Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En robust polymerase kæde reaktions baseret analyse til kvantificering af cytosin-guanin-guanin-Trinucleotid gentages i skrøbelig X mental retardering-1 gen

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59963
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 2, 2,3, 2,3, 2, 5, 5, 6,7, 2,3
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

En nøjagtig og robust polymerase kæde reaktions baseret analyse til kvantificering af cytosin-guanin-guanin-trinucleotid gentager i den skrøbelige X mental retardering-1-gen letter Molekylær diagnose og screening af skrøbeligt X-syndrom og skrøbelige X-relaterede problemer med kortere tid og investeringer i udstyr.

Abstract

Skrøbelige X syndrom (FXS) og tilknyttede lidelser er forårsaget af udvidelse af cytosin-guanin-guanin (CGG) trinucleotid Gentag i 5 ' ikke oversat region (UTR) af den skrøbelige X mental retardering-1 (FMR1) gene Promoter. Konventionelt, kapillar elektroforese fragment analyse på en genetisk analysator anvendes til dimensionering af CGG gentagelser af FMR1, men yderligere sydlige blot analyse er nødvendig for nøjagtig måling, når gentagelses tallet er højere end 200. Her præsenterer vi en nøjagtig og robust polymerase kædereaktion (PCR)-baseret metode til kvantificering af CGG gentagelser af FMR1. Det første trin i denne test er PCR amplifikation af gentagelses sekvenserne i 5 ' UTR af FMR1 -promotoren ved hjælp af et skrøbeligt X PCR-kit, efterfulgt af rensning af PCR-produkterne og fragment dimensionering på et mikrofluidisk kapillar-elektroforese-instrument, og efterfølgende fortolkning af antallet af CGG gentager ved at referere standarder med kendte gentagelser ved hjælp af Analysis software. Denne PCR-baserede analyse er reproducerbar og i stand til at identificere hele spektret af CGG-gentagelser af FMR1 -promotorer, herunder dem med et gentagelses nummer på mere end 200 (klassificeret som fuld mutation), 55 til 200 (premutation), 46 til 54 (mellemliggende) og 10 til 45 (normal). Det er en omkostningseffektiv metode, der letter klassificeringen af FXS og skrøbelige X-associerede lidelser med robusthed og hurtig rapporteringstid.

Introduction

Skrøbelige X syndrom (FXS) og skrøbelige X associerede lidelser, f. eks, tremor og ataksi syndrom (FX-TAS), og primær ovarie insufficiens (FX-POI) er primært forårsaget af cytosin-guanin-guanin (CGG) trinucleotid gentagen ekspansion i 5 ' uoversat region (UTR) for den skrøbelige X mental retardering-1 (FMR1) gen på XQ 27.31,2. Det FMR1 kodede protein (fmrp) er et polyribosome-associeret RNA-bindende protein, der fungerer i neuronal udvikling og synaptisk plasticitet ved at regulere alternative splicing, stabilitet og dendritisk transport af mRNA eller moduerende syntese af partielle postsynaptiske proteiner3,4,5,6,7.

Den dynamiske variation med en CGG-gentagelses størrelse på > 200 beskrives som fuld mutation, hvilket inducerer den afvigende hypermethylering og efterfølgende transkriptional hæmning af FMR1 Promoter8. Den deraf følgende fravær eller mangel på FMPS-proteinet forstyrrer normal neuronal udvikling og forårsager FXS9, karakteriseret ved forskellige kliniske symptomer, herunder moderat til svær intellektuel invaliditet, udviklingsmæssige forsinkelser, hyperaktiv adfærd, dårlige kontakter og autistiske manifestationer10,11,12. Præsentationen hos kvindelige FXS patienter er generelt mildere end den hos mænd. CGG-gentagelses størrelsen, der spænder fra 55 til 200 og 45 til 54, klassificeres som henholdsvis præmutation og mellemliggende status. På grund af den høje grad af ustabilitet, CGG gentage størrelse i en premutation eller mellemliggende allel formentlig udvider når overføres fra forældre til afkom13,14. Således er bærere med præmutation alleler i høj risiko for at få børn ramt af FXS på grund af gentagen ekspansion, og i nogle tilfælde kan mellemliggende alleler udvide deres gentagelses størrelse til hele Mutations området over to generationer15, 16. Desuden, mænd med premutation også formidle øget risiko for at udvikle sent-debut fx-tas17,18,19, mens præmutation hunner er disponerede for både fx-tas og fx-POI20, 21,22. For nylig er det blevet rapporteret, at autistiske spektrum lidelser med udviklingsmæssige forsinkelse og problemer i social adfærd er præsenteret hos børn med premutation FMR1 alleler23,24.

