Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Introduktion af et gen knockout direkte i den Amastigote fase af Trypanosoma cruzi ved hjælp af Crispr/Cas9 system

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59962

Summary

Her beskriver vi en protokol til at introducere en gen knockout i den ekstracellulære amastigote af Trypanosoma cruzi, ved hjælp af crispr/Cas9 system. Væksten fænotype kan følges op enten ved celletælling af axeniske amastigote kultur eller ved spredning af intracellulære amastigotes efter vært celle invasion.

Abstract

Trypanosoma cruzi er en patogen protozo parasisite, der forårsager Chagas ' sygdom hovedsagelig i Latin Amerika. For at identificere en ny drug target mod T. cruzi, er det vigtigt at validere væsentlighed af målgenet i pattedyrs fase af parasitten, den amastigote. Amastigotes af T. cruzi replikere inde i værtscellen; Derfor er det vanskeligt at gennemføre et knockout eksperiment uden at gå gennem andre udviklingsmæssige stadier. For nylig, vores gruppe rapporterede en vækst tilstand, hvor amastigote kan replikere axenisk i op til 10 dage uden at miste sin amastigote-lignende egenskaber. Ved at bruge denne temporale axeniske-amastigote-kultur introducerede vi med succes grnas direkte i den Cas9-udtrykte amastigote for at forårsage genknockouts og analyserede deres fænotyper udelukkende i amastigote scenen. I denne rapport, vi beskriver en detaljeret protokol til at producere in vitro afledte ekstracellulære amastigotes, og at udnytte den axeniske kultur i en crispr/Cas9-mediated knockout eksperiment. Den vækst fænotype knockout amastigotes kan evalueres enten ved celletal af den axeniske kultur, eller ved replikation af intracellulære amastigote efter vært celle invasion. Denne metode omgår parasitten fase differentiering normalt involveret i at producere en transgene eller en knockout amastigote. Udnyttelsen af den tidsmæssige axeniske-amastigote-kultur har potentialet til at udvide den eksperimentelle frihed for stadie specifikke studier i T. cruzi.

Introduction

Trypanosoma cruzi er det udløsende middel for Chagas ' sygdom, som primært er udbredt i Latin Amerika1. T. cruzi har karakteristiske stadier i livscyklussen, når den bevæger sig mellem en insekt vektor og en pattedyr-vært2. T. cruzi replikater som en epimastigote i ileum af en blod-sugende triatomine bug og differentierer til en infektiøs metacyclic trypomastigote i sin hindgut, før de deponeres på et menneske eller dyr vært. Når trypomastigote kommer ind i værtskroppen gennem bid-stedet eller gennem en slimhinde, invaderer parasitten en værtscelle og forvandler sig til en flagella-mindre runde form kaldet en amastigote. Den amastigote replikater i værtscellen og til sidst differentierer i trypomastigote, som sprænger ud af værtscellen og kommer ind i blodet for at inficere en anden værtscelle.

Da der i øjeblikket findes kemoterapeutika, benznidazol og nifurtimox, forårsage bivirkninger og er ineffektive i den kroniske fase af sygdommen3, det er af stor interesse at identificere nye Drug mål mod T. cruzi. I de seneste år, crispr/Cas9 system er blevet et kraftfuldt værktøj til effektivt at udføre gen knockout i T. cruzi, enten ved transfektering af separate eller enkelt plasmid (s) indeholdende grna og Cas94, ved stabile udtryk for Cas9 og efterfølgende indførelse af grna5,6,7 eller transskription skabelon af grna8, eller ved elektroporation af den præ-formede grna/Cas9 RNP kompleks7,9. Denne teknologiske avancement er meget forventet at fremskynde drug target forskning i Chagas ' sygdom.

For at fortsætte med narkotika udvikling, er det afgørende at validere den væsentlighed af målgenet eller effekten af Drug kandidat forbindelser i amastigote af T. cruzi, da det er replikation fase af parasitten i pattedyr vært. Dette er imidlertid en udfordrende opgave, fordi amastigoter ikke kan manipuleres direkte på grund af tilstedeværelsen af en obstruktiv værtscelle. I leishmania, en nært beslægtet protozo parasitten til T. cruzi, en axeniske amastigote dyrkning metode blev udviklet og er blevet udnyttet i Drug screening assays10,11,12, 13. selv om der er nogle uoverensstemmelser i modtagelighed for forbindelser mellem axeniske amastigotes og intracellulære amastigotes14, evnen til at opretholde den axeniske kultur ikke desto mindre giver værdifulde eksperimentelle værktøjer til at studere grundlæggende biologi af den klinisk relevante fase af leishmania15,16. I tilfælde af T. cruzi, litteratur om tilstedeværelsen af naturligt forekommende ekstracellulære amastigotes (EA)17 og in vitro-produktion af EA17,18,19 dato tilbage til årtier siden. Desuden er EA kendt for at have en smitsom kapacitet20, omend mindre end trypomastigote, og mekanismen i amastigote Host invasion er blevet belyst i de seneste år (anmeldt af Bonfim-Melo et al.21). Men i modsætning til leishmania, var EA ikke blevet udnyttet som et eksperimentelt værktøj i T. cruzi, primært fordi EA var blevet betragtet som en forpligte intracellulær parasit, og derfor ikke var blevet betragtet som "replikerende form" i en praktisk Følelse.

