En nøyaktig og robust polymerase Chain reaksjons BAS ert analyse for kvantifisere cytosin-Guanin-Guanin trinucleotide gjentar i skjøre X mental retardasjon-1-genet Letter molekylær diagnose og screening av skjøre X syndrom og skjøre X-relaterte med kortere sving rundt tid og investering i utstyr.
Skjøre X syndrom (FXS) og tilknyttede lidelser er forårsaket av utvidelse av cytosin-Guanin-Guanin (CGG) trinucleotide gjentar i 5 ‘ uoversatt region (UTR) av skjøre X mental retardasjon-1 (FMR1) Gene promoter. Konvensjonelt, kapillær elektroforese fragment analyse på en genetisk analysator brukes for dimensjonering av CGG repetisjoner av FMR1, men ytterligere Southern blot analyse er nødvendig for nøyaktig måling når repetisjons tallet er høyere enn 200. Her presenterer vi en nøyaktig og robust polymerase kjedere reaksjons metode (PCR) basert på kvantifisering av CGG repetisjoner av FMR1. Det første trinnet i denne testen er PCR forsterkning av gjenta sekvenser i 5 ‘ UTR av FMR1 arrangøren ved hjelp av en SKJØR X PCR Kit, etterfulgt av rensing av PCR-produkter og fragment dimensjonering på en mikrovæskebasert kapillær elektroforese instrument, og tolkning av antall CGG-repetisjoner ved å henvise til standarder med kjente repetisjoner ved hjelp av analyseprogramvaren. Dette PCR-baserte analysen er reproduserbar og i stand til å identifisere hele spekteret av CGG repetisjoner av FMR1 arrangører, inkludert de med en gjentakelse antall mer enn 200 (klassifisert som full mutasjon), 55 til 200 (premutation), 46 til 54 (middels), og 10 til 45 (normal). Det er en kostnadseffektiv metode som forenkler klassifisering av FXS og skjøre X-assosierte lidelser med robusthet og rask rapporterings tid.
Skjøre X syndrom (FXS) og skjøre X assosierte lidelser, f. eks, tremor og ataksi syndrom (FX-TAS), og primære eggstokkene insuffisiens (FX-POI) er hovedsakelig forårsaket av cytosin-Guanin-Guanin (CGG) trinucleotide gjenta ekspansjon i 5 ‘ uoversatt region (UTR) av den skjøre X mental retardasjon-1 (FMR1) genet på xQ 27.31,2. Den FMR1 kodet PROTEIN (FMRP) er en polyribosome-assosiert RNA-binding protein som fungerer i neuronal utvikling og Synaptic plastisitet ved å regulere alternative skjøting, stabilitet, og dendrittiske transport av mRNA eller modulerende syntese av delvis postsynaptic proteiner3,4,5,6,7.
Den dynamiske variasjonen med en CGG på > 200 er beskrevet som full mutasjon, noe som induserer den avvikende hypermethylation og påfølgende transcriptional demping av FMR1 arrangøren8. Den resulterende fravær eller mangel på FMRP protein forstyrrer normal neuronal utvikling og forårsaker FXS9, karakterisert ved ulike kliniske symptomer, inkludert moderat til alvorlig intellektuell funksjonshemming, utviklingsmessige forsinkelse, hyperaktiv atferd, fattige kontakter og autistiske manifestasjoner10,11,12. Presentasjonen i kvinnelige FXS pasienter er generelt mildere enn i menn. Det CGG gjentagelse størrelse oppstiller fra 55 å 200 og 45 å 54 er hemmelig idet premutation og mellomliggende rang, respectively. På grunn av den høye graden av ustabilitet, CGG gjenta størrelse i en premutation eller middels allel antagelig utvides når overføres fra foreldre til avkom13,14. Dermed, bærere med premutation alleler har høy risiko for å få barn rammet med FXS på grunn av gjenta ekspansjon, og i noen tilfeller kan mellomliggende alleler utvide sin gjenta størrelse til full mutasjon området over to generasjoner15, 16i den. Videre, hanner med premutation også formidle økt risiko for å utvikle sen-utbruddet FX-tas17,18,19, mens premutation kvinner er disponert for både FX-tas og FX-POI20, 21,22. Nylig har det blitt rapportert at autistiske spektrum lidelser med utviklingsmessige forsinkelser og problemer i sosial atferd er presentert hos barn med premutation FMR1 alleler23,24.
For å finne den eksakte CGG repetisjons størrelse er av stor betydning for klassifisering og prediksjon av FXS og skjøre X-tilknyttede lidelser25,26. Historisk har CGG gjenta Regionspesifikk polymerase kjedere reaksjon (PCR) med fragment dimensjonering pluss Southern blot analyse vært gullstandarden for molekylær profilering av FMR1 CGG gjenta27. Imidlertid er tradisjonell spesifikk PCR mindre følsom for store premutations med mer enn 100 til 130 repetisjoner og er ute av stand til å forsterke hele mutasjoner27,28. I tillegg kan kapillær elektroforese på en tradisjonell genetisk analysator for repetisjons dimensjonering ikke detektere FMR1 PCR-produkter med mer enn 200 CGG repetisjoner. The Southern blot analysen muliggjør differensiering av et bredere spekter av gjenta størrelse, fra normal til full mutasjon gjenta tall, og har vært mye brukt for å bekrefte hele mutasjoner (i menn) og differensiere heterozygot alleler med full mutasjon fra tilsynelatende homozygote alleler med normal gjenta størrelser (i kvinner). Imidlertid, resolusjonen for Kvantifisere det gjentar er begrenset. Enda viktigere er dette trinn-for-trinn testing strategien er arbeidskrevende, tidkrevende og kostnadseffektive.
Her presenterer vi en nøyaktig og robust PCR-basert metode for kvantifisering av CGG-repetisjoner av FMR1. Det første trinnet i denne testen er PCR forsterkning av gjenta sekvenser i 5 ‘ UTR av FMR1 promoter bruker SKJØRE X PCR Kit. PCR-produktene er renset og fragment dimensjonering utføres på et mikrovæskebasert kapillær elektroforese instrument, og etterfølgende tolkning av antallet CGG-repetisjoner ved hjelp av analyseprogramvaren ved å henvise til standarder med kjente repetisjoner basert på at PCR-fragment lengden er direkte proporsjonal med antallet CGG-repetisjoner. PCR-systemet omfatter reagenser som forenkler forsterkningen av det svært GC-rike trinucleotide gjentakelsesområdet. Dette PCR-baserte analysen er reproduserbar og i stand til å identifisere alle områder av CGG repetisjoner av FMR1 arrangører. Dette er en kostnadseffektiv metode som kan finne bred anvendelse i molekylær diagnose og screening av FXS og skjøre X-relaterte lidelser med mindre sving rundt tid og investeringer i utstyr og dermed kan utnyttes i et bredere spekter av kliniske Laboratorier.
FXS er den nest vanligste årsaken til intellektuell svekkelse etter Trisomi 21, sto for nesten halvparten av X-tilknyttede mental retardasjon30, som kan påvirke ca 1 av 4 000 menn og 1 av 8 000 kvinner. Enda viktigere, nesten 1 av 250-1000 kvinner bære en premutation, og denne frekvensen er 1 i 250-1600 i menn26,31,32,33. Siden risikoen for CGG gjenta ekspansjon til f…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra NSFC Emergency Management Project (Grant nr. 81741004), National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 81860272), den store forsknings plan av Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi ( Gi nei. AB16380219), Kina postdoktor Science Foundation Grant (Grant no. 2018M630993), og Guangxi Natural Science Foundation (Grant no. 2018GXNSFAA281067).
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample Diluent | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
FragilEase PCR Buffer mix | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward) FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse) |
|
FragilEase Polymerase | PerkinElmer | In kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ) | |
FraXsoft analysis software | PerkinElmer | ||
NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher | ||
Paper towels | |||
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plate | MACHEREY-NAGEL | 743100 | |
reference DNA sample | Coriell | NA20240 & NA20239 | |
S1000 96-well Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786) |
TriNEST Incubator/Shaker instrument | PerkinElmer | 1296-0050 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Life Technologies | 10977015 | For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning |
Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0256 (Model G560E) | Conventional vortex mixer |