Summary
Este artigo demonstra um modelo para estudar o remodelamento cardíaco após o cryoinjúria miocárdico nos ratos.
Abstract
O uso de modelos animais é essencial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a Síndrome Coronariana Aguda e suas complicações. Neste artigo, Nós demonstramos um modelo murino do infarto cryoinjela que gerencie tamanhos precisos do enfarte com reprodutibilidade e replicability elevados. Em suma, após a intubação e esternotomia do animal, o coração é levantado do tórax. A sonda de um sistema de entrega de nitrogênio líquido portátil é aplicada na parede miocárdica para induzir crioferimento. A função ventricular prejudicada e a condução elétrica podem ser monitoradas com ecocardiografia ou mapeamento óptico. A remodelação miocárdica transmural da área infartada caracteriza-se por deposição de colágeno e perda de cardiomiócitos. Comparado a outros modelos (por exemplo, Lad-ligadura), este modelo utiliza um sistema handheld da entrega do nitrogênio líquido para gerar uns tamanhos mais uniformes do infarto.
Introduction
A Síndrome Coronariana Aguda (SCA) é a principal causa de morte no mundo ocidental1,2. A oclusão aguda das artérias coronárias leva à ativação da cascata isquêmica e necrose do tecido cardíaco afetado3. O miocárdio danificado é substituído gradualmente pelo tecido não-contractile da cicatriz, que manifestz clìnica como uma falha de coração4,5. Apesar dos avanços recentes no tratamento de ACS, a predominância de ACS e de insuficiência cardíaca ACS-relacionada está levantando-se, e as opções terapêuticas são limitadas6,7. Portanto, o desenvolvimento de modelos animais para o estudo da SCA e suas complicações são de imenso interesse.
Até o momento, o modelo animal mais utilizado para o estudo da SCA e a remodelação miocárdica induzida pela SCA é a ligadura da artéria coronária descendente esquerda (LAD). A ligadura do LAD conduz à isquemia aguda do myocardium, similar ao tecido miocárdico humano durante ACS. Entretanto, os tamanhos inconsistentes do infarto permanecem o calcanhar de Aquiles da ligadura do Lad. A variação cirúrgica e a variabilidade anatômica do rapaz levam a tamanhos de infarto inconsistentes e dificultam a reprodutibilidade e a replicabilidade desse procedimento8,9,10. Além, a ligadura do LAD tem uma mortalidade intra e postsurgical elevada. Apesar de esforços recentes para melhorar a reprodutibilidade e reduzir a mortalidade11,12, um grande número de animais ainda são necessários para avaliar adequadamente as terapias antiremodeladoras.
Modelos alternativos de ACS têm sido propostos e estudados nos últimos anos, incluindo rádio-frequência13, térmico14 ou lesões criogênicas15,16,17,18. Os métodos de criolesão atual aplicam uma haste metálica pré-resfriada em nitrogênio líquido para danificar o tecido cardíaco do indivíduo15,16. Entretanto, este procedimento precisa de ser repetido diversas vezes para gerar um tamanho suficiente do infarto. Devido à alta condutividade e baixa capacidade de calor da haste em comparação com o tecido, a sonda aquece rapidamente, e o tecido é resfriado (e, portanto, infartado) de forma heterogênea. Para superar estas limitações, nós descrevemos nisto um modelo do cryoinfarction que utiliza um sistema de entrega de nitrogênio líquido à mão. Este modelo é reprodutível, fácil de executar e pode ser estabelecido de forma rápida e confiável. Uma lesão transmural reprodutível do infarto independente da anatomia coronária é gerada, que conduz eventualmente à falha cardíaca. Este método é especialmente adequado para estudar o processo de remodelação para a avaliação de novas estratégias terapêuticas farmacológicas e baseadas em engenharia tecidual.
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Protocol
Os animais receberam cuidados humanitários em conformidade com o guia para os princípios de animais de laboratório, elaborado pelo Instituto de recursos animais de laboratório, e publicados pelos institutos nacionais de saúde. Todos os protocolos de animais foram aprovados pela autoridade local responsável (a Universidade da Califórnia San Francisco (UCSF) institucional de cuidados e uso do animal Committee).
1. cuidados com os animais
- Obter camundongos com a idade de 14 semanas pesando aproximadamente 27 g (por exemplo, do Instituto de animais de laboratório).
Observação: camundongos BALB/c são usados para este artigo. - Mantenha os ratos condições convencionais em armários ventilados, alimentando-os ratos padrão Chow e água autoclavada ad libitum.
2. preparação do mouse
- Use uma câmara de indução para anestesiizar o rato com isoflurano (3,5%).
- Retire o cabelo sobre o peito e pescoço usando um aparador de cabelo.
- Coloc o rato na posição supina em uma almofada aquecida e mantenha a anestesia com uma boca da coberta do facemask e o nariz do rato.
- Verifique se há profundidade suficiente de anestesia por beliscar os pés traseiros e cauda para verificar a ausência de reflexos.
- Injetar buprenorfina subcutânea (0, 3 mg/kg) para analgesia.
