Summary
Dit artikel demonstreert een model om cardiale remodellering te bestuderen na myocard cryoletsel bij muizen.
Abstract
Het gebruik van diermodellen is essentieel voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën voor acuut coronair syndroom en de complicaties. In dit artikel demonstreren we een Murine cryoblessure infarct-model dat precieze infarct-grootten genereert met een hoge reproduceerbaarheid en replicabiliteit. In het kort, na intubatie en sternotomie van het dier, wordt het hart van de thorax opgeheven. De sonde van een handheld vloeibaar stikstoftoevoer systeem wordt aangebracht op de myocardiale wand om cryoletsel te induceren. Een verminderde ventriculaire functie en elektrische geleiding kan worden bewaakt met echocardiografie of optische mapping. Transmural myocardiale remodellering van het infarcten gebied wordt gekenmerkt door collageen afzetting en verlies van cardiomyocytes. In vergelijking met andere modellen (bijvoorbeeld LAD-ligatie), maakt dit model gebruik van een handheld vloeibaar stikstoftoevoer systeem om meer uniforme infarct groottes te genereren.
Introduction
Acuut coronair syndroom (ACS) is de belangrijkste doodsoorzaak in de westerse wereld1,2. Acute occlusie van de coronaire slagaders leidt tot activering van ischemische Cascade en necrose van het aangetaste hartweefsel3. Beschadigd myocardium wordt geleidelijk vervangen door niet-contracactiel littekenweefsel, die klinisch manifestz als hartfalen4,5. Ondanks de recente ontwikkelingen in de behandeling van ACS stijgt de prevalentie van ACS-en ACS-gerelateerde hartfalen en zijn therapeutische opties beperkt tot6,7. Daarom zijn het ontwikkelen van diermodellen om ACS en zijn complicaties te bestuderen van enorm belang.
Tot op heden is het meest gebruikte diermodel om ACS en ACS-geïnduceerde myocardiale remodellering te bestuderen de ligatie van de linker aflopende coronaire slagader (LAD). Ligatie van de jongen leidt tot acute ischemie van het myocardium, vergelijkbaar met menselijk myocard weefsel tijdens ACS. Echter, inconsistente infarct maten blijven de Achilles hiel van LAD ligatie. Chirurgische variatie en anatomische variabiliteit van de jongen leiden tot inconsistente infarct maten en belemmeren de reproduceerbaarheid en replicabiliteit van deze procedure8,9,10. Daarnaast heeft LAD ligatie een hoge intra-en postoperatieve sterfte. Ondanks de recente inspanningen om de reproduceerbaarheid te verbeteren en de sterfte te verminderen11,12, zijn grote aantallen dieren nog steeds nodig om anti-herinrichting therapieën naar behoren te evalueren.
Alternatieve modellen van ACS zijn in de afgelopen jaren voorgesteld en bestudeerd, waaronder radiofrequentie13, thermische14 of cryogene verwondingen15,16,17,18. Huidige cryoblessure methoden passen een metalen staaf voorgekoeld in vloeibare stikstof om het hartweefsel van het onderwerp te beschadigen15,16. Deze procedure moet echter meerdere malen worden herhaald om een voldoende infarct grootte te genereren. Als gevolg van de hoge geleidbaarheid en lage warmtecapaciteit van de staaf in vergelijking met het weefsel, de sonde warmt snel, en het weefsel wordt gekoeld (en dus infarcted) heterogene. Om deze beperkingen te overwinnen, beschrijven we hierin een cryoinfarct model met behulp van een hand-held vloeibaar stikstoftoevoer systeem. Dit model is reproduceerbaar, gemakkelijk uit te voeren en kan snel en betrouwbaar worden vastgesteld. Een reproduceerbare Transmurale infarct laesie onafhankelijk van coronaire anatomie wordt gegenereerd, die uiteindelijk leidt tot hartfalen. Deze methode is vooral geschikt om het renovatieproces te bestuderen voor de evaluatie van nieuwe therapeutische farmacologische en weefsel-engineering gebaseerde strategieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de gids voor de beginselen van laboratoriumdieren, bereid door het Institute of Laboratory Animal resources, en gepubliceerd door de National Institutes of Health. Alle dier protocollen werden goedgekeurd door de verantwoordelijke lokale overheid (de Universiteit van Californië-San Francisco (UCSF), het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité).
1. verzorging van dieren
- Het verkrijgen van muizen op de leeftijd van 14 weken met een gewicht van ongeveer 27 g (bijvoorbeeld van het Instituut voor laboratoriumdieren).
Opmerking: BALB/c muizen worden gebruikt voor dit artikel. - Houd muizen onder conventionele omstandigheden in geventileerde kasten, voeden ze standaard muizen Chow en geautoclaveerd water ad libitum.
2. voorbereiding van de muis
- Gebruik een inductie kamer om de muis te verdoven met Isofluraan (3,5%).
- Verwijder het haar over de borst en nek met behulp van een haar trimmer.
- Plaats de muis in rugligging positie op een verwarmde pad en onderhoud anesthesie met een gelaatsmasker dat de mond en neus van de muis bedekt.
- Controleer op voldoende diepte van de anesthesie door het knijpen van de achterpoten en staart om te controleren of er geen reflexen.
- Injecteer subcutane buprenorfine (0,03 mg/kg) voor analgesie.
- Verdeel de achterpoten en de ledematen en fixeer hun positie met behulp van tape.
- Desinfecteer het geschoren gebied met Povidon jodium, gevolgd door schrobben met 80% ethanol. Herhaal deze stap twee keer.
- Gebruik een kleine schaar om een middellijn huid incisie te maken van het onderste derde deel van het borstbeen naar de kin.
- Gebruik gebogen Tang en scheid de spieren rond de nek zorgvuldig om de luchtpijp bloot te leggen.
- Gebruik een micro-schaar om een tracheotomie uit te voeren tussen de tweede en derde kraakbeen ringen.
- Stel de ventilator in op een ventilatie frequentie van 110/min met een getijden volume van 0,5 mL.
- Verwijder het gelaatsmasker en plaats een plastic canule (20 G), aangesloten op de ventilator, in de luchtpijp. Het dier ventileren.
Opmerking: Zorg ervoor dat de ventilatie canule niet te diep is ingebracht door bilaterale Long ventilatie te bevestigen. - Gebruik cauterie om de juiste spieren van de pectoralis los te maken van de borstbeen-oorsprong tussen de derde en de zevende ribben.
- Gebruik een schuine veer schaar om de vierde tot de zesde ribben zo dicht mogelijk bij het borstbeen te snijden.
- Cauteriseren de borst slagader, als bloeden zichtbaar is.
- Verlaag Isofluraan tot 2,5%.
- Ontleden onderliggende bindweefsel om een duidelijk beeld in de borstholte te verkrijgen.
- Gebruik botte tang om het hartzakje te openen en het hart bloot te leggen.
- Gebruik een mini Goldstein oprolmechanisme om de ribben te verspreiden en de borstholte open te houden.
- Til het hart uit de thoracische holte met een stompe staaf.
- Verlaag de spanning van het oprolmechanisme om het openen van de borstkas te verminderen en het hart niet terug te vallen.
- Precool de cryoprobe (3 mm diameter) voor 10 s.
- Breng de cryoprobe op de voorste linkerventrikel wand en Vries gedurende 10 s om een linker ventriculaire Cryo-blessure infarct te genereren.
Let op: de cryoprobe kan op verschillende hart wanden worden aangebracht, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag en behoefte. - Irrigeren de cryoprobe met kamertemperatuur zoutoplossing om de sonde los te maken van de linker ventriculaire wand.
- Gebruik het oprolmechanisme om de borst opening te vergroten.
- Keer het hart voorzichtig terug naar de thoracische holte met een stompe staaf.
- Verwijder de oprolmechanisme en verbind de sternotomie met een enkele knoop met behulp van 6-0 hecht.
- Sluit de borstholte met behulp van 6-0 Running Suture. Gebruik een injectiespuit van 10 mL om de resterende lucht uit de borstkas te evacueren voordat u de knoop gaat binden.
- Pas de huid aan de caudal rand aan en hecht deze aan het punt van de tracheale opening met lopende hechtdraad (5-0).
- Stel Isofluraan in op 1,5% en wacht tot het dier spontaan ademt.
- Verwijder de tracheale katheter en breng het gelaatsmasker opnieuw op de dieren mond en neus om anesthesie te handhaven.
- Sluit de tracheale incisie met een 8-0 hecht.
- Herpositioneer de ventrale nekspieren terug naar hun positie om de luchtpijp te bedekken.
- Voltooi de huid hechting.
- Voeg metamizol toe aan het drinkwater (50 mg metamizol per 100 mL) voor pijn analgesie gedurende 3 dagen en bewaak het dier dagelijks.
Opmerking: de observatieperiode voor dit model is 8 weken. Zorg ervoor dat u de richtlijnen van uw instelling met betrekking tot analgesie regime te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het cryoblessure infarct model is geschikt om ACS en zijn complicaties te bestuderen. Lage sterftecijfers en efficiënt postchirurgisch herstel worden in dit model gezien. Cryoletsel veroorzaakte myocardiale beschadiging leidt tot een verminderde hartfunctie, elektrische ontkoppeling en Transmurale remodeling.
Echocardiografie kan worden gebruikt om de hartfunctie noninvasief in vivo te bewaken. In Cryo-gewonde harten, echocardiografie toont significant verminderd ejectiefractie en fractionele gebied verandering (Figuur 1a-c). Functionele stoornissen blijven van dag 7 na de operatie tot het observationele eindpunt van 56 dagen.
Gedetailleerde hartfunctie kan invasief worden beoordeeld door middel van een druk volume loop (PV-loop) analyse. Een 1,2 FR geleiding katheter wordt ingebracht in de linker ventrikel, en de linker ventriculaire druk wordt uitgezet tegen de linker ventriculaire volume. Hemodynamische parameters zoals lijn volume, lijnwerk, cardiale output en voorgeladen maximale vermogen kunnen worden berekend. Zoals weergegeven in Figuur 1d-h, leidt cryoinfarct tot een verminderde linker ventrikel (LV0 functie, die wordt weerspiegeld als een afname van het volume van de lijn, beroerte werk, cardiale output en vooraf aangepast maximaal vermogen.
Om cardiale elektrofysiologie te bestuderen, kan optische mapping ex vivo worden uitgevoerd. Harten worden verwijderd, geperfundeerd met Langendorff perfusie techniek, en gekleurd met een fluorescerende spanning gevoelige kleurstof. Cryogeblesseerd hart demonstreert verstopping van elektrische geleiding aan de grens van letsel, wat duidt op lokale elektrische ontkoppeling (Figuur 1i).
Histologische kleuring met de trichrome van Masson demonstreert Transmurale fibrotische weefselvorming op de plaats van de verwonding (Figuur 2a). Infarct grootte kan worden berekend door het meten van infarct litteken gebied of middellijn litteken lengte19 (Figuur 2b). Immunofluorescentie kleuring tegen alpha-sarcomeric actinine (cardiomyocyte marker) en collageen-Ik bevestig fibrotische remodellering en verlies van cardiomyocyten op de plaats van de verwonding (Figuur 2c).
Figuur 1 : Functionele en elektrofysiologische analyse van cryogeblesseerd hart. Representatieve tweedimensionale echocardiografie beelden die pre-operatief werden genomen (D0) en op postoperatieve dag 7 (D7), 28 (D28) en 56 (D56). (a) het bovenste paneel toont de parasternale lange-assige weergave aan de eind-diastole en het onderste paneel aan het einde-systole. (b, c) Ejectiefractie (EF) en fractionele gebieds verandering (FAC) afname na Cryo-infarct en bleef verminderd na verloop van tijd cardiale functie werd invasief beoordeeld door druk volume curve analyse. (d-g) Dag 56 post letsel beroerte volume (SV), lijnwerk (SW), cardiale output (CO), en vooraf aangepast maximaal vermogen (PAMP) waren significant lager dan bij pre-operatieve inheemse dieren. h) representatieve PV-lussen van inheemse en 56 dagen na de operatie vertoonden dieren karakteristieke rechts verschuiving en afname van de amplitude van het druk signaal na thoracale vena cava (TVC) occlusie. i) isochrone kaart van cardiale optische mapping van inheemse en cryogewonde harten 14 dagen na de operatie. Boven-en onderpanelen tonen harten tempo van de Apex en de basis, respectievelijk. Infarct gebied wordt aangeduid met een onderbroken witte lijn. Intergroepverschillen werden beoordeeld aan de hand van een eenrichtings analyse van variantie (ANOVA) met de post-hoc test van Bonferroni of de t-toets van de student. N = 3 dieren. * geeft p < 0,05 aan. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD). ESPVR = end-systolische druk volume verhouding; EDPVR = verhouding van het druk volume van het eind diastolische. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Histologische beoordeling van inheemse en Cryo-gewonde harten. a) de trichrome-kleuring van Masson toont de collageen depositie (groen) in het hart-gebied. Het hart-percentage van de linker ventrikel werd gemeten als (b) gebied en (c) lengte van de middellijn infarct. d) immunofluorescentie kleuring geeft een verhoogde collageen-I-depositie aan met gelijktijdig verlies van cardiomyocyten in een infarcteerd gebied. LV = linker ventrikel; RV = rechter ventrikel; Endo = endocardial; Epi = epicardial. N = 3 dieren. Foutbalken tonen SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft een muis cryoblessure model om te onderzoeken ACS en verwante farmacologische en therapeutische opties.
De meest cruciale stap is de toepassing van de cryoprobe op het hartweefsel. De contact duur moet streng worden gecontroleerd om de optimale infarct grootte te verkrijgen en om reproduceerbare resultaten te garanderen. Langdurige koeling van het myocardium zal leiden tot oversized infarcten of ventriculaire perforatie. Verkorte koeltijd genereert daarentegen beperkte epicardial laesies en elimineert niet alle ingezeten cellen. Vandaar, dit kan worden verstorende bij het bestuderen van regeneratieve celtransplantatie.
Vergeleken met andere cryoinfarct methodes20, heeft de open borst benadering zoals beschreven in dit artikel het voordeel dat de infarct vrij kan worden geïnduceerd op verschillende posities van het hart. Bovendien vergemakkelijkt deze aanpak therapeutische celinjectie of pleister toepassingen, omdat de grens van de infarct zichtbaar is en de plaats van de celtransplantatie dienovereenkomstig kan worden gekozen.
Een nadeel van dit model is de etiologie van myocard letsel. Cryoletsel resulteert in celdood als gevolg van de generatie van ijskristallen die de celmembraan verstoren in plaats van een directe ischemie. Bovendien is de richting van letsel meestal van epicardium naar binnen, terwijl ischemische infarcten de neiging hebben om naar buiten te propageren van de endocard naar de epicardial-laag. Daarom is dit model beperkt tot het bestuderen van de pathofysiologische mechanismen van myocardiale ischemie of om de ischemie-reperfusie-instelling te imiteren.
Concluderend, het hier beschreven model is goedkoop, gemakkelijk uit te voeren, kan snel en betrouwbaar worden vastgesteld. Cardiomyocyte necrose en daaropvolgende littekenvorming ontwikkelen na verloop van tijd, resulterend in een progressieve verminderde pompfunctie en elektrische geleiding. Goed bestuurbare infarct grootte, vorm en locatie maken dit model ideaal om experimentele interventies te evalueren gericht op het herstellen van de hartfunctie of cardiale regeneratie. Met succes geteste behandelingsopties moeten verder worden bevestigd in grote dierproeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Christiane Pahrmann voor haar technische hulp. D.W. werd gesteund door de Stichting Max kade. T.D. ontving subsidies van de else Kröner Fondation (2012_EKES. 04) en de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2 -1 _. S. S. ontving onderzoekssubsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
- Writing Group. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38-360 (2016).
- de Alencar Neto, J. N. Morphine, Oxygen, Nitrates, and Mortality Reducing Pharmacological Treatment for Acute Coronary Syndrome: An Evidence-based Review. Cureus. 10 (1), 2114 (2018).
- Detry, J. M. The pathophysiology of myocardial ischaemia. European Heart Journal. 17, Suppl G 48-52 (1996).
- Ertl, G., Frantz, S. Healing after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 66 (1), 22-32 (2005).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Velagaleti, R. S., Vasan, R. S. Heart failure in the twenty-first century: is it a coronary artery disease or hypertension problem. Cardiology Clinics. 25 (4), 487-495 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Morrissey, P. J., et al. A novel method of standardized myocardial infarction in aged rabbits. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 959-967 (2017).
- Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Experimental Physiology. 89 (4), 497-505 (2004).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Reichert, K., et al. Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (122), e55353 (2017).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (65), e3896 (2012).
- Antonio, E. L., et al. Left ventricle radio-frequency ablation in the rat: a new model of heart failure due to myocardial infarction homogeneous in size and low in mortality. J Card Fail. 15 (6), 540-548 (2009).
- Ovsepyan, A. A., et al. Modeling myocardial infarction in mice: methodology, monitoring, pathomorphology. Acta Naturae. 3 (1), 107-115 (2011).
- Ciulla, M. M., et al. Left ventricular remodeling after experimental myocardial cryoinjury in rats. Journal of Surgical Research. 116 (1), 91-97 (2004).
- Grisel, P., et al. The MRL mouse repairs both cryogenic and ischemic myocardial infarcts with scar. Cardiovascular Pathology. 17 (1), 14-22 (2008).
- Duerr, G. D., et al. Comparison of myocardial remodeling between cryoinfarction and reperfused infarction in mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 961298 (2011).
- Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular Research. 71 (1), 158-169 (2006).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology (1985). 102 (6), 2104-2111 (2007).
- van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
