Summary
I denne studien presenterer vi en protokoll for kortisol ekstraksjon fra fin og kjevebenet av Sturgeon arter. Fin og kjevebenet kortisol nivåer ble ytterligere undersøkt ved å sammenligne to vaske løsemidler etterfulgt av ELISA analyser. Denne studien testet muligheten for kjevebenet kortisol som en roman stress indikator.
Abstract
Målet med denne studien var å utvikle en teknikk for utvinning av kortisol fra Sturgeon finnene ved hjelp av to vaske løsemidler (vann og isopropanol) og kvantifisere eventuelle forskjeller i fin kortisol nivåer blant tre viktigste Sturgeon arter. Finnene ble høstet fra 19 ofret sturgeons inkludert syv Beluga (Huso Huso), syv Siberian (Acipenser baerii), og fem sevruga (A. stellatus). Sturgeons ble reist i iranske gårder i 2 år (2017-2018), og kortisol utvinning analysen ble gjennomført i Sør-Korea (januar-februar 2019). Jawbones fra fem H. huso ble også brukt for kortisol ekstraksjon. Data ble analysert ved hjelp av den generelle lineære modellen (GLM) prosedyren i SAS-miljøet. Den intra-og inter-analysen koeffisienter av variasjon var 14,15 og 7,70, henholdsvis. Kort, den kortisol utvinning teknikken involvert vaske prøvene (300 ± 10 mg) med 3 mL oppløsningsvæske (ultrarent vann og isopropanol) to ganger, rotasjon ved 80 RPM for 2,5 min, luft-tørking av vasket prøvene ved romtemperatur (22-28 ° c) i 7 dager, ytterligere tørking prøvene ved hjelp av en perle visp på 50 Hz for 32 min og sliping dem til pulver, bruke 1,5 mL metanol til tørket pulver (75 ± 5 mg), og langsom rotasjon (40 RPM) for 18 timer ved romtemperatur med kontinuerlig miksing. Etter ekstraksjon ble prøvene sentrifugert (9 500 x g i 10 min), og 1 ml supernatanten ble overført til et nytt mikrosentrifugen rør (1,5 ml), inkubert ved 38 ° c for å fordampe metanol, og analyseres via enzym koblet immunosorbentanalyse-analyse (Elisa) . Ingen forskjeller ble observert i fin kortisol nivåer blant arter eller i fin og kjevebenet kortisol nivåer mellom vasking løsemidler. Resultatene av denne studien viser at Sturgeon kjevebenet matrise er et lovende alternativ stress indikator til solid matriser.
Introduction
Kortisol er en pålitelig indikator på animalsk stress. Kortisol ekstraksjon gir et gyldig rammeverk for forskere å overvåke stress nivåer og generelle mønstre i stress. For eksempel tidligere studier har gjennomført metodisk validering av hår kortisol målinger ved hjelp av ulike metoder i mennesker1,2, aper3,4, storfe5, sau6, og gullfisk7,8. Inne fisken Art, kortisol mål inne matriser som skalaer, hud mucus, feces, og blod9 ha blitt vist å skaffe beskjed opp på fisken sunnhet. Når blodprøve er problematisk eller skalaer mangler, alternative matriser for kortisol utvinning er nødvendig. Inne fisken, alternativ matriser kanne inkludere det kjevebenet, en hard tissue analog med mennesket tann10.
Utviklingen av nye matriser og validerte teknikker for å bestemme fiske stress nivåer er av spesiell interesse for kaviar industrien, der Sturgeon kan oppleve langvarig eksponering for miljømessige stressfaktorer11. Sturgeon kan ikke fastslås før 2 års alder, og Sturgeon har ikke vekter. Fordi kortisol gradvis akkumuleres i solide matriser under veksten fase2,7,12, langsiktige kortisol akkumulering data fra hard matriser som fins og jawbones kunne gi innsikt i stress nivåer på ulike vekst stadier. I kontrast gir blod kortisol nivåer et øyeblikksbilde av stress nivåer på tidspunktet for dødsfallet, og kan ikke nøyaktig representere stress under langsiktige oppdrett forhold13,14. Med økende konkurranse i kaviar markedet, nye tilnærminger for å bedre stress forhold for produksjon av sunnere egg blant Sturgeon arter under lang tids oppdragelse (8-12 år eller lenger) er et stadig viktigere forskningsområde. På grunn av de høye kostnadene ved Sturgeon, høstes prøvene er svært kostbare ($ 8000-15000 per moden fisk avhengig av arter og vekst scenen), en begrensende faktor for forskningsprosjekter. Men utviklingen av en hensiktsmessig teknikk for kortisol ekstraksjon fra Sturgeon finnene og jawbones kunne nyttig anvendes både til fiskeoppdrett systemer og i vill fisk å forbedre kvaliteten og innhøstingen av Sturgeon egg for både forbruk og Bevaring.