- Espalhe os membros traseiros e dianteiros e fixe sua posição usando a fita.
- Com iodo povidona, desinfete a área raspada, seguida de esfregando com 80% de etanol. Repita este passo duas vezes.
- Use um pequeno Scissor para fazer uma incisão da pele do midline do terço mais baixo do esterno ao queixo.
- Use fórceps curvo e separe cuidadosamente os músculos ao redor do pescoço para expor a traquéia.
- Use uma Microtesoura para realizar uma traqueotomia entre a segunda e terceira cartilagem anéis.
- Ajuste o ventilador a uma frequência de ventilação de 110/min com um volume corrente de 0,5 mL.
- Retire o facemask e insira uma cânula plástica (20 G), conectada ao ventilador, na traquéia. Ventilar o animal.
Nota: Assegure-se de que a cânula de ventilação não esteja muito profunda, confirmando a ventilação pulmonar bilateral. - Use cauterização para separar o músculo peitoral direito de sua origem esternal entre a terceira e sétima costelas.
- Use as tesouras angulares laterais da mola para cortar o quarto a sexto reforços tão perto como possível ao esterno.
- Cauterize a artéria mamária, se o sangramento é visível.
- Diminua o isoflurano para 2,5%.
- Dissecar o tecido conjuntivo subjacente para obter uma visão clara da cavidade torácica.
- Use fórceps sem corte para abrir o pericárdio e expor o coração.
- Use um mini retractor Goldstein para espalhar as costelas e manter a cavidade torácica aberta.
- Levante o coração da cavidade torácica com uma haste sem corte.
- Diminua a tensão do retractor para reduzir a abertura do peito e para manter o coração de cair para trás.
- Precool o criossonda (diâmetro de 3 milímetros) para 10 s.
- Aplique o criossonda na parede anterior do ventrículo esquerdo e congele-se por 10 s para gerar um infarct ventricular esquerdo do Cryo-ferimento.
Nota: o criossonda pode ser aplicado às paredes diferentes do coração dependendo em cima da pergunta e da necessidade científicas. - Irrigar o criossonda com a temperatura ambiente salina para separar a sonda da parede ventricular esquerda.
- Use o retractor para ampliar a abertura do peito.
- Retorne delicadamente o coração à cavidade torácica com uma haste sem corte.
- Retire o retractor e conecte a esternotomia com um único nó usando 6-0 de sutura.
- Feche a cavidade torácica usando 6-0 sutura running. Use uma seringa de 10 mL para evacuar qualquer ar restante do tórax antes de amarrar o nó.
- Adaptar a pele na borda caudal e suturá-la até o ponto da abertura traqueal com sutura em funcionamento (5-0).
- Defina isoflurano para 1,5% e aguarde até que o animal ganhe respiração espontânea.
- Retire o cateter traqueal e reaplique o facemask na boca e no nariz dos animais para manter a anestesia.
- Fechar a incisão traqueal com uma 8-0 Sutura.
- Reposicione os músculos do pescoço ventral de volta à sua posição para cobrir a traquéia.
- Complete a sutura cutânea.
- Adicione metamizol à água potável (50 mg de metamizol por 100 mL) para analgesia de dor durante 3 dias e monitore o animal diariamente.
Nota: o período de observação para este modelo é de 8 semanas. Certifique-se de seguir as diretrizes da sua instituição sobre o regime de analgesia.
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Representative Results
O modelo de infarto crioferimento é adequado para o estudo da SCA e suas complicações. As baixas taxas de mortalidade e a recuperação postsurgical eficiente são vistas neste modelo. O dano miocárdico induzido por crioferimentos leva à redução da função cardíaca, desacoplamento elétrico e remodelação transmural.
A Ecocardiografia pode ser usada para monitorar a função cardíaca não invasora in vivo. Em corações crioferidos, a Ecocardiografia demonstra fração de ejeção significativamente reduzida e alteração da área fracionária (Figura 1a-c). O comprometimento funcional continua do dia 7 após a cirurgia até o desfecho observacional de 56 dias.
A função cardíaca detalhada pode ser avaliada invasivamente através da análise de loop de volume de pressão (PV-loop). Um cateter de condutância de 1,2 fr é introduzido no ventrículo esquerdo, e a pressão ventricular esquerda é plotada contra o volume ventricular esquerdo. Parâmetros hemodinâmicos, como volume de AVC, trabalho de AVC, débito cardíaco e potência máxima ajustada por pré-carga podem ser calculados. Como mostrado na Figura 1d-h, o crioinfarto leva a comprometimento do ventrículo esquerdo (função LV0, que se reflete como uma diminuição do volume do AVC, do trabalho do AVC, do débito cardíaco e do poder máximo ajustado à pré-carga.
Para estudar a eletrofisiologia cardíaca, o mapeamento óptico pode ser realizado ex vivo. Os corações são removidos, perfundidos com técnica da perfusão de Langendorff, e manchados com uma tintura sensível da tensão fluorescente. Os corações crioferidos demonstram bloqueio da condução elétrica na borda da lesão, indicando desengate elétrico local (Figura 1i).
A coloração histológica com o tricrômio de Masson demonstra a formação de tecido fibrótico transmural no local da lesão (Figura 2a). O tamanho do infarto pode ser calculado medindo-se a área da cicatriz do infarto ou o comprimento da cicatriz média19 (Figura 2b). A imunofluorescência que mancha contra o actinina alfa-sarcomérica (marcador do cardiomiócitos) e o colagénio-I confirmam o remodelamento fibrótica e a perda de cardiomiócitos no local da lesão (Figura 2c).
Figura 1 : Análise funcional e eletrofisiológica do coração crioflesado. Imagens de ecocardiografia bidimensional representativas realizadas no pré-operatório (D0) e no dia pós-operatório 7 (D7), 28 (D28) e 56 (D56). (a) o painel superior mostra a visão de eixo longo do paraesternal no final-diástole e o painel inferior no final-systole. (b, c) A fração de ejeção (EF) e a alteração da área fracionária (FAC) diminuem após o crioinfarto e permaneceram diminuídas ao longo do tempo a função cardíaca foi avaliada invasivamente pela análise da curva de volume de pressão. (d-g) O volume de acidente vascular cerebral (SV), o trabalho de AVC (SW), o débito cardíaco (CO) e o poder máximo ajustado por pré-carga (PAMP) foram significativamente menores do que nos animais nativos pré-operatórios. 56 (h) VP-loops representativos de animais nativos e 56 dias após a cirurgia mostraram deslocamento característico da direita e declínio na amplitude do sinal de pressão após a oclusão da veia cava torácica (TVC). (i) mapa isochrone de mapeamento óptico cardíaco de corações nativos e criostentados 14 dias após a cirurgia. Os painéis superior e inferior mostram os corações passeado do ápice e da base, respectivamente. A área do enfarte é marcada pela linha branca tracejada. As diferenças entre os grupos foram avaliadas pela análise de variância (ANOVA) unidirecional com o teste post-hoc de Bonferroni ou teste tde Student. N = 3 animais. * indica p < 0, 5. As barras de erro representam o desvio padrão (SD). ESPVR = relação volume-pressão sistólica final; EDPVR = relação volume de pressão diastólica final. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Avaliação histologic de corações nativos e Cryo-feridos. (a) a coloração Tricrômico de Masson mostra deposição de colágeno (verde) na área infartada. A porcentagem infartada do ventrículo esquerdo foi medida como (b) área e (c) comprimento do infarto da linha média. (d) a coloração de imunofluorescência demonstra deposição aumentada de colágeno-I com perda concomitante de cardiomiócitos na área infartada. LV = ventrículo esquerdo; RV = ventrículo direito; Endo = endocárdico; EPI = epicárdico. N = 3 animais. As barras de erro mostram o SD. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo descreve um modelo crioferimento do rato para investigar ACS e opções farmacológicas e terapêuticas relacionadas.
A etapa a mais crucial é a aplicação do criossonda no tecido cardíaco. A duração do contato deve ser controlada firmemente a fim obter o tamanho óptimo do infarto e garantir resultados reprodutíveis. O resfriamento prolongado do miocárdio levará a infartos superdimensionados ou perfuração ventricular. Em contraste, o tempo de resfriamento reduzido gera lesões Epicárdica limitadas e não elimina todas as células residentes. Daqui, isto pode ser confundimento ao estudar a transplantação regenerativa da pilha.
Comparado a outros métodos do cryoinfarction20, a aproximação aberta da caixa descrita neste artigo tem a vantagem que o infarto pode ser induzido livremente em posições diferentes do coração. Além disso, esta aproximação facilita aplicações terapêuticas da injeção ou do remendo da pilha, porque a beira do infarto é visível, e o local da transplantação da pilha pode ser escolhido conformemente.
Uma desvantagem deste modelo é a etiologia da lesão miocárdica. Crioferimento resulta em morte celular devido à geração de cristais de gelo interrompendo a membrana celular ao invés de uma isquemia direta. Além, o sentido do ferimento é geralmente do epicárdio para dentro, visto que os enfarte isquêmicos tendem a propagar para fora do endocárdico à camada Epicárdica. Portanto, este modelo se limita a estudar os mecanismos fisiopatológicos da isquemia miocárdica ou a imitar o ambiente de isquemia-reperfusão.
Em conclusão, o modelo descrito aqui é barato, fácil executar, pode ser estabelecido rapidamente e confiantemente. A necrose do cardiomiócito e a formação subsequente da cicatriz desenvolvem-se ao longo do tempo, resultando em função progressiva da bomba e condutância elétrica. O tamanho, forma e localização do infarto bem controlável tornam este modelo ideal para avaliar intervenções experimentais visando restaurar a função cardíaca ou a regeneração cardíaca. As opções de tratamento testadas com sucesso devem ser confirmadas em estudos de grandes animais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Christiane Pahrmann pela sua assistência técnica. A DW foi apoiada pela Fundação Max Kade. T.D. recebeu subsídios do outro Kröner Fondation (2012_EKES. 04) e o Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2 -1 _. S. S. recebeu subsídios de pesquisa da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3-1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
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