Summary
Denna artikel visar en modell för att studera hjärtats remodeling efter myokardiell kryoskada hos möss.
Abstract
Användningen av djurmodeller är avgörande för att utveckla nya terapeutiska strategier för akut koronarsyndrom och dess komplikationer. I denna artikel, vi visar en murina kryoskada-infarct modell som genererar exakta-infarct storlekar med hög reproducerbarhet och replikerbarhet. I korthet, efter intubation och sternotomi av djuret, hjärtat lyfts från bröstkorgen. Sonden av en handhållen flytande kväve leveranssystem appliceras på hjärtinfarkt väggen för att inducera kryoskada. Försämrad ventrikulär funktion och elektrisk ledning kan övervakas med ekokardiografi eller optisk kartläggning. Transmural myokarremodelleringen av det hjärtområdet kännetecknas av kollagen deposition och förlust av kardiomyocyter. Jämfört med andra modeller (t. ex. LAD-ligation), använder denna modell en handhållen flytande kväve leveranssystem för att generera mer enhetliga-infarct storlekar.
Introduction
Akut koronarsyndrom (ACS) är de vanligaste dödsorsakerna i västvärlden1,2. Akut ocklusion av hjärtats kranskärl leder till aktivering av ischemisk kaskad och nekros av den drabbade hjärtvävnad3. Skadad hjärtmuskeln gradvis ersätts av icke-kontraktila ärrvävnad, som manifestz kliniskt som en hjärtsvikt4,5. Trots de senaste framstegen i behandlingen av ACS, är prevalensen av ACS och ACS-relaterade hjärtsvikt stiger, och terapeutiska alternativ är begränsade6,7. Därför är det oerhört intressant att utveckla djurmodeller för att studera ACS och dess komplikationer.
Hittills, den mest använda djurmodell för att studera ACS och ACS-inducerad myokardiell remodeling är ligering av vänster fallande kranskärlssjukdom (LAD). Ligering av pojken leder till akut ischemi av myocardium, liknar mänsklig myokardvävnad under ACS. Men inkonsekvent-infarct storlekar förblir akilleshäl av LAD ligation. Kirurgisk variation och anatomiska variationer av lad leda till inkonsekventa-infarct storlekar och hindra reproducerbarhet och replikerbarhet av detta förfarande8,9,10. Dessutom har lad ligering en hög intraoch postkirurgisk dödlighet. Trots den senaste strävan att förbättra reproducerbarhet och minska dödligheten11,12, ett stort antal djur behövs fortfarande för att korrekt utvärdera anti-remodeling terapier.
Alternativa modeller av ACS har föreslagits och studerats under de senaste åren, inklusive radio-frekvens13, termisk14 eller kryogena skador15,16,17,18. Aktuella kryoskademetoder tillämpa en metallstång förkyld i flytande kväve för att skada försökspersonens hjärtvävnad15,16. Emellertid, denna procedur måste upprepas flera gånger för att generera en tillräcklig-infarct storlek. På grund av den höga ledningsförmåga och låg värmekapacitet stången jämfört med vävnad, sonden värmer snabbt, och vävnaden kyls (och därmed infarcted) heterogen. För att övervinna dessa begränsningar, beskriver vi häri en kryoinfarkt modell använder en handhållen flytande kväve leveranssystem. Denna modell är reproducerbar, lätt att utföra och kan etableras snabbt och tillförlitligt. En reproducerbar transmural-infarct lesion oberoende av koronar anatomi genereras, vilket så småningom leder till hjärtsvikt. Denna metod är särskilt lämplig för att studera remodeling processen för utvärdering av nya terapeutiska farmakologiska och vävnad Engineering-baserade strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djuren fick Human Care i enlighet med vägledningen för principerna för försöksdjur, utarbetad av Institutet för laboratoriedjur resurser, och publiceras av National Institutes of Health. Alla djur protokoll godkändes av den ansvariga lokala myndigheten (University of California San Francisco (UCSF) institutionella djuromsorg och användning kommittén).
1. djuromsorg
- Få möss vid en ålder av 14 veckor som väger cirka 27 g (t. ex. från Institutet för laboratoriedjur).
Obs: BALB/c-möss används för den här artikeln. - Håll möss under konventionella förhållanden i ventilerade skåp, mata dem standardmöss Chow och autoklaverat vatten AD libitum.