I tillegg til å gi pålitelige resultater6, valg av en hensiktsmessig kortisol utvinning teknikken er av avgjørende betydning for å sikre at andre forbindelser til stede i matrisen under prøveforberedelse ikke forvirre utdataene, som kan føre til inkonsekvente resultater. Det er like viktig å avgjøre om fin og kjevebenet kortisol nivåer er påvirket av hormonnivået i det omkringliggende vannet. Heimbürge et al.15 foreslo at en rekke faktorer kan påvirke kortisol nivåer inkludert alder, kjønn, graviditet, årstid, farge12, og kroppen regionen som kortisol er hentet16. Men lite informasjon er tilgjengelig på virkningene av vaske løsemidler på kortisol utvinning i fisk kroppen matriser8, og ingen på disse effektene i Sturgeon, med unntak for Sturgeon egg17.
Til tross for analyserer grunnlinjen kortisol høyder fra det fins og jawbones av Sturgeon behøver det fisken være euthanized, denne adgang er ikke medfører det invasjonen teknikker krevde for blod prøving inne bo Sturgeon. Fin og kjevebenet prøver er lett samles, og ekstraksjon fra disse vev kan utføres raskt. Tilsvarende, hormon utvinning og analyse er grei og krever lite spesialisert utstyr.
I denne studien presenterer vi en ny og lett anvendt teknikk for ekstraksjon, vasking og bestemmelse av kortisol fra fisk finnene og jawbones, med sikte på å avgjøre om kortisol nivåer målt fra disse matriser kan være pålitelig brukes som stress Indikatorer. Fordelene med denne teknikken inkluderer en enkel og ikke-invasiv8 tilnærming, mindre datavariasjon, og pålitelig utgang1,6,8,17; teknikken gjelder fiskearter uten vekter som Sturgeon. Teknikken krever slakting av fisk, valg av egnede vaske løsemidler2,4, riktig sliping av prøver3,5, profesjonell enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (Elisa) søknad5,7, og omfattende kunnskap om inkorporering av kortisol kilder i solid matriser6.
Vi brukte to forskjellige vaske løsemidler (ultrarent vann og isopropanol) for å oppnå basal kortisol nivåer i finnene fra tre Sturgeon arter: Beluga (Huso Huso), Siberian (Acipenser baerii), og sevruga (A. stellatus ), under standardmiljø forhold for hver art. Jawbones av H. huso ble også brukt til å evaluere stress i Sturgeon. Dette er den første studien til å måle kortisol nivåer i Sturgeon jawbones. Resultatene av denne studien vil gi komparative kortisol data for Sturgeon arter i tidlig vekst stadium (~ 1 år) før sex besluttsomhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende eksperimentelle prosedyrer og metoder ble godkjent av dyrevelferd og etikk Authority of Kangwon National University, Chuncheon, Republikken Korea.
1. fin samling
- Fang Sturgeon forsiktig med et nett for å minimere skader og stress.
- Skyll fisken forsiktig med friskt vann og tørk deretter kroppsoverflaten med et absorberende håndkle før dødshjelp.
- Hit hodet av fisken ved hjelp av en plasthammer slik at fisken er stunned eller mister bevisstheten. Fjern hodet med en kniv.
- Mål kroppsvekten (g) og lengden (cm).
- Etter dødshjelp, samle fin prøver ved å kutte så nær som kroppen som mulig ved hjelp sterilisert kirurgisk saks.
Merk: individuelle, ikke-resirkulert absorberende håndklær må brukes for hver fisk. Beskrivende statistikk for artene som brukes i denne studien var som følger: Beluga Sturgeon (H. huso): alder = 18 ± 2,1 måneder, kroppsvekt = 2 700 ± 300 g, og kroppens lengde = 55 ± 5 cm; Siberian Sturgeon (A. baerii): alder = 9,6 ± 2,4 måneder, kroppsvekt = 1 750 ± 250 g, og kroppen lengde = 45 ± 5 cm; sevruga Sturgeon (A. stellatus): Alder = 14 ± 1,3 måneder, kroppsvekt = 1 000 ± 100 g og kroppslengde = 65 ± 5 cm.
2. fin forberedelse for kortisol ekstraksjon
- Plasser fin prøvene (ett utvalg per vev: ~ 3 g) på laboratorie veie papir (107 mm × 210 mm) og tørk ved romtemperatur i noen dager til det er tørt.
- Pakk prøver i ark med aluminiumsfolie, plass i merket plastposer, og overføre til laboratoriet.
- Oppbevar prøver i et kjøleskap for videre bruk, inkludert vasking, kortisol ekstraksjon, tørking og ELISA-analyse (figur 2).
3. fin kortisol analyse
- Kalibrer den digitale analytiske skalaen (nøyaktighet: 0,0001) og veie ut 300 ± 10 mg prøver med veie papir på vekt pannen.
- Vask prøvene.
- Overfør hver prøve til en 15 L konisk polypropylen tube. Tilsett 3 mL isopropanol til hvert rør ved hjelp av en 5 000 μL enkeltkanals pipette.
- Roter rørene på 80 RPM for 2,5 min å vaske ut kortisol og fjerne eventuelle eksterne forurensning. Gjenta denne fremgangsmåten to ganger.
- Lufttørke de vasket prøvene ved romtemperatur (22-28 ° c) i 7 dager.
- Gjenta vaskeprosedyren med ultrarent vann som vaske middel.
- Pakk ut kjevebenet fra kroppen vev ved hjelp av bein-skjæring tang. Bruk trinn 1,5-3.2.4 på kjevebenet prøvene.
- Veie ut (75 ± 5 mg) tørket fin eller kjevebenet prøver og grind ved hjelp av en perle visp på 50 Hz for 32 min.
- Lever 1,5 mL av metanol i hvert rør som inneholder pulverisert fin eller kjevebenet med en 1000 μL pipette. Plasser prøvene på en tube Rotator ved langsom rotasjon (40 RPM) for 18 timer ved romtemperatur å trekke ut kortisol med kontinuerlig miksing.
- Etter kortisol ekstraksjon, sentrifuger prøvene ved 9 500 x g i 10 min ved romtemperatur. Etter sentrifugering, samle den øverste organiske laget som inneholder kortisol (1 mL) fra hver prøve og plassere den i en egen 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
- Tørk av prøvene ved å inkubasjons ved 38 ° c for å fordampe metanol. Hold utvunnet kortisol prøvene under en avtrekks hette over natten for å tillate metanol å forsvinne.
Merk: det kortisol-inneholdende laget er vanligvis gulaktig i farge.
- Tørk av prøvene ved å inkubasjons ved 38 ° c for å fordampe metanol. Hold utvunnet kortisol prøvene under en avtrekks hette over natten for å tillate metanol å forsvinne.
4. fin kortisol deteksjon
- Tin de tørkede fin-eller kjevebenet prøvene ved romtemperatur for 1,5 h før du bruker ELISA-settet.
- Tilsett 400 μL av fosfat buffer, Vortex og sentrifuge ved 1 500 x g i 15 min.
- Kjør hvert utvalg (25 μL) i duplikat for å forbedre analysen nøyaktighet og pålitelighet. Fjern eventuelle data utenfor standardkurven som outliers.
- Sett en mikroplate leser til 450 nm, deretter satt til μg dL-1 og lese den optiske tettheten av platen.
- Bruk mikroplate programvare med en fire-parameter ikke-lineær regresjon kurve passer. Konverter kortisol nivåer av prøvene innhentet fra programvaren i PG mg-1 ved hjelp av følgende ligning:
F = 10, 000E (A/B) (C/D),
der F = den endelige verdien av fin kortisol nivå i (PG mg-1), E = volumet (ml) av analysen buffer som brukes til å Rekonstituer tørket ekstrakt, A = konsentrasjonen (μg DL-1) levert av analysen utgang, B = vekten (mg) av fin utsatt for ekstra ilkobling, C = volumet (mL) av metanol lagt til pulverisert fin, og D = volumet (mL) av metanol utvinnes fra ekstrakt og deretter tørket ned3.
- Bruk mikroplate programvare med en fire-parameter ikke-lineær regresjon kurve passer. Konverter kortisol nivåer av prøvene innhentet fra programvaren i PG mg-1 ved hjelp av følgende ligning:
5. statistisk analyse
- Del hver prøve i to sub-prøver før vask prosedyren og deretter kjøre i duplikat under ELISA Kit analysen (2 × 2 = 4 observasjoner per prøve) for å forbedre kraften i test og påliteligheten av resultatene.
- Sammenlign effektene av de to vaske løsemidler og deres interaksjoner ved å bruke prosedyren for generell lineær modell (GLM) i SAS-miljøet til målings dataene18.
- Test forskjellene mellom midler ved hjelp av Tukey ' s test på en betydning nivå av p < 0,05. Godta 0,05 < p < 0,10 som bevis på en tendens snarere enn som en betydelig forskjell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterte fin kortisol utvinning teknikken ble utviklet og bekreftet i denne studien ved hjelp av tre Sturgeon arter. Kortisol nivåer innhentet ved hjelp av ultrarent vann og isopropanol som vaske løsemidler ble sammenlignet (figur 2). Kortisol fra H. huso jawbones ble undersøkt for å avgjøre om Sturgeon jawbones kan brukes som en alternativ matrise til finnene. Effekten av vaske løsemiddel, Sturgeon arter, og deres interaksjon er vist i tabell 1. Kortisol nivåer tendens til å være høyere i fin prøver vasket med isopropanol enn i de vasket med vann (p = 0,089). Det var ingen vesentlige forskjeller i fin kortisol nivåer (p = 0,525) blant Sturgeon arter. Det var ingen signifikant interaksjon mellom vasking løsemidler og Sturgeon arter (p = 0,947). Vaske løsemiddel hadde ingen signifikant effekt på kortisol nivået i H. huso Sturgeon (p = 0,45) (tabell 2). Intra-analyse og inter-analysen koeffisienter av variasjon var 14,15 og 7,70, henholdsvis. Dataene viste høy likhet blant finnene av de tre Sturgeon artene (tabell 1) og i H. Huso jawbones (tabell 2). Vi har ikke undersøkt sammenhenger mellom kortisol nivåer i jawbones og de i finnene av ulike Sturgeon arter fordi vi innhentet kjevebenet prøver bare fra H. huso. Disse forholdene bør utforskes i en fremtidig studie.
Figur 1. (A) fotografi av Huso Huso Sturgeon (10 år gammel). (B) morfologiske karakteristikker av Sturgeon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Infografikk av fin kortisol analyse5,6 utført i laboratoriet. Alle bildene som ble presentert i sammendraget av Infografikk ble tatt i laboratoriet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sturgeon arter (SS) | Løsemiddel til vasking (WS) | P-verdi | ||||||||
| Huso Huso | Acipenser baerii | Acipenser stellatus | Sem | Vann | Isopropanol | Sem | Ss | Ws | SS × WS | |
| Kortisol (PG mg-1) | ||||||||||
| 3,46 | 2,85 | 3,34 | 0,41 | 2,86 | 3,69 | 0,33 | 0,52 | 0,08 | 0,95 | |
Tabell 1. Fin kortisol nivåer i tre Sturgeon arter oppnås ved hjelp av to forskjellige vaske løsemidler.
| Løsemiddel til vasking (WS) | Sem | P-verdi | ||
| Vann | Isopropanol | |||
| Kortisol (PG mg-1) | 1,11 | 1,43 | 0,31 | 0,45 |
Tabell 2. Kjevebenet kortisol nivåer i Beluga Sturgeon (Huso Huso) ved bruk av to forskjellige vaske løsemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sturgeon kalles noen ganger en "levende fossil" fordi den har stilt noen tilpasninger gjennom tidligere årtusener. Den Sturgeon slekten Acipenser inneholder 27 arter som produserer kaviar; men tre arter (Beluga, baerii og sevruga) produserer det meste av den globale kaviar forsyningen. Sturgeon er sårbare for over-fiske og interferens i deres naturlige habitat og er derfor mer kritisk truet enn noen annen gruppe av arter. Sturgeon tilhører den eldste gruppen av levende virveldyr, som har eksistert i 150 000 000 år. Acipenser arter modnes og vokse langsomt; noen (f. eks H. huso) kan leve i 100 år og overstige 2 000 kg i vekt. Sturgeon er cartilaginous fisk uten skalaer, og er preget av fem rader av store, bein plater kalt scabs og taktile barbels plassert på forsiden av munnen (figur 1). Fysiologiske forskjeller mellom disse artene og annen fisk omfatter redusert plasma respons (kortikosteroider) mot miljømessige stressfaktorer. Våre fin kortisol målinger gir bevis for at Sturgeon kjevebenet akkumulerer kortisol i forhold til sirkulerende konsentrasjoner.
Fisk viser mange reaksjoner på fysiske, kjemiske og oppfattet stressfaktorer. Disse reaksjonene er godt kjent som adaptive mekanismer som gjør at fisken til å takle miljømessige forstyrrelser og opprettholde en homøostatisk tilstand. Hvis en stressor er tilstrekkelig langvarig eller alvorlig at fisken ikke er i stand til å gjenvinne homeostase ved hjelp av sine naturlige reaksjoner, da fisken kan oppleve bivirkninger, truer sin generelle helse og/eller livet19. Sex av Sturgeon kan fastsettes fra rundt 2 år. Derfor, for å avgjøre om kortisol nivåer og Sturgeon sex er korrelert, er det nødvendig å dokumentere langsiktige kortisol akkumulering i finnene og jawbones (som en ny tilnærming og alternativ matrise) av Sturgeon. Denne studien er den første til å rapportere fin og kjevebenet kortisol nivåer i Sturgeon.
Rollen til en kortisol vaske løsemiddel er å fjerne eksterne kortisol kilder fra huden mucus9. Aerts et al.14 brukt destillert vann for å fjerne ekstern kortisol forurensning fra fiske hud; i tidligere studier2,5,12,17, sammenlignet vi effekten av å bruke isopropanol og vann som et løsemiddel til å undersøke håret kortisol innhold. Effekten av vask løsemiddel kan variere blant prøvene på grunn av forskjeller i egenskapene til Sturgeon egg13, Skin15, finnene, og jawbones. Brossa7 rapporterte at kortisol nivå i skalaer av gullfisk (Carassius auratus) forble konstant når isopropanol ble brukt som løsningsmiddel uavhengig av antall vasker, mens kortisol nivåer varierte når vannet ble brukt. Våre resultater viste at vaske MIDlet ikke hadde noen effekt på kortisol nivåer i kjeven. Forskjellene mellom disse studiene er antall vasker, risting kontra virvlingen, isopropanol renhet, og viktigst, følsomhet eller motstand av skalaer/hud til ekstern væske inntrengning. Ghassemi Nejad et al.20 demonstrerte at anvendelsen av ulike analyser som RIA og Elisa kan føre til forskjeller i produksjonen. Steroider er mer løselig i lavere molekylær masse alkoholer (f. eks metanol) enn i alkoholer av høyere molekylvekt som isopropanol4. Metanol ekstraksjon denatures protein ved å bryte ikke-kovalente obligasjoner, og dermed gir håret kortisol utgivelse. Metanol også modifiserer hormon strukturen ved å bryte ikke-kovalente obligasjoner, noe som resulterer i utgivelsen av kortisol fra vev. For å effektivt homogenisere Sturgeon finner og jawbones før metanol ekstraksjon, kan en perle visp brukes til å effektivt bryte ned vevet struktur. Denne prosedyren krever tid til å fullstendig slipe fin og kjevebenet prøver; Derfor må prosessen gjentas for å sikre fullstendig pulverisering og homogenisering før kortisol utvinning. Langsom rotasjon for 18 h tillater gradvis fjerning av kortisol ved vasking.
Som foreslått i tidligere studier av pattedyr hår4,5,6, eksterne eller interne kilder av kortisol innhold i finnene og kjever, annet enn blod, bør ikke bli neglisjert. Selv om denne studien ikke var spesielt designet for å undersøke hvordan kortisol diffunderer fra blod til finnene eller kjever, fremhever det behovet for å utvide vår kunnskap om denne prosessen for å bedre tolke svingninger i kortisol fra disse matriser. Egenskapene til finnene og jawbones skiller seg fra skalaer og hud. Bussy et al.17 kvantifisert kortisol nivåer i innsjøen Sturgeon (A. fulvescens) egg for å undersøke miljømessige effekter på mors fysiologiske tilstand og egg kvalitet. De brukte methyl tert-butylether (MTBE), etanol acetate (AcOEt) MTBE, og dietyl Eter (et2O) som vasking løsemidler og konkluderte med at etanol acetate var den beste utvinning løsemiddel i form av utvinning og matrise effekt. I denne studien, isopropanol fjernet større mengder av eksterne kortisol fra huden mucus under vasking, fører til en liten overvurdering av kortisol fra Sturgeon finnene, som må vurderes nøye når tolke utvinnings resultater. Det er mulig at isopropanol var i stand til å vaske ut huden på fin, som har vært rapportert i en tidligere studie7. Isopropanol er kjent for å trenge gjennom hårsekkene og fiske vekter4,7. Resultatene av denne studien tyder på at valg av løsemiddel ikke hadde signifikant effekt på kortisol nivåer, noe som tyder på at kortisol ekstraksjon kan være vanskeligere i enkelte deler av fin enn i andre som bruker ultrarent vann; i slike tilfeller kan isopropanol brukes som et alternativ.
Denne studien demonstrerte anvendelsen av kjevebenet som en roman matrise for pålitelig indikasjon på stress i Sturgeon. H. huso kjevebenet kortisol verdier var lik de Hentet fra finnene av samme art; fremtidige studier bør bekrefte dette resultatet blant ulike arter, aldre og kjønn via korrelasjon analyse. Et lavt antall fisk ble brukt i dagens studie på grunn av de høye kostnadene ved Sturgeon; vi forsøkte å overvinne denne begrensningen ved å teste hver prøve to ganger og også duplisere metanol ekstraksjon for ELISA. Bruke Quadruple multiplikasjon kan øke kraften i testen for å dekke lavt antall prøver.
Vi konkluderer med at den type vask løsemiddel moderat påvirket kortisol ekstraksjon fra finnene, men ikke kjever, av Sturgeon. Før generalisere av denne studien og for å validere disse resultatene, bør videre forskning med ulike arter og løsemidler gjennomføres. Den nåværende arbeid gir bevis for at Sturgeon kjevebenet kan anvendes som en alternativ matrise i fremtidige studier ved hjelp av kortisol som en indeks av stress i Sturgeon. Egnetheten av ELISA for fin og kjevebenet kortisol måling ble også demonstrert i den foreliggende studien. Fremtidig forskning bør fokusere på to aspekter: 1) bestemme sammenhengen mellom kortisol nivåer i jawbones og de i finnene av Sturgeon og 2) høsting matrise prøver for kortisol måling fra eldre fisk og deres kaviar å bestemme langsiktige stress nivåer i ulike Sturgeon arter over levetiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble gjennomført med støtte fra Cooperative Research program for landbruk Science & Technology Development (prosjekttittel: husdyr produktivitet endring analyse med klimaendringer, Project nr. PJ012771), Rural Development Administration, Republikken Korea. I tillegg ble denne studien støttet av et stipend (nr. PJ01344604) fra Animal Nutrition & fysiologi team, National Institute of Animal Science, RDA, Seoul, Republikken Korea. Forfatterne takknemlig erkjenner persisk gest CEO Mohammad Hassan Salmanzadeh og hans team, som ga fisk fra de tre Sturgeon arter undersøkt i denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