For nylig, vores gruppe foreslog at udnytte EA af T. cruzi som en tidsmæssig axeniske kultur22. Amastigotes af T. cruzi tulahuen stamme kan replikere gratis af Host celler i lit medium ved 37 °c i op til 10 dage uden større forringelse eller tab af amastigote-lignende egenskaber. I løbet af den værts frie vækstperiode blev EA med held udnyttet til eksogen genekspression ved konventionel elektroporation, lægemiddel titrering med trypanocide forbindelser og CRISPR/Cas9-medieret udskæring efterfulgt af vækst fænotype overvågning. I denne rapport beskriver vi den detaljerede protokol til at producere in vitro-afledte EA og til at udnytte den axeniske amastigote i knockout eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: En oversigt over hele forsøgs strømmen er afbildet i figur 1.

Figure 1
Figur 1: oversigt over udskærings eksperimentet med EA. Vævskultur-afledte trypomastigoter høstes og differentieres i EA. grna omdannes til Cas9-udtrykker amastigoter ved elektroporation, og vækst fænotype af knockout amastigote evalueres enten ved axeniske replikation eller ved intracellulær replikering efter vært celle invasion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

1. kultur præparater til parasitter

  1. Tulahuen stamme af Trypanosoma cruzi anvendes i hele denne rapport. Oprethold epimastigotes af T. cruzi i oplyst medium (10% FCS, se supplerende tabel 1). Luk hætten sikkert, og hold dyrknings kolben ved 28 °C.
  2. Generer en transgene stamme af T. cruzi , der huser Cas9 endonuclease. Eksempler på udtryks plasmider, som indeholder Cas9-kodnings sekvens og G418 (neor)-markeringsmarkør, findes i lander et al.4 og Peng et al.5
    1. Transfect ovenstående plasmid i epimastigote ved elektroporation, ved hjælp af kit, der er anført i tabellen over materialer. For 1 kuvette, spin ned 2 x 107 celler, kassér supernatanten, og resuspension med 100 μl elektroporations buffer indeholdende den medfølgende supplement løsning.
      Bemærk: Elektroporations bufferen kan erstattes med EM-buffer24 (3:1-blanding af cytomix25 og fosfat-saccharose-buffer).
    2. Tilsæt 20-40 μg plasmid og Overfør blandingen til en 2 mm Gap elektroporation cuvette. Påfør pulsen med en elektroporations anordning (Se tabel over materialer) ved hjælp af X-14-programmet26.
    3. Cuvette indholdet overføres til en T-25 kolbe, der indeholder 5 mL oplyst medium (10% FCS). Flasken inkubates ved 28 °C i 24 timer.
    4. Der tilsættes G418 til en endelig koncentration på 250 μg/mL, og inkubationen fortsættes ved 28 °C. Det tager omkring 1 uge at dræbe de ikke-transfected epimastigotes. Når den G418-resistente population begynder at genvinde, passage kulturen en eller to gange om ugen for at undgå mætning og til at fortynde de døde celler. Etablering af en stabil cellelinje tager normalt i alt 4 uger.
      Bemærk: Hvis konstitutiv ekspression af Cas9 er en byrde for cellen5, skal du gøre udtrykket specifikt for amastigote scenen ved at konjugere 3 '-UTR af amastin genet umiddelbart efter den Cas9 åbne læse ramme27. Den detaljerede beskrivelse af det amastigote-specifikke Cas9 Expression plasmid findes i Takagi et al.22
  3. Etablere en vært-parasisite Co-kultur af Cas9-udtrykker T. cruzi og pattedyr Host celler. I denne rapport skal du bruge 3T3-Swiss albino fibroblast Cell som vært.
    1. Skelne T. cruzi epimastigotes ind i metacyclic trypomastigotes. Bestem celletætheden af epimastigote-kulturen ved hjælp af et hemocytometer og saml 5 x 107 celler ved centrifugering i 15 min ved 2.100 x g. Supernatanten kasseres, og cellerne opslæmmes med 10 mL RPMI-medium. Parasiteten inkubates ved 28 °C i 1 uge28.
    2. Saml metacyclic trypomastigotes i RPMI medium. Hæld forsigtigt kolben og pipet ud af opløsningen uden at forstyrre parasitterne, som er klæbet fast til den nederste overflade. Overføres mediet til et konisk rør og centrifugeres i 15 minutter ved 2.100 x g. Supernatanten kasseres, og parasistedet resuspenderes med 5 mL DMEM (10% FCS).
      Bemærk: Parasit populationen er en blanding af metacycliske trypomastigoter, epimastigoter, og nogle mellemliggende former. Selvom det ikke er nødvendigt, kan du isolere trypomastigote ved DEAE ionbytningskromatografi29. Alternativt kan epimastigoter elimineres ved at inkube parasitter med aktivt serum for at underkaste dem et supplement til lysis30.
    3. Seed 3T3-Swiss albino fibroblast celle til 60-70% konfluency, eller ca. 1,7-2,0 x 106 celler i 5 ml DMEM (10% FCS) i T-25 kultur kolbe. Fjern vækstmediet og Anvend parasimin blandingen fra trin 1.3.2. Inkubér i 24 timer ved 37 °C under 5% CO2 i en befuret inkubator for at etablere infektion.
    4. Fjern parasitter resterende uden for værten 3T3 celler ved at vaske Co-kultur med DMEM (10% FCS) to gange.
    5. Når Co-kulturen er mættet, passage amastigote-inficerede Host celler ved trypsinization. Aspirer mediet og skyl kulturen én gang med PBS. Anvend 1 mL 0,05% trypsin-opløsning til at dække hele dyrknings overfladen, og Inkuber i få minutter ved stuetemperatur, indtil de tilknyttede værtsceller bliver løse. Cellerne afmonteres fra kolbens overflade ved at skylle 3 mL DMEM (10% FCS) over cellerne.
    6. Overfør fritliggende værtsceller til et konisk rør, og centrifuger i 3 minutter ved 300 x g. Aspirér supernatanten og resuspension cellerne med 3 mL frisk DMEM (10% FCS). Dette trin hjælper med at eliminere de resterende epimastigoter. Overføres alle til en ren T-75 kolbe indeholdende 9 mL DMEM (10% FCS). Fortsæt dyrkning, indtil trypomastigote frigives til kultur supernatanten.
    7. Opretholde Co-kulturen ved at passaging med trypsinisering to gange om ugen. Når 70-80% af værts populationen bliver smittet, tilsættes regelmæssigt ikke-inficerede vært 3T3 celler i forholdet 5:1 (overførsel: frisk), for at undgå kultur forringelse. Trypomastigote egresses kontinuerligt, hvis balancen mellem værtscellerne og T. cruzi vedligeholdes korrekt.