2. mus förberedelse
- Använd en induktions kammare för att bedövas mus med isofluran (3,5%).
- Ta bort håret över bröstet och halsen med hjälp av en Hårtrimmer.
- Placera musen i liggande läge på en uppvärmd pad och underhålla anestesi med en ansiktsmask som täcker munnen och näsan av musen.
- Kontrollera om tillräckligt djup av anestesi genom att nypa bakfötterna och svansen för att kontrollera en avsaknad av reflexer.
- Injicera subkutant buprenorfin (0,03 mg/kg) för analgesi.
- Sprid bakbenen och förbanden och fixera deras position med tejp.
- Med povidon jod, desinficera den rakade området, följt av skrubbning med 80% etanol. Upprepa detta steg två gånger.
- Använd en liten sax för att göra en mittlinje hud snitt från den nedre tredjedelen av bröstbenet till hakan.
- Använd böjda tång och noggrant separera musklerna runt halsen för att exponera luftstrupen.
- Använd en mikrosax för att utföra en trakeotomi mellan den andra och tredje brosk ringarna.
- Ställ in ventilatorn på en ventilations frekvens på 110/min med en tidvatten volym på 0,5 mL.
- Ta bort ansiktsmask och sätt i en plastkanyl (20 G), ansluten till ventilatorn, i luftstrupen. Ventilera djuret.
Obs: se till att ventilations kanyl inte är insatt för djupt genom att bekräfta bilateral lungventilation. - Använd diatermi att lossa rätt pectoralis muskeln från dess sternala ursprung mellan den tredje och sjunde revbenen.
- Använd sida vinklad våren sax för att skära den fjärde till sjätte revbenen så nära som möjligt till bröstbenet.
- Cauterize bröst artären, om blödning är synlig.
- Minska isofluran till 2,5%.
- Dissekera underliggande bindväv för att få en klar bild i brösthålan.
- Använd trubbiga tång för att öppna hjärttäcken och exponera hjärtat.
- Använd en mini Goldstein upprullningsdon att sprida revbenen och hålla brösthålan öppen.
- Lyft hjärtat från brösthålan med en trubbig stav.
- Minska spänningen i upprullningsdonet för att minska bröst öppningen och för att hålla hjärtat från att falla tillbaka.
- Precool kryosonden (3 mm diameter) för 10 s.
- Applicera kryosonden på främre vänstra ventrikeln väggen och frysa för 10 s för att generera en Vänsterkammar Cryo-skada infarct.
Obs: kryosonden kan appliceras på olika hjärt väggar beroende på den vetenskapliga frågan och behovet. - Vattna kryosonden med rumstemperatur saltlösning för att lossa sonden från vänster kammar vägg.
- Använd upprullningsdonet för att förstora bröst öppningen.
- Försiktigt tillbaka hjärtat till brösthålan med en trubbig stav.
- Ta bort upprullningsdonet och Anslut sternotomi med en enda Knut med 6-0 sutur.
- Stäng brösthålan med hjälp av 6-0 Running sutur. Använd en 10 mL spruta för att evakuera eventuell kvarvarande luft från bröstet innan du binder knuten.
- Anpassa huden vid den kaudala kanten och sutur den till den punkt i trakealöppningen med rinnande sutur (5-0).
- Ställ isofluran till 1,5% och vänta tills djuret får spontan andning.
- Ta bort trakealkatetern och återapplicera ansiktsmask på djurens mun och näsa för att bibehålla anestesi.
- Stäng luftrör snitt med en 8-0 Sutur.
- Flytta den ventrala nackmusklerna tillbaka till sin position för att täcka luftstrupen.
- Komplettera huden suturen.
- Tillsätt metamizol till dricksvattnet (50 mg metamizol per 100 mL) för smärtlindring i 3 dagar och övervaka djuret dagligen.
Anmärkning: observationsperioden för denna modell är 8 veckor. Var noga med att följa din institutions riktlinjer om analgesi regim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kryoskadeinfarct modellen är lämplig för att studera ACS och dess komplikationer. Låg dödlighet och effektiv postkirurgisk återhämtning ses i denna modell. Kryoskadinducerade hjärtinfarkt skador leder till minskad hjärtfunktion, elektrisk avkoppling, och transmural remodeling.
