Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Serum fri produksjon av tredimensjonale humant Hepatospheres fra Pluripotent stamceller

Published: July 20, 2019 doi: 10.3791/59965
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1,4, 1, 1, 4, 3, 1
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2UCL Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 3Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health and Life Sciences, Brunel University London, 4School of Biochemistry and Immunology, Trinity Biomedical Sciences Institute, Trinity College Dublin

Summary

Denne protokollen beskriver en tilnærming til å produsere hepatospheres fra menneskelige Pluripotent stamceller ved hjelp av et definert kultur system og celle selv montering. Denne protokollen er reproduserbar i en rekke cellelinjer, kostnadseffektive og tillater produksjon av stabile menneskelige hepatospheres for biomedisinsk anvendelse.

Abstract

Utviklingen av fornybare kilder av leveren vev er nødvendig for å forbedre celle-basert modellering, og utvikle menneskelig vev for transplantasjon. Human embryonale stamceller (hESCs) og humant indusert Pluripotent stamceller (hiPSCs) representerer lovende kilder til menneskelige lever kuler. Vi har utviklet en serum fri og definert metode for cellulær differensiering å generere tredimensjonale menneskelige lever kuler dannet av humant Pluripotent stamceller. En potensiell begrensning av teknologien er produksjon av tette sfærer med dødt materiale inni. For å omgå dette har vi benyttet agarose mikrotiterplateleser teknologi ved definerte celle tetthet for å kontrollere størrelsen på 3D-kulene, og hindre generering av apoptotisk og/eller nekrotisk kjerner.  Spesielt, kulene som genereres av vår tilnærming viser leverfunksjon og stabile fenotype, som representerer en verdifull ressurs for grunnleggende og anvendt vitenskapelig forskning. Vi tror at vår tilnærming kan brukes som en plattformteknologi for å utvikle ytterligere vev til modell og behandle menneskelig sykdom, og i fremtiden kan tillate generering av menneskelig vev med komplekse vev arkitektur.

Introduction

Muligheten av menneskelige Pluripotent stamceller (hPSCs) til selv-fornyelse, mens beholde pluripotency, gir en mulighet til å produsere menneskelige celletyper og vev på forespørsel. hPSCs har vært effektivt differensiert i hepatocytter celler (HLCs) ved hjelp av to-dimensjonale (2D) tilhenger kultur systemer1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Disse systemene har blitt brukt for å kunne modellere monogenic sykdom, virus livssyklus, narkotikaindusert leverskade (DILI), fosterets eksponering for giftstoffer og alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Men disse modellene har noen ulemper, som begrenser deres rutine bruk. De inkluderer fosterets markør uttrykk, ustabil fenotype og dårlig vevs arkitektur16,17,18,19, som også kan begrense ekstrapolering til organfunksjon in vivo.

For å overkomme disse begrensningene har tredimensjonale (3D) differensiering-plattformer blitt utviklet for å etterligne in vivo vevs arkitektur. Selv om aktivering, de tilnærminger stole på bruk av animalske avledede produkter og matriser til å drive tissue Genesis20,21,22, begrenser oppskalering og utbredt anvendelse.

Her har vi detaljerte prosedyrer for å generere store mengder 3D-hepatospheres fra hPSCs ved hjelp av definerte materialer og celle selv montering. Spesielt er vevet generert av vår prosedyre fortsatt funksjonell i mer enn ett år i cellekultur og er i stand til å støtte leverfunksjon i vivo23.

Oppsummert gjør vår definerte differensiering tilnærming generering av stabile menneskelige hepatospheres fra både menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og indusert Pluripotent stamceller (iPSCs). Vi mener at den beskrevne prosedyren representerer et betydelig gjennombrudd i genereringen av 3D-hepatospheres for grunnleggende og anvendt vitenskapelig forskning.

Protocol

1. utarbeidelse av Agarose Mikroplate muggsopp

Merk: Medier som brukes for disse eksperimentene må være sterile og ved romtemperatur (RT) for cellekultur.

