Summary
精确和强大的聚合酶链反应测定，用于量化易碎 X 智力迟钝-1 基因中细胞氨酸-瓜氨酸-鸟-鸟三核苷酸重复，有助于分子诊断和筛选易碎 X 综合征和易碎 X 相关周转时间较短，设备投资时间缩短。
Abstract
易碎 X 综合征 （FXS） 和相关疾病是由易碎 X 智力迟钝-1（FMR1）基因启动子的 5' 未翻译区域 （UTR） 中细胞氨酸-瓜氨酸 -鸟-鸟苷 （CGG） 三核苷酸重复的扩展引起的。按照惯例，基因分析仪上的毛细血管电泳片段分析用于FMR1的CGG重复大小，但当重复数高于200时，需要额外的南方印斑分析才能进行精确测量。在这里，我们提出了一种准确和强大的聚合酶链反应（PCR）为基础的方法，用于定量FMR1的CGG重复。本测试的第一步是使用易碎 X PCR 试剂盒对FMR1启动子的 5'UTR 中的重复序列进行 PCR 扩增，然后对 PCR 产品进行纯化和微流体毛细管电泳仪器上的片段大小，以及随后通过使用分析软件引用已知重复项的标准来解释 CGG 重复次数。这种基于PCR的测定是可重复的，能够识别FMR1启动子的全部CGG重复，包括重复数超过200（分类为完全突变）、55至200（预突变）、46至54（中间）和10至45（正常）。它是一种经济高效的方法，有助于对 FXS 和易碎 X 相关疾病进行分类，具有鲁棒性和快速报告时间。
Introduction
易碎 X 综合征 （FXS） 和易碎 X 相关疾病，例如震颤和失流综合征 （FX-TAS），以及原发性卵巢功能不全 （FX-POI） 主要是由 5' 未翻译的细胞氨酸-瓜氨酸 -瓜氨酸 （CGG） 三核苷酸重复扩张引起的Xq27.31，2. 脆弱 X 智力迟钝 -1（FMR1）基因的区域 （UTR）FMR1编码蛋白（FMRP）是一种多核体相关的RNA结合蛋白，通过调节mRNA的替代拼接、稳定性和树突状传输或调制合成，在神经元发育和突触可塑性方面发挥作用部分贴午后蛋白3，4，5，6，7。
CGG重复大小为>200的动态变异被描述为完全突变，导致FMR1启动子8的异常超甲基化和随后转录沉默。由此产生的FMRP蛋白的缺失或缺乏会破坏正常的神经元发育，并导致FXS9，其特征是各种临床症状，包括中度至重度智力残疾、发育迟缓、过度活跃行为、不良接触和孤独症表现10，11，12。女性FXS患者的表达通常比男性温和。CGG 重复大小从 55 到 200 和 45 到 54 分别归类为预突变和中间状态。由于高度不稳定，CGG重复大小在预突变或中间等位基因大概扩大时，从父母传给后代13，14。因此，具有预突变等位基因的携带者由于重复扩张而使儿童受FXS影响的风险很高，在某些情况下，中间等位基因可以将其重复大小扩展到两代15之间的全部突变范围。 16.此外，预变异的男性也增加患晚发病FX-TAS17、18、19的风险，而预突变女性则倾向于FX-TAS和FX-POI20， 21，22.最近，有报道称，患有发育迟缓和社会行为问题的自闭症谱系障碍在预突变FMR1等位基因23、24的儿童中出现。
确定确切的CGG重复大小对于FXS和易碎X相关疾病的分类和预测具有重要意义25，26。从历史上看，CGG重复区域特异性聚合酶链反应（PCR）具有片段大小加上南方斑点分析，是FMR1 CGG重复27分子分析的黄金标准。然而，传统的特异性PCR对超过100至130次重复的大型预突变不太敏感，并且无法扩增完全突变27，28。此外，用于重复尺寸的传统基因分析仪上的毛细血管电泳无法检测超过 200 CGG 重复的FMR1 PCR 产品。南方印斑分析能够区分更广泛的重复大小，从正常突变到完全突变重复数，并已广泛用于确认完全突变（在男性）和区分异质异位基因与完全突变明显具有正常重复大小的同源性等位子（在女性中）。但是，量化重复的分辨率是有限的。更重要的是，这种分步测试策略是劳动密集型、耗时且成本效益高的。
在这里，我们提出了一种准确和可靠的基于PCR的方法，用于定量FMR1的CGG重复。本测试的第一步是使用易碎 X PCR 试剂盒对FMR1启动器的 5'UTR 中的重复序列进行 PCR 扩增。PCR 产品经过纯化，片段大小在微流体毛细管电泳仪器上执行，随后使用分析软件对 CGG 重复次数进行解释，通过引用基于PCR 片段长度与 CGG 重复次数成正比。PCR系统包括促进高GC富分子三核苷酸重复区域扩增的试剂。这种基于PCR的测定是可重复的，能够识别FMR1启动子的所有CGG重复范围。这是一种经济高效的方法，可在FXS和易碎X相关疾病的分子诊断和筛查中得到广泛应用，周转时间少，设备投资更少，因此可用于更广泛的临床实验室。
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Protocol
香港中文大学-新界东集群临床研究伦理委员会获伦理批准（参考编号：2013.055）
1. PCR扩增
- 开始之前，从-20°C冷冻室中取出PCR缓冲液混合物、样品稀释剂和DNA样品（包括测试和参考DNA）（参见材料表），并将其保持在室温下20-30分钟，以确保所有试剂和DNA完全解冻。涡旋，并在使用前短暂旋转。
- 使用分光光度计测量DNA样品的浓度（见材料表）。DNA浓度应为25纳克/μL;必要时用样品稀释至适当的浓度稀释。
注：应提取和纯化DNA以去除干扰物质，如蛋白质和高盐浓度。非降解、高质量的DNA应用于后续PCR扩增和分析（A260/A280：1.8_2.0和A260/A230：>1.0）。 - 标记 PCR 板或 0.2 mL PCR 管的孔，以识别参考和测试的 DNA 样本。
- 计算测试样品、2 个参考样品和阴性对照样本所需的 PCR 反应数。通过加入15μL的PCR缓冲液混合物、2.6 μL的样品稀释剂和0.4μL的聚合酶，制备PCR主混合物。
注：使用样品稀释剂的负对照对于监测PCR性能至关重要。在室温下准备 PCR 主混合物，不要在冰上移液器。PCR 缓冲液混合体是粘性的。混合管子，然后在使用前短暂旋转。 - 从步骤 1.4 涡旋 PCR 主组合 10-20 s 并旋转。缓慢地将18μL的混合物分配到每个井或管中。
- 漩涡和旋转下来的DNA样本。将每个DNA的移液器2μL放入适当的井或管中，最终PCR体积为20μL。通过上下移液5次混合。
注：每次反应的DNA总量应为50~100纳克。每20μLPCR反应的DNA量大于150纳克，可能导致大重复等位子的扩增不良。对于低浓度DNA，PCR主混合物中的样品稀释剂量可以由DNA溶液取代。 - 用粘合板密封器或管盖密封板。
- 将密封的 PCR 板或管放入带加热盖的热循环器中。使用以下设置运行程序：95 °C 5 分钟，随后在 98°C 下进行 25 次变性，35 秒，在 59°C 退火 35 秒，在 72°C 下延长 4 分钟;在 72°C 下的最后一步 10 分钟，将 PCR 产品保持在循环器中的 4°C，直到拆卸以进行进一步处理。
- PCR扩增后，立即纯化和分析产品，或储存在+2至+8°C过夜。或者，产品可在-30至-16°C下储存长达30天。
2. PCR产品的净化
- 将培养箱摇床预热至 65°C。
- 对于每个PCR反应，从第1节向每个PCR产物的20μL中加入80μL的1x TE缓冲液（见材料表）。
- 使用多通道移液器将样品混合物转移到 PCR 清理板（参见材料表）。
- 保持板未覆盖，并将其放入孵化器摇床，并在 65°C 孵育，同时在 1，200 rpm 下摇动 10 分钟。
- 孵育后，将真空仪器设置为250 mbar（或 25 kPa，188 mmHg，7.4 英寸汞柱），并通过过滤器吸入溶液 15 分钟。Wells 应没有液体残留。
- 将培养箱摇床冷却至 25°C。
- 第一次吸气后，关闭真空，向每个井添加 50 μL 的 1x TE 缓冲液。不要混合。使用步骤 2.5 中的真空设置将溶液吸出 10 分钟。
- 将滤板底部牢固地压在一叠纸巾上，擦干滤板底部。
- 将 20 μL 的 1x TE 缓冲液添加到每个井的底部中心。将板放在培养箱摇床中，在 25°C 下孵育，同时以 1，200 rpm 摇动 5 分钟。
- 孵育后，将每个纯化PCRDNA的>15 μL从步骤2.9转移到新鲜的96孔PCR板。纯化的DNA可以直接分析，或者可以储存在-30至-16°C，直到需要。
3. PCR 产品的碎片大小
- 开始之前，允许DNA染料浓缩物、DNA凝胶基质、DNA标记、DNA阶梯和纯化DNA样本从步骤2到平衡到室温30分钟。
-
设置注油站。
- 使用新一批试剂时，更换注射器（见材料表）。
- 调整底板，松开注射器夹的操纵杆并将其滑到顶部位置。
- 启动尺寸调整软件（参见材料表），并准备凝胶-染料混合物。
-
涡流染料浓缩10s，然后向下旋转。将25μL的染料加入凝胶基瓶。涡旋混合溶液良好，并旋转下来。
- 将凝胶染料混合物转移到旋转过滤器。将旋转过滤器置于微型离心机中，在室温下以 1，500 x g ± 20% 旋转 10 分钟。
注：用染料保护溶液免受光，使用后储存在4°C。凝胶-染料混合物可用于约15个芯片一旦准备。在使用前，让凝胶染料混合物每次与室温平衡30分钟。
- 将凝胶染料混合物转移到旋转过滤器。将旋转过滤器置于微型离心机中，在室温下以 1，500 x g ± 20% 旋转 10 分钟。
-
加载凝胶-染料混合物。
- 在注油站上插入一个新的DNA芯片。将 9 μL 的凝胶染料混合物加入标有"G"的井中。请确保柱塞位于 1 mL 标记处，然后关闭注油站。
- 向下按注射器柱塞，直到夹子按住它。等待正好 30 s，然后释放剪辑。等待 5 s，然后缓慢地将柱塞拉回 1 mL 位置。
- 打开注油站，将 9 μL 的凝胶染料混合物加入标有"G"的井中。
- 在标有梯形符号的井中添加 5 μL 标记，并在 12 个样品井中每口加 5 μL 标记。不要将任何水井留空。
- 将 1 μL 的 DNA 梯子添加到标有梯形符号的井中。从步骤 3.1 或 1 μL 的超纯水（未使用的井）中加入 1 μL PCR 产品（使用井）到 12 个样品井中。将芯片水平放入涡旋混合器适配器和涡流适配器中 1 分钟，在指示设置（2，400 rpm） 下。
- 将芯片插入生物分析仪仪器，并在 5 分钟内将芯片运行到仪器中。
- 测定完成后，立即从仪器中取出用过的芯片。
- 缓慢地将 350 μL 的去离子水加入电极清洁剂的一口井中。打开生物分析仪的盖子，将电极清洁剂放入其中。合上盖子并孵育约10s。打开盖子并取出电极清洁剂。再等 10 s，让电极上的水蒸发，然后合上盖子。
4. 分析片段大小调整结果
注：参考样品应由同一批次中的同一热循环器和生物分析仪与未知样品进行放大和分析。
- 生物分析器运行完成后，将每次运行的峰值数据导出为 .csv 表文件，以便进行后续分析。
- 启动分析软件，从步骤 4.1 打开导出的 .csv 峰值表文件。
- 通过QC菜单选项卡，查看两个参考样本中拟合到四个点（图上显示为蓝色钻石）的回归线。回归线的 R2值应为 >0.98（典型值超过 0.999）。
- 通过"结果"菜单选项卡，检查每个样本的重复大小，其片段长度根据从参考样本派生的线性回归标准曲线自动绘制。该软件还根据不同的准则提供每个样品的分类。
- 通过"导出"菜单选项卡，导出每个样本的结果报告，其中带有重复编号和诊断分类，以及每次运行的示例信息和 QC 报告摘要。
注：分析软件允许使用自定义分类指南，如美国医学遗传学学院 （ACMG） 或临床分子遗传学协会/欧洲人类遗传学协会 （CMGS/ESHG） 指南，以及预定义的分类标准。
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Representative Results
预突变母参考样本（NA20240，重复尺寸30和80）和全突变母参考样本（NA20239，重复尺寸为20和200）的大小调整结果分别如图1A和图1B所示。通常，片段大小配置文件中包括两个标记峰（下标记 50 基对 [bp] 和上标记 10，380 bp）。通常有一个底漆复合峰，其大小接近 95 bp。通过参考样本，可以构造一个包含四个点的线性回归标准曲线，如图1C所示。
临床正常、中间、预突变和完全突变样本的代表性大小特征如图2A+D所示。特别是，具有两个展开片段峰和一个正常峰的马赛克全突变在图2E中呈现。在某些女性情况下，微流体电泳结果中只显示一个峰值，如图2F所示。这可以解释正常同源性等位子的呈现（在两个等位子中具有相同的CGG重复数），或者无法区分重复数差异为4或更少29的异构位等。然而，这些单峰结果可以归类为正常，因为已经验证，基于PCR的管道能够强健地扩增和检测完全突变或突变等位基因，从而将假阴性的可能性降至最低。这种情况。一种类型的次优情况是基线偏差，如图2G所示，在某些情况下，这可能会产生不明确或无法解释的结果。怀疑这种情况是由仪器问题引起的。根据从参考样本派生的线性回归标准曲线绘制未知样本的测量片段大小，以便使用分析软件自动计算重复大小，如图 2H所示。小于 200 个重复的片段大小入线性回归标准曲线，而较大的全突变等位均值大小则通过沿同一标准线的外推进行测量。该软件还根据不同的准则显示每个样品的分类。
图1：母参考样本和相应的线性回归曲线的尺寸调整结果。（A， B） 分别显示预突变母参考样本（NA20240，重复大小30和80）和全突变母参考样本（NA20239，重复尺寸为200）的大小特征。每个样品的电泳结果中包括两个标记（下标记、50 bp 和上标记 10380 bp）。近 95 bp 大小的峰值表示引物复合物。黑色箭头表示引物复合体的峰值大小，蓝色箭头表示参考样本的片段长度。（C） 在分析软件中构造了两个参考样本中四个点（蓝色钻石）的线性回归标准曲线。水平和垂直轴显示计算出的CGG重复数和微流体电泳中测得的片段长度。回归的 R2值为 0.99967。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：不同CGG重复大小的临床样本代表性结果。（A+E） 通过生物分析仪按正常顺序显示代表性尺寸特征（片段长度为 328 bp 和 353 bp，对应于重复数 28 和 36），中间体（片段长度为 335 bp 和 390 bp，对应于重复数 30 和 49），预突变（片段长度为 332 bp 和 439 bp，对应于重复数 29 和 65），完全突变（片段长度为 337 bp 和 1911bp，对应于重复数 31 和 545）和马赛克完全突变（片段长度为349 bp、1201 bp和2688 bp，对应于33、294和751的重复数）（F） 呈现可能具有同源性等位势（两个等位势中具有相同 CGG 重复数）的女性的单峰微流体电泳结果（片段长度为 334 bp，对应于重复数 30）或杂性异位器（CGG 重复数差异为 4 或更少）。（G） 显示了一种次优的情况，即基线偏差。黑色箭头表示引物复合体的峰值大小，红色箭头表示样本的片段长度。（H） 显示分析软件的主要结果界面.根据线性回归标准曲线绘制未知样本的测量片段大小，以自动计算重复大小。（E ） 中所示的马赛克全突变母样本的法位均值映射到坐标轴区域左下角的标准曲线（以绿色绘制），而较大的全突变等位基因（以红色绘制）外推出四个标准点（曲线上的蓝色钻石）。图下半部分的表格部分根据所选的 ACMG 准则边界显示片段大小和相应的诊断分类。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
FXS是仅次于三联体21的第二大智力障碍原因，占X相关智力迟钝30的近一半，这可能影响大约四千名男性中的一个和八千名女性中的一个。更重要的是，近1在250-1，000女性携带预突变，这个频率是1在250-1，600男性26，31，32，33。由于 CGG 重复扩张到完全突变的风险在将预突变等位基因传输到后代时显著上升，例如，当母体重复大小为 55-59 时的 4% 到 98%， 当大小为 100–20014时，CGG 的确定在更广泛的范围内重复大小可以促进FXS的诊断和预突变携带者的生殖规划的筛查。此处介绍的基于 PCR 的方法准确、快速、可靠，可放大FMR1启动器 5'UTR 中的重复序列，并量化微流体毛细管电泳仪器上 CGG 重复数的全谱，从而可以以更少的周转时间和设备投资，促进其在FXS和易碎X相关疾病的分子诊断和筛查中的广泛应用。生物分析仪仪器可在低到中等吞吐量测试设置中自信地使用，以便重复尺寸测量。该设备比其他毛细管电泳仪器（如ABI毛细管遗传分析仪）更小、成本更低、维护更简单。对于大容量筛选，包含多达 384 个样本模型的 MultiDX 系统为测试提供了广泛的灵活性和吞吐量。
测定包括四个主要步骤：PCR扩增FMR1启动器5'UTR中的重复序列（PCR设置和PCR扩增需要近3.5小时），PCR产物的纯化（需要近1小时），微流体片段大小毛细管电泳仪（需要近 1 小时），并使用分析软件从已知重复的参考标准推断 CGG 重复次数（需要近 0.5 小时）来解释。总共，此测定的周转时间约为 6 小时。为了获得最佳性能，DNA样本应经过纯化，以去除蛋白质和高盐浓度等假定干扰物质。此外，推荐的输入DNA量为每20μLPCR反应50~100纳克。DNA量大于150纳克每20μL的PCR系统已被证明导致大重复等位子的扩增不良。此外，强烈建议在每个 PCR 运行中设置至少两个具有良好重复大小的参考样本，以便同时分析重复数，作为质量控制和随后的自动片段大小调整分析软件29. 通常，从参考样本派生的线性回归曲线的 R2值应大于 0.98。此外，PCR产品在微流体毛细管电泳前应进行纯化，以提高检测效率。由于PCR引体标有FAM荧光29，因此可直接使用适当的电泳系统（例如，生物分析仪和MultiDX系统）进行片段尺寸调整，无需额外标记。
Bruce E. Hayward等人对FXS及相关疾病的诊断和研究方法进行了全面回顾，包括基于DNA的测定和FMRP蛋白测定34。与在大多数情况下一样，FXS的分子基础是动态突变，其特点是FMRP1基因的启动子区域具有膨胀CGG重复，使用基因组DNA的南方印迹和扩增化测定是最常用的检测确定重复数。众所周知，基于PCR的检测在成本效益和最低DNA量要求方面过度称量南方印迹。然而，CGG重复的放大是一个主要的挑战，因为高GC含量会影响效率，并且多年来为PCR系统的优化已经做出了很大的努力。脆弱的X PCR试剂盒已经过优化，可以精确放大整个CGG三核苷酸重复，并且关于这种基于PCR的方法的性能的验证研究已经由我们的小组29报告。Mailick Seltzer等人于2012年35年报告了一种类似的基于PCR的方法，但ABI 3730xl仪器用于重复尺寸测定，只确定了重复尺寸小于200的个人。这可能是由于他们所选择的平台无法检测到重复大小超过 200 的大重复。相比之下，我们使用的生物分析仪仪器提供了一个更强大的片段大小测定，因为它可以准确和经济有效地检测FMR1 CGG重复包括全突变29的全部频谱。
除了重复数，其他几个因素也需要确定，以适当诊断FXS和FXS相关疾病，包括FMR1突变，甲基化的程度和马赛克34。甲基化状态可以通过各种方法监测，例如使用甲基化敏感限制性酶或双硫酸盐修饰测定34加入预消化步骤，然而，我们的测定无法确定FMR1启动子的 5'UTR 甲基化状态。此外，FMR1等位基因的膨胀风险还取决于AGG中断的存在，在传播过程中可以稳定基因。基于PCR的重复检测已被修改以检测AGG中断，而消化酶不稳定性是主要限制之一。在 CGG 重复或 AGG 中断中使用混合 PCR 底漆结合，是另一种 PCR 测定，可同时检测 CGG 重复大小和 AGG 中断。然而，我们描述的FMR1基因特异性PCR方法无法识别AGG中断，除非FMR1基因测序后进行扩增。最近，Hayward等人报告了自己实验室用于测定完整基因研究或彻底实验室研究所需的所有参数的PCR方法，包括可检测重复数、AGG中断状态和甲基化状态36.不幸的是，这两种测定都不能全面确定所有这些因素。
值得注意的是，检测无法检测缺失或单核苷酸变异内的FMR1基因，约占FXS病例的1%27。很少，在有细胞马赛克为FMR1重复的个体，PCR可能给出一个假阴性结果，因为未能检测更大的预突变和全突变等位基因的马赛克。已经证明，当峰值检测器阈值设定在基线29之上的三个荧光单位时，这种基于PCR的马赛克全突变雄性样本（341次重复）的阈值为2.5%。如果指示马赛克等位位位， 则建议在情况下进行南方污点分析。此外，关于电泳平台，先前的研究表明，与毛细电泳系统（例如ABI 3130XL仪器）相比，生物分析仪仪器无法区分正常的同源性具有单独片段峰的雌性样本具有杂音重复大小，重复数差异为4个或更少29。然而，这些单峰样本可以归类为正常，因为已经验证，这种基于PCR的管道能够强健地扩增和检测完全突变或突变等位基因，从而最大限度地减少了在这种情况。尽管存在上述限制，该方法可作为一级管道，用于分子识别FXS和易碎X相关疾病，具有成本效益、鲁棒性和快速报告时间，并辅之以FMR1基因和南方甲基化水平的斑点分析。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家自然科学基金应急管理项目（第81741004号赠款）、国家自然科学基金（第81860272号）、广西省科技基金重大研究计划（第81741004号）的资助。授予号AB16380219），中国博士后科学基金资助（批号2018M630993）和广西自然科学基金（批号2018GXNSFAA281067）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free | Ambion | AM9849 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate | Thermo Fisher | AB0800 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips | Agilent | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument | |
| Agilent DNA 7500 kit | Agilent | 5067-1506 | For Fragment sizing |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA chips | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner | Agilent | In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Agilent DNA 7500 kit: Syringe | Agilent | Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506) | |
| Chip priming station | Agilent | 5065-4401 | Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument |
| Cubee Mini-centrifuge | GeneReach | aqbd-i | |
| Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold | Merck Millipore | MSVMHTS00 | Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification |
| Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper | Merck Millipore | XX2004718 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump | Merck Millipore | WP6122050 | Filter plate vacuum Manifold |
| Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel | Merck Millipore | XX1004705 | Filter plate vacuum Manifold |
| FragilEase Fragile X PCR kit | PerkinElmer | 3101-0010 | For PCR amplification |
References
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