Summary
이 프로토콜은 정의된 배양 시스템 및 세포 자가 조립을 사용하여 인간 다능성 줄기 세포로부터 간구를 생성하는 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 다수의 세포주에서 재현가능하고 비용 효율적이며 생체 의학 적용을 위한 안정적인 인간 간구의 생산을 허용합니다.
Abstract
간 조직의 재생 가능한 소스의 개발은 세포 기반 모델링을 개선 하는 데 필요한, 이식에 대 한 인간의 조직을 개발. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)는 인간 간 구체의 유망한 소스를 나타냅니다. 우리는 인간 다능성 줄기 세포에서 형성된 3차원 인간 간 구체를 생성하기 위해 세포 분화의 무혈청 및 정의된 방법을 개발했습니다. 기술의 잠재적 인 한계는 내부에 죽은 물질과 조밀 한 구체의 생산이다. 이를 우회하기 위해, 우리는 3D 구체의 크기를 제어하기 위해 정의 된 세포 밀도에서 agarose 마이크로 웰 기술을 채택하여 세포 사멸 및 / 또는 괴사 코어의 생성을 방지했습니다. 특히, 우리의 접근 방식에 의해 생성 된 구체는 간 기능과 안정적인 표현형을 표시, 기본 및 응용 과학 연구를위한 귀중한 자원을 나타내는. 우리는 우리의 접근이 인간적인 질병을 모형하고 취급하기 위하여 추가 조직을 개발하는 플랫폼 기술로 이용될 수 있고 미래에 복잡한 조직 건축을 가진 인간 조직의 생성을 허용할 수 있다는 것을 믿습니다.
Introduction
다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 능력은 다능성을 유지하면서 자가 갱신하는 동시에 필요에 따라 인간 세포 유형과 조직을 생산 할 수있는 기회를 제공합니다. hPSC는 2차원(2D) 부착 배양 시스템1,2,3,4,5,6을 사용하여 간세포형 세포(HLCs)로 효율적으로 분화되었습니다. ,7,8,9,10. 이러한 시스템은 단원성 질환, 바이러스 수명 주기, 약물 유발 간 손상(DILI), 독소 및 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)에 대한 태아 노출(NAFLD)11,12,13을 성공적으로 모델링하는 데 사용되었습니다. ,14,15. 그러나 이러한 모델에는 일상적인 사용을 제한하는 몇 가지 단점이 있습니다. 이들은 태아 마커 발현, 불안정한 표현형 및 가난한 조직 건축16,17,18,19를포함하며, 이는 또한 생체 내에서 장기 기능에 대한 외삽을 제한할 수 있다.
이러한 한계를 극복하기 위해, 3차원(3D) 분화 플랫폼은 생체 내 조직 구조를 모방하기 위해 개발되었다. 비록 가능하게, 그 접근은 조직 창세기20,21,22를구동하기 위하여 동물 유래 제품 및 매트릭스의 사용에 의존합니다, 확장 및 광범위한 신청을 제한하.
여기서는 정의된 재료 및 셀 자체 어셈블리를 사용하여 hPSC에서 대량의 3D 간구를 생성하는 절차를 자세히 설명합니다. 특히, 우리의 시술에 의해 생성된 조직은 세포 배양에서 1년 이상 기능적으로 유지되며 생체내 간 기능을 지원할 수 있다23.
요약하자면, 우리의 정의된 분화 접근법은 인간 배아 줄기 세포(hESCs) 및 유도만능 줄기 세포(iPSCs)로부터 안정적인 인간 간구의 생성을 허용한다. 우리는 설명된 절차가 기본 및 응용 과학 연구를 위한 3D 간구의 생성에 있는 중요한 돌파구를 나타낸다고 믿습니다.
Protocol
1. 아가로즈 마이크로 플레이트 금형의 준비
참고: 이러한 실험에 사용되는 배지는 세포 배양을 위해 멸균 및 실온(RT)이어야 합니다.
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2% 아가로즈 금형을 준비합니다.
- 저용융 온도의 아가로오스 2 g을 멸균 된 증류수 100 mL에 녹입니다. 완전히 녹을 수 있도록 간격이 흔들리면서 전자 레인지에서 조심스럽게 가열하십시오.