Ekokardiografi kan användas för att övervaka hjärtfunktionen noninvasivt in vivo. I Cryo-skadade hjärtan, ekokardiografi visar signifikant minskad ejektionsfraktion och fraktionerad område förändring (figur 1a-c). Funktionsnedsättning fortsätter från dag 7 efter operationen till observations Endpoint på 56 dagar.
Detaljerad hjärtfunktion kan bedömas invasivt genom tryck volym loop (PV-loop) analys. En 1,2 fr värmeledningsförmåga kateter förs in i vänster kammare, och Vänsterkammar trycket plottas mot Vänsterkammar volymen. Hemodynamiska parametrar som slagvolym, strokearbete, hjärt effekt och förbelastningsjusterad maximal effekt kan beräknas. Som visas i figur 1d-h, kryoinfarkt leder till nedsatt vänster kammare (LV0 funktion, vilket återspeglas som en minskning av stroke volym, stroke arbete, hjärtminutvolymen och preload-justerade maximal effekt.
För att studera kardiell elektrofysiologi kan optisk kartläggning utföras ex vivo. Hjärtan avlägsnas, parfymerades med Langendorff perfusion teknik, och färgas med en fluorescerande spännings känsligt färgämne. Kryoskadade hjärtan uppvisar blockering av elektrisk ledning vid gränsen till skada, vilket indikerar lokal elektrisk avkoppling (figur 1i).
Histologisk färgning med Massons trikrom visar transmural fibrotisk vävnad bildas vid platsen för skadan (figur 2a). -Infarct storlek kan beräknas genom att mäta-infarct ärr område eller mittlinjen ärr längd19 (figur 2b). Immunofluorescensfärgning mot alfa-sarcomeric actinin (kardiomyocytmarkör) och kollagen-Jag bekräftar fibrotisk remodeling och förlust av kardiomyocyter på platsen för skadan (figur 2c).
Figur 1 : Funktionell och Elektrofysiologisk analys av kryoskadat hjärta. Representativa tvådimensionella ekokardiografi bilder tagna pre-operatively (D0) och på postoperativ dag 7 (D7), 28 (D28) och 56 (D56). (a) den övre panelen visar den parasternal lång-axelvy vid slutet diastole och bottenpanelen vid slutet Systole. (b, c) Ejektionsfraktion (EF) och fraktionerad Area förändring (FAC) minskar efter Cryo-infarkt och förblev minskat över tid hjärtfunktionen bedömdes invasivt av tryck volymkurva analys. (d-g) Dag 56 post skada Slagvolym (SV), stroke arbete (SW), hjärtminutvolymen (CO), och preload-justerade maximal effekt (PAMP) var signifikant lägre än i pre-operativ infödda djur. (h) representativa PV-slingor från infödda och 56 dagar efter operationen djur visade karakteristiska rätt Skift och nedgång i amplitud av tryck signalen efter bröst Vena Cava (TVC) ocklusion. (i) isochrone karta över kardiell optisk kartläggning från infödda och kryoskadade hjärtan 14 dagar efter operationen. Topp och botten paneler visar hjärtan tempo från Apex och bas, respektive. Infarct-området markeras med streckad vit linje. Skillnaderna mellan grupper bedömdes genom enkelriktad analys av varians (ANOVA) med Bonferronis post hoc-test eller Students t-test. N = 3 djur. * indikerar p < 0,05. Felstaplarna representerar standardavvikelsen (SD). ESPVR = systoliskt tryck volym förhållande; EDPVR = slutet diastoliskt tryck volym relation. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Histologisk bedömning av infödda och Cryo-skadade hjärtan. (a) Massons trikrom färgning visar kollagen deposition (grön) i den hjärtområdet. Den hjärt procentsatsen av vänster kammare mättes som (b) område och (c) mittlinjen-infarct längd. d) immunofluorescenfärgning visar ökad kollagen-i-deposition med samtidig förlust av kardiomyocyter i hjärt område. LV = vänster kammare; RV = höger kammare; endo = endokardiell; EPI = epikardiell. N = 3 djur. Felstaplar visar SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här artikeln beskrivs en mus cryoskade modell för att undersöka ACS och relaterade farmakologiska och terapeutiska alternativ.
Det mest avgörande steget är tillämpningen av cryoprobe på hjärtvävnad. Kontakttiden måste kontrolleras noggrant för att erhålla optimal infarktstorlek och för att garantera reproducerbara resultat. Långvarig kylning av hjärtmuskeln kommer att leda till överdimensionerade infarkter eller ventrikulär perforation. I kontrast, förkortad kyltid genererar begränsade epikardiella lesioner och eliminerar inte alla inhemska celler. Därav, detta kan vara confounding när man studerar regenerativ celltransplantation.
Jämfört med andra kryoinfarkt metoder20, den öppna bröstet tillvägagångssätt som beskrivs i denna artikel har fördelen att infarkten kan induceras fritt på olika positioner i hjärtat. Dessutom underlättar denna metod terapeutisk cell injektion eller patch applikationer, som-infarct gränsen är synlig, och platsen för celltransplantation kan väljas i enlighet med detta.
En nackdel med denna modell är etiologin för hjärtinfarkt skada. Kryoskada resulterar i celldöd på grund av generering av iskristaller störa cellmembranet snarare än en direkt ischemia. Dessutom är riktningen av skadan vanligtvis från epicardium inåt, medan ischemiska infarkter tenderar att propagera utåt från endokardiell till epikardiella skiktet. Därför är denna modell begränsad till att studera de patofysiologiska mekanismerna för myokardischemi eller för att imitera ischemi-reperfusion-inställningen.
Sammanfattningsvis är den modell som beskrivs här billigt, lätt att utföra, kan fastställas snabbt och tillförlitligt. Kardiomyocytnekros och efterföljande ärrbildning utvecklas över tid, vilket resulterar i progressiv försämrad pumpfunktion och elektrisk konterhet. Väl kontrollerbar-infarct storlek, form och läge gör denna modell idealisk för att utvärdera experimentella interventioner som syftar till att återställa hjärtfunktion eller hjärt förnyelse. Framgångsrikt testade behandlingsalternativ bör bekräftas ytterligare i stora djurstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Christiane Pahrmann för hennes tekniska hjälp. D.W. stöddes av stiftelsen Max Kade. T.D. fick bidrag från Else kröner Fondation (2012_EKES. 04) och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2- -1 _. S. S. mottog forskningsbidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
- Writing Group. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 38-360 (2016).
- de Alencar Neto, J. N. Morphine, Oxygen, Nitrates, and Mortality Reducing Pharmacological Treatment for Acute Coronary Syndrome: An Evidence-based Review. Cureus. 10 (1), 2114 (2018).
- Detry, J. M. The pathophysiology of myocardial ischaemia. European Heart Journal. 17, Suppl G 48-52 (1996).
- Ertl, G., Frantz, S. Healing after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 66 (1), 22-32 (2005).
- Jugdutt, B. I. Ventricular remodeling after infarction and the extracellular collagen matrix: when is enough enough. Circulation. 108 (11), 1395-1403 (2003).
- Velagaleti, R. S., Vasan, R. S. Heart failure in the twenty-first century: is it a coronary artery disease or hypertension problem. Cardiology Clinics. 25 (4), 487-495 (2007).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 146-603 (2017).
- Morrissey, P. J., et al. A novel method of standardized myocardial infarction in aged rabbits. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 959-967 (2017).
- Degabriele, N. M., et al. Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction. Experimental Physiology. 89 (4), 497-505 (2004).
- Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).
- Reichert, K., et al. Murine Left Anterior Descending (LAD) Coronary Artery Ligation: An Improved and Simplified Model for Myocardial Infarction. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (122), e55353 (2017).
- Kim, S. C., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (65), e3896 (2012).
- Antonio, E. L., et al. Left ventricle radio-frequency ablation in the rat: a new model of heart failure due to myocardial infarction homogeneous in size and low in mortality. J Card Fail. 15 (6), 540-548 (2009).
- Ovsepyan, A. A., et al. Modeling myocardial infarction in mice: methodology, monitoring, pathomorphology. Acta Naturae. 3 (1), 107-115 (2011).
- Ciulla, M. M., et al. Left ventricular remodeling after experimental myocardial cryoinjury in rats. Journal of Surgical Research. 116 (1), 91-97 (2004).
- Grisel, P., et al. The MRL mouse repairs both cryogenic and ischemic myocardial infarcts with scar. Cardiovascular Pathology. 17 (1), 14-22 (2008).
- Duerr, G. D., et al. Comparison of myocardial remodeling between cryoinfarction and reperfused infarction in mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 961298 (2011).
- Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular Research. 71 (1), 158-169 (2006).
- Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology (1985). 102 (6), 2104-2111 (2007).
- van den Bos, E. J., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
