Summary
Neste estudo, apresentamos um protocolo de extração de cortisol da barbatana e mandíbula de espécies de esturjão. Os níveis do cortisol da aleta e do Jawbone foram examinados mais adicional comparando dois solventes de lavagem seguidos por ensaios de ELISA. Este estudo pilotou a viabilidade do cortisol do Jawbone como um indicador novo do esforço.
Abstract
Os objetivos deste estudo foram desenvolver uma técnica para a extração de cortisol a partir de barbatanas de esturjão utilizando dois solventes de lavagem (água e isopropanol) e quantificar quaisquer diferenças nos níveis de cortisol Fin entre três espécies principais de esturjão. As barbatanas foram colhidas de 19 esturjão sacrificados, incluindo sete beluga (Huso Huso), sete siberianos (Acipenser baerii), e cinco Sevruga (A. stellatus). Os esturjão foram levantados em fazendas iranianas por 2 anos (2017-2018), e a análise da extração do cortisol foi conduzida em Coreia sul (janeiro-fevereiro 2019). Os Jawbones de cinco H. Huso foram usados igualmente para a extração do cortisol. Os dados foram analisados utilizando-se o procedimento de modelo linear geral (GLM) no ambiente SAS. Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio foram de 14,15 e 7,70, respectivamente. Resumidamente, a técnica de extração de cortisol envolveu a lavagem das amostras (300 ± 10 mg) com 3 mL de solvente (água ultrapura e isopropanol) duas vezes, rotação a 80 rpm por 2,5 min, secagem de ar as amostras lavadas à temperatura ambiente (22-28 ° c) por 7 dias, secagem adicional as amostras usando um batedor de talão em 50 Hz para 32 min e moagem-los em pó, aplicando 1,5 mL de metanol para o pó seco (75 ± 5 mg), e rotação lenta (40 rpm) para 18 h em temperatura ambiente com mistura contínua. Após a extração, as amostras foram centrifugadas (9.500 x g por 10 min), e 1 ml de sobrenadante foi transferido para um novo tubo de microcentrífuga (1,5 ml), incubados a 38 ° c para evaporar o metanol e analisados via ensaio IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) . Não foram observadas diferenças nos níveis de cortisol Fin entre as espécies ou nos níveis de cortisol de barbatana e mandíbula entre solventes de lavagem. Os resultados deste estudo demonstram que a matriz do Jawbone do esturjão é um indicador alternativo prometedor do esforço às matrizes contínuas.
Introduction
O cortisol é um indicador fiável do stress animal. Extração de cortisol fornece um quadro válido para os pesquisadores para monitorar os níveis de estresse e padrões gerais em estressores. Por exemplo, estudos prévios realizaram validação metodológica de medições de cortisol capilar utilizando vários métodos em humanos1,2, macacos3,4, bovinos5, ovinos6e Goldfish7,8. Em espécies de peixes, as medições de cortisol em matrizes como escalas, muco cutâneo, fezes e sangue9 foram mostradas para fornecer informações sobre a saúde dos peixes. Quando a amostragem de sangue é problemática ou as escalas faltam, matrizes alternativas para a extração do cortisol são necessários. Em peixes, matrizes alternativas podem incluir o osso maxilar, um tecido duro semelhante ao dente humano10.
O desenvolvimento de novas matrizes e técnicas validadas para determinar os níveis de estresse dos peixes é de particular interesse para a indústria de caviar, onde o esturjão pode experimentar exposição prolongada a fatores de estresse ambiental11. O sexo do esturjão não pode ser determinado antes dos 2 anos de idade, e o esturjão não tem escalas. Porque o cortisol se acumula gradualmente em matrizes sólidas durante a fase de crescimento2,7,12, dados de acumulação de cortisol de longo prazo de matrizes duras, tais como barbatanas e Jawbones poderia fornecer insight sobre o stress níveis em diferentes estágios de crescimento. Em contrapartida, os níveis de cortisol no sangue proporcionam um instantâneo dos níveis de estresse no momento da morte e não podem representar com precisão o estresse durante as condições de criação de longo prazo13,14. Com o aumento da concorrência no mercado de caviar, novas abordagens para melhorar as condições de stress para a produção de ovos mais saudáveis entre as espécies de esturjão durante a criação de longo prazo (8-12 anos ou mais) são uma área cada vez mais importante de pesquisa. Devido ao alto custo do esturjão, as amostras colhidas são extremamente dispendiosas ($ 8000-15000 por peixe maduro, dependendo da espécie e do estágio de crescimento), um fator limitante para projetos de pesquisa. No entanto, o desenvolvimento de uma técnica adequada para a extração de cortisol de barbatanas de esturjão e mandíbula poderia ser aplicado de forma útil tanto para sistemas de piscicultura e em peixes selvagens para melhorar a qualidade e colheita de ovos de esturjão para consumo e Conservação.
Além de fornecer resultados confiáveis6, a seleção de uma técnica de extração de cortisol adequada é de importância crucial para garantir que outros compostos presentes na matriz durante a preparação da amostra não confundir a saída, o que pode levar a resultados inconsistentes. É igualmente importante determinar se os níveis de cortisol da aleta e do Jawbone são influenciados pelos níveis hormonais na água circunvizinha. Heimbürge et al.15 sugeriram que uma série de fatores pode influenciar os níveis de cortisol, incluindo idade, sexo, gravidez, estação, cor12e região do corpo a partir do qual o cortisol é extraído16. No entanto, pouca informação está disponível sobre os efeitos da lavagem de solventes na extração de cortisol em matrizes de corpo de peixe8, e nenhum sobre estes efeitos em esturjão, exceto para os ovos de esturjão17.
Embora a análise dos níveis basais de cortisol das barbatanas e mandíbula do esturjão exija que o peixe seja eutanasiado, essa abordagem não implica as técnicas invasivas necessárias para a amostragem de sangue em esturjão vivo. As amostras da aleta e do Jawbone são coletadas facilmente, e a extração destes tecidos pode ser executada ràpida. Da mesma forma, extração e análise hormonal são simples e exigem pouco equipamento especializado.
Neste estudo, apresentamos uma técnica nova e facilmente aplicada para a extração, lavagem e determinação do cortisol a partir de barbatanas de peixe e mandíbula, com o objetivo de determinar se os níveis de cortisol medidos a partir dessas matrizes podem ser utilizados de forma confiável como estresse Indicadores. As vantagens desta técnica incluem uma abordagem fácil e não invasiva8 , menor variação de dados e saída confiável1,6,8,17; a técnica é aplicável a espécies de peixes sem escalas como o esturjão. A técnica requer abate dopeixe, seleçãode solventes de lavagem apropriados2,4, moagemadequada das amostras3,5, ensaio imunoenzimático profissional (ELISA) aplicação5,7e amplo conhecimento da incorporação de fontes de cortisol em matrizes sólidas6.
Aplicamos dois diferentes solventes de lavagem (água ultrapura e isopropanol) para obter níveis de cortisol basal em barbatanas de três espécies de esturjão: beluga (Huso Huso), Siberian (Acipenser baerii) e Sevruga (A. stellatus ), em condições ambientais padrão para cada espécie. Os Jawbones de H. Huso foram usados igualmente para avaliar o esforço no Sturgeon. Este é o primeiro estudo para medir os níveis de cortisol em mandíbula de esturjão. Os resultados deste estudo proporcionarão dados comparativos de cortisol para espécies de esturjão na fase inicial de crescimento (~ 1 ano) antes da determinação do sexo.
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Protocol
Os seguintes procedimentos e métodos experimentais foram aprovados pela autoridade de ética e bem-estar dos animais da Universidade Nacional de Kangwon, Chuncheon, República da Coréia.
1. coleção da aleta
- Capture o esturjão delicadamente usando uma rede para minimizar ferimento e esforço.
- Enxágüe o peixe cuidadosamente com água fresca e, em seguida, limpe a superfície do corpo com uma toalha absorvente antes da eutanásia.
- Bata a cabeça do peixe usando um martelo de plástico de tal forma que o peixe é atordoado ou perde a consciência. Retire a cabeça usando uma faca.
- Meça o peso corporal (g) e o comprimento (cm).
- Após a eutanásia, colete amostras da aleta cortando tão perto quanto o corpo como possível usando tesouras cirúrgicas esterilizadas.
Nota: as toalhas absorventes individuais não recicláveis devem ser utilizadas para cada peixe. As estatísticas descritivas para as espécies utilizadas neste estudo foram as seguintes: esturjão de beluga (H. Huso): idade = 18 ± 2,1 meses, peso corporal = 2.700 ± 300 g e comprimento corporal = 55 ± 5 cm; Esturjão siberiano (A. baerii): idade = 9,6 ± 2,4 meses, peso corporal = 1.750 ± 250 g e comprimento do corpo = 45 ± 5 cm; Sevruga esturjão (A. stellatus): idade = 14 ± 1,3 meses, peso corporal = 1.000 ± 100 g e comprimento do corpo = 65 ± 5 cm.
2. preparação da aleta para a extração do cortisol
- Coloque as amostras de barbatana (uma amostra por tecido: ~ 3 g) em papel de pesagem laboratorial (107 mm × 210 mm) e seque à temperatura ambiente por alguns dias até secar.
- Envolva amostras em folhas de folha de alumínio, coloque em sacos plásticos rotulados e transfira para o laboratório.
- Armazene amostras em um refrigerador para o uso mais adicional, incluindo a lavagem, a extração do cortisol, a secagem, e a análise de ELISA (Figura 2).
3. análise de cortisol fin
- Calibre a balança analítica digital (precisão: 0, 1) e pesar 300 ± 10 mg amostras com papel de pesagem na panela de escala.
- Lave as amostras.
- Transfira cada amostra para um tubo de polipropileno cônico de 15 L. Adicione 3 mL de isopropanol a cada tubo utilizando uma pipeta de canal único de 5.000 μL.
- Gire os tubos em 80 rpm por 2,5 min para lavar o cortisol e remover qualquer potencial contaminação externa. Repita este procedimento duas vezes.
- Seque as amostras lavadas à temperatura ambiente (22-28 ° c) durante 7 dias.
- Repita o procedimento de lavagem utilizando água ultrapura como agente de lavagem.
- Extraia o osso maxilar do tecido do corpo usando fórceps de corte ósseo. Aplique as etapas de 1,5 a 3.2.4 às amostras de osso maxilar.
- Pese (75 ± 5 mgs) amostras secas da aleta ou do Jawbone e moer usando um batedor do grânulo em 50 hertz para 32 minutos.
- Entregue 1,5 mL de metanol em cada tubo contendo barbatana em pó ou mandíbula usando uma pipeta de 1000 μL. Coloc as amostras em um rotator do tubo na rotação lenta (40 rpm) para 18 h na temperatura ambiente para extrair o cortisol com mistura contínua.
- Após a extração de cortisol, Centrifugue as amostras em 9.500 x g por 10 min à temperatura ambiente. Após a centrifugação, colete a camada orgânica superior que contem o cortisol (1 mL) de cada amostra e coloc a em um tubo separado do microcentrifugador de 1,5 mL.
- Seque as amostras por incubação a 38 ° c para evainar o metanol. Mantenha as amostras de cortisol extraídas uma capa de fumaça durante a noite para permitir que o metanol se dissipar.
Nota: a camada contendo cortisol é geralmente de cor amarelada.
- Seque as amostras por incubação a 38 ° c para evainar o metanol. Mantenha as amostras de cortisol extraídas uma capa de fumaça durante a noite para permitir que o metanol se dissipar.
4. deteção do cortisol da aleta
- Descongelar as amostras de barbatanas secas ou de mandíbula à temperatura ambiente durante 1,5 h antes de utilizar o kit ELISA.
- Adicionar 400 μL de tampão fosfato, vortex e centrifugador a 1.500 x g durante 15 min.
- Execute cada amostra (25 μL) em duplicado para melhorar a precisão e a fiabilidade do ensaio. Remova todos os dados fora da curva padrão como outliers.
- Ajuste um leitor do microplate a 450 nanômetro, a seguir ajustado a μg dL-1 e leia a densidade ótica da placa.
- Use o software de microplacas com um ajuste de curva de regressão não linear de quatro parâmetros. Converta os níveis de cortisol das amostras obtidas do software em PG MG-1 usando a seguinte equação:
F = 10, 000E (A/B) (C/D),
onde F = o valor final do nível de cortisol Fin em (PG MG-1), E = o volume (ml) do tampão de ensaio utilizado para reconstituir o extrato seco, a = a concentração (μg DL-1) fornecida pela saída do ensaio, B = o peso (mg) da nadadeira submetida a extra C = volume (mL) de metanol adicionado à nadadeira em pó, e D = volume (mL) de metanol recuperado do extrato e posteriormente secado3.
- Use o software de microplacas com um ajuste de curva de regressão não linear de quatro parâmetros. Converta os níveis de cortisol das amostras obtidas do software em PG MG-1 usando a seguinte equação:
5. análise estatística
- Divida cada amostra em duas subamostras antes do procedimento de lavagem e, em seguida, corra em duplicado durante o ensaio do kit ELISA (2 × 2 = 4 observações por amostra) para melhorar a potência do teste e a confiabilidade dos resultados.
- Compare os efeitos dos dois solventes de lavagem e suas interações aplicando o procedimento de modelo linear geral (GLM) no ambiente de software SAS aos dados de medição18.
- Diferenças de teste entre médias utilizando o teste de Tukey a um nível de significância de p < 0, 5. Aceitar 0, 5 < p < 0,10 como evidência de uma tendência em vez de como uma diferença significativa.
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Representative Results
A técnica de extração de cortisol Fin apresentada foi desenvolvida e confirmada neste estudo com três espécies de esturjão. Os níveis de cortisol obtidos com água ultrapura e isopropanol como solventes de lavagem foram comparados (Figura 2). O cortisol de H. Huso Jawbones foi examinado para determinar se os Jawbones do esturjão puderam ser usados como uma matriz alternativa às nadadeiras. Os efeitos do solvente de lavagem, espécies de esturjão e sua interação estão demonstrados na tabela 1. Os níveis de cortisol tenderam a ser maiores nas amostras de nadadeiras lavadas com isopropanol do que naqueles lavados com água (p = 0, 89). Não houve diferenças significativas nos níveis de cortisol fin (p = 0,525) entre as espécies de esturjão. Não houve interação significativa entre solventes de lavagem e espécies de esturjão (p = 0,947). O solvente de lavagem não teve efeito significativo sobre o nível de cortisol no esturjão de H. Huso (p = 0,45) (tabela 2). Os coeficientes de variação intragrupo e inter-ensaio foram de 14,15 e 7,70, respectivamente. Os dados mostraram alta similaridade entre as barbatanas das três espécies de esturjão (tabela 1) e em H. Huso Jawbones (tabela 2). Não foram investigadas correlações entre os níveis de cortisol em mandíbula e aquelas em barbatanas de diferentes espécies de esturjão, pois obtivemos amostras de osso maxilar apenas de H. Huso. Essas relações devem ser exploradas em um estudo futuro.
Figura 1. (A) fotografia de Huso Huso esturjão (10 anos de idade). (B) características morfológicas do esturjão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Infográfico de análise de cortisol Fin5,6realizado em laboratório. Todas as fotografias apresentadas no resumo infográfico foram realizadas no laboratório. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Espécies de esturjão (SS) | Solvente de lavagem (WS) | Valor de P | ||||||||
| Huso Huso | (Braga) | Acipenser stellatus | SEM | Água | Isopropanol | SEM | Ss | Ws | SS × WS | |
| Cortisol (PG MG-1) | ||||||||||
| 3,46 | 2,85 | 3,34 | 0,41 | 2,86 | 3,69 | 0,33 | 0,52 | 0, 8 | 0,95 | |
Tabela 1. Níveis de cortisol Fin em três espécies de esturjão obtidas utilizando dois solventes de lavagem diferentes.
| Solvente de lavagem (WS) | SEM | Valor de P | ||
| Água | Isopropanol | |||
| Cortisol (PG MG-1) | 1,11 | 1,43 | 0,31 | 0,45 |
Tabela 2. Níveis de cortisol Jawbone no esturjão de beluga (HusoHuso) usando dois solventes de lavagem diferentes.
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Discussion
O esturjão é às vezes chamado de "fóssil vivo" porque exibiu poucas adaptações ao longo dos últimos milênios. O gênero de esturjão Acipenser contém 27 espécies que produzem caviar; no entanto, três espécies (beluga, baerii e Sevruga) produzem a maior parte do suprimento global de caviar. Esturjão são vulneráveis à sobrepesca e interferência em seu habitat natural e, portanto, são mais criticamente ameaçadas do que qualquer outro grupo de espécies. O esturjão pertence ao grupo o mais velho de vertebrados vivos, que existiu por 150 milhões anos. Espécies Acipenser amadurecidas e crescem lentamente; alguns (por exemplo, H. Huso) podem viver por 100 anos e exceder 2.000 quilogramas no peso. Esturjão são peixes cartilaginosos sem escalas, e são caracterizados por cinco fileiras de grandes placas ósseas chamadas escamas e barbas táteis localizados na frente da boca (Figura 1). As diferenças fisiológicas entre estas espécies e outros peixes incluem diminuição das respostas plasmáticas (corticosteroides) aos estressores ambientais. Nossas medidas do cortisol da aleta fornecem a evidência que o Jawbone do esturjão acumula o cortisol na proporção às concentrações de circulação.
Os peixes exibem inúmeras respostas a estressores físicos, químicos e percebidos. Essas reações são bem conhecidas como mecanismos adaptativos que permitem que os peixes para lidar com distúrbios ambientais e manter um estado homeostático. Se um estressor é suficientemente prolongado ou grave que o peixe é incapaz de recuperar a homeostase usando suas respostas naturais, em seguida, os peixes podem experimentar efeitos adversos, colocando em risco a sua saúde geral e/ou vida19. O sexo de esturjão pode ser determinado a partir de cerca de 2 anos de idade. Portanto, para determinar se os níveis de cortisol e o sexo com esturjão estão correlacionados, é necessário documentar o acúmulo de cortisol em longo prazo em barbatanas e mandíbula (como uma nova abordagem e matriz alternativa) de esturjão. Este estudo é o primeiro a relatar os níveis do cortisol da aleta e do Jawbone no Sturgeon.
O papel de um solvente de lavagem de cortisol é remover fontes externas de cortisol do muco da pele9. Aerts et al.14 utilizaram água destilada para remover a contaminação externa de cortisol da pele de peixe; em estudos prévios2,5,12,17, comparamos os efeitos do uso de isopropanol e água como solvente para examinar o conteúdo de cortisol capilar. Os efeitos do solvente de lavagem podem variar entre as amostras devido às diferenças nas propriedades dos ovos de esturjão13, pele15, barbatanas e mandíbula. Brossa7 relatou que o nível de cortisol em escalas de peixinho (Carassius auratus) permaneceu constante quando o isopropanol foi utilizado como solvente, independentemente do número de lavagens, enquanto os níveis de cortisol variaram quando a água foi utilizada. Nossos resultados mostraram que o solvente de lavagem não teve nenhum efeito em níveis do cortisol da maxila. As diferenças entre estes estudos incluem o número de lavagens, agitação versus vortexing, pureza do isopropanol, e importante, sensibilidade ou resistência de escalas/pele à penetração líquida externa. Ghassemi Nejad et al.20 demonstraram que a aplicação de diferentes ensaios como ria e Elisa pode levar a diferenças na produção. Os esteroides são mais solúveis em álcoois de massa molecular inferior (por exemplo, metanol) do que em álcoois de maior peso molecular, como isopropanol4. A extração de metanol desnatura a proteína quebrando ligações não covalentes, permitindo assim a liberação do cortisol do cabelo. O metanol também modifica a estrutura hormonal quebrando as ligações não covalentes, resultando na liberação de cortisol dos tecidos. Para homogeneizar eficazmente barbatanas de esturjão e mandíbula antes da extração de metanol, um batedor de talão pode ser usado para quebrar eficientemente a estrutura do tecido. Este procedimento exige o tempo para moer completamente as amostras da aleta e do Jawbone; Conseqüentemente, o processo deve ser repetido para assegurar a pulverização e a homogeneização completas antes da extração do cortisol. Lenta rotação para 18 h permite a remoção gradual de cortisol por lavagem.
Como sugerido em estudos prévios de pêlos de mamíferos4,5,6, fontes externas ou internas de conteúdo de cortisol em barbatanas e mandíbulas, além do sangue, não devem ser negligenciadas. Embora este estudo não tenha sido especificamente projetado para investigar como o cortisol se difunde do sangue para as barbatanas ou mandíbulas, destaca a necessidade de ampliar nosso conhecimento desse processo para interpretar melhor as flutuações do cortisol nessas matrizes. As propriedades das barbatanas e mandíbula diferem das das escalas e da pele. Bussy et al.17 quantificaram os níveis de cortisol em ovos de esturjão-do-Lago (a. fulvescens) para investigar os efeitos ambientais sobre a condição fisiológica materna e a qualidade dos ovos. Utilizaram metil tert-butylether (MTBE), acetato de etilo (AcOEt) MTBE e éter dietílico (et2O) como solventes de lavagem e concluíram que o acetato de etila foi o melhor solvente de extração em termos de recuperação e efeito matricial. No presente estudo, o isopropanol removeu maiores quantidades de cortisol externo do muco cutâneo durante a lavagem, levando a uma ligeira superestimação do cortisol das barbatanas de esturjão, que deve ser cuidadosamente considerada na interpretação dos resultados da extração. É possível que o isopropanol tenha sido capaz de lavar a pele da nadadeira, como foi relatado em estudo prévio7. O isopropanol é conhecido por penetrar os folículos pilosos e as escalas de peixes4,7. Os resultados do presente estudo indicam que a escolha do solvente não teve efeito significativo nos níveis de cortisol, sugerindo que a extração de cortisol pode ser mais difícil em algumas partes da nadadeira do que em outras que utilizam água ultrapura; em tais casos, o isopropanol pode ser usado como uma alternativa.
Este estudo demonstrou a aplicabilidade do Jawbone como uma matriz nova para a indicação de confiança do esforço no Sturgeon. Os valores de H. Huso Jawbone cortisol foram semelhantes aos extraídos de barbatanas da mesma espécie; estudos futuros devem confirmar esse resultado entre diferentes espécies, idades e sexos por meio da análise de correlação. Um baixo número de peixes foi utilizado no estudo atual devido ao alto custo do esturjão; Tentamos superar essa limitação testando cada amostra duas vezes e também duplicando a extração de metanol para o ELISA. Usando a multiplicação quádrupla poderia aumentar o poder do teste para cobrir o baixo número de amostras.
Concluímos que o tipo de solvente de lavagem afetou moderadamente a extração de cortisol de barbatanas, mas não de mandíbulas, de esturjão. Antes de generalizar a conclusão deste estudo e validar esses resultados, deve ser realizada uma pesquisa adicional com diferentes espécies e solventes. O presente trabalho fornece evidências de que o osso maxilar do esturjão pode ser aplicado como uma matriz alternativa em estudos futuros usando o cortisol como um índice de estresse no esturjão. A adequação do ELISA para a mensuração da nadadeira e do cortisol maxilar também foi demonstrada no presente estudo. A pesquisa futura deve centrar-se sobre dois aspectos: 1) determinar a correlação entre níveis do cortisol nos Jawbones e naqueles nas nadadeiras do esturjão e 2) colhendo amostras da matriz para a medida do cortisol dos peixes mais velhos e de seu caviar para determinar o stress a longo prazo níveis em diferentes espécies de esturjão durante a vida útil.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi conduzido com o apoio do programa de pesquisa cooperativa de ciência da agricultura & desenvolvimento tecnológico (título do projeto: análise de mudança de produtividade pecuária com mudanças climáticas, projeto n º. PJ012771), administração de desenvolvimento rural, República da Coréia. Além disso, este estudo foi apoiado por uma subvenção (no. PJ01344604) da nutrição animal & equipe de Fisiologia, Instituto Nacional de Zootecnia, RDA, Seul, República da Coréia. Os autores reconhecem com gratidão o CEO do persa gesto Mohammad Hassan Salmanzadeh e sua equipe, que forneceu peixes das três espécies de esturjão examinadas neste estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
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