- 256웰 포맷 몰드에 520 μL의 용융 아가로스를 넣고 굳어버립합니다.
- 각 아가로즈 마이크로플레이트를 12웰 플레이트의 단일 웰로 옮김.
- 1.5mL의 DPS를 Ca2++Mg2+로 각각 의 인산 완충 식염수(DPBS)를 추가하고 P1000 파이펫 팁을 사용하여 여러 번 위아래로 부드럽게 파이펫팅하여 마이크로웰에서 기포를 제거합니다. 이것은 균일 한 세포 시종을 보장하기 위해 수행됩니다.
참고: 아가로즈 마이크로플레이트는 1x DPBS에서 4°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
2. 아가로스 마이크로웰 플레이트에 인간 다능성 줄기 세포를 파종
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세포 현탁액의 준비
- 앞서 설명한바와같이 hPSC의 미분화 배양으로부터 배지를 흡인8.
참고: hPSC는 mTeSR1에서 LN-521에서 배양되고 배지는 매 24시간마다 변경되고, 세포가 앞서 설명한바와같이 75% ~ 85%의 합류에 도달하면 정기적으로 통과된다 8. - Ca2+ /Mg2 + 없이 RT 1x DPBS 5 mL로 세포를 헹구고 버퍼를 제거하십시오.
- 세포에 1x 1x 해리 시약(재료표)의5 mL을 추가하고 6-8 분 동안 37 °C에서 세포를 배양하여 세포 해리를 허용합니다.
참고: 반응을 멈추려면 현미경으로 세포 분리를 검사하십시오. 세포는 플레이트에서 부분적으로 분리되어야합니다. 더 긴 시간이 필요한 경우 추가 1-2 분 동안 배양을 연장하십시오. - 세포 해리 시약을 제거하여 반응을 멈추고 10 μM Rho-관련 키나아제(ROCK) 억제제 Y27632로 보충된 신선한 mTeSR1 배지 5 mL를 세포에 첨가한다. P1000 파이펫 팁을 사용하여 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 셀을 해리합니다.
- 혈세포계와 트라이판 블루 염색 배제를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다. 이에 따라, 필요한 농도로 세포 현탁액을 준비한다.
- 필요한 총 셀 수를 계산합니다. 3D 간구 분화를 위해, 아가로즈 마이크로플레이트당 종자 3.84 x 105 세포는 직경이 100-150 μm인 스페로이드를 생성한다.
- 원하는 수의 세포를 멸균 15 mL 또는 50 mL 원심분리기로 옮기고 RT에서 5분 동안 200 x g에서 튜브를 원심분리기로 하여 세포를 펠렛한다.
- 흡인 및 mTeSR1 배지 플러스 10 μM ROCK 억제제 Y27632에서 상수 및 재중단 세포를 폐기한다. 세포 펠릿을 배지의 적절한 부피에서 2.1 x 106 세포/mL의 최종 농도로 희석합니다.
- 앞서 설명한바와같이 hPSC의 미분화 배양으로부터 배지를 흡인8.
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제조된 아가로즈 마이크로플레이트에 세포를 파종
참고: 냉장고에 저장된 아가로즈 마이크로플레이트를 사용하는 경우, 사용하기 전에 적어도 1시간 동안 37°C에서 세포 인큐베이터에 놓고 세포 파종 전에 우물에서 1x DPBS를 흡인합니다.- 아가로스 마이크로웰에 세포 현탁액 190 μL을 넣습니다.
- 파종 후, 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서 세포인큐베이터로 되돌려 2시간 동안 세포가 침전될 수 있도록 한다.
- 2시간 후, 10 μM ROCK 억제제 Y27632를 보충한 신선하고 따뜻한 mTeSR1 배지 1 mL을 각 웰에 추가합니다.
- 플레이트를 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 세포 인큐베이터로 되돌리고 세포가 부착될 수 있도록 다음날 구체 형성을 검사합니다.
3. HPSCs를 아가로즈 마이크로웰의 3D 간구로 차별화
- 폴리 2-하이드록시틸 메타크릴레이트(폴리-HEMA) 코팅 웰의 제조
- 95% 에탄올 100 mL에 폴리 헤마 2 g을 녹입니다. 용액을 55°C에서 핫 플레이트를 사용하여 밤새 저어줍니다. 24웰 플레이트의 웰당 250 μL의 폴리-HEMA 용액을 넣고 오븐을 사용하여 60°C에서 밤새 건조시다.
- 분화 매체의 준비
- 인간 액티빈 A 동결성 단백질을 멸균 0.2% 소 혈청 알부민(BSA)/DPBS에 용해시켜 인간 액티빈 A의 1,000x 스톡 용액을 최종 농도 100 μg/mL로 제조한다. -20°C에서 작은 알리쿼트에 보관하십시오. 1:1,000에서 사용하십시오.
- 마우스 Wnt3a 동결화 단백질을 멸균 0.2% BSA/DPBS에 용해시켜 10 μg/mL의 최종 농도로 Wnt3a의 1,000x 스톡 용액을 준비한다. -20°C에서 작은 알리쿼트에 보관하십시오. 1:200에서 사용하십시오.
- 인간 간세포 성장 인자(HGF)의 1,000x 스톡 용액을 멸균 0.2% BSA/DPBS에서 인간 HGF 동결성 단백질을 10 μg/mL의 최종 농도로 용해시킴으로써 제조한다. -20°C에서 작은 알리쿼트에 보관하십시오. 1:1,000에서 사용하십시오.
- OSM을 멸균 0.2% BSA/DPBS에 용해시켜 20 μg/mL의 최종 농도로 온코스타틴 M(OSM)의 1,000x 스톡 솔루션을 준비합니다. -20°C에서 작은 알리쿼트에 보관하십시오. 1:1,000에서 사용하십시오.
- 멸균 0.2% BSA/DPBS에서 동결성 단백질을 10 μg/mL의 최종 농도로 용해시킴으로써 상피 성장 인자(EGF)의 1000x 스톡 용액을 준비한다. -20°C에서 작은 알리쿼트에 보관하십시오. 1:1,000에서 사용하십시오.
- 10 μg/mL의 최종 농도로 멸균 0.2% BSA/DPBS에서 동결성 단백질을 용해시킴으로써 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 1,000x 스톡 용액을 준비한다. -20°C에서 작은 알리쿼트에 보관하십시오. 1:1,000에서 사용하십시오.
- 0.2% BSA/DPBS에서 0.2% BSA/DPBS로 용해시켜 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 1,000x 스톡 용액을 최종 농도 10 μg/mL로 준비한다. -20°C에서 작은 알리쿼트에 보관하십시오. 1:1,000에서 사용하십시오.
- 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640) 기저 배지로 구성된 내배엽 분화 매체를 2 % B27 보충제 (인슐린없이 50 x) 및 1 % 페니실린 / 스트렙 토마이신 (최종 농도 : 100 IU / mL 및 100 μg / mL, 각각)을 참조하십시오. 표시하지 않는 한, 각 매체 변화에서, 각각 50 ng/mL 및 100 ng/mL의 최종 농도에서 Wnt3a 및 activin A로 필요한 부피를 보충하십시오.
참고: 4 °C에서 보관하고 2 주 이내에 사용하십시오. - 20% 녹아웃 혈청 교체(KOSR)로 녹아웃 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (KO-DMEM)로 구성된 간세포 분화 매체를 만들고 L-글루타민에 대한 대체 보충제0.5 %, 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA)으로 보충하십시오. 0.1 mM 베타 메르카포에탄올, 1% 디메틸 설폭사이드(DMSO), 1% 페니실린/스트렙토마이신(최종 농도는 각각 100 IU/mL 및 100 μg/mL)입니다. 진공 하에서 필터를 적용합니다.
참고: 4 °C에서 보관하고 2 주 이내에 사용하십시오. - L-글루타민에 대한 대체 보충제의 1%로 보충된 간세포 성숙 배지, 10 μM 하이드로코르티손 21-헤미수피네이트 나트륨 염(HCC), 1% 페니실린/스트렙토미신(최종 농도 100 IU/mL 및 각각 100 μg/mL). 각 배지 변화에 대해 OSM 및 HGF(최종 농도20 ng/mL 및 10 ng/mL)로 필요한 부피를 보충합니다.
참고: 재고를 4 °C에 보관하고 2 주 이내에 사용하십시오. - L-글루타민에 대한 대체 보충제 1%, 페니실린/스트렙토마이신 1%로 구성된 10% 녹아웃 혈청 교체로 보충된 윌리엄의 E 배지로 구성된 간세포 유지 관리 매체를 만드십시오(최종 농도는 100 IU/mL 및 100 μg/mL, 각각)을 참조하십시오. 각 배지 변화에 대해, HGF, EGF, bFGF 및 VEGF(10 ng/mL에서 각 성장 인자의 최종 농도)로 필요한 부피를 보충합니다.
참고: 재고를 4 °C에 보관하고 2 주 이내에 사용하십시오.
- 간구 형성 24 시간 포스트 파종을 확인하고 간세포 분화를 시작합니다. mTeSR1 배지를 조심스럽게 제거하고 100 ng/mL 활성 A 및 50 ng/mL Wnt3a로 보충된 신선한 내배엽 분화 매체 1 mL로 교체하십시오.
- hESC에 대해 24시간마다 24시간마다 보충된 내배엽 프라이밍 배지를 변경합니다. hiPSCs로 작업할 때, 액티빈 A(100ng/mL)만으로 미디어를 보충하는 2일 동안 이 단계를 연장합니다.
- 최종 내배엽 유도에 이어, 5일 동안 간폭발 분화 배지로 전환하여 매 2일마다 배지를 교체하고 간폭발 사양의 마지막 날에 마지막 변화를 수행한다.
- 간구를 폴리 헤마 코팅 웰로 옮김.
- KSR/DMSO 배지를 제거한 후 보충제 없이 간세포 성숙 배지로 세포를 한 번 씻고 10 ng/mL HGF 및 20 ng/mL OSM으로 보충한 간세포 성숙 배지 1 mL을 추가합니다.
- P1000 파이펫을 사용하여 용액을 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 아가로스 마이크로 플레이트에서 간구를 들어 올립니다.
- 간구를 함유하는 배지를 잘 코팅된 폴리-HEMA로 옮김을 이월한다.
- 10 ng/mL HGF 및 20 ng/mL OSM으로 보충된 간세포 성숙 배지 1 mL를 사용하여 아가로스 마이크로플레이트를 세척하고 배지를 폴리-HEMA 코팅으로 잘 옮김을 전달한다.
- 아가로스 마이크로플레이트로부터 모든 간구를 옮기기 위해 3.6.4단계를 가능한 한 여러 번 반복한다.
참고: 간구가 포함된 용액을 위아래로 조심스럽게 피펫하여 손상을 방지하는 것이 중요합니다.
- 간구를 잘 코팅된 폴리-HEMA에 남아 있는 배지의 ~1 mL까지 P100 피펫을 사용하여 간구를 제거하지 않고 과량 배지를 조심스럽게 흡인한다.
- 12 일 동안 매 48 시간마다 매체를 변경하십시오.
- 20일째에 hESCs로 작업할 때 또는 22일째에 hiPSCs로 작업하는 경우 중간을 간세포 유지 보수 매체로 전환하십시오.
- 간세포 성숙 배지를 제거하고 보충제없이 간세포 유지 보수 매체로 세포를 한 번 씻어. HGF, EGF, FGF 및 VEGF의 10 ng/mL로 보충된 간세포 유지 보수 배지 1 mL를 추가합니다.
- 48시간마다 신선한 간세포 유지 보수 매체를 위해 매 질을 변경하십시오.
4. 장기 배양 3D 간구의 기능 분석
- 기능 분석을 수행하기 전에 10 μM HCC, L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신(각각 100 IU/mL 및 100 μg/mL에서 최종 농도)과 10 ng/mL HGF 48h로 보충된 간세포 성숙 배지로 전환합니다.
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시토크롬 (CYP) P450 분석을 사용하여 간세포 대사 기능을 분석합니다.
- CYP3A 기저 활성 또는 CYP2를 검출하기 위해 100 μM 루시페린 메틸 에테르(luciferin-PFBE) 기판으로 보충된 50 μM luciferin-6'-pentafluoro-benzyl 에테르(luciferin-PFBE) 기판으로 보충된 신선한 간세포 성숙 배지 1mL로 배지교체 기저 활동(복제 수 = 3). 조직 배양 배지를 음성 대조군으로 사용한다.
참고: 교차 반응성을 피하기 위해 3D 간구를 포함하는 동일한 웰을 사용하여 다른 CYP P450 활동을 테스트하지 말고 개별 우물에서 수행하는 것이 좋습니다. - 37 ° C에서 24 시간 동안 세포를 배양하십시오.
- P100 파이펫 팁을 사용하여 상급자를 수집하고 제조업체의 지침에 따라 분석을 수행합니다.
- 기저 활성의 상대적 수준을 측정하고 비신코닌산 분석(BCA)에 의해 결정된 바와 같이 mg 단백질당 정규화한다.
- CYP3A 기저 활성 또는 CYP2를 검출하기 위해 100 μM 루시페린 메틸 에테르(luciferin-PFBE) 기판으로 보충된 50 μM luciferin-6'-pentafluoro-benzyl 에테르(luciferin-PFBE) 기판으로 보충된 신선한 간세포 성숙 배지 1mL로 배지교체 기저 활동(복제 수 = 3). 조직 배양 배지를 음성 대조군으로 사용한다.
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효소 연계 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 혈청 단백질 생산을 테스트합니다.
- 10 ng/mL HGF 및 20 ng/mL OSM(복제 수 = 3)으로 보충된 신선한 간세포 성숙 배지 1mL로 배지를 교체합니다. 조직 배양 배지를 음성 대조군으로 사용한다.
- 37 ° C에서 24 시간 동안 세포를 배양하십시오.
- P100 파이펫 팁을 사용하여 상층을 수집하고 제조업체의 지침에 따라 혈청 단백질 생산의 상대수준을 측정합니다.
- BCA 분석에 의해 결정된 바와 같이 mg 단백질 당 정규화.
5. 면역 세포 화학
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간구를 포함하는 파라핀 절제.
- 간구를 1x DPBS로 세 번 씻습니다.
- 간구를 얼음으로 차가운 메탄올로 30분 동안 고정합니다.
- 1x DPBS로 세 번 씻으소서.
- H2O에 용해된 2% 아가로즈용액의 300 μL에 간구를포함시키고 24웰 플레이트의 빈 웰을 사용하여 금형으로 30분 동안 고형화시켰다.
- 파라핀에 간구를 함유한 아가로즈를 포함시켰다.
- 마이크로토메를 사용하여 4 μm 두께의 단면에 고정 된 간구를 포함하는 파라핀 블록을 단면화.
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섹션의 왁싱 및 재수화.
참고: 가능하면 새로운 솔루션을 사용하십시오. 1주일 이상 얼룩진 트로프에 있던 용액을 사용하지 마십시오.- 슬라이드 랙에 섹션을 배치합니다.
- 300 mL의 자일렌을 함유한 스테인링 트로프에 섹션이 포함된 슬라이드 랙을 5분 동안 담급니다.
- 5.2.2단계를 반복합니다.
- 20s의 절대 에탄올에 담가.
- 95% 에탄올에 20년대에 담그소.
- 90% 에탄올에 20년대에 담그소.
- 20s에 80% 에탄올에 담그소.
- 20s에 70% 에탄올에 담그소.
- 5 분 동안 물로 섹션을 재수화하십시오.
참고: 슬라이드를 동일한 슬라이드 랙에 유지하고 얼룩이 있는 한 트로프에서 다음 슬라이드로 이동합니다. 사용 된 볼륨 (일반적으로 ~ 300 mL)은 염색 트로프의 크기에 따라 다릅니다.
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간구를 포함하는 파라핀 단면의 항원 검색.
- 800W에서 전자레인지에서 15분 동안 1x Tris-EDTA(TE) pH 9.0 완충액으로 왁스를 제거하고 재수화한 부분을 가열합니다.
- 수돗물에 5분간 담그어 시료를 식힙니다.
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면역 염색.
- RT에서 1 시간 동안 0.1 % 폴리 소르베이트 20 (PBS / T)/10 % BSA로 만든 PBS로 만든 차단 용액으로 인큐베이션 슬라이드.
- 차단 용액을 PBS/T/1% BSA에서 희석된 적절한 1차 항체로 교체하고 밤새 부드러운 교반으로 4°C에서 배양하십시오.
- PBS/T로 세포를 5분 동안 세척하고 세 번 반복합니다.
- PBS/T/1% BSA에서 희석된 적절한 이차 항체와 배양하고 부드러운 교반으로 1시간 동안 RT에서 어둠 속에서 배양합니다.
참고: 최적화된 1차 및 2차 항체는 재료표에 나열되어 있습니다. - PBS/T로 세포를 5분 동안 세척하고 세 번 반복합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 셀에 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)를 추가하고 유리 커버슬립을 부드럽게 놓아 기포를 줄입니다. 고정 된 세포를 어둠 속에서 4 °C로 유지하십시오. 적절한 필터와 형광등으로 현미경으로 염색을 관찰하십시오.
참고: 이미징이 될 때까지 접시를 어두운 환경에서 4 °C에서 보관하십시오.
Representative Results
배아 줄기 세포주(H9) 또는 유도된 만능 줄기 세포주(P106)로부터의 3차원 응집체는 당사의 정의된 절차를이용하여 간세포 혈통을 향해 분화되었다(도 1). 다능성 줄기 세포는 먼저 간세포증 규격 이전에 최종 내배엽을 향해 프라이밍되었다. 이에 따라, 간세포는 최대 1년23년동안 문화에서 유지될 수 있는 3D 간구로 성숙되었다.
3D 구체의 구조를 연구하기 위해, 30일 된 hESC- 또는 iPSC 유래 구체를 고정, 단면화 및 염색하여 간세포 및 중간엽 세포에서 발현되는 단백질의 존재를 검출하였다. 간세포 핵 인자 4 알파(HNF4α) 및 중간엽 마커 비멘틴을 채택하였고, 중간엽 세포의 코어를 둘러싼 세포와 같은 간세포로구성된 외층의 존재를 밝혔다(그림 2). 알부민, CYP3A 및 E-cadherin : 우리는 간세포에서 표현 된 단백질의 발현을 분석하는 이러한 실험을 따랐다. 면역염색은 이들 단백질의 발현이 구체의 외부층으로 제한되었다는 것을 밝혔다(도 3).
간구의 기능분석은 30일째에 수행되었다. CYP1A2 및 CYP3A는 기능성 간세포 내에서 중요한 효소입니다. 그들의 활동은 확립된 검사를 사용하여 평가되었습니다. H9-유래 간구는 220,375±74514 RLU/mL/mg 단백질 및 CYP1A2 활성732,440±33,330 RLU/mL/mg 단백질의 CYP3A 활성을 나타내었다(그림4A). P106 유래 간구에서CYP3A 활성은 132117 ±43,391 RLU/mL/mg 단백질이었고 CYP1A2 활성은 409,907±121,723 RLU/mL/mg 단백질(도4B)이었다. 인간 1차 간세포의 2개의 배치와 비교했을 때, 3D 간 구체는 CYP 활성10의존경받는 수준을 나타냈다.
알부민과 알파 페토프로테인(AFP)의 합성 및 분비를 분석한 결과, H9 유래 간구는 각각 알부민과 알파 페토프로테인의 683.9±84 및 159±20 ng/mL/24 h/mg 단백질을 분비한 것으로 나타났다(그림5A). P106 유래 간구는 각각 알부민및 알파-페토프로테인의 497±41 및 756±24 ng/mL/24 h/mg 단백질을 분비한 반면, 각각 5B).
그림 1 : hESC에서 3D 간구를 생성하는 단계별 분화 절차. 파란색 대괄호는 hiPSC에 대한 분화의 날을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 3D 간구의 구조 개편. 간세포 핵 인자 4 알파(HNF4α-녹색) 및 비멘틴(적색)의 발현의 대표적인 이미지는 (A) H9 유래 3D 간구및 (B) P106 유래 3D 간구 및 이들의 상응하는 면역글로불린 G(IgG) 대조군 . 축척 막대는 60 μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 3D 간구에서 간 마커 발현 평가. 알부민, CYP3A, E-카데린 및 그에 상응하는 IgG 제어 (A) H9-및 (B) P106 유래 3D 간구 - 간세포 마커의 발현의 대표적인 이미지. 배율 막대 = 60 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 3D 간구에서 시토크롬 P450 기능. (A) H9 유래 3D 간구 및 (B) P106 유래 3D 간구에서시토크롬 P450 1A2 및 3A 활성의측정. 데이터는 세 가지 생물학적 복제의 평균을 나타내고, 오차 막대는 표준 편차(SD)를 나타낸다. 활성은 단백질 의 mg 당 mL 당 상대적인 광 단위 (RLU)로 인용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 간구 단백질 분비 분석. 알부민 및 알파-페토프로테인(AFP)의 분비물을 (A) H9 유래 3D 간구 및 (B) P106 유래 3D 간구에서 분석하였다. 데이터는 3개의 생물학적 복제의 대표이고, 오류 막대는 SD를 나타냅니다. 분비된 단백질은 단백질의 mg 당 24 시간 당 mL 당 단백질의 나노그램으로 인용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
3D로 인간 간구를 생산하기 위해 정의된 제노 프리 시스템의 개발은 시험관 내 및 생체 내 노력 모두에 필요합니다. 현재 대부분의 간세포 분화 접근법은 인간 만능 줄기 세포로부터2차원 부착 배양으로 수행된다. 이러한 환경은 조직 기원 및 항상성에 관여하는 많은 환경 단서가 부족합니다. 이종 세포 상호 작용, 매트릭스 생산 및 리모델링, 생체 내 생물학에 가난한 번역의 결과18,19.
그 결과, 연구는 다능성 줄기 세포에서 간구를 생성하는 대체 접근법에 초점을 맞추고있다. 3D 연구의 숫자는 필드를 진행했지만, 그 지원 및 / 24를 제공하기 위해 동물 성 제품에 의존21,22 복잡 기술 확장 및 실험 재현성 및 응용 프로그램을 손상시고 있습니다.
당사의 기사(그림1)에 설명된 절차는 정의되고, 효율적이며, 매우 재현가능하며 비용 효율적이며, 시험관 내에서 1년 동안 기능적으로 유지되고 중요한 간 지원을 제공하는 기능성 간 구체의 생산을 허용합니다. 생체 내14. 중요한 것은,이 플랫폼은 사용자가 조밀 한 괴사 센터의 형성과 표현형의 손실을 제한, 3D 간 구체의 크기를 제어 할 수 있습니다.
3D 간구를 폴리-HEMA 코팅 플레이트로 의전하는 것은 이 프로토콜에서 중요한 단계를 나타낸다. 구가 손상되지 않도록 절차에서이 단계에서 부드럽게 파이펫하는 것이 중요합니다. 또한 구 구조의 전단 응력과 왜곡을 방지하기 위해 미디어 변경을 신중하게 수행해야 합니다.
이러한 연구에서, 3D 간구는 조직화된 구조를 나타내었다(도2 및 도3), 시토크롬 P450 기능(도4)및 알부민 및 알파-페토프로테인을 포함하는 분비간 단백질(도 5). 이 절차는 성공적으로 비교 결과를 가진 4개의 만능 줄기 세포 선에서 수행되었습니다. 앞을 내다보면서, 이 기술은 복잡한 아키텍처를 가진 추가 내피 및 중간엽 조직을 개발하는 플랫폼으로 이용될 수 있습니다.
Disclosures
데이비드 C. 헤이는 스템노바테(Stemnovate) 및 하이어스테이크스(HigherSteaks Ltd)의 공동 창립자이자 주주입니다. 저자의 나머지 는 이 문서에서 논의 된 주제 또는 자료에 대한 이해 상충이 없음을 증명합니다.
Acknowledgments
이 연구는 영국 재생 의학 플랫폼 (MRC MR / L022974 / 1)과 수석 과학자 사무실 (TCS / 16 /37)의 상으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture and functional assays | |||
| Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
| Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
| Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Equipment | |||
| Microwave | Bosch | ||
| Microtome | Leika | RM2125RT | |
| Oven | Thermoscientific | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
| CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
| IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
| Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |
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