For at bestemme den nøjagtige CGG gentagelse størrelse er af stor betydning for klassificering og forudsigelse af FXS og skrøbelige X-associerede lidelser25,26. Historisk, CGG gentage region-specifikke polymerase kædereaktion (PCR) med fragment dimensionering plus Southern blot analyse har været den gyldne standard for Molekylær profil af FMR1 CGG Gentag27. Men, traditionel specifik PCR er mindre følsom over for store præmutationer med mere end 100 til 130 gentagelser og er ude af stand til at forstærke fuld mutationer27,28. Desuden undlader kapillær elektroforese på en traditionel genetisk analysator til gentagen dimensionering at detektere FMR1 PCR-produkter med mere end 200 CGG-gentagelser. Southern blot-analysen gør det muligt at differentiere en bredere vifte af gentagelses størrelser, fra normal til fuld mutation gentagne tal, og er blevet meget brugt til at bekræfte fuld mutationer (hos mænd) og differentiere heterozygot alleler med en fuld mutation fra tilsyneladende homozygot alleler med normale gentagelses størrelser (hos kvinder). Beslutningen om at kvantificere gentagelserne er dog begrænset. Endnu vigtigere er, at denne trin-for-trintest strategi er arbejdskraftintensiv, tidskrævende og omkostningseffektiv.

Her præsenterer vi en nøjagtig og robust PCR-baseret metode til kvantificering af CGG-gentagelserne af FMR1. Det første trin i denne test er PCR-forstærkning af gentagelses sekvenserne i 5 ' UTR for FMR1 -arrangøren ved hjælp af et skrøbeligt X PCR-sæt. PCR-produkterne er renset og fragment dimensionering udføres på et mikrofluidisk kapillar-elektroforese instrument, og efterfølgende fortolkning af antallet af CGG gentages ved hjælp af analysesoftwaren ved at referere til standarder med kendte gentagelser baseret på begrundelse, at PCR fragment længde er direkte proportional med antallet af CGG gentagelser. PCR-systemet omfatter reagenser, der letter amplificeringen af den meget GC-rige trinucleotid-gentagelses region. Denne PCR-baserede analyse er reproducerbar og i stand til at identificere alle intervaller af CGG gentagelser af FMR1 promotorer. Dette er en omkostningseffektiv metode, der kan finde bred anvendelse i molekylær diagnose og screening af FXS og skrøbelige X-relaterede lidelser med mindre turn-around tid og investeringer i udstyr og dermed, kan udnyttes i et bredere spektrum af kliniske Laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etisk godkendelse blev givet af det fælles kinesiske universitet i Hongkong — nye territorier East Cluster klinisk forskning etiske komité (reference nummer: 2013,055)

1. PCR amplifikation

  1. Før start skal du fjerne PCR-buffer blanding, prøvefortynder og DNA-prøver (både test-og reference-DNA) (Se tabellen over materialer) fra-20 °c-fryseren og opbevare dem ved stuetemperatur i 20-30 minutter for at sikre, at alle reagenser og DNA er helt optøede. Vortex, og drej kortvarigt ned før brug.
  2. Måle koncentrationen af DNA-prøverne ved hjælp af et spektrofotometer (Se tabel over materialer). DNA-koncentrationen skal være 25 ng/μL; fortyndes med prøvefortynder til den relevante koncentration, hvis det er nødvendigt.
    Bemærk: DNA skal udvindes og renses for at fjerne interfererende stoffer, såsom proteiner og høje saltkoncentrationer. Ikke-forringet, høj kvalitet DNA bør anvendes til efterfølgende PCR forstærkning og analyse (A260/A280:1.8-2.0 og A260/A230: > 1.0).
  3. Etiket brønde af en PCR-plade eller 0,2 mL PCR-rør for at identificere reference-og testede DNA-prøver.
  4. Beregn antallet af PCR-reaktioner, der kræves til testprøverne, 2 referenceprøver og negativ kontrolprøve. PCR-Master Mix fremstilles ved tilsætning af 15 μL PCR-buffer blanding, 2,6 μL prøve fortyndingen og 0,4 μL polymerase for hver reaktion.
    Bemærk: En negativ kontrol ved hjælp af prøvefortynder er afgørende for at overvåge PCR-ydeevnen. Klargør PCR-masterblandingen ved stuetemperatur, må du ikke pipetteres på is. PCR-buffer blandingen er viskøs. Bland røret og drej kortvarigt ned før brug.
  5. Vortex PCR Master Mix fra trin 1,4 for 10 – 20 s og spin ned. Hæld langsomt 18 μL af blandingen i hver brønd eller slange.
  6. Vortex og spin ned DNA-prøverne. Der afpipetteres 2 μL af hvert DNA i passende brønd eller rør til et endeligt PCR-volumen på 20 μL. Bland ved pipettering op og ned 5 gange.
    Bemærk: Den totale mængde DNA pr. reaktion skal være 50 – 100 ng. DNA-mængder større end 150 ng pr. 20 μL PCR-reaktion kan resultere i en dårlig forstærkning af store gentagne alleler. For mindre koncentrerede DNAs kan mængden af prøvefortynder i PCR-masterblandingen erstattes af DNA-opløsning.
  7. Forsegl pladen med klæbende pladeforsegling eller med rørhætter.
  8. Anbring den forseglede PCR-plade eller rørene i den termiske variator med opvarmet låg. Kør programmet med følgende indstillinger: 95 °c i 5 min, efterfulgt af 25 cyklusser med denaturering ved 98 °c for 35 s, udglødning ved 59 °c for 35 s og forlængelse ved 72 °c i 4 min; et sidste trin ved 72 °C i 10 min. hold PCR-produkterne ved 4 °C i cycleren, indtil de fjernes for yderligere behandling.
  9. Efter PCR amplifikation, rense og analysere produkterne med det samme, eller opbevares ved + 2 til + 8 °C natten over. Alternativt kan produktet opbevares i op til 30 dage ved-30 til-16 °C.

2. rensning af PCR-produkterne

  1. Forvarm inkubator shaker til 65 °C.
  2. For hver PCR-reaktion tilsættes 80 μL 1x TE buffer (Se tabellen over materialer) til 20 μl af hvert PCR-produkt fra punkt 1.
  3. Prøveblandingen overføres til en PCR-rense plade (Se tabel over materialer) ved hjælp af en pipette med flere kanaler.
  4. Hold pladen udækket og Placer den i inkubator ryste og Inkuber ved 65 °C under omrystning ved 1.200 rpm i 10 min.
  5. Efter inkubation indstilles vakuum instrumentet ved 250 mbar (eller 25 kPa, 188 mmHg, 7,4 i HG) og Aspirér opløsningen gennem filteret i 15 min. brønde må ikke have væske tilbage.
  6. Afkøl inkubator shaker ned til 25 °C.
  7. Efter den første aspiration skal du slukke for vakuum og tilføje 50 μL 1x TE buffer til hver brønd. Må ikke blandes. Opsug opløsningen i 10 minutter ved hjælp af vakuum indstillingerne i trin 2,5.
  8. Tør bunden af filterpladen ved at trykke den fast på en stak papirhåndklæder.
  9. Tilsæt 20 μL 1x TE buffer i det nederste centrum af hver brønd. Anbring pladen i inkubator ryste og Inkuber ved 25 °C under omrystning ved 1.200 rpm i 5 min.
  10. Efter inkubation overføres > 15 μL af hvert renset PCR-DNA fra trin 2,9 til en frisk 96-brønd-PCR-plade. Det rensede DNA kan analyseres direkte eller alternativt kan opbevares ved-30 til-16 °C, indtil det er nødvendigt.