2. differentiering af Trypomastigoter i EA

  1. På dagen før dette eksperiment, fjerne vækstmedium af vært-parasisite Co-kultur og tilføje frisk DMEM (10% FCS) at vaske væk EA og trypomastigotes, der allerede var blevet frigivet fra værtscellerne i de foregående dage. Regelmæssige eksperimenter kræver mindst to T-75 kolber af flydende Co-kultur.
  2. Saml kultur supernatanten i et konisk rør for at høste frisk opdukkede trypomastigotes. Kontroller prøven under et mikroskop (10x eller 20x objektiv linse) for kvaliteten. Hvis der er værtscelle rester, centrifugeres prøven kortvarigt, og supernatanten overføres til et nyt rør. Hvis der er et betydeligt antal EAs, isoleres trypomastigotes ved følgende svømmeprocedure.
    1. Spin ned blandingen af trypomastigotes og amastigotes i 15 min på 2.100 x g. Kassér det meste af supernatanten og efterlader 0,5-1,0 mL medium i røret.
      Bemærk: reducering af lydstyrken er valgfri, men det gør følgende trin lettere.
    2. Inkuber pellet ved 37 °C i 1-2 timer, så aktive trypomastigoter kan svømme ud af pellet (figur 2).
    3. Supernatanten, der indeholder trypomastigoter, overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
  3. Centrifuger det koniske rør i 15 minutter ved 2.100 x g for at indsamle trypomastigoter. Hvis svømme-ud-proceduren blev udført ovenfor, centrifugeres 1,5 mL røret i 2 min ved 4.000 x g for at pille trypomastigote. Kassér supernatanten.
  4. Resuspension af pellet med 5 mL DMEM Buffered med 20 mM MES (pH 5,0), suppleret med 0,4% BSA19. Parasit-en skal overføres til en kultur kolbe, der ikke er 25. Lad hætten være løs. Celletætheden skal være omkring eller under 1 x 107 celler/ml, da overmætning øger chancen for celledød.
    Bemærk: Farven på DMEM skal være gul, ikke orange. Hvis den oprindelige DMEM havde en høj bufferings kapacitet, er 20 mM MES (pH 5,0) ikke nok til at sænke pH-værdien. PH-værdien i mediet skal justeres ved tilsætning af HCl i dette tilfælde. Det sure medium kan opbevares ved 4 °C, men ikke længere end 1 måned.
  5. Dyrknings kolben inkubates ved 37 °C under 5% CO2 i en befuret inkubator. Omkring 95% af parasitter differentiere i amastigoter efter 24 h.

3. Elektro portering af EA

  1. Forbered gRNA til elektroporation. Dette kan gøres ved in vitro transskription, eller blot ved at købe syntetiske RNA-oligonukleotider fra en producent. I denne rapport anvendes crRNA og tracrRNA fra integrerede DNA-teknologier, Inc..
  2. Centrifuger kulturen i EAs i 15 minutter ved 2.100 x g. Kassér supernatanten.
  3. Resuspendere pellet med elektro poration buffer indeholder medfølgende supplement løsning til den endelige celletæthed på 1 x 108 celler/ml.
    Bemærk: EM-buffer forårsager flere celledød i forhold til den elektro poration buffer, der er anført i tabel over materialer; Derfor anbefales det ikke for amastigote transfektering (supplerende figur 1).
  4. Alikvot 100 μL af resuspenderede parasitter (1 x 107 celler) i 1,5 ml mikrocentrifuge glas. Tilsæt 5-10 μg gRNA, og bland forsigtigt ved pipettering.
  5. Overfør blandingen til en 2 mm Gap elektroporation kuvette. Påfør pulsen med elektro portering enhed, ved hjælp af X-14 program.
  6. Cuvette-indholdet overføres til en T-25-kolbe, der indeholder 5 mL præ-opvarmet TÆNDTE medium (10% FCS). Lad hætten gå løs og Inkuber kolben ved 37 °C under 5% CO2.
  7. Overvåge cellevæksten enten ved fortsættelse af axeniske-dyrkning (afsnit 4) eller som intracellulære amastigoter efter værtscelle infektion (afsnit 5).

4. overvågning af væksten af knockout celler som axenic amastigotes

  1. EAs bosætter sig i bunden af dyrkningsmediet, så Ryst forsigtigt kolben for at resuspendere dem i opløsningen. Vask af kolbens overflade ved pipettering hjælper, da nogle celler klæber til kolben.
  2. 1 μl propidium kaliumiodid (PI) opløsning (20 μg/ml) blandes med 20 μl amastigote-kultur.
    Bemærk: Lad ikke dyrknings kolben stå uden for inkubator i længere tid end nødvendigt. Temperatur er en af faktorer, der muliggør axeniske proliferation22.
  3. Påfør prøven på hemocytometer og observere under et fluorescens mikroskop. PI er beregnet til beskadigede celle membran, men er udelukket fra levende celler. Tæl antallet af levedygtige amastigoter, der ikke farves af PI (ex/EM 570 nm/602 nm).

5. overvågning af væksten af knockout-celler som intracellulære Amastigoter

  1. Seed Host 3T3 celler i en 12-brønd plade med DMEM (10% FCS). Juster celletætheden til 70-80% konfluency eller ca. 3 x 105 celler pr. brønd.
    Bemærk: Da amastigotes ikke er motile, dækker de fleste af vækst overfladen af værtscellerne forbedrer infektions effektiviteten.
  2. Saml knockout-amastigoter fra trin 3,6 ved at centrifugeres en dag efter elektroporation. Supernatanten kasseres, og parasiden opslæmmes med 2 mL DMEM (10% FCS).
  3. Fjern medium fra værten cellekultur og anvende opslæmmet amastigotes. Multiplicitet af infektion bør være 20 eller højere. Pladen inkubates ved 37 °C under 5% CO2 i 2 dage for at give amastigotes mulighed for at etablere infektion.
    Bemærk: Infektion periode kan være 1 dag, afhængigt af formålet.
  4. Vask væk EAs forblev uden for værtscellerne to gange med DMEM (10% FCS).
  5. Tilsæt frisk DMEM (10% FCS) til værten-parasiten Co-kultur og fortsætte inkubationen ved 37 °C i yderligere 2 dage.
  6. For at evaluere infektions effektivitet, visualisere kerner af værtscellerne og intracellulære amastigote.
    Bemærk:
    kerner tendens til at blive overlappet i mættet Co-kultur. Re-plating cellerne ved lavere celletæthed (såsom 1:5 fortynding) før fiksering og farvning hjælper med at tælle kerner lettere.
    1. Fjern dyrkningsmediet, og Anvend 1 mL 10% formalin-opløsning i PBS for at fastsætte cellerne. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
    2. Formalin-opløsningen udskiftes med 1 mL PBS, der indeholder 1 μg/mL Hoechst 33342 og 0,1% Triton X-100. Inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur.
    3. Fjern Hoechst-opløsningen, og skyl cellerne én gang med PBS. Tilsæt 1 mL frisk PBS.
  7. Observere under fluorescens mikroskop og identificere Host cellekerner, der er forbundet med mindre parasitations kerner (figur 4). Værtsceller, der indeholder mere end 2 amastigoter, bør betragtes som inficerede, ikke at inkludere ikke-produktive Initial infektion eller uvasket EAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering af trypomastigotes ved svømme proceduren

For at høste friske trypomastigotter fra kontaminerende gamle EAs ved svømnings procedure, skal celle pellets inkuberet i det mindste for 1 h. inkuberet pellets i mere end 2 h øger ikke signifikant antallet af trypomastigotes svømning i opløsningen ( Figur 2b). I dette særlige eksperiment var procentdelen af trypomastigote i den oprindelige blanding 38%, og procentsatsen efter svømningen var over 98% på et givent tidspunkt. Fra to T-75 kolber af flydende Co-Culture, får vi rutinemæssigt 3-4 x 107 celler af Pure trypomastigote ved denne Swim-out protokol.

Vækst overvågning af knockout amastigote som axeniske kultur

I modsætning til andre udviklingsmæssige stadier af T. cruzier flagellar-mindre amastigoter praktisk taget statisk. Således, farvning med PI hjælper med at skelne levende amastigotes fra døde dem. PI er uigennemtrængelig for den intakte celle membran, men trænger let ind i døde celler (figur 3a). Amastigotes transficeret med grna mod Essential gen, TcCGM1 (tcclb. 511807.80), viste en signifikant vækst defekt sammenlignet med kontrolgruppen, der modtog grna ikke homologe til T. cruzi genom (figur 3b).

Vækst overvågning af knockout parasitter som intracellulære amastigoter

Den væsentlighed af målgenet i amastigote fase kan også påvises ved evaluering af vækst fænotype knockout T. cruzi som intracellulære amastigote (figur 4). Den brøkdel af Host kerner, der er forbundet med mindre T. cruzi kerner var betydeligt lavere i TcCGM1-ko gruppe sammenligne med kontrolgruppen.

Knockout af et fase specifikt gen forårsager fænotypisk forskel i amastigote og trypomastigote stadier

Paraflagellar stang komponent PAR1 er stærkt udtrykt i trypomastigote fase, men er nedreguleret i amastigote fase af T. cruzi22,31. Faktisk, transfektering af grna mod TcPAR1 (tcclb. 506755.20) ikke signifikant påvirke væksten af EA efter 4 dage af axeniske dyrkning (figur 5b). grna transfektering efterfulgt af vært celle invasion viste også, at TcPAR1-ko ikke hæmmer væksten af intracellulære amastigotes, i form af den brøkdel af inficerede Host celler på 4 dage efter infektion (figur 5c). Antallet af parasitter i den enkelte værtscelle syntes ikke at være påvirket af knockout, enten (supplerende figur 2). Disse resultater indikerer, at TcPAR1 ikke er afgørende i amastigote fase af T. cruzi.

Antallet af trypomastigoter opstod dog ud af værtscellerne ved 5 dage efter infektion var signifikant lavere i TcPAR1-ko Co-kultur, sammenlignet med kontrol Co-kultur (figur 5D). Også differentierede trypomastigoter inden for vært 3T3 celle før egression syntes at være ganske aktiv i kontrolgruppen (supplerende film 1), men syntes træg i TcPAR1-ko gruppe (supplerende film 2). Disse resultater tyder på, at TcPAR1 spiller en vigtig rolle i trypomastigote fase af T. cruzi, formentlig ved at give motilitet til at hjælpe egression, på trods af sin ikke-væsentlighed i amastigote fase.

Figure 2
Figur 2: isolering af trypomastigote ved svømme-ud-proceduren. A) skematisk gengivelse af protokollen. Rød = tilstedeværelse af trypomastigote. B) antallet af trypomastigoter, der har svømmet ud af pellet på angivne tidspunkter. Oprindelige pellets indeholdt i alt 3 x 107 parasitter, 38% af dem var trypomastigotes og resten var amastigotes. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer, og middelværdien (± SD) afbildes. Renheden af trypomastigotes i opløsning var over 98% på et givent tidspunkt. (C) mikroskopi billeder af parasitter før svømnings procedure (venstre), trypomastigoter, der har svømmet ud af en pellet (midten), og parasitter tilbage i en pellet (højre) efter 1 h inkubation. Skala stænger = 10 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: vækst overvågning af axeniske amastigote. A) udelukkelses analyse af propidium kaliumiodid (PI). Mikroskopi billeder af EA på et hemocytometer i lyse felt (venstre), fluorescens kanal (midten), og overlagt billede (højre). Gule pile indikerer PI-farvede døde celler. Skala stænger = 20 μm. (B) celletal af Cas9-udtrykker amastigoter efter transfektering med grnas mod TcCGM1 (åben cirkel) og kontrol grna uden homologi til T. cruzi genom (lukket cirkel). Elektro porationer blev udført i tre eksemplarer, og middelværdierne (± SD) afbildes. (* * p < 0,01 af welchs t-test). Dette tal er blevet modificeret fra Takagi et al.22venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: vækst af knockout amastigotes efter vært invasion. (A) nuklear farvning af værten-parasisite Co-kultur efter intracellulær replikering af amastigotes transficeret med grnas mod TcCGM1 og kontrol grna. gRNA-transfected EAs blev anvendt på 3T3 celler 1 dag efter elektroporation og fik lov til at inficere værtsceller i 2 dage. Amastigoter forblev uden for værtscellerne blev skyllet væk, og værten-parasisite Co-kultur blev inkuberet i yderligere 2 dage. Skala stænger = 20 μm. Dette tal er blevet modificeret fra Takagi et al.22 (B) procentdel af Host 3T3 celler inficeret af Control amastigotes (Black bar) og TcCGM1-ko amastigotes (grå bar). Middelværdien (± SD) af tre infektions forsøg afbildes (* * p < 0,01, welchs t-test). Dette tal er blevet modificeret fra Takagi et al.22venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: fænotypisk forskel mellem knockout amastigote og differentieret trypomastigote. (A) skematisk gengivelse af eksperimentel tidslinje. (B) celletal af axeniske amastigote ved 4 dage efter transfektering for Control amastigotes (Black bar) og TcPAR1-ko amastigotes (grå bar). Middelværdier (± SD) af tre elektroporations forsøg afbildes (n.s.: ikke signifikant, Mann-Whitney U test). (C) procentdel af inficerede vært 3T3 celler på 4 dage efter infektion af Control amastigote (Black bar) og TcPAR1-ko amastigote (grå bar). Middelværdier (± SD) af tre kultur brønde afbildes (n.s.: ikke signifikant, Mann-Whitney U test). (D) antal trypomastigote frigivet til kulturmedium på 5 dage efter infektion for kontrol Co-kultur (Black bar) og TcPAR1-ko Co-kultur (grå bar). Middelværdier (± SD) af tre kultur brønde afbildes (* p < 0,05, Mann-Whitney U test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende tabel 1: sammensætning af oplyst medium. LIT medium blev fremstillet i henhold til ATCC 1029, bortset fra mængden af dinatriumhydrogenphosphat. Venligst klik her for at downloade tabellen.

Supplerende figur 1: effekt af elektro poration buffer på amastigote cellelevedygtighed. EA blev elektroporeret enten i elektroporations buffer eller i EM-buffer. Amastigote blev plettet med PI efter 24 timer for at tælle antallet af levende og døde amastigoter. Procentdelen af døde celler i hver gruppe og i No Pulse-gruppen afbildes. Middelværdien (± SD) af tre elektroporations forsøg vises (* p < 0,05, n.s.: ikke signifikant, Krubør-Wallis-test). Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 2: mikroskopi billeder af atomar farvede TcPAR1-ko og kontrol intracellulære amastigotes. Co-kultur af Host 3T3 celler og transficeret amastigotes blev fastsat og plettet på 4 dage efter infektion. Skala stænger: 20 μm. Klik her for at downloade figuren.

Supplerende figur 3: vækst fænotype af Cas9-udtrykker epimastigote. Celletal af dværg epimastigotes (WT), epimastigoter, der konstitutivt udtrykker Cas9-egfp (Cas9-egfp), og epimastigoter, der udtrykker Cas9-egfp under reguleringen af amastigote-specifikke 3 '-UTR (Cas9-egfp-amautr) er afbildet i log skala Epimastigoter blev dyrket i oplyst medium (10% FCS) ved 28 °C. Parasisite celletæthed blev justeret til 1 x 106 celler/ml på dag 0. Kumulative celletal beregnes som celletæthed ganget med den totale fortyndingsfaktor. Middelværdien (± SD) af tre kultur kolber vises (* p < 0,05, n.s.: ikke signifikant, Krubør-Wallis-test). Venligst klik her for at downloade figuren.

Supplerende film 1: Microscopy video billede af kontrol Co-kultur. Antal og aktivtivitet af trypomastigoter, der har differentieret fra kontrol amastigoter. Video billede på 5 dage efter infektion vises.  Venligst klik her for at downloade filmen.

Supplerende film 2: Microscopy video billede af TcPAR1-ko Co-kultur. Antal og aktivtivitet af trypomastigoter, der har differentieret fra TcPAR1-KO amastigotes. Video billede på 5 dage efter infektion vises. Venligst klik her for at downloade filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi viste, at den axeniske kultur af T. cruzi amastigotes kan udnyttes i crispr/Cas9-mediated gen knockout, ved at elektro porating grna direkte ind i Cas9-udtrykker EA. På denne måde kan den væsentlighed af målgenet specifikt i amastigote fase evalueres uden at gå gennem andre udviklingsmæssige stadier.

En anden gavnlig aspekt af amastigote transfektering er den bekvemmelighed i test for et stort antal målgener. Når Co-kulturen af Cas9-udtrykker T. cruzi og vært pattedyr celle er etableret, det tager kun få dage at omdanne den vævs-afledte trypomastigotes til EA og transficere grna at opnå knockout amastigotes. gRNA er det eneste materiale, der skal skræddersys til hvert målgen, men syntetisk gRNA er tilgængeligt fra antallet af producenter, så det kan simpelthen købes. En alternativ metode til at analysere den fase specifikke væsentlighed af Target gener ville være at etablere en inducerbar knockout system32. I så fald skal plasmider konstrueres for hvert målgen og overføres til parasitten i epimastigote stadiet for at muliggøre lægemiddel udvælgelse af transfectanterne, da plasmid-transfektiviteten er meget lavere end for gRNA (< 15% for plasmid 26 som formodes at > 96% for grna22). Udvalgte transfectanter skal differentieres i metacyclic trypomastigotes for at inficere værtscellerne til endelig at inducere en udskæring i intracellulær amastigote. Hele denne proces ville tage 1-2 måneder.

I denne rapport brugte vi pi til at skelne døde celler i axeniske amastigote kultur for at kvantificere celletætheden med et hemocytometer. Alternativt kan metaboliske assays såsom resazurin levedygtighed assay anvendes til at estimere antallet af levende amastigotes, som er mere egnet til et højt gennemløb format. I vores hænder, 1 x 105 amastigotes pr brønd udbytte tilstrækkelig redox aktivitet, der skal påvises ved en resazurin assay efter 5 h inkubation.

En ulempe ved at etablere en Cas9-ekspressiv cellelinje er den potentielle cellulære byrde og ikke-specifik spaltning på grund af Cas9 overekspression5,33. Der er flere rapporter, der viser, at konstitutiv udtryk for Cas9 har ingen indflydelse på væksten i T. cruzi4,6,7,8. Men i et tilfælde5 og også i vores hænder, Cas9-udtrykker parasitat viste langsom vækst sammenlignet med wildtype. For at overvinde dette spørgsmål, vi ansat den amastigote-specifikke 3 '-UTR at begrænse ekspression af Cas9 til amastigote etape22. Konjugering af amastin 3 '-UTR til den Cas9 åbne læse ramme genoprettede replikeringsprocenten for transgene parasitter (supplerende figur 3), hvorved man producerede robust vært-parasisite-Co-kultur til kontinuerligt at levere trypomastigoter til in vitro amastigogenesis. For nylig, andre grupper har vist, at indførelsen af grna/Cas9 RNP kompleks til dværg parasit kan forårsage genomredigering i T. cruzi7,9. Denne metode bør undersøges som en mindre stressende tilgang til parasitstedet9, da undersøgelsen i pattedyrceller tyder på, at brugen af RNP reducerer uønsket off-Target genomredigering, på grund af den korte halveringstid af Cas9 protein34.

En anden valgfri ændring af protokollen ville være co-transfection af donor-DNA som en skabelon for homologe rekombination. Det er blevet rapporteret, at donor-DNA, der indeholder homologe sekvenser til opstrøms og nedstrøms for spaltningen, i form af enten dobbeltstrenget DNA4,5,8,35 eller enkeltstrenget oligonucleotid7,9, letter reparationsprocessen af dobbelt-strandede pause forårsaget af Cas9 nuclease. Selv om nogle rapporter indikerer, at microhomology medieret end at slutte sig til uden donor skabelon kan reparere kavalergang og indføre en sletning mutation5, indførelse af den definerede sekvens til mutation site ikke desto mindre hjælper med at bekræfte vellykket genomredigering, fordi det er svært at vise DNA-beviset for gen knockout i nogle tilfælde, selv om målet protein reduktion og fænotypiske udfald tyder på målgenet blev muteret4.

Cas9/grna RNP transfektering og co-transfektering af et donor-DNA påvises ikke i denne rapport for at forenkle beskrivelsen af protokollen og for at fokusere på forberedelsen af EA og anvendelsen af axeniske-kulturen derefter. Hvis man ønsker at udføre disse eksperimenter, kan det gøres ved blot at udskifte komponenterne i elektro portering.

Vores metode til at udnytte EA af T. cruzi som et eksperimentelt værktøj kan potentielt muliggør en række fase specifikke undersøgelser, herunder forbigående genekspression ved plasmid transfektering og Drug effekt test22. Virkningen af denne fremgangsmåde er imidlertid kun blevet afprøvet i Tulahuen-stammen hidtil. Da stammer af T. cruzi er ganske forskelligartede, anvendelse af denne protokol til andre stammer skal undersøges.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af JSPS KAKENHI Grant nummer 18K15141 til Y.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% formalin solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 068-03863 fixing cells
25 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3100-025
75 cm2 double seal cap culture flask AGC Techno Glass 3110-075
All-in One Fluorescence Microscope Keyence BZ-X710
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for Control) IDT custom made target sequence = GGACGGCACCTTCATCTACAAGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcCGM1) IDT custom made target sequence = TAGCCGCGATGGAGAGTTTATGG
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA (for TcPAR1) IDT custom made target sequence = CGTGGAGAACGCCATTGCCACGG
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA IDT 1072532 to anneal with crRNA
Amaxa Nucleofector device LONZA AAN-1001 electroporation
Basic Parasite Nucleofector Kit 2 LONZA VMI-1021 electroporation
BSA Sigma-Aldrich A3294 component of the medium for in vitro amastigogenesis
Burker-Turk disposable hemocytometer Watson 177-212C cell counting
Coster 12-well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Corning 3513
DMEM FUJIFILM Wako Pure Chemical 044-29765 culture medium
Fetal bovine serum, Defined Hyclone SH30070.03 heat-inactivate before use
G-418 Sulfate Solution FUJIFILM Wako Pure Chemical 077-06433 selection of transformant
Hemin chloride Sigma-Aldrich H-5533 component of LIT medium
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 staining of nuclei
Liver infusion broth, Difco Becton Dickinson 226920 component of LIT medium
MES FUJIFILM Wako Pure Chemical 349-01623 component of the medium for in vitro amastigogenesis
PBS (–) FUJIFILM Wako Pure Chemical 166-23555
Propidium Iodide Sigma-Aldrich P4864-10ML staining of dead cells
RPMI 1646 Sigma-Aldrich R8758 medium for metacyclogenesis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. (WHO) Fact sheet: Chagas disease (American trypanosomiasis). , [updated 2017 Mar; cited 2017 Aug], at http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/ (2017).
  2. Clayton, J. Chagas disease 101. Nature. 465 (n7301_supp), S4-S5 (2010).
  3. Apt, W. Current and developing therapeutic agents in the treatment of Chagas disease. Drug Design, Development and Therapy. 4, 243-253 (2010).
  4. Lander, N., Li, Z. H. H., Niyogi, S., Docampo, R. CRISPR/Cas9-induced disruption of paraflagellar rod protein 1 and 2 genes in Trypanosoma cruzi reveals their role in flagellar attachment. mBio. 6 (4), e01012 (2015).
  5. Peng, D., Kurup, S. P., Yao, P. Y., Minning, T. A., Tarleton, R. L. CRISPR-Cas9-mediated single-gene and gene family disruption in Trypanosoma cruzi. mBio. 6 (1), e02097-e02114 (2015).
  6. Romagnoli, B. A. A., Picchi, G. F. A., Hiraiwa, P. M., Borges, B. S., Alves, L. R., Goldenberg, S. Improvements in the CRISPR/Cas9 system for high efficiency gene disruption in Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 178, 190-195 (2018).
  7. Burle-Caldas, G. A., Soares-Simões, M., Lemos-Pechnicki, L., DaRocha, W. D., Teixeira, S. M. R. Assessment of two CRISPR-Cas9 genome editing protocols for rapid generation of Trypanosoma cruzi gene knockout mutants. International Journal for Parasitology. 48 (8), 591-596 (2018).
  8. Costa, F. C. Expanding the toolbox for Trypanosoma cruzi: A parasite line incorporating a bioluminescence-fluorescence dual reporter and streamlined CRISPR/Cas9 functionality for rapid in vivo localisation and phenotyping. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (4), e0006388 (2018).
  9. Soares Medeiros, L. C. High-Efficiency Genome Editing in Protozoan Parasites Using CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins. mBio. 8 (6), (2017).
  10. Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An axenic amastigote system for drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (4), 818-822 (1997).
  11. Bates, P. A. Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitology Today. 9 (4), 143-146 (1993).
  12. Ravinder, R., Bhaskar, B., Gangwar, S., Goyal, N. Development of luciferase expressing Leishmania donovani axenic amastigotes as primary model for in vitro screening of antileishmanial compounds. Current Microbiology. 65 (6), 696-700 (2012).
  13. Nühs, A. Development and Validation of a Novel Leishmania donovani Screening Cascade for High-Throughput Screening Using a Novel Axenic Assay with High Predictivity of Leishmanicidal Intracellular Activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), 1-17 (2015).
  14. De Rycker, M. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  15. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  16. Pescher, P., Blisnick, T., Bastin, P., Späth, G. F. Quantitative proteome profiling informs on phenotypic traits that adapt Leishmania donovani for axenic and intracellular proliferation. Cellular Microbiology. 13 (7), 978-991 (2011).
  17. Andrews, N. W., Hong, K. S. U., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Stage-specific surface antigens expressed during the morphogenesis of vertebrate forms of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 64 (3), 474-484 (1987).
  18. Pan, S. C. Trypanosoma cruzi: intracellular stages grown in a cell-free medium at 37 C. Experimental Parasitology. 45 (2), 215-224 (1978).
  19. Tomlinson, S., Vandekerckhove, F., Frevert, U., Nussenzweig, V. The induction of Trypanosoma cruzi trypomastigote to amastigote transformation by low pH. Parasitology. 110 (05), 547 (1995).
  20. Ley, V., Andrews, N. W., Robbins, E. S., Nussenzweig, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine. 168 (0022-1007 (Print)), 649-659 (1988).
  21. Bonfim-Melo, A., Ferreira, E. R., Florentino, P. T. V., Mortara, R. A. Amastigote Synapse: The Tricks of Trypanosoma cruzi Extracellular Amastigotes. Frontiers in Microbiology. 9, 1341 (2018).
  22. Takagi, Y., Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K. Utilization of proliferable extracellular amastigotes for transient gene expression, drug sensitivity assay, and CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in Trypanosoma cruzi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 13 (1), e0007088 (2019).
  23. Fernandes, J. F., Castellani, O. Growth characteristics and chemical composition of Trypanosoma cruzi. Experimental Parasitology. 18 (2), 195-202 (1966).
  24. Oberholzer, M., Lopez, M. A., Ralston, K. S., Hill, K. L. Approaches for Functional Analysis of Flagellar Proteins in African Trypanosomes. Methods in Cell Biology. 93, 21-57 (2009).
  25. van den Hoff, M. J. B., Moorman, A. F. M., Lamers, W. H. Electroporation in ‘intracellular’ buffer increases cell survival. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2902-2902 (1992).
  26. Pacheco-Lugo, L., Díaz-Olmos, Y., Sáenz-García, J., Probst, C. M., DaRocha, W. D. Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection. Parasitology International. 66 (3), 236-239 (2017).
  27. Coughlin, B. C., Teixeira, S. M., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Amastin mRNA abundance in Trypanosoma cruzi is controlled by a 3’-untranslated region position-dependent cis-element and an untranslated region-binding protein. The Journal of Biological Chemistry. 275 (16), 12051-1260 (2000).
  28. Shaw, A. K., Kalem, M. C., Zimmer, S. L. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere. 1 (2), (2016).
  29. Chao, D., Dusanic, D. G. Comparative studies of the isolation of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi by DEAE ion exchange chromatography. Zhonghua Minguo wei sheng wu ji mian yi xue za zhi (Chinese Journal of Microbiology and Immunology). 17 (3), 146-152 (1984).
  30. Nogueira, N., Bianco, C., Cohn, Z. Studies on the selective lysis and purification of Trypanosoma cruzi. The Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 224-229 (1975).
  31. Minning, T. A., Weatherly, D. B., Atwood, J., Orlando, R., Tarleton, R. L., Tarleton, R. L. The steady-state transcriptome of the four major life-cycle stages of Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 10, 370 (2009).
  32. Rico, E., Jeacock, L., Kovářová, J., Horn, D. Inducible high-efficiency CRISPR-Cas9-targeted gene editing and precision base editing in African trypanosomes. Scientific Reports. 8 (1), 7960 (2018).
  33. Fu, Y. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  34. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  35. Chiurillo, M. A., Lander, N., Bertolini, M. S., Storey, M., Vercesi, A. E., Docampo, R. Different roles of mitochondrial calcium uniporter complex subunits in growth and infectivity of Trypanosoma cruzi. mBio. 8 (3), e00574-e00617 (2017).

Tags

Genetik crispr/Cas9 gen knockout Stage-specifikke Trypanosoma cruzi Chagas sygdom kinetoplastid parasit Drug Target axeniske kultur amastigote
Introduktion af et gen knockout direkte i den Amastigote fase af <em>Trypanosoma cruzi</em> ved hjælp af Crispr/Cas9 system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K.,More

Akutsu, Y., Doi, M., Furukawa, K., Takagi, Y. Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System. J. Vis. Exp. (149), e59962, doi:10.3791/59962 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter