Summary
在这项研究中，我们提出了从鱼翅和下颌骨中提取皮质醇的规程。通过比较两种洗涤溶剂，然后进行ELISA测定，进一步检查了鳍和颌骨皮质醇水平。这项研究试验了颌骨皮质醇作为一种新的应激指标的可行性。
Abstract
本研究的目的是开发一种利用两种洗涤溶剂（水和异丙醇）从鱼翅中提取皮质醇的技术，并量化三种主要鱼种在鳍皮质醇水平上的任何差异。鱼翅是从19只牺牲的鱼中收获的，包括7只贝卢加（胡索胡索）、7只西伯利亚（阿西彭塞·贝尔里）和5只塞夫鲁加（A.斯特拉图斯）。在伊朗农场饲养了2年（2017-2018年），在韩国进行了皮质醇提取分析（2019年1月至2月）。五个H.Huso的爪骨也被用于皮质醇提取。在SAS环境中使用一般线性模型（GLM）过程对数据进行了分析。变异的测定内系数和相互变化系数分别为14.15和7.70。简而言之，皮质醇萃取技术涉及用3mL溶剂（超纯水和异丙醇）清洗样品（300~10mg），在80rpm下旋转2.5分钟，在室温（22-28°C）下对洗涤样品进行7天的空气干燥，进一步干燥样品在50 Hz下使用珠打手32分钟，将其研磨成粉末，将1.5mL甲醇涂在干粉（75~5mg）上，在室温下缓慢旋转（40rpm），持续搅拌18小时。提取后，对样品进行离心（9，500 x g，10分钟），将1mL上清液转移到新的微离心管（1.5 mL），在38°C孵育以蒸发甲醇，并通过酶连结免疫吸油测定（ELISA）进行分析.在鱼翅皮质醇水平方面，在洗涤溶剂之间，在鳍和下颌骨皮质醇水平方面没有观察到差异。这项研究的结果表明，鱼尾骨基质是固体基质的一个有前途的替代应力指标。
Introduction
皮质醇是动物压力的可靠指标。皮质醇提取为研究人员提供了一个有效的框架，以监测压力水平和压力源的一般模式。例如，以前的研究已经进行了方法验证头发皮质醇测量使用各种方法在人类1，2，猴子3，4，牛5，绵羊6，和金鱼7，8。在鱼类物种中，基质（如鳞片、皮肤粘液、粪便和血液）中的皮质醇测量显示，可以提供有关鱼类健康的信息。当血液取样有问题或缺乏鳞片时，需要替代皮质醇提取基质。在鱼类中，替代基质可以包括下颌骨，一种类似于人类牙齿10的硬组织。
开发新的基质和经过验证的技术来确定鱼子酱的应力水平是特别感兴趣的鱼子酱行业，在那里鱼子酱可能经历长期暴露于环境压力因素11。在2岁之前不能确定鱼群的性别，而且鱼没有鳞片。由于皮质醇在生长阶段2、7、12期间逐渐积累在固体基质中，因此来自硬质质质质质基（如鳍和颌骨）的长期皮质醇积累数据可以提供对应力的洞察处于不同生长阶段的水平。相比之下，血液皮质醇水平提供死亡时压力水平的快照，不能准确表示长期饲养条件下的压力13，14。随着鱼子酱市场竞争的日益激烈，在长期饲养（8-12年或更长时间）期间改善鱼苗品种生产更健康鸡蛋的压力条件的新方法日益成为一个日益重要的研究领域。由于鱼的昂贵成本，收获的样品非常昂贵（根据物种和生长阶段，每条成熟鱼8，000-15，000美元），这是研究项目的一个限制因素。然而，从鱼翅和颌骨中提取皮质醇的适当技术可以应用于养鱼系统和野生鱼类，以提高食用和食用的鱼卵的质量和收获保护。
除了提供可靠的结果6之外，选择适当的皮质醇提取技术对于确保样品制备过程中基质中存在的其他化合物不会混淆输出至关重要，这可能导致结果不一致。同样重要的是，确定鳍和颌骨皮质醇水平是否受周围水中的激素水平影响。Heimbürge等人15日提出，许多因素可能影响皮质醇水平，包括年龄、性别、怀孕、季节、颜色12和提取皮质醇的人体区域。然而，关于洗涤溶剂对鱼体基质8中皮质醇提取的影响，除了鱼卵17外，对鱼类的这些影响没有一点。
虽然分析来自鱼鳍和下颌骨的基线皮质醇水平需要对鱼进行安乐死，但这种方法并不涉及活鱼的血液取样所需的侵入性技术。鱼翅和颌骨样本很容易收集，并且可以从这些组织快速提取。同样，激素提取和分析是直接的，需要很少的专用设备。
在这项研究中，我们提出了一种新的、易于应用的技术，用于从鱼翅和颌骨中提取、洗涤和测定皮质醇，目的是确定从这些基质中测量的皮质醇水平是否可以可靠地用作应力指标。该技术的优点包括简单无创的8方法，更少的数据变异，和可靠的输出1，6，8，17;该技术适用于没有鳞片的鱼种，如鱼鳞。该技术需要屠宰鱼，选择适当的洗涤溶剂2，4，适当研磨样品3，5，专业酶链接免疫吸附测定（ELISA）应用5，7，并广泛了解皮质醇源纳入固体基质6。
我们应用了两种不同的洗涤溶剂（超纯水和异丙醇），从三种鱼翅中获得基底皮质醇水平：贝卢加（胡索胡索）、西伯利亚（阿西彭塞·贝尔里）和塞夫鲁加（A.斯特拉图斯）），在每个物种的标准环境条件下。H. huso的骨骼也被用来评估在鱼的应力。这是首次测量鱼尾骨皮质醇水平的研究。这项研究的结果将为在性别测定前的早期生长阶段（+1年）的鱼种提供比较皮质醇数据。
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Protocol
以下实验程序和方法经大韩民国春川市康原国立大学动物福利与伦理管理局批准。
1. 鳍收集
- 用网轻轻捕捉鱼苗，以尽量减少伤害和压力。
- 在安乐死前，用清水仔细冲洗鱼，然后用吸水毛巾擦拭身体表面。
- 用塑料锤打鱼头，使鱼惊呆了或失去知觉。用刀取下头部。
- 测量体重 （g） 和长度 （cm）。
- 安乐死后，使用消毒手术剪刀尽可能接近身体，收集鳍样本。
注：每条鱼必须使用单独的非回收吸收毛巾。本研究所使用的物种的描述性统计数字如下：贝卢加鱼（H.Huso）：年龄=18~2.1个月，体重=2，700~300克，体长=55~5厘米;西伯利亚鱼 （A. baerii）： 年龄 = 9.6 × 2.4 个月， 体重 = 1，750 × 250 g， 体长 = 45 × 5 厘米;塞夫鲁加鱼（A. 斯特拉图斯）：年龄 = 14 × 1.3 个月， 体重 = 1，000 × 100 g， 体长 = 65 × 5 厘米.
2. 皮质醇提取的翅片制备
- 将翅片样品（每组织一个样品：±3克）放在实验室称重纸上（107毫米×210毫米），在室温下干燥几天，直到干燥。
- 将样品包裹在铝箔片中，放入贴有标签的塑料袋中，然后转移到实验室。
- 将样品存放在冰箱中供进一步使用，包括洗涤、皮质醇提取、干燥和 ELISA 分析（图 2）。
3. 鳍皮质醇分析
- 校准数字分析刻度（精度：0.0001），用秤盘上的称重纸称量 300 × 10 mg 样品。
- 清洗样品。
- 将每个样品转移到15L锥形聚丙烯管中。使用 5，000 μL 单通道移液器将 3 mL 异丙醇添加到每个管中。
- 以 80 rpm 转速旋转管 2.5 分钟，以洗掉皮质醇并清除任何潜在的外部污染。重复此过程两次。
- 在室温（22-28°C）下对洗涤样品进行7天的空气干燥。
- 使用超纯水作为洗涤剂重复清洗过程。
- 使用切骨钳从身体组织中提取下颌骨。将步骤 1.5-3.2.4 应用于颌骨样本。
- 称量（75 × 5 mg）干鳍或下颌骨样品，并在50 Hz下用珠打手研磨32分钟。
- 使用 1000 μL 移液器将 1.5 mL 的甲醇输送到每个含有粉状鳍或下颌骨的管中。在室温下，将样品以慢速旋转（40 rpm）18小时置于管旋转器上，以连续混合提取皮质醇。
- 提取皮质醇后，在室温下以9，500 x g将样品离心10分钟。离心后，从每个样品中收集含有皮质醇（1 mL）的顶层有机层，并将其放入单独的1.5 mL微离心管中。
- 在38°C孵育下干燥样品，蒸发甲醇。将提取的皮质醇样品放在烟气罩下过夜，以便甲醇消散。
注： 含皮质醇的图层通常呈黄色。
- 在38°C孵育下干燥样品，蒸发甲醇。将提取的皮质醇样品放在烟气罩下过夜，以便甲醇消散。
4. 鳍皮质醇检测
- 在使用 ELISA 试剂盒之前，在室温下将干燥的鳍或颌骨样品解冻 1.5 小时。
- 在1，500 x g下加入400 μL的磷酸盐缓冲液、涡流和离心机，15分钟。
- 重复运行每个样品（25 μL），以提高测定精度和可靠性。删除标准曲线外的任何数据作为异常值。
- 将微孔板读取器设置为 450 nm，然后设置为 μg dL-1并读取板的光学密度。
- 使用具有四参数非线性回归曲线拟合的微板软件。使用以下公式将从软件获得的样本的皮质醇水平转换为 pg mg-1：
F = 10，000E （A/B） （C/D），
其中 F = 鳍皮质醇水平的最终值（pg mg-1），E= 用于重组干提取物的测定缓冲液的体积 （mL），A = 测定输出提供的浓度 （μg dL-1），B= 受额外约束的翅片的重量 （mg）c = 添加到粉状翅片中的甲醇体积（mL），D = 从提取物中回收并随后干涸的甲醇体积（mL）3 。
- 使用具有四参数非线性回归曲线拟合的微板软件。使用以下公式将从软件获得的样本的皮质醇水平转换为 pg mg-1：
5.统计分析
- 在洗涤过程之前将每个样本分成两个子样本，然后在 ELISA 试剂盒测定期间重复运行（每个样本 2 + 2 + 4 次观察），以提高测试的功率和结果的可靠性。
- 通过在SAS软件环境中将一般线性模型（GLM）过程应用于测量数据18，比较两种洗涤溶剂的影响及其相互作用。
- 在 p < 0.05 的显著性级别使用 Tukey 测试的表示数之间的测试差异。接受 0.05 < p < 0.10 作为趋势的证据，而不是显著差异。
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Representative Results
在这项研究中，使用三种鱼种开发并确认了鱼翅皮质醇提取技术。比较了使用超纯水和异丙醇作为洗涤溶剂获得的皮质醇水平（图2）。检查了来自H.胡索颌骨的皮质醇，以确定下颌骨是否可被用作鳍的备用基质。洗涤溶剂、鱼种及其相互作用的影响在表1中所示。使用异丙醇洗涤的鳍样本中的皮质醇水平往往高于用水洗的鳍样本（p = 0.089）。鱼种的鳍皮质醇水平（p = 0.525）无显著差异。洗涤溶剂与鱼种之间没有显著的相互作用（p = 0.947）。洗涤溶剂对H.huso鱼的皮质醇水平没有显著影响（p = 0.45）（表2）。内测定和间测定变异系数分别为14.15和7.70。数据显示，三种鱼翅（表1）和H.胡索颌骨（表2）的鳍高度相似。我们没有研究颌骨中的皮质醇水平与不同鱼种鳍的皮质醇水平之间的相关性，因为我们只从H.huso获得颌骨样本。这些关系应该在今后的研究中加以探讨。
图 1.（A）胡索胡索鱼（10岁）的照片。（B） 鱼的形态特征.请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.鳍皮质醇分析信息图5，6在实验室进行。信息图摘要中提供的所有照片都是在实验室拍摄的。请点击此处查看此图的较大版本。
| 鱼种 （SS） | 洗涤溶剂 （WS） | P 值 | ||||||||
| 胡索·胡索 | 阿西彭塞·贝尔里 | 阿奇彭斯·斯特拉图斯 | Sem | 水 | 异 丙 醇 | Sem | SS | Ws | SS_WS | |
| 皮质醇 （pg 毫克-1） | ||||||||||
| 3.46 | 2.85 | 3.34 | 0.41 | 2.86 | 3.69 | 0.33 | 0.52 | 0.08 | 0.95 | |
表1.使用两种不同的洗涤溶剂获得的三种鱼种的鳍皮质醇水平。
| 洗涤溶剂 （WS） | Sem | P 值 | ||
| 水 | 异 丙 醇 | |||
| 皮质醇 （pg 毫克-1） | 1.11 | 1.43 | 0.31 | 0.45 |
表2.使用两种不同的洗涤溶剂在贝卢加鱼（胡索胡索）中黄骨皮质醇水平。
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Discussion
鱼儿有时被称为"活化石"，因为它在过去几千年里很少表现出适应。鱼子酱属含有27种鱼子酱;然而，三个物种（贝卢加、贝里和塞夫鲁加）生产了全球大部分鱼子酱。鱼种容易受到过度捕捞和自然栖息地的干扰，因此比其他任何物种群体都更加濒危。鱼是现存最古老的脊椎动物，已有1.5亿年的历史。物种成熟，生长缓慢;一些（例如，H.huso）可以活100年，体重超过2000公斤。鱼是无鳞片的软骨鱼，其特征是位于嘴前五排大骨板，称为"刺"和触觉的刺（图1）。这些鱼种与其他鱼类之间的生理差异包括血浆（皮质类固醇）对环境压力的反应减少。我们的鳍皮质醇测量提供了证据，证明鱼尾骨积累皮质醇的比例与循环浓度成比例。
鱼对物理、化学和感知压力器表现出许多反应。这些反应是众所周知的自适应机制，使鱼能够应对环境扰动，并保持静息状态。如果压力器足够长或严重，以因而鱼无法恢复平衡，使用其自然反应，则鱼可能遭受不利影响，危及其整体健康和/或生命19。鱼群的性别可以从大约2岁开始确定。因此，要确定皮质醇水平与鱼尾性是否相关，有必要记录鱼鳍和颌骨中长期皮质醇积累（作为一种新的方法和替代矩阵）。这项研究是第一个报告鳍和下颌骨皮质醇水平在鱼苗。
皮质醇洗涤溶剂的作用是从皮肤粘液9中去除外部皮质醇来源。Aerts等人14使用蒸馏水去除鱼皮的外皮质醇污染;在以前的研究中，我们比较了使用异丙醇和水作为溶剂来检查头发皮质醇含量的效果。由于鱼卵13、皮肤15、鳍和下颌骨的特性不同，洗涤溶剂的作用在样品之间可能有所不同。Brossa7报告说，当异丙醇用作溶剂时，金鱼（Carassius auratus）的皮质醇水平保持不变，而使用水时皮质醇水平则有所不同。结果表明，洗涤溶剂对下颌皮质醇水平无影响。这些研究之间的差异包括：清理次数、晃动与涡旋数、异丙醇纯度，以及重要的是，鳞片/皮肤对外部液体渗透的敏感性或抵抗力。Ghassemi Nejad等人20日证明，使用RIA和ELISA等不同病因会导致产量差异。类固醇在低分子质量的醇（如甲醇）中比分子量较高的醇（如异丙醇4）更可溶性。甲醇萃取通过打破非共价键使蛋白质变性，从而允许头发皮质醇释放。甲醇还通过破坏非共价键来改变激素结构，导致组织释放皮质醇。为了在甲醇提取之前有效地使鱼翅和颌骨均匀化，可以使用珠打手有效地分解组织结构。此过程需要时间来完全研磨鳍和颌骨样本;因此，在皮质醇提取之前，必须重复该过程以确保完全粉碎和均质化。慢旋转 18 小时允许通过洗涤逐渐去除皮质醇。
正如先前对哺乳动物毛发4、5、6的研究所建议，除血液外，鳍和下颚皮质醇含量的外源或内部来源不应被忽视。虽然这项研究不是专门用来研究皮质醇如何从血液扩散到鳍或下颚，但它强调需要扩大我们对这个过程的了解，以便更好地解释这些基质中皮质醇的波动。鳍和下颌骨的特性与鳞片和皮肤的特性不同。Bussy等人17日量化了湖中鱼卵皮质醇水平，以调查环境对母体生理条件和卵子质量的影响。他们使用甲基乙酸乙酯（MTBE）、乙酸乙酯（AcOEt）MTBE和二乙醚（Et2O）作为洗涤溶剂，并得出结论，乙酸乙酯是回收和基质效应方面最好的萃取溶剂。在本研究中，异丙醇在洗涤过程中从皮肤粘液中去除更多的外部皮质醇，导致对鱼翅皮质醇的轻微高估，在解释提取结果时必须仔细考虑。有可能异丙醇能够洗掉鳍的皮肤，正如先前研究7中所报道的。异丙醇已知可穿透毛囊和鱼鳞4，7。本研究结果表明，溶剂的选择对皮质醇水平没有显著影响，这表明皮质醇在鳍的某些部分比使用超纯水的某些部分更难;在这种情况下，异丙醇可用作替代。
这项研究证明了下颌骨作为可靠指示鱼群压力的新矩阵的适用性。H. 胡索颌骨皮质醇值与从同一物种的鳍中提取的值相似;未来的研究应该通过相关性分析来证实不同物种、年龄和性别的结果。由于鱼的成本高昂，目前研究中使用的鱼数量很少;我们试图克服这一限制，测试每个样品两次，并复制甲醇提取ELISA。使用四倍乘法可以增加测试的功率，以覆盖数量少的样本。
我们得出结论，洗涤溶剂的类型适度影响皮质醇从鳍，但不是下颚，鱼翅提取。在总结本研究的结论并验证这些结果之前，应采用不同的物种和溶剂进行进一步研究。目前的研究提供了证据，证明鱼尾骨可以作为替代矩阵应用于未来的研究使用皮质醇作为压力指数在鱼。本研究还论证了ELISA对鳍和颌骨皮质醇测量的适用性。未来的研究应侧重于两个方面：1） 确定颌骨中的皮质醇水平与鱼翅中的皮质醇水平之间的相关性;2） 从老鱼和鱼子酱中采集皮质醇的采集基质样本，以确定长期压力不同鱼种的寿命水平。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
这项工作是在农业科学和技术发展合作研究方案的支持下进行的（项目标题：牲畜生产力变化与气候变化分析，项目No.PJ012771），农村发展管理局，大韩民国。此外，这项研究也得到了赠款的支持（第1号。PJ01344604）来自韩国首尔国立动物科学研究所动物营养与生理学团队。作者感激地感谢波斯手势首席执行官穆罕默德·哈桑·萨勒曼扎德和他的团队，他们提供了在这项研究中所检查的三种鱼种的鱼。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
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