  1. Forbered 2% agarose muggsopp.
    1. Oppløsning 2 g lav Smeltetemperatur agarose i 100 mL sterilisert destillert vann. Forsiktig varme i en mikrobølgeovn med intervall risting for å oppløse helt.
    2. Tilsett 520 μL av smeltet agarose til en 256-brønn format mold og la stivne.
    3. Overfør hver agarose mikroplate til en enkelt brønn av en 12-brønn plate.
    4. Tilsett 1,5 mL 1x Dulbecco fosfat-bufret saltvann (DPBS) med ca2 +/mg2 + til hver brønn og fjern luftboblene fra microwells ved å forsiktig pipettering opp og ned flere ganger ved hjelp av en P1000 pipette spissen. Dette gjøres for å sikre ensartet celle seeding.
      Merk: Agarose mikroplater kan oppbevares i opptil 6 måneder ved 4 ° c i 1x DPBS.

2. seeding Human Pluripotent stamceller i Agarose Mikrotiterplateleser plater

  1. Utarbeidelse av celle suspensjon
    1. Aspirer mediet fra en udifferensierte kultur av hPSCs som tidligere beskrevet8.
      Merk: hPSCs er KULTIVERT på LN-521 i mTeSR1 med mediet endret hver 24 h, og passert regelmessig når cellene når 75% til 85% av confluency som tidligere beskrevet8.
    2. Skyll cellene med 5 mL RT 1x DPBS uten ca2 +/mg2 + og fjern bufferen.
    3. Tilsett 5 mL 1x celle dissosiasjon reagens (tabell av materialer) til cellene og Tillat celle dissosiasjon av incubating celler ved 37 ° c for 6-8 min.
      Merk: Hvis du vil stoppe reaksjonen, undersøker du celle løsgjøring under mikroskopet. Cellene skal være delvis løsrevet fra platen. Forlenge inkubasjons for en ekstra 1-2 min hvis lengere tid er krevde.
    4. Stopp reaksjonen ved å fjerne celle dissosiasjon reagens og tilsett 5 mL fersk mTeSR1 medium supplert med 10 μM Rho-assosiert kinase (ROCK) inhibitor Y27632 til cellene. Distansere celler ved pipettering opp og ned flere ganger ved hjelp av en P1000 pipette spissen.
    5. Telle levedyktige celler ved hjelp av en hemocytometer og trypan blå farging eksklusjon. Etter dette, forberede cellen suspensjonen på ønsket konsentrasjon.
    6. Beregn det totale antallet celler som trengs. For 3D hepatosphere differensiering, frø 3,84 x 105 celler per agarose mikroplate å generere spheroids med 100-150 μm i diameter.
    7. Overfør det ønskede antall celler til et sterilt 15 mL eller 50 mL sentrifugerør og sentrifuger røret ved 200 x g i 5 min ved RT til pellets cellene.
    8. Aspirer og kast de supernatanten og resuspend cellene i mTeSR1 medium pluss 10 μM ROCK-hemmer Y27632. Fortynne cellen pellet i riktig volum av medium til en endelig konsentrasjon av 2,1 x 106 celler/ml.
  2. Seeding cellene til forberedt agarose mikroplater
    Merk:     hvis du bruker kjøleskap-lagret agarose mikroplater, plasserer du dem i celle inkubator ved 37 ° c i minst en time før bruk og aspirer 1X DPBS fra brønnen før celle seeding.
    1. Tilsett 190 μL av celle fjæringen i agarose mikrotiterplateleser.
    2. Etter seeding, returnere platene til cellen inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 for 2 h slik at cellene til å bosette seg.
    3. Etter 2 h, tilsett 1 mL friskt og varmt mTeSR1 medium supplert med 10 μM ROCK inhibitor Y27632 til hver brønn.
    4. Returner platene til celle inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 for 24 timer og Undersøk dannelsen av kuler neste dag for å tillate cellene å feste.

3. differensiering hPSCs til 3D Hepatospheres på Agarose Microwells

  1. Utarbeidelse av Poly 2-hydroxyethyl akrylat (Poly-HEMA) belagt brønner
    1. Oppløsning 2 g Poly-HEMA i 100 mL 95% etanol. Rør løsningen over natten ved hjelp av en varm tallerken ved 55 ° c. Tilsett 250 μL av Poly-HEMA oppløsning per brønn av en 24-brønn plate og tørk over natten ved 60 ° c ved hjelp av en ovn.
  2. Utarbeidelse av differensiering medium
    1. Forbered en 1, 000x lagerløsning av menneskelig activin A ved å oppløse menneskelig activin et lyofilisert protein i steril 0,2% storfe serum albumin (BSA)/DPBS til en endelig konsentrasjon på 100 μg/mL. Oppbevares ved-20 ° c i små alikvoter. Bruk ved 1:1000.
    2. Forbered en 1, 000x lagerløsning av Wnt3a ved å oppløse musen Wnt3a lyofilisert protein i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL. Oppbevares ved-20 ° c i små alikvoter. Bruk på 1:200.
    3. Forbered en 1, 000x lagerløsning av humant hepatocytter vekstfaktor (HGF) ved å oppløse humant HGF lyofilisert protein i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL. Oppbevares ved-20 ° c i små alikvoter. Bruk ved 1:1000.
    4. Forbered en 1, 000x lagerløsning av oncostatin M (OSM) ved å oppløse OSM i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig konsentrasjon på 20 μg/mL. Oppbevares ved-20 ° c i små alikvoter. Bruk ved 1:1000.
    5. Forbered en 1000x lagerløsning av epitel vekstfaktor (EGF) ved å oppløse det lyofilisert proteinet i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL. Oppbevares ved-20 ° c i små alikvoter. Bruk ved 1:1000.
    6. Forbered en 1, 000x lagerløsning av grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF) ved å oppløse det lyofilisert proteinet i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL. Oppbevares ved-20 ° c i små alikvoter. Bruk ved 1:1000.
    7. Forbered en 1, 000x lagerløsning av vaskulær endothelial vekstfaktor (VEGF) ved å oppløse det lyofilisert proteinet i 0,2% BSA/DPBS til en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL. Oppbevares ved-20 ° c i små alikvoter. Bruk ved 1:1000.
    8. Lag endoderm differensiering medium bestående av Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basal medium supplert med 2% B27 supplement (50x, uten insulin), og 1% penicillin/Streptomycin (endelig konsentrasjoner: 100 IU/mL og 100 μg/mL, (henholdsvis). Med mindre noe annet er angitt, må du ved hver medium endring supplere det nødvendige volumet med Wnt3a og activin A i en endelig konsentrasjon på 50 ng/mL og 100 ng/mL.
      Merk: Oppbevares ved 4 ° c og brukes innen to uker.
    9. Lag hepatoblast differensiering medium bestående av knockout Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium (KO-DMEM) med 20% knockout serum erstatning (KOSR) og supplert med 0,5% av et alternativt supplement til L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoethanol, 1% dimethyl sulfoxide (DMSO) og 1% penicillin/Streptomycin (slutt konsentrasjoner ved 100 IU/mL og 100 μg/mL, henholdsvis). Filter under vakuum.
      Merk: Oppbevares ved 4 ° c og brukes innen to uker.
    10. Lag hepatocytter modnings medium bestående av hepatocytter medium supplert med 1% av et alternativt supplement til L-glutamin, 10 μM Hydrocortisone 21-hemisuccinate natrium salt (HCC), 1% penicillin/Streptomycin (slutt konsentrasjoner ved 100 IU/mL og 100 μg/mL, henholdsvis). For hver medium endring, supplere det nødvendige volum med OSM og HGF (endelige konsentrasjoner på 20 ng/mL og 10 ng/mL, henholdsvis).
      Merk: Oppbevar aksjen ved 4 ° c og bruk innen to uker.
    11. Lag hepatocytter vedlikeholds medium bestående av William ' s E medium supplert med 10% knockout serum erstatning, bestående av 1% av et alternativt supplement til L-glutamin, 1% penicillin/Streptomycin (endelig konsentrasjoner ved 100 IU/mL og 100 μg/mL, (henholdsvis). For hver medium endring, supplere det nødvendige volumet med HGF, EGF, bFGF og VEGF (endelig konsentrasjon av hver vekstfaktor ved 10 ng/mL).
      Merk: Oppbevar aksjen ved 4 ° c og bruk innen to uker.
  3. Sjekk hepatosphere formasjon 24 h innlegg seeding og initiere hepatocytter differensiering. Fjern forsiktig mTeSR1 medium og erstatte det med 1 mL fersk endoderm differensiering medium supplert med 100 ng/mL activin A og 50 ng/mL Wnt3a.
  4. Endre supplert endoderm priming medium hver 24 h for 3 dager for hESCs. Når du arbeider med hiPSCs, forlenge denne fasen for ytterligere 2 dager supplere Media med activin A (100ng/mL) alene.
  5. Etter definitive endoderm induksjon, Bytt til hepatoblast differensiering medium for hepatoblast spesifikasjon for 5 dager erstatte mediet hver 2 dager og utføre den siste endringen på den siste dagen i hepatoblast spesifikasjonen.
  6. Overfør hepatospheres til Poly-HEMA belagte brønner.
    1. Vask cellene en gang med hepatocytter modnings medium uten kosttilskudd etter fjerning av KSR/DMSO-medium og tilsett 1 mL hepatocytter modnings medium supplert med 10 ng/mL HGF og 20 ng/mL OSM.
    2. Ved hjelp av en P1000 pipette, løft opp hepatospheres fra agarose mikroplate ved pipettering opp og ned løsningen flere ganger.
    3. Overfør mediet som inneholder hepatospheres til en Poly-HEMA belagt brønn.
    4. Vask agarose mikroplate med 1 mL hepatocytter modnings medium supplert med 10 ng/mL HGF og 20 ng/mL OSM og Overfør mediet til Poly-HEMA belagt godt.
    5. Gjenta trinn 3.6.4 så mange ganger som mulig for å overføre alle hepatospheres fra agarose mikroplate.
      Merk: Det er viktig å nøye pipette opp og ned løsningen som inneholder hepatospheres for å unngå å skade dem.
  7. Nøye aspirer overflødig medium uten å fjerne hepatospheres ved hjelp av en P100 pipette til ~ 1 mL medium inneholder hepatospheres forblir i Poly-HEMA belagt godt.
  8. Endre mediet hver 48 h for 12 dager.
  9. På dag 20 når du arbeider med hESCs eller dag 22 hvis du arbeider med hiPSCs, bytte medium til hepatocytter vedlikehold medium.
    1. Fjern hepatocytter modnings medium og vask celler en gang med hepatocytter vedlikeholds medium uten kosttilskudd. Tilsett 1 mL hepatocytter vedlikeholds medium supplert med 10 ng/mL HGF, EGF, FGF og VEGF.
  10. Endre mediet for fersk hepatocytter vedlikehold medium hver 48 h.

4. funksjonell analyse av langsiktig kultivert 3D Hepatospheres

  1. Bytt til hepatocytter modnings medium supplert med 10 μM HCC, L-glutamin, 1% penicillin/Streptomycin (slutt konsentrasjoner ved 100 IU/mL og 100 μg/mL, henholdsvis) og 10 ng/mL HGF 48 h før utføring av funksjonell analyse.
  2. Analyser hepatocytter metabolsk funksjon ved hjelp av cytokrom (CYP) P450 analyser.
    1. Bytt medium med 1 mL fersk hepatocytter modnings medium supplert med 50 μM luciferin-6'-pentafluoro-benzylalkohol Eter (luciferin-PFBE) substrat for å oppdage CYP3A basal aktivitet eller 100 μM luciferin-metyl Eter (luciferin-ME) substrat for å oppdage CYP1A2 basal aktivitet (antall replikerer = 3). Bruk vevs kultur medier som en negativ kontroll.
      Merk: For å unngå kryss-reaktivitet anbefales det ikke å bruke de samme brønnene som inneholder 3D-hepatospheres for å teste forskjellige CYP P450-aktiviteter, men å utføre dem i individuelle brønner.
    2. Ruge celler for 24 h ved 37 ° C.
    3. Samle supernatanter ved hjelp av en P100 pipette spissen og utføre analysen i henhold til produsentens instruksjoner.
    4. Mål den relative nivåer av basal aktivitet og normalisere til per mg protein som bestemmes av bicinchoninic acid analysen (BCA).
  3. Test serum protein produksjon ved hjelp av enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (ELISA).
    1. Bytt medium med 1 mL fersk hepatocytter modnings medium supplert med 10 ng/mL HGF og 20 ng/mL OSM (antall replikerer = 3). Bruk vevs kultur medier som en negativ kontroll.
    2. Ruge celler for 24 h ved 37 ° C.
    3. Samle supernatanten ved hjelp av en P100 pipette spissen og måle den relative nivåer av serum protein produksjon som per produsentens instruksjoner.
    4. Normalisere til per mg protein som bestemmes av BCA-analysen.

5. immuncytokjemi

  1. Utarbeidelse av para fin seksjoner som inneholder hepatospheres.
    1. Vask hepatospheres tre ganger med 1x DPBS.
    2. Fest hepatospheres med iskaldt metanol i 30 min.
    3. Vask tre ganger med 1x DPBS.
    4. Bygg inn hepatospheres i 300 μL av en herdet løsning på 2% agarose oppløst i H2O ved hjelp av en tom brønn av en 24-brønn plate som en mold og la den stivne i 30 min.
    5. Bygg inn agarose som inneholder hepatospheres i parafin.
    6. Del para fin blokken som inneholder faste hepatospheres i 4 μm tykke seksjoner ved hjelp av en mikrotomen.
  2. De-voksing og rehydrering av delene.
    Merk:     Bruk ferske løsninger når det er mulig. Ikke bruk løsninger som har vært på farging gjennom lengre enn en uke.
    1. Plasser inndelinger i et lysbilde stativ.
    2. Dypp objektglasstativet som inneholder seksjoner i en farge trau som inneholder 300 mL med xylen i 5 min.
    3. Gjenta trinn-5.2.2.
    4. Dypp i absolutt etanol for 20 s.
    5. Senk ned i 95% etanol til 20 s.
    6. Senk ned i 90% etanol til 20 s.
    7. Senk ned i 80% etanol til 20 s.
    8. Senk ned i 70% etanol til 20 s.
    9. Rehydrate delene med vann i 5 min.
      Merk: Behold lysbildene i samme lysbilde stativ, og flytt dem fra en farge til den neste. Volum brukt (vanligvis ~ 300 mL) avhenger av størrelsen på flekker trau.
  3. Antigen henting av parafin seksjoner som inneholder hepatospheres.
    1. Heat de-voks og rehydrert seksjoner i 1x Tris-EDTA (TE) pH 9,0 buffer løsning i 15 minutter i en mikrobølgeovn på 800 W.
    2. Kjøl ned prøvene ved å dyppe dem i vann fra springen i 5 min.
  4. Immunostaining.
    1. Ruge lysbilder med blokkerende løsning laget av PBS med 0,1% polysorbat 20 (PBS/T)/10% BSA for 1 h at RT.
    2. Erstatt blokkerings løsning med riktig primær antistoff fortynnet i PBS/T/1% BSA og ruge ved 4 ° c med skånsom omrøring over natten.
    3. Vask celler med PBS/T for 5 min og gjenta tre ganger.
    4. Ruge med riktig sekundært antistoff fortynnet i PBS/T/1% BSA og ruge i mørket ved RT for 1 time med skånsom agitasjon.
      Merk: De optimaliserte primær-og sekundær Antistoffene er listet opp i materialfortegnelsen.
    5. Vask celler med PBS/T for 5 min og gjenta tre ganger.
    6. Tilsett 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til cellene i henhold til produsentens instruksjoner og Plasser et glass dekkglass forsiktig for å redusere luftbobler. Hold faste celler ved 4 ° c i mørket. Observer farging under et mikroskop med passende filter og lysrør.
      Merk: lagre plater ved 4 ° c i mørket til bildebehandling.

Representative Results

Tredimensjonale aggregater fra den embryonale Stamcelle linjen (H9) eller den induserte pluripotent Stamcelle linjen (P106) ble differensiert mot hepatocytter avstamning ved hjelp av vår definerte prosedyre (figur 1). Pluripotent stamceller ble først primet mot definitive endoderm før hepatoblast spesifikasjon. Etter dette ble hepatoblasts modnet til 3D-hepatospheres som kunne opprettholdes i kultur i inntil ett år23.

For å studere strukturen av 3D-kuler, var 30 dager gamle hESC-eller iPSC-avledede kuler faste, delt og flekkete å oppdage tilstedeværelsen av proteiner uttrykt i hepatocytter og mesenchymal celler. Hepatocytter kjernefysiske faktor 4 Alpha (HNF4α) og mesenchymal markør vimentin var ansatt, avslører tilstedeværelsen av et ytre lag bestående av hepatocytter som celler rundt en kjerne av mesenchymal celler (figur 2). Vi fulgte disse eksperimentene analysere uttrykk for proteiner uttrykt i hepatocytter: albumin, CYP3A og E-cadherin. Immunostaining avslørte at uttrykket av disse proteinene var begrenset til det ytterste laget av kulene (Figur 3).

Funksjonelle analyser av hepatospheres ble utført i dag 30 kulturer. CYP1A2 og CYP3A er viktige enzymer innenfor funksjonell hepatocytter. Deres aktivitet ble vurdert ved hjelp av etablerte analyser. H9-avledet hepatospheres utstilt CYP3A aktivitet på 220 375 ± 74514 RLU/mL/mg protein og CYP1A2 aktivitet på 732 440 ± 33 330 RLU/mL/mg protein (Figur 4A). CYP3A aktivitet i P106-avledet hepatospheres var 132117 ± 43 391 RLU/mL/mg protein og CYP1A2 aktivitet var 409 907 ± 121 723 RLU/mL/mg protein (Figur 4B). Sammenlignet med to grupper av menneskelig primære hepatocytter, 3D lever kuler vist respektabel nivåer av CYP aktivitet10.

Analyse av syntese og sekresjon av albumin og alpha-fetoprotein (AFP) avslørte at H9-avledet hepatospheres utskilles 683,9 ± 84 og 159 ± 20 ng/mL/24 h/mg protein av albumin og alpha-fetoprotein, henholdsvis (figur 5A). Mens P106-avledet hepatospheres utskilles 497 ± 41 og 756 ± 24 ng/mL/24 h/mg protein av albumin og alpha-fetoprotein, henholdsvis (figur 5B).

Figure 1
Figur 1 : Trinnvis differensiering prosedyre for å generere 3D-hepatospheres fra hESCs. Blå braketter representerer dager med differensiering for hiPSCs. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Strukturell omorganisering av 3D-hepatospheres. Representative bilder av uttrykk for hepatocytter kjernefysiske faktor 4 Alpha (HNF4α-grønn) og vimentin (rød) i (A) H9-avledet 3D-hepatospheres og (B) P106-avledet 3D-hepatospheres og deres tilsvarende immunglobulin G (IgG) kontroller . Vektstenger representerer 60 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Evaluering av uttrykk for lever markør i 3D-hepatospheres. Representative bilder av uttrykk for hepatocytter markører-albumin, CYP3A, E-cadherin og deres tilsvarende IgG kontroller i (A) H9-og (B) P106-avledet 3D hepatospheres. Skala stolper = 60 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Cytokrom P450-funksjon i 3D-hepatospheres. Måling av cytokrom P450 1A2 og 3A aktivitet i (A) H9-avledet 3D-hepatospheres og (B) P106-avledet 3D-hepatospheres. Dataene representerer gjennomsnittet av tre biologiske replikeres, og feilfeltene representerer standardavviket (SD). Aktivitet er sitert som relative lys enheter (RLU) per mL per mg protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Analyse av hepatosphere protein sekresjon. Utskillelsen av albumin og alpha-fetoprotein (AFP) ble analysert i (A) H9-avledet 3D-hepatospheres og (B) P106-avledet 3D-hepatospheres. Dataene er representative for tre biologiske replikerer, og feil stolpene representerer SD. utskilles protein er sitert som nanograms protein per mL per 24 t per mg protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Utviklingen av definerte og Xeno systemer for å produsere humant hepatospheres i 3D kreves for både in vitro-og in vivo-bestrebelser. I dag mest hepatocytter differensiering tilnærminger fra menneskelige Pluripotent stamceller utføres i todimensjonale tilhenger kulturer. Disse miljøene mangler mange av de miljømessige signaler involvert i vev Genesis og homeostase som inkluderer; heterotypic celle interaksjoner, matrise produksjon og remodeling, noe som resulterer i dårlig oversettelse til in vivo biologi18,19.

Som et resultat, forskning har fokusert på alternative tilnærminger til å generere hepatospheres fra Pluripotent stamceller. En rekke 3D studier har avansert feltet, men de er avhengige av animalske produkter20,22,24 for å gi støtte og/eller krever bruk av menneskelig vev21,22 som kompliserer teknologi skalerer og kompromisser eksperimentell reproduserbarhet og anvendelse.

Fremgangsmåten som er beskrevet i vår artikkel (figur 1) er definert, effektiv, svært reproduserbar og kostnadseffektiv, slik at produksjonen av funksjonelle lever kuler, som forblir funksjonell over et år in vitro og gi kritisk lever støtte i vivo14. Viktigere, tillater denne plattformen brukeren å kontrollere størrelsen på 3D lever kuler, begrenser dannelsen av tette nekrotisk sentre og tap av fenotype.

Overføringen av 3D-hepatospheres til Poly-HEMA belagte plater representerer et kritisk trinn i denne protokollen. Det er viktig å Pipetter forsiktig på dette stadiet i prosedyren for å unngå skade på sfæren. I tillegg må Media endringer utføres nøye for å unngå skjær stress og forvrengning av sfære struktur.

I disse studiene viste 3D-hepatospheres en organisert struktur (figur 2 og Figur 3), cytokrom P450-funksjon (Figur 4) og utskilt lever proteiner, inkludert albumin og alpha-fetoprotein (figur 5). Denne prosedyren har blitt utført i fire Pluripotent stamceller linjer med sammenlignbare utfall. Ser fremover, kan denne teknologien være ansatt som en plattform for å utvikle ytterligere endodermal og mesenchymal vev med komplekse arkitekturer.

Disclosures

David C. Hay er en av grunnleggerne og aksjonær i Stemnovate Ltd og HigherSteaks Ltd. Resten av forfatterne bekrefter at de ikke har noen interessekonflikter i emnet eller materialene som omtales i denne artikkelen.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet med priser fra den britiske regenererende medisin plattformen (MRC MR/L022974/1) og Chief Scientist ' s Office (TCS/16/37).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture and functional assays
Agarose Fisher Bioreagents 10766834
B27 supplement  Life Technologies  12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies  31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A2058 
DAPI  Invitrogen D1306
DMSO  Sigma-Aldrich  D5879
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher  14190250
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher  14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies  7174
GlutaMax  Life Technologies  35050
HepatoZYME-SFM Life Technologies    17705021
Human Activin A  Peprotech  120-14E
Human Alpha Fetoprotein ELISA Alpha Diagnostics 500
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor Peprotech  100-18B
Human Epithelial Gropwth Factor Peprotech  236-EG
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech  100-39
Human Oncostatin M  Peprotech  300-10
Human Recombinant Laminin 521  BioLamina  LN521-02
Human Serum Albumin ELISA Alpha Diagnostics 1190
Human Vascular Growth Factor Bio-techne 293-VE
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich  H4881
Knockout DMEM  Life Technologies  10829
Knockout Serum Replacement  Life Technologies  10828
Micro-mold spheroids  Sigma-Aldrich  Z764000
mTeSR1 medium  STEMCELL Technologies  5850
Non-essential amino acids  Life Technologies  11140
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies  15140122
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate)  Sigma-Aldrich  P3932
Recombinant mouse Wnt3a  Bio-techne 1324-WN-500/CF
RPMI 1640  Life Technologies  21875
Equipment
Microwave Bosch
Microtome Leika RM2125RT
Oven Thermoscientific
Antibodies
Primary antibodies
Albumin  Sigma-Aldrich  A6684  1:100 (mouse)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:100 (rabbit)
IgG DAKO X0943 1:400
Vimentin DAKO M0725 1:100 (sheep)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
  2. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).
  3. Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26 (4), 894-902 (2008).
  4. Hannan, N. R., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
  5. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14 (2), 237-252 (2014).
  6. Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  8. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
  9. Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  10. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
  11. Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
  12. Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170362 (2018).
  13. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
  14. Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91 (11), 3633-3643 (2017).
  15. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  16. Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63 (4), 934-942 (2015).
  17. Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4 (20), 3433-3442 (2016).
  18. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22 (5), 456-472 (2017).
  19. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  20. Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9 (1), (2014).
  21. Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9 (2), 396-409 (2014).
  22. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
  23. Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
  24. Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).

Tags

Utviklingsbiologi Pluripotent stamceller tredimensjonal kultur hepatospheres stoff metabolisme og protein sekresjon stabil celle fenotype definert kultur system
Serum fri produksjon av tredimensjonale humant Hepatospheres fra Pluripotent stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H.,… More

Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O'Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter