Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Införa en gen knockout direkt i Amastigote skede av Trypanosoma cruzi med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59962
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för att introducera en gen knockout i den extracellulära amastigote av Trypanosoma cruzi, med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet. Tillväxten fenotyp kan följas upp antingen genom cellräkning av axenic amastigote kultur eller genom spridning av intracellulära amastigotes efter värd cell invasion.

Abstract

Trypanosoma cruzi är en patogena protozoer parasit som orsakar Chagas sjukdom främst i Latinamerika. För att identifiera ett nytt drog mål mot T. cruzi, är det viktigt att validera essentialitet av målgenen i däggdjurs stadiet av parasiten, amastigoten. Amastigotes av T. cruzi replikera inuti värdcellen; Därför är det svårt att genomföra ett knockout-experiment utan att gå igenom andra utvecklingsstadier. Nyligen rapporterade vår grupp en tillväxtvillkor där amastigote kan replikera axenically i upp till 10 dagar utan att förlora sina amastigote-liknande egenskaper. Genom att använda denna temporala axenic amastigote kultur, introducerade vi framgångsrikt gRNAs direkt i Cas9-uttrycker amastigote att orsaka Gene Knockouts och analyserade deras fenotyper uteslutande i amastigote skede. I denna rapport beskriver vi ett detaljerat protokoll för att producera in vitro-härledda extracellulära amastigotes, och att utnyttja axenic kulturen i ett CRISPR/Cas9-medierad knockout experiment. Den tillväxt fenotyp av knockout amastigotes kan utvärderas antingen av cell räkningar av axenic kulturen, eller genom replikering av intracellulära amastigote efter värd cell invasion. Denna metod kringgår parasiten skede differentiering normalt involverade i att producera en transgen eller en knockout amastigote. Utnyttjandet av den temporala axeniska amastigote kulturen har potential att utöka den experimentella friheten av scenspecifika studier i T. cruzi.

Introduction

Trypanosoma cruzi är smittämnet av Chagas sjukdom, som är förhärskande främst i Latinamerika1. T. cruzi har distinkta livscykelstadier som färdas mellan en insekt vektor och en däggdjurs värd2. T. cruzi replikerar som en epimastigote i midgut av en blodsugande triatomine bugg och skiljer sig till en smittsam metacyklisk trypomastigote i hindgut innan de deponeras på en människa eller djur värd. När trypomastigote hamnar i den mottagande kroppen genom bettet webbplats eller genom en slemhinna, invaderar parasiten en värd cell och förvandlas till en flagella-mindre runda form kallas en amastigote. Den amastigote replikat inom värdcellen och så småningom differentierar till trypomastigote, som spricker ut ur värdcellen och går in i blodet för att infektera en annan värd cell.

Eftersom för närvarande tillgängliga kemoterapeutiska medel, benznidazol och nifurtimox, orsaka negativa biverkningar och är ineffektiva i den kroniska fasen av sjukdomen3, det är av ett stort intresse att identifiera nya läkemedel mål mot T. cruzi. Under de senaste åren har CRISPR/Cas9-systemet blivit ett kraftfullt verktyg för att effektivt utföra genknockout i T. cruzi, antingen genom överföring av separata eller enstaka plasmid (s) som innehåller Grna och Cas94, genom ett stabilt uttryck av Cas9 och efterföljande införande av grna5,6,7 eller transkription mall av grna8, eller genom elektroporation av den redan bildade grna/Cas9 RNP Complex7,9. Denna tekniska avancemang är mycket förväntas påskynda drogen mål forskning i Chagas sjukdom.

För att fortsätta med läkemedelsutveckling, är det viktigt att validera essentialitet målgenen eller effekten av drogen kandidat föreningar i amastigote av T. cruzi, eftersom det är replikering skede av parasiten i däggdjurs värd. Detta är dock en utmanande uppgift, eftersom amastigotes inte kan manipuleras direkt på grund av närvaron av en obstruktiv värd cell. I Leishmania, en närbesläktad protozoer parasit till T. cruzi, en axenic amastigote odlingsmetod utvecklades och har utnyttjats i Drug screening analyser10,11,12, 13. även om det finns vissa skillnader i känslighet för föreningar mellan axenic amastigotes och intracellulära amastigotes14, förmågan att upprätthålla axenic kulturen ändå ger värdefulla experimentella verktyg för att studera grundläggande biologi av det kliniskt relevant arrangerar av Leishmania15,16. I fallet med T. cruzi, litteraturer om förekomsten av naturligt förekommande extracellulära amastigotes (EA)17 och in vitro-produktion av EA17,18,19 tillbaka till decennier sedan. Dessutom är EA känt för att ha en smittsam förmåga20, om än mindre än trypomastigote, och mekanismen för amastigote värd invasion har klargjorts under de senaste åren (granskad av Bonfim-Melo et al.21). Men till skillnad från Leishmaniahade EA inte utnyttjats som ett experimentellt verktyg i T. cruzi, främst därför att EA hade betraktats som en obligate intracellulär parasit, och därför inte hade ansetts vara "replikativ form" i en praktisk Känsla.

Nyligen föreslog vår grupp att utnyttja EA av T. cruzi som en temporal axenic kultur22. Amastigotes av T. cruzi tulahuen stam kan replikera fria från värdceller i lit medium vid 37 ° c i upp till 10 dagar utan större försämring eller förlust av amastigote-liknande egenskaper. Under värd-fri tillväxtperiod, EA var framgångsrikt utnyttjas för exogena genuttryck genom konventionell elektroporation, drog titrering analys med trypanocidal föreningar, och CRISPR/Cas9-medierad knockout följt av tillväxt fenotyp övervakning. I denna rapport beskriver vi det detaljerade protokollet för att producera in vitro-härledda EA och för att utnyttja axenic amastigote i knockout-experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anmärkning: En översikt över hela experiment flödet avbildas i figur 1.

Figure 1
Figur 1: översikt över knockout-experimentet med EA. Vävnadsodling-härledda trypomastigotes skördas och differentieras till EA. grna är transfekterade till Cas9-uttrycker amastigotes genom elektroporation, och tillväxt fenotyp av knockout amastigote utvärderas antingen genom axenic replikering eller genom intracellulär replikering efter värd cell invasion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

1. preparat för parasit odling

  1. Tulahuen stam av Trypanosoma cruzi används i hela denna rapport. Underhåll epimastigoter av T. cruzi i lit medium (10% FCS, se kompletterande tabell 1). Stäng locket ordentligt och håll odlings kol ven vid 28 ° c.
  2. Generera en transgen stam av T. cruzi som hamnar Cas9 Endonuklease. Exempel på uttrycket plasmider som innehåller Cas9 kodsekvens och G418 (Neor) markerings markör finns i Lander et al.4 och peng et al.5
    1. Transfect ovanstående plasmid i epimastigote genom elektroporation, med hjälp av kit som anges i tabellen av material. För 1 Cuvette, snurra 2 x 107 celler, Kassera supernatanten, och Omsuspendera med 100 μl av elektroporation buffert som innehåller den medföljande tillägget lösningen.
      Anmärkning: Den elektroporation buffert kan ersättas med EM buffert24 (3:1 blandning av Cytomix25 och fosfat-sackaros buffert).
    2. Tillsätt 20-40 μg plasmid och överför blandningen till en 2 mm gap elektroporation kuvette. Applicera pulsen med en elektroporation enhet (se tabell över material), med hjälp av X-14 program26.
    3. Överför kyvetten-innehållet till en T-25-kolv som innehåller 5 ml upplyst medium (10% FCS). Inkubera kolven vid 28 ° c i 24 timmar.
    4. Tillsätt G418 till en slutlig koncentration på 250 μg/mL och fortsätt inkuberingen vid 28 ° c. Det tar ungefär 1 vecka att döda de icke-transfected epimastigotes. När G418-resistenta befolkningen börjar återhämta sig, passage kulturen en eller två gånger i veckan för att undvika mättnad och att späda ut de döda cellerna. Etablering av en stabil cell linje tar vanligtvis totalt 4 veckor.
      Anmärkning: Om konstitutiva uttrycket av Cas9 är en börda för cellen5, göra uttrycket specifikt för amastigote skede genom konjugating 3 '-utr av amastin genen omedelbart nedströms Cas9 öppna läsbild27. Den detaljerade beskrivningen av den amastigote-specifika Cas9 Expression plasmid finns i Takagi et al.22
  3. Upprätta en värd-parasit Co-kultur av Cas9-uttrycka T. cruzi och däggdjur värdceller. I denna rapport, Använd 3T3-schweiziska Albino fibroblast cell som värd.
    1. Differentiera T. cruzi epimastigotes till metacykliska trypomastigotes. Bestäm CELLTÄTHETEN av epimastigote kulturen med hjälp av en hemocytometern och samla 5 x 107 celler genom centrifugering för 15 min vid 2 100 x g. Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna med 10 mL RPMI-medium. Inkubera parasiten vid 28 ° c i 1 vecka28.
    2. Samla in metacykliska trypomastigotes i RPMI medium. Luta kolven försiktigt och Pipettera ut lösningen utan att störa parasiterna som fastnat på bottenytan. Överför mediet till ett koniskt rör och Centrifugera i 15 min vid 2 100 x g. Kassera supernatanten och Omsuspendera parasiten med 5 mL DMEM (10% FCS).
      Anmärkning: Parasiten populationen är en blandning av metacykliska trypomastigotes, epimastigotes, och vissa mellanliggande former. Även om det inte är nödvändigt, kan du isolera trypomastigote av DEAE jonbytekromatografi29. Alternativt kan epimastigoter elimineras genom inkuberande parasiterna med aktivt serum för att underkulera dem att komplettera lysis30.
    3. Seed 3T3-schweiziska Albino fibroblast cell till 60-70% confluency, eller omkring 1.7-2.0 x 106 celler i 5 ml av DMEM (10% FCS) i T-25 odlings flaska. Ta bort odlingsmediet och applicera parasit blandningen från steg 1.3.2. Inkubera i 24 timmar vid 37 ° c under 5% CO2 i en fuktad inkubator för att etablera infektion.
    4. Ta bort parasiterna som återstår utanför värd 3T3-cellerna genom att tvätta samkulturen med DMEM (10% FCS) två gånger.
    5. När medkulturen är mättad, passage amastigote-infekterade värdceller genom trypsinization. Aspirera mediet och skölj kulturen en gång med PBS. Applicera 1 mL 0,05% trypsin lösning för att täcka hela odlingsytan, och inkubera i några minuter i rumstemperatur tills de bifogade värdcellerna lossnar. Lossa cellerna från kolvens yta genom att spola 3 mL DMEM (10% FCS) över cellerna.
    6. Överför fristående värdceller till ett koniskt rör och Centrifugera i 3 min vid 300 x g. Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellerna med 3 mL färsk DMEM (10% FCS). Detta steg hjälper till att eliminera kvarvarande epimastigoter. Överför allt till en ren T-75 kolv som innehåller 9 mL DMEM (10% FCS). Fortsätt odling tills trypomastigote släpps ut i kulturen supernatant.
    7. Upprätthålla Co-kulturen genom passaging med trypsinization två gånger i veckan. När 70-80% av värdbefolkningen blir smittade, regelbundet lägga till icke-infekterade värd 3T3 celler vid förhållandet 5:1 (överföring: färsk), för att undvika kultur försämring. Trypomastigote som kontinuerligt om balansen mellan värdceller och T. cruzi är korrekt underhållna.

2. differentiering av trypomastigotes till EA

  1. På dagen före detta experiment, ta bort odlingsmediet av värd-parasiten Co-Culture och tillsätt färsk DMEM (10% FCS) att tvätta bort EA och trypomastigotes som redan hade släppts från värdcellerna i tidigare dagar. Regelbundna experiment kräver minst två T-75 kolvar av konflytande samodling.
  2. Samla kultur supernatanten i ett koniskt rör att skörda nyligen uppstått trypomastigotes. Kontrollera provet under ett mikroskop (10X eller 20x objektiv) för kvaliteten. Om det finns värd cell skräp, kort Centrifugera provet och överföra supernatanten till ett nytt rör. Om det finns ett betydande antal EAs, isolera trypomastigotes genom följande Swim-out förfarande.
    1. Snurra ner blandningen av trypomastigotes och amastigotes för 15 min på 2 100 x g. Kassera det mesta av supernatanten och lämna 0,5-1,0 mL medium i röret.
      Obs: att minska volymen är valfritt, men det gör följande steg lättare.
    2. Inkubera pelleten vid 37 ° c för 1-2 h, så att aktiva trypomastigotes att simma ut ur pelleten (figur 2).
    3. Överför supernatanten som innehåller trypomastigotes till ett 1,5 mL microcentrifugerör.
  3. Centrifugera det koniska röret i 15 min vid 2 100 x g för att samla trypomastigotes. Om Swim-out förfarandet utfördes ovan, Centrifugera 1,5 mL röret för 2 min vid 4 000 x g till pellets trypomastigote. Kassera supernatanten.
  4. Omsuspendera pelleten med 5 mL DMEM buffrad med 20 mM MES (pH 5,0), kompletterad med 0,4% BSA19. Överför parasiten till en T-25 odlings kolv. Lämna locket löst. CELLTÄTHETEN måste vara runt 1 x 107 celler/ml, eftersom övermättnaden ökar risken för celldöd.
    Anmärkning: Färgen på DMEM måste vara gul, inte orange. Om den ursprungliga DMEM hade hög buffring kapacitet, 20 mM MES (pH 5,0) är inte tillräckligt för att sänka pH. Mediets pH måste justeras genom tillsats av HCl i det fallet. Det sura mediet kan förvaras vid 4 ° c, men inte längre än 1 månad.
  5. Inkubera odlings kol ven vid 37 ° c under 5% CO2 i en fuktad inkubator. Omkring 95% av parasiterna gör åtskillnad mellan in i amastigotes efter 24 h.

3. elektroporation av EA

  1. Förbered gRNA för elektroporation. Detta kan göras genom in vitro-transkription, eller helt enkelt genom att köpa syntetiska RNA oligonukleotides från en tillverkare. I denna rapport används crRNA och tracrRNA från integrerade DNA Technologies, Inc.
  2. Centrifugera kulturen av EAs för 15 min vid 2 100 x g. Kassera supernatanten.
  3. Omsuspendera pelleten med elektroporering buffert som innehåller medföljande tillägg lösning till den slutliga CELLTÄTHETEN av 1 x 108 celler/ml.
    Obs: EM-buffert orsakar fler celldöd jämfört med den elektroporation buffert som anges i tabell över material; Sålunda, det rekommenderas inte för amastigote transfektion (kompletterande figur 1).
  4. Aliquot 100 μL av återsuspenderade parasiter (1 x 107 celler) i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 5-10 μg gRNA och blanda försiktigt genom pipettering.
  5. Överför blandningen till en 2 mm gap elektroporation kuvette. Applicera pulsen med elektroporation enheten, med hjälp av X-14 program.
  6. Överför kyvetten-innehållet till en T-25-kolv som innehåller 5 ml förvärmd tänd medium (10% FCS). Låt locket vara löst och inkubera kolven vid 37 ° c under 5% CO2.
  7. Övervaka celltillväxten antingen genom fortsättning av axenic odling (avsnitt 4) eller som intracellulära amastigotes efter värd cell infektion (avsnitt 5).

4. övervaka tillväxten av knockout-celler som axenic amastigotes

  1. EAs bosätta sig i botten av odlingssubstrat, så försiktigt skaka kolven för att Omsuspendera dem i lösningen. Tvättning av kolvens yta genom pipettering hjälper, eftersom vissa celler följs kolven.
  2. Blanda 1 μl propidiumjodid jodid (PI) lösning (20 μg/ml) med 20 μl av amastigote-kulturen.
    Anmärkning: Lämna inte odlings kol ven utanför inkubatorn längre än nödvändigt. Temperatur är en av faktorer som gör att axenic proliferation22.
  3. Applicera provet på hemocytometern och observera under ett fluorescensmikroskop. PI är permenderat att skadat cellmembran men är uteslutet från levande celler. Räkna antalet livskraftiga amastigotes som inte är färgade av PI (ex/EM 570 nm/602 nm).

5. övervaka tillväxten av knockout-celler som intracellulära amastigotes

  1. Seed värd 3T3 celler i en 12-brunn tallrik med DMEM (10% FCS). Justera CELLTÄTHETEN till 70-80% confluency, eller om 3 x 105 celler per brunn.
    Anmärkning: Eftersom amastigotes inte motile, täcker de flesta av tillväxt ytan av värdcellerna förbättrar infektions effektiviteten.
  2. Samla knockout amastigotes från steg 3,6 genom centrifugering en dag efter elektroporation. Kassera supernatanten och Omsuspendera parasiten med 2 mL DMEM (10% FCS).
  3. Ta bort medium från värd cellkulturen och applicera återsuspenderade amastigotes. Mångfalden av infektion bör vara 20 eller högre. Inkubera plattan vid 37 ° c under 5% CO2 för 2 dagar så att amastigotes att etablera infektion.
    Anmärkning: Infektions perioden kan vara 1 dag, beroende på syftet.
  4. Tvätta bort EAs förblev utanför värdcellerna två gånger med DMEM (10% FCS).
  5. Tillsätt färsk DMEM (10% FCS) till den mottagande parasiten Co-Culture och fortsätt inkuberingen vid 37 ° c i ytterligare 2 dagar.
  6. För att utvärdera infektions effektivitet, visualisera kärnor av värdceller och intracellulära amastigote.
    Anmärkning:     kärnor tenderar att överlappas i mättade Co-kultur. Omplätering cellerna vid lägre celltäthet (såsom 1:5 utspädning) före fixering och färgning hjälper till att räkna kärnor lättare.
    1. Ta bort odlingssubstrat och applicera 1 mL 10% formalin lösning i PBS för att fixera cellerna. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
    2. Byt ut formalin-lösningen mot 1 mL PBS innehållande 1 μg/mL Hoechst 33342 och 0,1% Triton X-100. Inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
    3. Ta bort Hoechst lösningen och skölj cellerna en gång med PBS. Tillsätt 1 mL färsk PBS.
  7. Observera under fluorescensmikroskop och identifiera värd cells kärnor som är förknippade med mindre parasit kärnor (figur 4). Värdceller som innehåller mer än 2 amastigotes bör betraktas som smittade, att inte inkludera nonproduktiv initial infektion eller otvättade EAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av trypomastigotes genom Swim-out förfarande

Att skörda färska trypomastigotes från att förorta gamla EAs genom att simma ut förfarande, cell pellets måste inkuberas åtminstone för 1 h. Inkuberande pellets för mer än 2 h inte avsevärt öka antalet trypomastigotes simma i lösningen ( Figur 2b). I detta experiment var andelen trypomastigote i den initiala blandningen 38%, och procentsatsen efter att simma ut var över 98% vid en given tidpunkt. Från två T-75 kolvar av konfluenta Co-Culture, vi rutinmässigt få 3-4 x 107 celler av ren trypomastigote genom detta Swim-out protokoll.

Tillväxt övervakning av knockout amastigote som axenic kultur

Till skillnad från andra utvecklingsstadier av T. cruzi, flagellar-mindre amastigotes är praktiskt taget statiska. Sålunda, färgning med PI hjälper till att skilja levande amastigotes från döda sådana. PI är ogenomtränglig för intakt cellmembran men lätt tränger döda celler (figur 3a). Amastigotes transfekterade med grna mot essentiell gen, TcCGM1 (tcclb. 511807.80), visade en signifikant tillväxtfel jämfört med kontrollgruppen som fick grna inte homolog till T. cruzi genomet (figur 3b).

Tillväxt övervakning av knockout-parasiter som intracellulära amastigotes

Den essentialitet av målgenen i amastigote skede kan också påvisas genom utvärdering av tillväxt fenotyp av knockout T. cruzi som intracellulära Amastigote (figur 4). Andelen av värd kärnor som är förknippade med mindre T. cruzi kärnor var signifikant lägre i TcCGM1-Ko-gruppen jämfört med kontrollgruppen.

Knockout av en Stage-specifik gen orsakar fenotypisk skillnad i amastigote och trypomastigote stadier

Paraflagellar Rod komponent PAR1 uttrycks starkt i trypomastigote skede, men är nedreglerad i amastigote skede av T. cruzi22,31. I själva verket påverkade transfektion av gRNA mot TcPAR1 (tcclb. 506755.20) inte signifikant tillväxten av EA efter 4 dagar av axenic odling (Figur 5b). gRNA transfektion följt av Host cell invasion visade också att TcPAR1-Ko inte hämmar tillväxten av intracellulära amastigotes, i termer av andelen infekterade värdceller vid 4 dagar efter infektion (figur 5c). Antalet parasiter inom den enskilda värdcellen verkade inte påverkas av knockout, antingen (kompletterande figur 2). Dessa resultat tyder på att TcPAR1 inte är nödvändigt i amastigote skede av T. cruzi.

Emellertid, antalet trypomastigotes fram ur värdceller vid 5 dagar efter infektion var betydligt lägre i TcPAR1-Ko Co-kultur, jämföra med kontroll samkulturen (figur 5D). Dessutom differentierade trypomastigotes inom värd 3T3 cell innan egression verkade vara ganska aktiv i kontrollgruppen (kompletterande film 1) men verkade trög i TcPAR1-Ko grupp (kompletterande filmer 2). Dessa resultat tyder på att TcPAR1 spelar en viktig roll i trypomastigote skede av T. cruzi, förmodligen genom att ge motilitet för att hjälpa egression, trots dess icke-essentialitet i amastigote skede.

Figure 2
Figur 2: isolering av trypomastigote genom Swim-out förfarande. A) schematisk representation av protokollet. Röd = förekomst av trypomastigote. Bantalet trypomastigoter som har simmat ut ur pelleten vid angivna tidpunkter. Initial pellets innehöll totalt 3 x 107 parasiter, 38% av dem var trypomastigotes och resten av dem var amastigotes. Experiment utfördes i tre exemplar och medelvärden (± SD) ritas. Renheten hos trypomastigotes i lösning var över 98% vid varje given tidpunkt. Cmikroskopi bilder av parasiter före Swim-out förfarande (vänster), trypomastigotes som har simmat ur en pellet (mitten), och parasiter kvar i en pellet (höger) efter 1 h av inkubering. Skalstreck = 10 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: tillväxt övervakning av axenic amastigote. A) uteslutnings analysen av propidium jodid (PI). Mikroskopi bilder av EA på en hemocytometern i ljust fält (vänster), fluorescens kanal (mitten), och överlagd bild (höger). Gula pilar indikerar PI-färgade döda celler. Skalstreck = 20 μm. (B) cell räkning av Cas9-uttrycka amastigotes efter transfektion med grnas mot TcCGM1 (öppen cirkel) och kontroll grna utan homologi till T. cruzi genom (sluten cirkel). Elektroporationer utfördes i tre exemplar och medelvärden (± SD) ritas. (* * p < 0,01 av Welchs t-test). Denna siffra har modifierats från Takagi et al.22vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: tillväxt av knockout amastigotes efter värd invasion. (A) nukleär färgning av den värd-parasiten Co-Culture efter intracellulär replikation av amastigotes transfekterade med grnas mot TcCGM1 och kontroll grna. gRNA-transfected EAs applicerades på 3T3 celler 1 dag efter elektroporation och tillåtet att infektera värdceller för 2 dagar. Amastigoter kvar utanför värdcellerna spolades bort, och värd-parasiten samkulturen inkuberades i ytterligare 2 dagar. Skalstreck = 20 μm. Denna siffra har modifierats från Takagi et al.22 (B) procent av värd 3T3 celler infekterade av kontroll amastigotes (svart bar) och TcCGM1-Ko amastigotes (grå bar). Medelvärdet (± SD) för tre infektions experiment ritas (* * p < 0,01, Welch t-test). Denna siffra har modifierats från Takagi et al.22vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: fenotypisk skillnad mellan knockout amastigote och differentierad trypomastigote. (A) schematisk representation av den experimentella tidslinjen. (B) cell antal av axenic amastigote vid 4 dagar efter transfektion för kontroll amastigotes (svart bar) och TcPAR1-Ko amastigotes (grå bar). Medelvärden (± SD) för tre experiment med elektroporering ritas (NS: inte signifikant, Mann-Whitney U -test). (C) procentandel infekterade värd 3T3 celler vid 4 dagar efter infektion genom kontroll amastigote (svart bar) och TcPAR1-Ko amastigote (grå bar). Medelvärden (± SD) för tre kulturbrunnar ritas (NS: inte signifikant, Mann-Whitney U -test). (D) antal trypomastigote släpps ut i odlingssubstrat på 5 dagar efter infektion för kontroll Co-Culture (svart bar) och TcPAR1-Ko Co-Culture (Gray bar). Medelvärden (± SD) för tre kulturbrunnar ritas (* p < 0,05, Mann-Whitney U test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande tabell 1: tänd mediets sammansättning. LIT medium bereddes enligt ATCC 1029, med undantag för mängden av dinatriumvätefosfat. Vänligen klicka här för att ladda ner tabellen.

Kompletterande figur 1: effekten av elektroporering buffert på amastigote cell lönsamhet. EA var electroporated antingen i elektroporation buffert eller i EM buffert. Amastigote färgas med PI efter 24 h att räkna antalet levande och döda amastigotes. Procentsatser av döda celler i varje grupp och i ingen puls grupp ritas. Medelvärdet (± SD) för tre försök med elektroporering visas (* p < 0,05, NS: inte signifikant, Kruskal-Wallis-test). Vänligen klicka här för att ladda ner figuren.

Kompletterande figur 2: mikroskopi bilder av kärnfärgade TcPAR1-ko och kontroll intracellulära amastigotes. Co-kultur av värd 3T3 celler och transfekterade amastigotes fastställdes och färgas vid 4 dagar efter infektion. Skala staplar: 20 μm. vänligen klicka här för att ladda ner figuren.

Kompletterande figur 3: tillväxt fenotyp av Cas9-uttrycker epimastigote. Cell räknas av vildtyp epimastigotes (WT), epimastigotes som konstitutivt uttrycker Cas9-egfp (Cas9-egfp), och epimastigotes som uttrycker Cas9-egfp enligt regleringen av amastigote-specifika 3 '-utr (Cas9-egfp-amautr) ritas i logg skalan. Epimastigoter odlades i LIT medium (10% FCS) vid 28 ° c. Parasit cellernas densitet justerades till 1 x 106 celler/ml dag 0. Antalet ackumulerade celler beräknas som celltäthet multiplicerat med den totala utspädningsfaktorn. Medelvärdet (± SD) för tre odlingsflaskor visas (* p < 0,05, NS: ej signifikant, Kruskal-Wallis-test). Vänligen klicka här för att ladda ner figuren.

Kompletterande film 1: mikroskopi video bild av kontroll Co-kultur. Antal och aktivitet trypomastigotes som har differentierat från kontroll amastigotes. Video bild vid 5 dagar efter infektion visas.  Vänligen klicka här för att ladda ner filmen.

Kompletterande film 2: Microscopy video bild av TcPAR1-Ko Co-Culture. Antal och aktivitet trypomastigotes som har differentierat från TcPAR1-KO amastigotes. Video bild vid 5 dagar efter infektion visas. Vänligen klicka här för att ladda ner filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi visade att axenic kulturen av T. cruzi amastigotes kan utnyttjas i CRISPR/Cas9-medierad Gene knockout, genom att elektroporating grna direkt i Cas9-uttrycker EA. Detta sätt, den essentialitet av målgenen specifikt i amastigote skede kan utvärderas utan att gå genom andra utvecklingsstadier.

En annan gynnsam aspekt av amastigote transfection är bekvämligheten med att testa för ett stort antal målgener. När Co-kulturen i Cas9-uttrycker T. cruzi och värd däggdjursceller är etablerad, det tar bara några dagar att omvandla vävnad-härledda trypomastigotes till EA och transfect grna att få knockout amastigotes. gRNA är det enda material som behöver skräddarsys för varje målgen, men syntetiska gRNA är tillgängliga från antal tillverkare, så det kan enkelt köpas. En alternativ metod för att analysera scenens specifika essentialitet av målgener skulle vara att etablera ett inducerbart knockout-system32. I så fall måste plasmider konstrueras för varje målgen och transfekterade till parasiten i epimastigotestadiet för att möjliggöra läkemedels val av transfektanter, eftersom plasmidns verkningsgrad är mycket lägre än för grna (< 15% för plasmid 26 som ska > 96% för grna22). Utvalda transfektanter måste differentieras till metacykliska trypomastigotes att infektera värdceller för att slutligen framkalla en knockout i intracellulära amastigote. Hela denna process skulle ta 1-2 månader.

I denna rapport använde vi PI för att särskilja döda celler i axenic amastigote kultur att kvantitera celltäthet med en hemocytometer. Alternativt kan metaboliska analyser som resazurin genomförbarhet analysen användas för att uppskatta antalet levande amastigotes, vilket är mer lämpad för ett högt dataflöde format. I våra händer, 1 x 105 amastigotes per brunn avkastning tillräcklig redox aktivitet som ska upptäckas av en resazurin analys efter 5 h av inkubering.

En nackdel med att etablera en Cas9-uttrycker cellinjer är den potentiella cellulära bördan och icke-specifik klyvning på grund av Cas9 överuttryck5,33. Det finns flera rapporter som visar att konstitutiva uttrycket av Cas9 har ingen effekt på tillväxttakten i T. cruzi4,6,7,8. Men i en instans5 och även i våra händer, Cas9-uttrycker parasit visade långsam tillväxt jämfört med wildtype. För att övervinna denna fråga, använde vi amastigote-specifika 3 '-UTR att begränsa uttrycket av Cas9 att amastigote steg22. Konjugering av amastin 3 '-UTR till Cas9 öppen läsbild återställde replikeringshastigheten av transgena parasiter (kompletterande figur 3), och därmed producera robust värd-parasit Co-kultur att kontinuerligt leverera trypomastigotes för in vitro- amastigogenesis. Nyligen har andra grupper visat att införandet av grna/Cas9 RNP Complex till vild typ parasit kan orsaka genom redigering i T. cruzi7,9. Denna metod bör undersökas som en mindre stressande inställning till parasiten9, eftersom studie i däggdjursceller tyder på att användningen av RNP minskar oönskade off-Target genom redigering, på grund av den korta halveringstiden för Cas9 protein34.

En annan frivillig ändring av protokollet skulle vara co-transfektion av givar-DNA som en mall för homolog rekombination. Det har rapporterats att givar-DNA som innehåller homolog sekvenser till uppströms och nedströms av klyvningsstället, i form av antingen dubbelsträngad DNA4,5,8,35 eller enkelsträngad oligonukleotid7,9, underlättar reparationsprocessen av dubbel-strandad rast orsakad av Cas9 Nuclease. Även om vissa rapporter tyder på att mikrohomologi medierad slutet gå utan givare mall kan reparera klyvning och införa en radering mutation5, införandet av den definierade sekvensen till mutationen platsen ändå hjälper till att bekräfta framgångsrik genom redigering, eftersom det är svårt att Visa DNA-bevis för gen knockout i vissa fall, även om målet protein minskning och fenotypisk utfall tyder på målgenen var muterad4.

Cas9/gRNA RNP-transfektion och co-transfektion av ett givar-DNA visas inte i denna rapport för att förenkla beskrivningen av protokollet och för att fokusera på beredningen av EA och användningen av axenic-kulturen därefter. Om man vill utföra dessa experiment, kan det göras genom att helt enkelt ersätta komponenterna i elektroporation.

Vår metod för att utnyttja EA av T. cruzi som ett experimentellt verktyg möjliggör potentiellt en mängd olika scenspecifika studier, inklusive övergående genuttryck genom plasmid transfektion och läkemedels effekt test22. Men effektiviteten av detta tillvägagångssätt har testats endast i Tulahuen stammen hittills. Eftersom stammar av T. cruzi är ganska varierande, tillämpligheten av detta protokoll till andra stammar måste undersökas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av JSPS KAKENHI Grant Number 18K15141 till Y.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% formalin solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 068-03863 fixing cells
25 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3100-025
75 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3110-075
All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) IDT custom made target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) IDT custom made target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) IDT custom made target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072532 to anneal with crRNA
Amaxa Nucleofector device LONZA AAN-1001 electroporation
Basic Parasite Nucleofector Kit 2 LONZA VMI-1021 electroporation
BSA Sigma-Aldrich A3294 component of the medium for in vitro amastigogenesis
Burker-Turk disposable hemocytometer Watson 177-212C cell counting
Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3513
DMEM FUJIFILM Wako Pure Chemical 044-29765 culture medium
Fetal bovine serum, Defined Hyclone SH30070.03 heat-inactivate before use
G-418 Sulfate Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 077-06433 selection of transformant
Hemin chloride Sigma-Aldrich H-5533 component of LIT medium
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 staining of nuclei
Liver infusion broth, Difco Becton Dickinson 226920 component of LIT medium
MES FUJIFILM Wako Pure Chemical 349-01623 component of the medium for in vitro amastigogenesis
PBS (–) FUJIFILM Wako Pure Chemical 166-23555
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML staining of dead cells
RPMI 1646 Sigma-Aldrich R8758 medium for metacyclogenesis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
  2. Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
  3. Apt, W. Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease. Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).
  4. Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. 6 (4), e01012 (2015).
  5. Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi. mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).
  6. Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).
  7. Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants. International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).
  8. Costa, F. C. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388 (2018).
  9. Soares Medeiros, L. C. High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins. mBio. 8 (6), (2017).
  10. Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An axenic amastigote system for drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).
  11. Bates, P. A. Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).
  12. Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds. Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).
  13. Nühs, A. Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).
  14. De Rycker, M. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  15. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  16. Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation. Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).
  17. Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).
  18. Pan, S. C. Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C. Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).
  19. Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH. Parasitology. 110 (05), 547 (1995).
  20. Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).
  21. Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes. Frontiers in Microbiology. 9, 1341 (2018).
  22. Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088 (2019).
  23. Fernandes, J. F., Castellani, O. Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).
  24. Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).
  25. van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).
  26. Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection. Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).
  27. Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein. The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).
  28. Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere. 1 (2), (2016).
  29. Chao, D., Dusanic, D. G. Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography. Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).
  30. Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi. The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).
  31. Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 10, 370 (2009).
  32. Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes. Scientific Reports. 8 (1), 7960 (2018).
  33. Fu, Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  34. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  35. Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi. mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).

Tags

Genetik fråga 149 CRISPR/Cas9 Gene knockout Stage-specifika Trypanosoma cruzi Chagas sjukdom kinetoplastid parasit drog mål axenic kultur amastigote
Införa en gen knockout direkt i Amastigote skede av <em>Trypanosoma cruzi</em> med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K.,… More

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K., Takagi, Y. Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (149), e59962, doi:10.3791/59962 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter