enheter fördelade över sex inspelningsplatser. Viktigt, denna metod kan också spela in enstaka enheter för minst 160 dagar.

Denna implantation strategi, inklusive tillfälligt stärkande varje enhet med en infällbar kisel insättning Shuttle, innebär tjudra av enheter på deras mål djup till en skalle-anslutit plast bas pjäs som är specialdesignad för varje uppsättning av inspelning och stabilisering/skydd av apparaterna i ett silikon fyllt, specialdesignat plasthölje. Också täckt är utarbetandet av enheter för implantation, och design principer som bör vägleda anpassning till olika kombinationer av hjärnområden eller array Designs.

Introduction

En idealisk neurala implantat skulle spela in från ett mycket stort antal enskilda nervceller i distribuerade hjärnområden över veckor till månader. Flexibla polymer elektrod matriser ger elektrofysiologiska inspelningar med livslängden för att registrera i månader och stabiliteten för att spåra enskilda nervceller^1,2,3. Men samma mekaniska egenskaper som minskar skjuvning skador⁴ och ger biokompatibilitet och inspelningskapacitet^{2,3,5,6,7, 8} utgör en utmaning för deras införande i hjärnan i förhållande till deras stela motsvarigheter. Tidigare arbete utfört högst 4 32-kanals arrayer, men den totala avkastningen av sorterade förmodade enda nervceller är orapporterat^2,3,9. Omvänt, kisel-baserade elektrodmatriser har använts i hög densitet, flera regioner implantat, men dessa tekniker saknar antingen förmågan att spela in spikar från nervceller under månader (livslängd) eller att spåra samma nervceller (stabilitet) på den tidsskalan, eller densiteten för att spela in från hundratals enskilda nervceller i flera hjärnregioner. Den metod som presenteras här övervinner det låga antalet införanden i nuvarande polymer elektrod array-baserade metoder, vilket ger medel för Elektrofysiologisk inspelning av ett stort antal enskilda nervceller i flera anatomiskt avlägsna regioner för månader, med stabiliteten att spela in från samma enskilda nervceller över många dagar.

Det finns en viss debatt om vikten av att använda ett polymersubstrat i stället för microwire-eller kisel-baserade strategier. Som framgår av Dhawale et al.¹⁰, microwires verkligen kan månader långa stabila inspelningar på gnagare, även om implantaten begränsades till 16 tetrodes i en enda region. Skala upp storleken på microwire implantatet når en relativt hög övre gräns, med upp till 1792 implanterade kanaler uppnås i en icke-mänsklig primater¹¹. Byggandet av mikrotrådarrayer är dock oförenligt med kisel nanotillverkning processer och är därför extremt tidskrävande, vilket kräver manuell hantering av varje kanal individuellt under konstruktionen^{12,13 ,14}. Som sådan är det inte klart om denna teknik skulle kunna stödja en storleksordning ökning av inspelnings kanaler.

Nuvarande kisel enheter kan placera hundratals eller till och med över tusen elektroder på en enda monolitisk enhet^{15,16,17,18,19}. De senaste kisel tillverkningsprocesserna genererar enheter med mindre tvärsnittsarea, oavsett material, vilket resulterar i mindre glialaktivering^{20,21,22,23 ,24} och mer kompatibla enheter. Det finns en variation i rapporter om kisel sond enenhets inspelning livslängd, med vissa indikerar att relativt stora kisel sonder kan ge långsiktig inspelning^25,26. Särskilt de senaste kommersiellt tillgängliga kisel-enheter¹⁷ har livslängden att spela in i flera månader och har tvärsnitts områden mycket liknar de skaft som används i den metod som beskrivs här (juni et al. 2017¹⁷: 70 μm x 20 μm, anordningar som beskrivs här och i Chung et al. 2019¹: 68 μm – 80 μm x 14 μm). På grund av skillnaden i stabilitet, denna sond har inte visat sig kunna spela in från samma nervceller under veckor. Detta sannolikt beror på en kombination av användningen av styv kisel samt direkt tjudra till skallen, kända för att orsaka mikromotion, instabilitet, och glios på array-Brain gränssnitt^27,28. För att konstruera en enhet som kan röra sig med neurala vävnad, material som är mjuk^5,29 och flexibla⁷ krävs. Många tillgängliga polymerer (se Geddes och Roeder³⁰, fattahi et al.³¹, och Weltman et al.³² för recensioner) har flexibiliteten och stabiliteten i microwires och är också förenliga med nanotillverkning processer, som gör det möjligt den täta packningen av kisel anordningar.

Flera neurala implantation frågor är specifika för användning av flexibla polymer elektrod matriser. Den första av dessa är införandet av matrisen, som flexibla arrayer saknar styvhet att vara avancerade in i hjärnan som kisel-eller microwire-baserade strategier. Majoriteten av insättnings strategier för flexibla enheter beror på en tillfällig stelning av underlaget som görs i denna metod (se Weltman et al.³² för granskning). Det finns fem anmärkningsvärda strategier som inte använder sig av en styv Shuttle. För det första finns det metoder som utnyttjar material som övergår från styv till kompatibel vid implantation^33,34. En nackdel med denna strategi är att det kräver en relativt stor tvärsnittsarea för att uppnå den kraft som krävs för penetration av hjärnvävnad innan buckling som dikteras av Eulers buckling Force beräkning³⁵. Denna ökning av tvärsnittsarea kommer att negativt påverka hälsan hos omgivande vävnad^{20,21,22,23,24}. Andra är användningen av en avtagbar stödjande struktur ovanför hjärnan³⁶, även om detta kräver tidskrävande avlägsnande eller upplösning av byggnadsställningar för att upprätthålla en minimal stöds längd (och hög buckling kraft). Alternativt skulle det kräva att matrisen infogas med en längre unsupported längd, vilket kräver en styvare array substrat eller en större array tvärsnittsarea. Tredje är pre-penetration för att öppna ett hål för flexibel array som skall införas i efteråt³⁵. Detta kräver exakt Omjustering eller relativt stor pre-penetration diameter, och elektrod array styvhet och tvärsnittsarea för att tillåta inte stöds insättning. För det fjärde är användningen av löslig beläggning för att skärpa den flexibla anordningen. Detta ökar markant tvärsnittsarea och akuta skador orsakade av insättning, även när särskilda försiktighetsåtgärder vidtas för att bevara den vassa spetsen på en enhet³⁷. Femte är injektion av polymermatrisen. Denna strategi har haft framgång i att uppnå implantat med upp till 4 32-CH införanden², men kräver att använda en mycket större tvärsnittsarea för insättning, en 250 μm-1,5 mm yttre diameter glas kapillärröret⁹, orsakar större akuta skador. Däremot använder en flyttbar Shuttle, samtidigt lägga tvärsnittsarea till akut insättning, möjliggör användning av styvaste möjliga material, och kan därför vara den teoretiska minsta storleken när du sätter en godtyckligt flexibel enhet. Således är införandet med hjälp av en styv Shuttle för närvarande det mest attraktiva alternativet för att infoga flexibla enheter.

Det finns två krav på varje införande Shuttle strategi: ett lämpligt styvt substrat och ett sätt att koppla den flexibla enheten till underlaget. Isättning av pendel material är vanligtvis kisel^38,39,40,41, rostfrittstål^8,42eller volfram^{43,44, 45}, med styvare material som möjliggör mindre tvärsnittsytor. Dessa är vanligtvis anbringas med hjälp av ett lim såsom polyetylenglykol (PEG)^{8,38,39,42,43}, elektrostatiska krafter⁴⁰, eller direkt fysisk koppling^45,46. I alla fall, utmaningarna är anpassningen och kopplingen av elektrod array och införande Shuttle innan insättning och frikoppling efter insättning. Berättade nedan är en förfining av den metod som införts av Felix et al.³⁹ att tillfälligt stag elektrod array med en kisel insättning Shuttle, bifogas med PEG, som tas bort efter införandet av matrisen till dess mål djupet.

En andra utmaning som presenteras av flexibla enheter inom ett kroniskt implantat är att stabilisera enheten i hjärnan samtidigt som den gör det möjligt för enheten att integreras i ett implantat fäst på skallen. Hjärnan rör sig i förhållande till skallen på grund av naturliga pulseringar, posttraumatisk ödematös förändringar, påverkan, och andra orsaker, och elektroden array måste därför vara åtminstone något fritt att flytta i förhållande till där den är fäst på skallen och inspelning hårdvara. Detta uppnås med hjälp av en 3D-tryckt plast bas pjäs, skräddarsydda för varje uppsättning av implantat mål, som har flera funktioner: en saltlösning reservoar under implantation, plats att tjudra polymermatriser, och bostäder för silikongel. Den tjudra platsen ovanför skallen och silikongel arbeta tillsammans för att skapa en större radie av krökning för matrisen och därmed möjliggöra större tryckkrafter på matrisen. Detta i sin tur möjliggör förflyttning av hjärnan i förhållande till ankarpunkterna i matrisen (skalle) som skall översättas till buckling belastning.

Ytterligare utmaningar inkluderar behovet av att hus flera arrayer och ge gott dragavlastning för djuret att fritt bete sig utan överföring av vibrationer eller slag krafter till elektroden arrayer, vilket kan orsaka rörelse i förhållande till neurala vävnad. Anpassningar till lösningar som har använts i liknande applikationer där hjärnan måste vara stabil i förhållande till en styv inspelnings fönster har tagit upp denna utmaning. En konstgjord dural tätningsmedel silikongel (tabell över material), som tidigare har visat sig vara giftfri och förhindra CSF läckage⁴⁷, ger mottryck till hjärnan för att förhindra utåtriktad svullnad och att stabilisera matrisen vid hjärn ytan. Ett extra lager av skydd läggs till enheten band av medium-viskositet, kirurgisk kvalitet silikon elastomer, tidigare visat för användning i tätning kronisk neural elektrod implantat⁴⁸. Slutligen, den silikon-buffrade implantat och headstage är innesluten med 3D-tryckta stycken anpassade för att bibehålla en låg centrum av massan för minimal minskning av djurets normala rörlighet.

Detta protokoll inleds med en flexibel polymer microelektrod array monterad på en Silicon insättning Shuttle. Det fortsätter med montering av array-Shuttle-enheten till 3D-tryckta insertion bitar, beskriver kirurgisk teknik och implantat konstruktion steg som krävs för att framgångsrikt implantat ett djur, och kan stödja sexton polymer multi-elektrod matriser implanteras i åtta anatomiskt avlägsna regioner i en enda råtta¹.

Detta protokoll förutsätter utgångsmaterial av polymer elektrod matriser bifogas med biolöslig adhesiva polyetylenglykol (PEG) till en Silicon insättning Shuttle, som visas i Felix et al.³⁹, och minst två självständigt rörliga insättning bitar: en som kisel Shuttle kommer att limmas och en som elektrod matrisens kontakt kommer att följas. Detta protokoll använder också ett tredje insättnings stycke för att på ett säkrare sätt fästa de två insättnings styckena på en micromanipulator i micron skala. Alla filer för 3D-utskrifter finns på: https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3DParts

Varje polymer elektrod array, som används i denna metod består av två till fyra inspelning skaft, ett band som förmedlar de elektriska spåren, och i slutet av bandet, en hårdvara kontakt eller kretskort. Elektroden array och band är fast ovanpå kisel Shuttle med PEG. Varje band har en 2 cm lång x 1 mm tjock polyimid röret fäst på bandet via UV härdbar epoxi, sträcker sig vinkelrätt mot längden på bandet. Varje enhet (elektrod array och insättning Shuttle) måste lastas på de 3D-tryckta insättnings delar som kommer att användas för att sätta in matrisen i hjärnan och dra tillbaka skytteln (figur 1). I denna konstruktion, den hydrauliska införing micromanipulator (grön, tabell av material) flyttar hela insättnings apparat (bit 1, bit 2 och återgående micromanipulator, orange) till sitt mål djup. När matrisen har lossnat från insättnings apparaten och fixeras, drar den andra, återgående micromanipulatorn (orange) del 1 och den bifogade skytteln oberoende av resten av insättnings apparaten, och tar bort skytteln utan att flytta matrisen.

Figur 1: Inserter-komponenter.
A) delarna 1 och 2 är tillfälligt fixerade till varandra med en avtagbar skruv och kommer senare att dockas på den återgående mikromanipulatorkolven (orange). (B) array-och insättnings skyttaren följs i stycke 1 och mat ris kopplingen fästs i stycke 2 med dubbelhäftande tejp. Piece 3 förbinder återgående micromanipulator och delar 1 och 2 till infogning micromanipulator (grön). Infognings mikromanipulatorn är fixerad på en stereotaktisk adapter för placering av implantat. Stycken 1-3 avbildas i deras relativa storlek. Piece 4 är en stabiliserande pjäs för korrekt anpassning av införandet Shuttle. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Alla djur-inblandade protokoll som beskrivs i detta manuskript har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid UCSF.

1. beredning av polymerelektroder matriser för insättning (~ 30 min)

1. Fäst stycke 1 i stycke 2 genom att sätta in en skruv genom justerade, vertikalt orienterade hål för att låsa ihop bitarna (figur 2). Håll dessa två stycken i en Last. Fäst dubbelhäftande tejp (tabell över material) till toppen av Piece 2. Fäst det stabiliserande stycket 4 i slutet av stycke 1. Den kommer att hållas på plats av friktion.

Bild 2: montering för Array-Shuttle anpassning.
(A) montering av stycken 1, 2, och stabiliserande pjäs i förberedelse av införande Shuttle kvarstad. (B) stycken 1 och 2 hålls samman med tumskruv. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. För hand, rikta in elektrod matrisen och fäst insättnings bussen med det smala änd segmentet i stycke 1. När sonden är i linje med den längsgående axeln i stycke 1, fäster array Connector till polyimid dubbelhäftande tejp på den plana delen av bit 2.
3. Med plast tippade tång, kontakta endast polyimid vinge bifogas matrisen bandet, lyft införandet Shuttle-elektrod Array enhet spets av stycke 1, till utsidan av stabiliserande pjäs (figur 3a).
4. Applicera en liten mängd cyanoakrylat (tabell över material) eller annat lim (~ 10 μl) i slutet av stycke 1. För lite kommer inte att fästa starkt insättnings bussen till stycke 1, riskera avlossning under införing eller indragning. Alltför mycket riskerar överfyllda skytteln och ansluter sig till själva arrayen till Piece 1.
5. Med hjälp av plast tippade tång, kontakta endast polyimid vinge fäst vid matrisen bandet, justera enheten med den smala segmentet av stycke 1, med den fyrkantiga fliken för införande Shuttle (och endast Shuttle) ovanpå limmet (figur 3b). Gör små justerings justeringar genom att manipulera sidan av Silicon Shuttle eller PEG. Undvik att tillämpa överdriven kraft på bandet eller Shanks.

Figur 3: justering, fastsättning och sterilisering av array-Shuttle.
(A) korrekt orientering av införande Shuttle-elektrod array anordning för applicering av lim på dockningsstationen i stycke 1. Tvåskaftarray-Shuttle visas. (B) polymer elektrod array och införande Shuttle monterad på insättningspunkten, med tillfällig stabiliserande pjäs för justering. Tvåskaftarray-Shuttle visas. Cinmatnings anordning innesluten i plastlåda för skydd under sterilisering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Applicera mjukt tryck nedåt med pinkoppar på båda sidor av stabiliserande delen och ta bort den från församlingen utan att flytta matrisen.
7. Ta bort den monterade enheten (delarna 1 och 2, array, insertion Shuttle och array Connector) från Last och fästa den med dubbelhäftande tejp till basen av en liten plastlåda för sterilisering av etylenoxid (figur 3c). Ångsterilisering är inte lämplig för dessa enheter.

2. konstruktion av basbit

1. Bestäm kraniektomi storlekar för utvalda stereotaktiska mål samt platser av skalle skruvar och mark skruvar. Kraniektomi storlek bestäms av array footprint, med ett par hundra (~ 300) micron omkrets för placering justeringar för att undvika ytvaskulatur.
2. Med hjälp av en designprogramvara (t. ex., CAD), designa fotavtryck av basen pjäs för att omge den planerade kraniectomies och passar inom den omkrets som definieras av temporala åsen och skalle skruvar, maximera skalle yta som kommer att vara utanför bas pjäs som lim täta cement kan binda att fästa implantatet till skallen.
3. Kontur bottenytan av basen pjäs så att den kan följas i skallen utan luckor, minska risken för infektion och förhindra saltlösning eller silikon elastomer från sipprar ut.
4. Ställ höjden på basen bit till 3-7 mm, tillräckligt hög för att hålla saltlösning och silikon elastomer men tillräckligt låg för att inte hindra synlighet under array insertion (s).
   Obs: bas biten kan utformas med vertikala stolpar eller liknande funktioner som polyimid vingar kan tjudras vid en punkt högre ovanför skallen. Tillåt inte att fästpunkter hindrar vyn.
5. 3D Skriv ut bas biten (figur 4) och sterilisera bas biten före implantation.

Figur 4: skalle förberedd för implantat.
Durectomies komplett med skallskruvar, bas akrylskikt, och bas pjäs fast till skalle.

3. beredning av skalle (~ 2 h)

1. Välj en råtta 400 g eller högre för att stödja vikten av implantatet. Male Long-Evans tjaller, på 6-12 månaders ålder användes.
2. Anesthetize råttan. Placera djuret i en anestesi kammare. Slå på 5% isofluran.
3. Injicera en intraperitoneal dos av ketamin (50 mg/kg), xylazin (6 mg/kg) och atropin (0,14 mg/kg).
   1. Övervaka anestesidjup var 20 min under hela förfarandet genom att kontrollera att det inte finns något tillbakadragande från Paw nypa och andningsfrekvens förblir 50-75 andetag/min.
4. Applicera ögonsalva på råtta.
5. Raka huvudet av råttan.
6. Placera djuret i stereotaxic-hållaren.
7. Förbered operationsområdet genom skrubbning med tre alternerande Scrubs vardera av povidon-jod kirurgisk Scrub, följt av steril saltlösning.
8. Injicera 0,2 cc av 0,5% lidokain i hårbotten.
9. Gör en sagittal snitt vid mittlinjen av skallen utsätta minst 3 mm Anterior till bregma och 3 mm posteriort om lambda.
10. Ta bort periostet med bomullsvabb.
11. Mark insättning och kraniektomi platser genom att poängsätta skallen med en skalpell med ett Kartesiskt koordinatplan nollställdes på bregma med en stereotaktisk instrument.
12. Borra kraniektomi platser, lämnar ett tunt lager av ben som kan avlägsnas med tång. Utsätt inte Dura. Detta gör det möjligt för rengöring skalle av ben damm utan att störa Dura.
13. Borra och sätt in benskruvar, en i taget, för att förhindra att bendamm tränger in i hålen. Använd generös isoton bevattning för att ta bort bendamm. För ett implantat på cirka 50 gram, Använd 10-12 skruvar. Titanskruvar tillåter osseointegration⁴⁹.
    1. Advance skruvarna till ett djup som helt tränger in i skallen utan att påverka hjärnan.
14. Anslut minst en ben skruv till en elektriskt ledande tråd för att fungera som en krets jord.
15. Efter all borrning är klar, rengör skallen av ben damm med en saltlösning tvätta.
16. Torka skallen med bomullsvabb eller andra absorbenter och tillämpa ett initialt skikt av lim cement (tabell över material) till skruvarna (Använd inte emalj etsmedel på gnagare skalle). Denna preliminära lim täta cement skikt kommer att öka implantatet vidhäftning och minska arbetskraft i senare vidhäftning steg.
17. Ta bort det tunna lagret av ben kvar på varje kraniektomi webbplats.
18. Incise Dura med en 30-gauge nål med en böjd spets samtidigt undvika eventuella kärl. Längden på snittet matchar måtten på insättnings Shuttle.
    1. Om det blöder, skölj manuellt med en mild saltlösning och fortsätt inte förrän blödningen har upphört.
19. Om flera durectomies utförs, hålla platser fuktig med gel skum eller annan metod, såsom regelbunden bevattning med några minuters mellanrum med kroppstemperatur saltlösning.
20. Torka skallen igen med bomullsvabb eller andra absorbenter i förberedelse för täta cement vidhäftning av basen pjäs till skallen.
21. Placera den sterila bas biten. Om bas delen kommer att täcka bregma, markera en annan plats på ett känt avstånd bort som en proxy.
22. Applicera självhäftande lutnings cement runt omkretsen av bas stycket. Fyll den som fastnat bas pjäs med saltlösning; identifiera och lappa läckage med självhäftande lutnings cement vid gränssnittet mellan bas stycket och skallgränssnittet (figur 5).
    Obs: det är viktigt att basen bit vara helt säkrade till skallen för att förhindra läckage av konstgjorda dural tätningsmedel silikongel, eftersom detta kommer att förhindra adekvat vidhäftning av implantatet till skallen. Djuret är redo att ha matriser insatta.

4. Serial infogningar av arrayer och retractions av shuttles (~ 1 h per array)

Anmärkning: den här proceduren bör lodas med en icke-livskraftig enhet, särskilt för flermatrisimplantat där en enhet kan störa implantation av efterföljande enheter.

1. Ladda delarna 1 och 2 på den återgående micromanipulatorkolven. Ställ in Piece 1: s micromanipulator till en utökad position och bit 3: s micromanipulator till en infällt position. Kolven kommer att glida till ett terminaldjup insidan av stycke 1. Piece 2 passar inom den övre delen av bit 3, med hålen justerade.
   1. Ladda Piece 3 på införingsmicromanipulator kolv, och säkra på plats med en skruv på undersidan av bit 3 (figur 5a, B).
   2. Fyll på och skruva ihop delarna 2 och 3, så att du flyttar infognings apparaten (figur 5c).
   3. Ta bort skruven som rymmer stycken 1 och 2 tillsammans. Piece 1 rör sig oberoende av stycke 2, för att tillåta separat indragning av insättnings bussen från apparaten.
   4. För in denna skruv i det laterala hålet på bit 1, vinkelrät mot kolvspåret, tills skruven applicerar tryck på kolven. Detta försäkrar att stycke 1 rör sig i enlighet med den tillbakadragande kolven, vilket framgår av figur 5D. Var noga med att välja det laterala hålet som inte kommer att hindra synen när apparaten är monterad på stereotaktisk instrument.

Figur 5: montering av Inserter.
A) montering av stycke 3 till mikromanipulatorer. B) fastsättning av delarna 1 och 2 på insättnings apparaten. C) införingsstycken med monterad pendel enhet med elektrod system. (D) tumskruv håller bit 1 och 2 tillsammans bort. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Ta bort alla gel-skum från craniectomies. Använd den verkliga eller proxy bregma för stereotaktisk inriktning. När du flyttar enheten till insättningsstället, bibehålla en höjd av minst ett par centimeter ovanför skallen.
   1. Undvik långa perioder av arrayen-Shuttle-enheten nära skallen eller hjärnan för att minska risken för att kondens lossnar ur matrisen från insättnings bussen före eller under införingen. Om detta inträffar, försök att höja array-Shuttle enheten högt över hjärnan och skalle och vänta på att torka och åter följa.
3. Justera implantatkoordinaterna för att undvika ytvaskulatur. Som under kraniektomi och durectomy, undvika penetrerande fartyg direkt.
4. Sätt i enheten raskt (~ 25 μm/s), sänkning med stereotaktisk instrumentet tills enheten kommer in i hjärnan. Enheten kommer inte att tränga in i hjärnan omedelbart. Graden av motstånd och dimpling beror på målplatsen och enhetens utformning (t. ex. två kontra fyra skaft, spetsvinkel), men dimpling vanligtvis inte överstiger 1 mm (figur 6).

Figur 6: insättning av array-Shuttle.
Array-Shuttle är avancerade i hjärnan för att rikta djup. 4-skafts array-Shuttle visas.

5. En gång i hjärnan, lägre med micromanipulator, minskande hastighet på inställning till mål djupet:
   1. Använd stereotaktisk arm för att börja sätta in med 25 μm/s.
   2. Använd mikromanipulatorn för att sätta in vid 10 μm/s när 2 mm till 1 mm över mål djupet.
   3. Långsam insättning med micromanipulator till 5 μm/s när 1 mm till 500 μm över mål djupet.
   4. Långsam insättning ytterligare till 1-2 μm/s under den slutliga 500 μm till målet.
6. Visualisera anordningen vingar (horisontella polyimid slang) och insättningspunkten under sänkning för att undvika för tidig Shuttle-array Detachment.
7. När målet djup har uppnåtts (figur 7a), bilateralt förankra polyimid vingar till basen pjäs fästplatser via ljus-bosig akryl eller annan lim såsom cyanoakrylat (tabell över material). Torka, om nödvändigt, vingarna eller fästpunkten på basen pjäs, som kondensation kan samla på dessa ytor och förhindra vidhäftning. Om synlighet eller andra utrymmesbegränsningar kräver, är förankring på endast en polyimid vinge normalt tillräckligt.
8. Före upplösningen kommer PEG visas som en globulära massa sitter ovanpå array och införande Shuttle gränssnitt (figur 7a). Lös PEG genom att försiktigt droppande kroppstemperatur saltlösning på matrisen vid den punkt där det följs skyttel. Hur lång tid detta kräver beror på molekylvikten för den valda PEG och fullständig upplösning kan verifieras med direkt visualisering. När PINNEN har helt upplöst gränserna för arrayer kommer att vara helt urskiljbar från skyttel och stycke 1 (figur 7b).

Figur 7: indragning av Shuttle.
(A) tjudra av vingar före indragning. Tvåskaftarray och shuttle visas. (B) PEG upplösning och vinge vidhäftning med skaft funktion (inringad, blå) som gör det möjligt för visuell bekräftelse av framgångsrik frikoppling av array och shuttle under återdragning. (C) en lyckad array insättning efter införandet Shuttle har dragits tillbaka. (D) bas stycke med silikongel fyllningar för en enda två-skaft array insättning. Den låg viskositet silikongel som används har en blå nyans. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

9. Använd den återgående micromanipulatorn och dra långsamt in insättnings bussen. Fortsätt saltlösning bevattning (~ 1 Drop/s) på matrisen dras tillbaka. Använd återgångshastigheter som är desamma som insättnings hastigheten på relevanta avstånd från mål djupet:
   1. Dra tillbaka med hjälp av micromanipulatorn på 1-2 μm/s från mål djupet till-500 μm.
   2. Påskynda retraktion med hjälp av micromanipulatorn vid 5 μm/s när-500 μm till-1 mm.
   3. Snabba upp retraktion med mikromanipulatorn vid 10 μm/s när-1 mm till-2 mm.
   4. Dra in den stereotaktiska armen med 25 μm/s från-2 mm från mål och uppåt.
10. Visualisera gränssnittet mellan array och insättning Shuttle under återdragning. Polymermatrisen kommer synligt att separera från skytteln och visas genomskinlig eftersom skytteln dras tillbaka vid den semicirkulära korsningen mellan skaft av insättnings bussen (figur 7b).
11. Ta bort vektor kopplingen från stycke 2 och flytta till en plats som inte stör efterföljande infogningar. Polymerelektroden matrisen är nu i hjärnan och inte längre ansluten till stereotaktisk instrument (figur 7C). Ta bort insättnings bussen och annan inmatnings maskinvara.
12. Upprepa steg 4.1-4.9 för flera infogningar. Gå inte vidare till nästa avsnitt tills alla önskade matriser infogas. Det är illa tillrådligt att sätta in två enheter inom 250 μm av varandra, eftersom den lilla bugande av anordningen bandet mellan hjärna och vingar i stammen lättnad regionen kan förlänga åtminstone så här långt.

5. implantat konstruktion (~ 2 h)

1. Efter den sista array insättning, Töm saltlösning från basen pjäs med hjälp av en pipett eller bomullspinne, är noga med att inte störa den implanterade matriser eller band.
2. Fyll craniectomies och basen pjäs med låg viskositet silikon elastomer, eller andra konstgjorda dural tätningsmedel. Låt den bota (figur 7d). Med flera infogningar placerar du de maskinvaruanslutningar där de inte stör (figur 8a). Orientera mat ris kontakterna på lämpligt sätt och konstruera implantatet så att banden är i sin slutliga önskade position.
3. Täck matriser, array band, och kontakter i medelhög viskositet silikon elastomer. Ägna särskild uppmärksamhet åt polymer-Connector gränssnitt, eftersom detta mjukt material gränssnitt är benägna att skada. Täck matrisen band helt så att när medium-viskositet silikon botemedel, de är immobiliserade.
4. Bifoga de elastomertäckta anordningarna i det konstruerade fodralet.
5. Förstärka implantat basen med Dental akryl. Låt inte akryl komma i direkt kontakt med matrisen band eftersom utbyggnaden av akryl medan det botemedel kan skada ledande spår.
6. Applicera Bupivicaine och bacitracin salva runt snittet.
7. Stäng snittet med 4-0 nylon suturer och hudlim.

6. återvinning och implantat vård

1. Ta bort djuret från stereotaktisk instrument och placera på sin sida på en värmedyna.
2. Ge en subkutan injektion av varm Ringers lösning (5 – 10 mL) för att återfukta djuret.
3. När djuret är förflyttning (10-60 min), överföra till en bur med hälften av buren under en värmedyna vid 37 ° c för 2-3 dagar.
4. Under en värmedyna, ge tillgång till mjuknat mat och vatten.
5. Injicera djur med 2 mg/kg meloxikam var 24: e timme (subkutan eller oral administrering) i 1 vecka efter behov för smärt Lind-
6. Låt råtta 1-2 veckor att läka och anpassa sig till implantatet vikt (figur 8b).
7. Utför regelbunden klorhexidin tvätta av vävnaden runt implantatet och daglig inspektion för irritation, infektion, eller dehiscence.

Figur 8: flera inmatade arrayer och råtta efter återhämtning från implantation. (A) maskinvaruanslutningar på platser för att inte störa efterföljande införanden. (B) ett 1 024-kanals, kroniskt polymer array-implantat. Återges med tillstånd från neuron [kompletterande figur 1H]¹. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Representative Results

Efter detta protokoll, en 1 024-kanals neurala implantat inspelning gav 375 enda enheter¹ (sorteras med mountainsort⁵⁰, buller överlappning < 0,03, isolering > 0,96, 512 kanaler som används för en enda enhet inspelning, figur 9a). Detta protokoll kan användas för att inplantera olika antal enheter, med olika kanal antal och specifikationer, till olika kombinationer av inspelnings mål. Med hjälp av samma protokoll, en enda enhet inspelning livslängd har visats för minst 160 dagar¹ i data från 19 enheter (18 32-kanals enheter i prefrontala cortices, 1 64-kanals enhet i orbitofrontal cortex) över tre olika råttor ( Figur 9B). En av de tre djuren hade ett digitalt elektriskt fel som resulterade i en oförmåga att spela in från fyra enheter. Av de återstående 15/19-enheterna fanns det en inspelningskapacitet på ~ 1 enkel enhet per kanal. Enskilda enheter hade avkastningar på endast några enstaka enheter upp till ~ 2 enheter per kanal. Det är typiskt att se mycket olika avkastning på enheter implanteras i samma djur i samma region.

Dessutom, ett annat kirurgiskt team efter det protokoll som beskrivs här implanteras sex ytterligare djur vardera med en kombination av 4-6 32-kanals enheter riktade till orbitofrontal cortex och Nucleus accumbens, och en tetrode hyperdrift (totalt implantat vikt ca 50 g). Ett djur hade ett implantat lossas inom en månad efter operationen. Ett andra djur dog under den postoperativa återhämtnings perioden, vilket sannolikt inte hade något samband med de protokoll steg som beskrivs här. De resterande fyra djuren återstod friska med stabila implantat som för längden av experiment, som varade 4-11 månader. En enhet räknas liknar de som tidigare rapporterats för 32-kanalenheter.

Figur 9: kapacitet för enstaka enheter och registrering av livslängd.
(A) antal förmodade enenhetskluster från 512 kanaler (av 1 024-kanalimplantatet), stratifierade efter kvalitets trösklar. Automatiserad kuration med MountainSort (brus överlappning 0,03, isolering 0,96, svart låda i övre högra) resulterade i identifiering av 375 enstaka enheter från 512 kanaler. Återges med tillstånd från neuron [figur 2A]¹. B) enenhetskörning för polymermatriser per kanal (vänster y-axel) eller per 16-kanalshanken (höger y-axel) över 160 dagar efter implantation (x-axel) hos råttor. Heldragen linje är medelvärdet för cell utbytet över 8 skaft, prickade linjer ± 1 SE. individuella tidpunkter per skaft visas som färgkodade punkter efter region. Återges med tillstånd från neuron [figur 3A]¹. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta är en metod för implantation av flera polymer elektrod matriser till distribuerade hjärnområden för inspelning av enskilda enheter över månader. Denna metod representerar en 8x ökning i inspelnings kanaler och 4x ökning av antalet införanden från närmaste storskaliga polymer-array baserat system^2,3. Det systemet utnyttjas en polymer mesh injektion-baserade system i mus men inte rapportera ett absolut antal förmodade enda enheter och därmed en jämförelse av Single neuron avkastning är inte möjligt.

Metoden för införande av en flexibel enhet är baserad på ett tidigare protokoll från Felix et al.³⁹, med viktiga modifieringar: en tre-bit insättnings apparat för oberoende rörelse av kisel Shuttle under återdragning, och tjudra av matrisen vid sitt mål djup före indragning av skytteln, som tillsammans eliminerar behovet av det snabba tillbakadragande som beskrivs i det ursprungliga protokollet. Dessa förändringar minimerar vävnadsskador och upprätthåller matrisens stabilitet under återdragning av skytteln. Andra flexibla strategier för enhets implantation, till exempel tillfälligt stelning av enheter med biologiskt upplösnings Bart material, är kompatibla med efterföljande steg i detta protokoll. Att säkra enheterna inom implantatet krävde integrering av tidigare validerade strategier för att täcka hjärnan och skydda de ömtåliga banden.

På grund av sin bräcklighet, omsorg och uppmärksamhet krävs för att undvika direkt kontakt eller på annat sätt överföra kraft till polymerelektroden matriser och kisel insättning shuttles. Särskilt när man arbetar med flera enheter, bör införandet observeras under ett mikroskop för att undvika störningar av en enhet med en annan. I allmänhet är det möjligt att hantera en elektrod array försiktigt med plast tippad tång, undvika spår. En sådan strategi är lämplig, till exempel om polymerelektroden matrisen börjar dra tillbaka med införandet Shuttle. Detta kan inträffa om PINNEN inte är helt upplöst, eller på grund av ytspänningen av saltlösning eller CSF mellan polymer och kisel.

En av de vanligaste återvinningsbara fel är array avlossning från införandet Shuttle. Detta kan inträffa vid insättning, som hjärnan gropar och tryck på enheten spetsen ökar, om matrisen och shuttle är ofullständigt inriktade eller om kondensation har delvis upplöst PINNEN. För att åter följa en array, höja den så högt som möjligt ovanför hjärnans yta och vänta på att torka (ca 5 min).

En kritisk aspekt av planeringen av en multi-array implantation kirurgi är utformningen av basen pjäs för att rymma alla implantat mål och sitta utan luckor mot konturen av skallen. Basen pjäs är en liten plast bit som är fast i skallen efter skalle rengöring, skruvplacering, och partiell kraniectomies, före införandet av arrayer. Den har tre funktioner: 1) för att hålla saltlösning för att lösa upp PEG efter array insättning men innan kisel Shuttle retraktion, 2) för att ge en plats ovanför skallytan som arrayer kan fästas med polyimid vingar, vilket gör att sila lättnad längs bandet ovanför dess insättningspunkt i hjärnan, och 3) att hålla konstgjorda dural tätningsmedel, som stabiliserar och skyddar matriser och hjärnan. Bas biten kan vara formad för hand eller 3D-tryckt. Det observerades att dränering och torkning basen bit saltlösning är mycket viktiga före anordningen insättning. Dessa steg förhindrar kondens och separation av matrisen och införande Shuttle. Torkning basen pjäs är också avgörande för att fylla basen bit med konstgjorda dural tätningsmedel. Det är också viktigt att bas biten inte läcker, som en film av silikongel är svårt att ta bort från skallen och kommer att förhindra vidhäftning av Dental akryl för tillförlitlig kronisk fastsättning av implantatet till skallen. Det förväntas att alla lågviskositet, biokompatibla silikonelastomer kan användas för att fylla craniectomies och bas pjäs, med en högre viskositet silikon elastomer som omger den och den exponerade polymer array band.

Framstegen inom polymer nanotillverkning kommer att översättas till polymerbaserade elektrod kedjor, minska funktions storlekar och öka det möjliga antalet elektroder i en matris närmare de av kisel enheter^{15,16,17 ,18,19}. På samma sätt kommer tvärsnitts områdena för polymerenheter att krympa vid sidan av funktions storlekar, vilket ger ännu bättre biokompatibilitet⁸. Återigen, som åstadkoms med kisel enheter, integration med förstärkning, digitalisering och Multiplexing chips¹⁷ kommer ytterligare möjliggöra större skala neurala inspelning.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printed Stereotax Adapter Parts (3) and Base Piece (1)	N/A	N/A	3d print parts, suggest <30 μm resolution for minimal hand finishing of parts. Files available at:
https://github.com/jasonechung/PolymerProbe3dParts
Dental Acrylic (Hygenic Repair Resin, Coltene type II quick set)	Colten/Whaledent	8886784, 8881627	Dental acrylic for use during implant construction
Hydraulic Micromanipulator (x2)	Narishige Group	MO-10	1-axis micromanipulator
Kapton Polyimide Tape	Bertech	PPTDE-1/2	Double-sided tape
Kopf Stereotax Arm	Kopf Instruments	103088R, 103088L	Standard rodent stereotax
Light Curable Dental Acrylic, Vivid Flow	Coltene/Whaledent	D33-01-00	Light curable dental acrylic for use during implant construction
Loctite Gel Control	Henkel Corp.	234790 1364076 1735574 1752699	Cyanoacrylate for adhering silicon shuttle to corresponding 3d printed part
Metabond Quick Cement	Parkell	S380	For direct application to skull to create strong connection between skull and implant
Polymer Electrode Arrays and Silicon Insertion Shuttles	Lawrence-Livermore National Laboratory	N/A	Fabricated at Lawrence-Livermore National Laboratory, polyimide electrode arrays, silicon insertion shuttle
Silicone Gel Kit, Low Viscosity	Dow Corning	03/80	Low-viscosity silicone gel for filling of 3d printed base piece
Silicone, Medium-Viscosity Kit	World Precision Instruments	Kwik-Sil	Medium-viscosity silicone gel for protection of polymer electrode arrays