3. fragment dimensionering af PCR-produkter

  1. Før start skal du tillade DNA-farve koncentrat, DNA-gel-matrix, DNA-markør, DNA-stigen og rensede DNA-prøver fra trin 2 for at ækvibrere til stuetemperatur i 30 minutter.
  2. Indstil priming stationen.
    1. Udskift sprøjten (Se tabel over materialer) ved brug af et nyt parti reagenser.
    2. Juster bundpladen, og slip armen på sprøjte klemmen, og skub den op til den øverste position.
  3. Start dimensionering software (Se tabel over materialer) og forberede gel-farvestof mix.
  4. Vortex Dye koncentrat til 10 s og spin ned. Tilsæt 25 μL af farvestoffet til et gel-matrix hætteglas. Vortex den blandede løsning godt og spin ned.
    1. Overfør gel-farveblandingen til et spin filter. Spin filteret placeres i en mikrocentrifuge, og der centrifugeres i 10 minutter ved stuetemperatur på 1.500 x g ± 20%.
      Bemærk: Opløsningen beskyttes med farvestof fra lys og opbevares ved 4 °C efter brug. Gel-Dye mix kan bruges til ca. 15 chips, når de er tilberedt. Lad gel-farvestof blandingen ækvibrere til stuetemperatur i 30 minutter hver gang før brug.
  5. Læg gel-farvestof blandingen i.
    1. Isæt en ny DNA-chip på priming-stationen. Tilsæt 9 μL gel-farvestof mix i brønden mærket med "G". Kontroller, at stemplet er anbragt ved 1 mL-mærket, og luk derefter priming-stationen.
    2. Tryk injektionssprøjtens stempel ned, indtil det holdes i klemme. Vent præcis 30 s og slip derefter klippet. Vent i 5 s, og træk derefter langsomt stemplet tilbage til 1 mL-positionen.
    3. Åbn priming stationen og tilsæt 9 μL gel-Dye mix i brøndene mærket med "G".
  6. Tilsæt 5 μL markør ind i brønden med stigen-symbolet og tilsæt 5 μL markør til hver af de 12 prøve brønde. Efterlad ikke brønde tomme.
  7. Tilsæt 1 μL DNA-stigen til det godt markerede med stigen-symbolet. Der tilsættes 1 μl PCR-produkt (brugte brønde) fra trin 3,1 eller 1 μl ultrarent vand (ubrugte brønde) til hvert af de 12 prøve brønde. Sæt chippen horisontalt i adapteren af vortex mixer og vortex i 1 min ved den angivne indstilling (2.400 rpm).
  8. Indsæt chippen i bioanalysator instrumentet, og Kør chippen i instrumentet inden for 5 minutter.
  9. Efter analysen er færdig, straks fjerne den brugte chip fra instrumentet.
  10. Tilsæt langsomt 350 μL deioniseret vand til en af elektrode rendens brønde. Åbn låget på bioanalysatoren, og Anbring elektrode renseren i den. Luk låget og Inkuber i ca. 10 s. Åbn låget og fjern elektrode renseren. Vent endnu 10 s for at lade vandet på elektroderne fordampe og derefter lukke låget.

4. Analysér fragment størrelses resultaterne

Bemærk: Referenceprøverne skal forstærkes og analyseres af samme termiske variator og bioanalysator i samme parti med de ukendte prøver.

  1. Når bioanalysator kørslen er fuldført, skal du eksportere spids dataene fra hver kørsel som en. csv-tabel fil til efterfølgende analyse.
  2. Start analysesoftwaren, og Åbn den eksporterede. csv peak Table-fil fra trin 4,1.
  3. Gennemgå den regressionslinje, der er tilpasset de fire punkter (vist som blå diamanter på plottet), via fanen QC -menu fra de to referenceprøver. R2 -værdien for regressionslinjen skal være > 0.98 (typiske værdier overstiger 0,999).
  4. Under fanen resultat menu skal du kontrollere gentagelses størrelsen for hvert eksempel, hvis fragment længde (r) automatisk afbildes i forhold til den lineære regressions standardkurve, der er afledt af referenceprøverne. Softwaren giver også klassificeringen af hver prøve i henhold til forskellige retningslinjer.
  5. Via fanen Eksporter menu skal du eksportere resultatrapporten for hvert eksempel med gentagelses numrene og diagnosticerings klassifikationen samt en oversigt over eksempel oplysninger og QC-rapport for hver kørsel.
    Bemærk: Analyse software giver mulighed for brug af brugerdefinerede klassifikations retningslinjer, såsom American College of Medical Genetics (ACMG) eller klinisk molekylær genetik Society/European Society of Human Genetics (CMGS/ESHG) retningslinjer, samt foruddefinerede klassificering Kriterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Størrelses resultaterne af den formutation kvindelige referenceprøve (NA20240, gentagne størrelser på 30 og 80) og den fulde mutation kvindelige referenceprøve (NA20239, gentagne størrelser på 20 og 200) er vist i henholdsvis figur 1a og figur 1b. Typisk er to markør toppe (nedre markør 50 base Pairs [BP] og øvre markør 10.380 BP) inkluderet i fragment størrelses profilen. Der er normalt en primer kompleks peak med en størrelse på næsten 95 BP. Gennem referenceprøven kan der konstrueres en lineær regressions standardkurve med fire punkter, som udstillet i figur 1c.

De repræsentative størrelses træk ved kliniske normale, mellemliggende, præmutations-og fuldmutations prøver er vist i figur 2A – D. Især mosaik fuld mutationer med to ekspanderede fragment toppe og en normal peak er præsenteret i figur 2E. I nogle kvindelige tilfælde vises der kun én spids i de mikrofluidiske elektroforese resultater, som vist i figur 2F. Dette kan forklares ved præsentationen af normale homozygot alleler (med samme CGG gentage tal i de to alleler) i disse tilfælde eller manglende evne til at differentiere heterozygot alleler, der har gentagelses nummer forskelle på fire eller mindre29. Disse enkelt topresultater kunne dog klassificeres som normale, fordi det er blevet valideret, at den PCR-baserede rørledning muliggør robust forstærkning og påvisning af fuld mutation eller præmutation alleler, hvilket minimerer muligheden for falsk negativ i denne situation. En type sub-optimal situation er baseline bias, som vist i figur 2g, som kunne producere tvetydige eller uforolkelige resultater i nogle tilfælde. En sådan betingelse er mistænkt for at være forårsaget af et instrument spørgsmål. De målte fragment størrelser for ukendte prøver afbildes i forhold til den lineære regressions standardkurve afledt af referenceprøverne for automatisk at beregne gentagelses størrelserne ved hjælp af analysesoftwaren, som vist i figur 2H. Fragment størrelser mindre end 200 gentagelser er interpoleret ind i den lineære regressions standardkurve, mens større Full-mutation allel størrelser måles ved at ekstrapolere langs samme standardlinje. Softwaren viser også klassificeringen af hver prøve i henhold til forskellige retningslinjer.

Figure 1
Figur 1: størrelses resultaterne af de kvindelige referenceprøver og den tilsvarende lineære regressions kurve. (A, B) viser størrelses funktionerne i den formutation kvindelige referenceprøve (NA20240, gentagne størrelser på 30 og 80) og den fulde mutation kvindelige referenceprøve (NA20239, gentagelses størrelser på henholdsvis 20 og 200). To markører (nedre markør, 50 BP og øvre markør 10380 BP) er inkluderet i elektroforese resultatet for hver prøve. Toppen med en størrelse på næsten 95 BP indikerer en primer kompleks. Sorte pile angiver spids størrelsen på primer-komplekset, og blå pile repræsenterer fragment længden for referenceprøven. C) den lineære regressions standardkurve med fire punkter (blå diamanter) fra de to referenceprøver er konstrueret i analysesoftwaren. De vandrette og lodrette akser viser de beregnede CGG-gentagelses numre og den målte fragment længde i mikrofluidisk elektroforese. R2 -værdien af regression var 0,99967. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: de repræsentative resultater af kliniske prøver med forskellige CGG-gentagelses størrelser. A – E) viser bioanalysatorens repræsentative størrelses træk i den normale rækkefølge (med fragment længder på 328 bp og 353 BP, svarende til gentagelses tallet 28 og 36), mellemliggende (med fragment længder på 335 bp og 390 BP, svarende til gentagne tal på 30 og 49), præmutation (med fragment længder på 332 BP og 439 BP, svarende til gentagne tal på 29 og 65), fuld mutation (med fragment længder af 337 BP og 1911bp, svarende til de gentagne tal 31 og 545) og mosaik fuld mutationer (med fragment længder på 349 BP, 1201 BP og 2688 BP, svarende til de gentagne tal for 33, 294 og 751) prøver. (F) præsenterer et enkelt-peak mikrofluidisk elektroforese resultat (med en fragment længde på 334 BP, svarende til det gentagne antal af 30) af en kvindelig, der sandsynligvis har homozygot alleler (med de samme CGG gentage tal i de to alleler) eller heterozygot alleler (med CGG gentage antallet forskelle på fire eller mindre). G) viser en type af den suboptimale situation, der er bias ved baseline. Sorte pile angiver spids størrelsen på primer-komplekset, og røde pile repræsenterer stikprøvens fragment længde. (H) viser analyse softwarens hovedresultat grænseflade. De målte fragment størrelser for ukendte prøver afbildes i forhold til den lineære regressions standardkurve for automatisk at beregne gentagelses størrelserne. Den normale allel af den mosaik-Full-mutation kvindelige prøve, der er vist i (E), er knyttet til standardkurven i nederste venstre hjørne af koordinat akse regionen (afbildet med grønt), og de større Full-mutation alleler (plottet i rødt) ekstruderet ud over den fire standard punkter (blå diamanter på kurven). Tabel sektionerne i den nederste halvdel af figuren præsenterer fragment størrelserne og den tilsvarende diagnostiske klassifikation i henhold til de valgte ACMG-retningslinjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FXS er den næstmest almindelige årsag til intellektuel svækkelse efter trisomi 21, der tegner sig for næsten halvdelen af X-linked mental retardering30, som kan forekomme hos ca. 1 ud af 4.000 hanner og 1 ud af 8.000 hunner. Endnu vigtigere, næsten 1 ud af 250 – 1000 kvinder bære en formutation, og denne frekvens er 1 i 250 – 1600 i mænd26,31,32,33. Da risikoen for CGG gentage ekspansion til fuld mutationer ved overførsel af præmutation alleler til afkom dramatisk hæver, for eksempel fra 4%, når moderen gentagelse størrelse er 55 – 59 til 98% når størrelsen er 100 – 20014, bestemmelsen af CGG gentagen størrelse på et bredere område kunne lette diagnosticering af FXS og screening af præmutation bærere for deres reproduktive planlægning. Den PCR-baserede metode, der introduceres her, er nøjagtig, hurtig og robust til at forstærke gentagelses sekvenserne i 5 ' UTR for FMR1 -promotoren og kvantificere det fulde spektrum af CGG-gentagelses numre på et mikrofluidisk kapillær elektroforese-instrument og kan således øge sin brede anvendelse i molekylær diagnose og screening af FXS og skrøbelige X-relaterede lidelser med mindre turn-around tid og investeringer i udstyr. Bibilioteker instrumentet kan trygt udnyttes i lav til moderat gennemløb test indstillinger for gentagelse størrelse måling. Udstyret er meget mindre, billigere og enklere at vedligeholde end andre kapillar elektroforese instrumenter, såsom ABI kapillær genetiske analysatorer. Ved høj volumen screening giver MultiDX-systemet med op til 384-prøve model en omfattende fleksibilitet og gennemløb for testene.

Analysen omfatter fire hovedtrin: PCR amplifikation af gentagelses sekvenserne i 5 ' UTR af FMR1 -promotoren (PCR-opsætning og PCR-forstærkning tager næsten 3,5 h), rensning af PCR-produkterne (tager næsten 1 time), fragment dimensionering på en mikrofluidisk kapillar elektroforese instrument (tager næsten 1 h), og fortolkningen af antallet af CGG gentager ved hjælp af analyse software ved udlede fra referencestandarder med kendte gentagelser (tager næsten 0,5 h). I alt, turn-around tid af denne analyse er ca 6 h. For at opnå optimal ydeevne skal DNA-prøver renses for at fjerne formodede interfererende stoffer såsom proteiner og høje saltkoncentrationer. Derudover er den anbefalede mængde input-DNA 50 – 100 ng pr. 20 μL PCR-reaktion. DNA-mængder større end 150 ng pr. 20 μL af PCR-systemet har vist sig at resultere i dårlig forstærkning af store gentagne alleler. Desuden anbefales det på det kraftigste at oprette mindst to referenceprøver med velkarakteriserede gentagelses størrelser i hver PCR-kørsel til simultan analyse af gentagelses numre som kvalitetskontrol og efterfølgende automatiseret fragment dimensionering i analysesoftwaren 29. typisk bør R2 -værdien af den lineære regressions kurve afledt af referenceprøverne være større end 0,98. Derudover skal PCR-produkterne renses før mikrofluidisk kapillær elektroforese for at forbedre detekterings effektiviteten. Da PCR-primer er mærket med Fam fluorescens29, kan fragment dimensionering med et passende elektroforese system (f. eks. bibilioteker og multidx-systemet) udføres direkte uden yderligere mærkning.

En række forskellige metoder til diagnosticering og undersøgelse af FXS og beslægtede lidelser er blevet grundigt gennemgået af Bruce E. Hayward et al., herunder DNA-baserede assays og FMPS-protein assays34. Som i de fleste tilfælde er det molekylære grundlag for FXS dynamisk mutation karakteriseret ved en ekspansion CGG gentagelse i arrangøren regionen af FMRP1 gen, Southern blotting og amplifikation-baserede assays ved hjælp af GENOMISK DNA er de mest almindeligt anvendte assays for bestemmelse af gentagelses tallet. Det er velkendt, at PCR-baserede assays overvejer Southern blotting i omkostningseffektivitet og minimumskrav til DNA-beløb. Men forstærkning af CGG-REPEAT er en Hovedudfordring, da High GC-indhold kan påvirke effektiviteten, og der er gjort en stor indsats for optimering af PCR-systemet i årene34. Det skrøbelige X PCR kit er blevet optimeret til nøjagtig forstærkning af hele CGG trinucleotid gentagelser, og en valideringsundersøgelse af resultaterne af denne PCR-baserede metode er tidligere blevet rapporteret af vores gruppe29. En lignende PCR-baseret metode blev rapporteret af Mailick Seltzer et al. i 201235, men ABI 3730xl instrumentet blev anvendt til bestemmelse af gentagen størrelse, og kun personer med en gentagelses størrelse på mindre end 200 blev identificeret. Dette kan skyldes det faktum, at deres valgte platform ikke var i stand til at opdage de større gentagelser med Gentag størrelse over 200. I modsætning hertil tilbyder det bioanalysator instrument, vi bruger, en mere robust fragment dimensionerings analyse, da det præcist og omkostningseffektivt kan registrere hele spektret af FMR1 CGG REPEAT inklusive fulde mutationer29.

Bortset fra gentagne tal skal der også fastslås flere andre faktorer for en passende diagnose af FXS-og FXS-relaterede lidelser, herunder FMR1 mutation, omfanget af methylering og mosaisme34. Methylering status kan overvåges ved forskellige metoder såsom inkorporering af præ-fordøjelse trin ved hjælp af methylering-følsomme restriktion enzym eller bisulfit modifikation assay34, men vores analyse er ude af stand til at bestemme methylering status af 5 ' UTR af FMR1 promotoren. Desuden afhænger ekspansions risikoen for en FMR1 allel også af tilstedeværelsen af AGG-afbrydelser, som kan stabilisere genet under transmissionen. PCR-baserede gentagelses analyser er blevet ændret for at detektere AGG-afbrydelser, hvorimod ustabilitet i fordøjelsesenzymer er en af de vigtigste begrænsninger. Triplet-primed (TP) PCR ved hjælp af en hybrid PCR primer binding i CGG gentagelser eller AGG-afbrydelser er en anden type PCR-analyse, som kan detektere CGG-gentagelses størrelse og AGG-afbrydelser samtidigt. Den FMR1 gen-specifikke PCR-metode, som vi har beskrevet, kan dog ikke identificere AGG-afbrydelser, medmindre FMR1 -gensekvensering efter amplificeringen udføres. For nylig rapporterede Hayward et al. de PCR-metoder, der anvendes i deres eget laboratorium til bestemmelse af alle de parametre, der er nødvendige for en komplet genetisk oparbejdningen eller grundig laboratorieundersøgelse, herunder analyser, som kan detektere gentagelses nummer, AGG-afbrydelses status og methylering-status36. Desværre er hverken assay i stand til at foretage en omfattende fastlæggelse af alle disse faktorer ajour.

Det er værd at bemærke, at analysen ikke er i stand til at detektere sletninger eller enkelt-nukleotidvarianter inden for FMR1 genet, som tegner sig for ca. 1% af FXS-tilfældene27. Sjældent, i personer, der har cellulær mosaisme for FMR1 REPEAT, kan PCR give et falsk negativt resultat på grund af manglende påvisning af mosaisme for større præmutation og Full-mutation alleler37,38. Det er blevet påvist, at tærsklen for denne PCR-baserede analyse for fuld mutation af mosaik prøver (341 gentagelser) er 2,5%, når grænseværdien for spids detektoren er fastsat til tre fluorescens enheder over baseline29. Sydlige blot analyse anbefales i de tilfælde, hvis mosaik alleler er indiceret. Med hensyn til elektroforese-platformene har tidligere undersøgelser vist, at sammenlignet med kapillar elektroforese-systemer (f. eks. ABI 3130XL-instrumentet) er bioanalysator instrumentet ikke i stand til at differentiere den normale homozygot kvindelige prøver med individuelle fragment toppe fra kvindelige prøver med heterozygot gentagne størrelser, der har gentagne tal forskelle på fire eller mindre29. Disse enkelt topprøver kunne dog klassificeres som normale, fordi det er blevet valideret, at denne PCR-baserede rørledning muliggør robust forstærkning og påvisning af fuld mutation eller præmutation alleler, hvilket minimerer muligheden for falsk negativ i denne situation. Uanset ovenstående begrænsninger kan metoden udnyttes som en første-lags rørledning til molekylær identifikation af FXS og skrøbelige X-associerede sygdomme med omkostningseffektivitet, robusthed og hurtig rapporteringstid suppleret med sekventering af FMR1 gen og Southern blot analyse af methylering niveauer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af tilskud fra NSFC Emergency Management Project (Grant No. 81741004), Kinas National Natural Science Foundation (Grant No. 81860272), den store forsknings plan for provins videnskab og teknologi Foundation i Guangxi ( Giv nr. AB16380219), China postdoc Science Foundation Grant (Grant No. 2018M630993) og Guangxi Natural Science Foundation (Grant No. 2018GXNSFAA281067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M. Jr, et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Tags

Genetik polymerase kædereaktion mikrofluidisk kapillar elektroforese cytosin-guanin-guanin-gentagelser trinucleotid skrøbelig x mental retardering-1 promotor skrøbeligt x syndrom fuld mutation premutation
En robust polymerase kæde reaktions baseret analyse til kvantificering af cytosin-guanin-guanin-Trinucleotid gentages i skrøbelig X mental retardering-1 gen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung,… More

Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter