Summary
Dit protocol beschrijft een benadering voor de productie van hepatosferen van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd cultuur systeem en cel zelf montage. Dit protocol is reproduceerbaar in een aantal cellijnen, kostenbesparend en maakt de productie mogelijk van stabiele menselijke hepatosferen voor biomedische toepassing.
Abstract
De ontwikkeling van hernieuwbare bronnen van leverweefsel is nodig om cel-gebaseerde modellering te verbeteren en menselijk weefsel voor transplantatie te ontwikkelen. Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) vertegenwoordigen veelbelovende bronnen van menselijke lever sferen. We hebben een serum vrije en gedefinieerde methode van celdifferentiatie ontwikkeld om driedimensionale humane lever bollen te genereren die zijn gevormd uit menselijke pluripotente stamcellen. Een mogelijke beperking van de technologie is de productie van dichte bollen met dode materiaal binnen. Om dit te omzeilen, hebben we agarose micro well-technologie op gedefinieerde celdichtheden gebruikt om de grootte van de 3D-bollen te beheersen, waardoor het genereren van apoptotische en/of necrotische kernen wordt voorkomen. Met name de bollen gegenereerd door onze aanpak display leverfunctie en stabiele fenotype, die een waardevolle bron voor fundamenteel en toegepast wetenschappelijk onderzoek. Wij geloven dat onze aanpak kan worden gebruikt als platformtechnologie om verdere weefsels te ontwikkelen voor het modelleren en behandelen van menselijke ziekten en in de toekomst de aanmaak van menselijk weefsel met complexe weefsel architectuur kan toestaan.
Introduction
Het vermogen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) om zichzelf te verlengen, met behoud van pluripotentie, biedt de mogelijkheid om menselijke celtypen en weefsels op aanvraag te produceren. hpscs zijn efficiënt gedifferentieerd in hepatocyte-achtige cellen (hlc's) met behulp van tweedimensionale (2D)-aanhankende kweeksystemen1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Deze systemen zijn gebruikt om met succes monogene ziekte te modelleren, virus Lifecycle, drug geïnduceerde leverletsel (DILI), foetale blootstelling aan toxines en niet-alcoholische vette leverziekte (nafld)11,12,13 ,14,15. Echter, deze modellen hebben een aantal nadelen, die hun routine gebruik beperken. Deze omvatten foetale marker expressie, unstable fenotype en slechte weefsel architectuur16,17,18,19, die ook extrapolatie naar orgel functie in vivo zou kunnen beperken.
Om deze beperkingen te overwinnen, zijn driedimensionale (3D) differentiatie platformen ontwikkeld om na te bootsen in vivo weefsel architectuur. Hoewel deze benaderingen in staat stellen, vertrouwen ze op het gebruik van dierlijke afgeleide producten en matrices om weefsel Genesis20,21,22te stimuleren, schaalverdeling en wijdverbreide toepassing te beperken.
Hier geven we gedetailleerde procedures voor het genereren van grote hoeveelheden 3D-hepatosferen van hPSCs met behulp van gedefinieerde materialen en zelf assemblage van cellen. Met name het weefsel dat door onze procedure wordt gegenereerd, blijft langer dan een jaar functioneel in celkweek en is in staat om de leverfunctie in vivo23te ondersteunen.
Kortom, onze gedefinieerde differentiatie aanpak maakt het mogelijk om stabiele menselijke hepatosferen te genereren uit menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Wij geloven dat de beschreven procedure een belangrijke doorbraak vormt in de generatie van 3D-hepatosferen voor fundamenteel en toegepast wetenschappelijk onderzoek.
Protocol
1. bereiding van agarose-microplaat mallen
Opmerking: Voor deze experimenten gebruikte media moeten steriel zijn en bij kamertemperatuur (RT) voor celkweek.
-
Bereid 2% agarose mallen voor.
- Los 2 g van de lage smelttemperatuur agarose op in 100 mL gesteriliseerd gedestilleerd water. Verwarm voorzichtig in een magnetron met interval schudden om volledig op te lossen.
- Voeg 520 μL gesmolten agarose toe aan een 256-well formaat schimmel en laat het stollen.
- Breng elke agarose-microplaat over in een enkele put van een 12-put-plaat.
- Voeg 1,5 mL 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) met CA2 +/mg2 + toe aan elk putje en verwijder de luchtbelletjes uit de micro putjes door meerdere malen zachtjes op en neer te pipetteren met een P1000 pipetpunt. Dit wordt uitgevoerd om een uniforme celseeding te garanderen.
Opmerking: Agarose microplaten kunnen tot 6 maanden bij 4 °C worden bewaard in 1x DPBS.
2. het zaaien van menselijke pluripotente stamcellen in agarose-Microwell-platen
-
Voorbereiding van celsuspensie
- Aspirate het medium van een ongedifferentieerde cultuur van hPSCs zoals eerder beschreven8.
Opmerking: hpscs worden gekweekt op LN-521 in mTeSR1, waarbij het medium om de 24 uur is veranderd en regelmatig wordt overgeprikt zodra de cellen 75% tot 85% van de confluentie bereiken zoals eerder beschreven8. - Spoel de cellen af met 5 mL RT 1x DPBS zonder CA2 +/mg2 + en verwijder de buffer.
- Voeg 5 mL 1x celdissociatie reagens (tabel met materialen) toe aan de cellen en laat celdissociatie door cellen te incuberen bij 37 °c gedurende 6-8 min.
Opmerking: Om de reactie te stoppen, onderzoeken celloslating onder de Microscoop. De cellen moeten gedeeltelijk van de plaat worden losgemaakt. Verleng de incubatie voor een extra 1-2 min als langere tijd nodig is. - Stop de reactie door het celdissociatie reagens te verwijderen en voeg 5 mL vers mTeSR1 medium toe, aangevuld met 10 μM Rho-geassocieerde kinase (GESTEENTE) remmer Y27632 aan de cellen. Dissocieren cellen door meerdere malen omhoog en omlaag te pipetteren met behulp van een P1000 pipetpunt.
- Tel de levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en trypeen blauwe kleurings uitsluiting. Daarna bereidt u de celsuspensie voor op de vereiste concentratie.
- Bereken het totale aantal benodigde cellen. Voor 3D hepatosphere differentiatie, zaad 3,84 x 105 cellen per agarose microplaat voor het genereren van sferoïden met 100-150 μm in diameter.
- Breng het gewenste aantal cellen over in een steriele centrifugebuis van 15 mL of 50 mL en centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 5 minuten bij RT om de cellen te pellet.
- Aspireren en gooi de supernatant en respenderen cellen in mTeSR1 medium plus 10 μM ROTSREMMER Y27632. Verdun de celpellet in de juiste hoeveelheid medium tot een eindconcentratie van 2,1 x 106 cellen/ml.
- Aspirate het medium van een ongedifferentieerde cultuur van hPSCs zoals eerder beschreven8.
-
Het zaaien van de cellen naar de bereide agarose microplaten
Opmerking: als u de met koelkast opgeslagen agarose-microplaten gebruikt, plaats ze dan in de celincubator bij 37 °c gedurende ten minste een uur voorafgaand aan gebruik en aspireren de 1x DPBS van de put voordat de cel wordt seeding.- Voeg 190 μL celsuspensie toe aan de agarose microwell.
- Na het zaaien, de platen terug naar de cel incubator bij 37 ° c en 5% CO2 voor 2 h om de cellen te laten vestigen.
- Voeg na 2 uur 1 mL vers en warm mTeSR1 medium toe, aangevuld met 10 μM ROTSREMMER Y27632 aan elk goed.
- Breng de platen terug naar de cel incubator bij 37 °C en 5% CO2 voor 24 uur en onderzoek de vorming van bollen de volgende dag om de cellen toe te voegen.
3. differentiëren van hPSCs naar 3D-Hepatosferen op agarose-micro putten
- Bereiding van poly 2-hydroxyethyl methacrylaat (poly-HEMA) gecoate putten
- Los 2 g poly-HEMA op in 100 mL 95% ethanol. Roer de oplossing 's nachts door een kookplaat bij 55 °C. Voeg 250 μL poly-HEMA oplossing per put van een 24-put plaat toe en droog 's nachts bij 60 °C met behulp van een oven.
- Voorbereiding van het differentiatie medium
- Bereid een 1, 000x stamoplossing van humaan activine a door het oplossen van menselijke activine een gelyofiliseerd eiwit in steriele 0,2% boviene serumalbumine (BSA)/DPBS tot een eindconcentratie van 100 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000.
- Bereid een 1, 000x stockoplossing van Wnt3a door het oplossen van de muis Wnt3a gelyofiliseerd eiwit in steriele 0,2% BSA/DPBS tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Gebruik op 1:200.
- Bereid een 1, 000x stamoplossing van humane hepatocyten groeifactor (HGF) door het oplossen van humaan HGF gelyofiliseerd eiwit in steriele 0,2% BSA/DPBS tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000.
- Bereid een 1, 000x stamoplossing van oncostatine M (OSM) voor door OSM in steriele 0,2% BSA/DPBS op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 20 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000.
- Bereid een 1000x stamoplossing van de epitheliale groeifactor (EFG) uit door het gevriesdrooseerde eiwit in steriele 0,2% BSA/DPBS op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000.
- Bereid een 1, 000x stamoplossing van de basis fibroblast-groeifactor (bFGF) uit door het gelyofiliseerde eiwit in steriele 0,2% BSA/DPBS op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000.
- Bereid een 1, 000x stamoplossing van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) in door het gelyofiliseerde eiwit in 0,2% BSA/DPBS op te lossen tot een uiteindelijke concentratie van 10 μg/mL. Bewaren bij-20 °C in kleine aliquots. Te gebruiken op 1:1000.
- Maak endoderm-differentiatie medium bestaande uit Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basal medium aangevuld met 2% B27 supplement (50x, zonder insuline) en 1% penicileen/streptomycine (eindconcentraties: 100 IE/mL en 100 μg/mL, respectievelijk). Tenzij aangegeven, bij elke gemiddelde verandering, het vereiste volume aanvullen met Wnt3a en activine a bij een eindconcentratie van respectievelijk 50 ng/mL en 100 ng/mL.
Opmerking: Bewaren bij 4 °C en binnen twee weken gebruiken. - Maak hepatoblast differentiatie medium bestaande uit knock-out Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (KO-DMEM) met 20% Knockout serum vervanging (KOSR) en aangevuld met 0,5% van een alternatieve aanvulling op L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0,1 mM Beta-mercaptoethanol, 1% dimethylsulfoxide (DMSO), en 1% penicillaire/streptomycine (eindconcentraties bij respectievelijk 100 I.E./ml en 100 μg/mL). Filter onder vacuüm.
Opmerking: Bewaren bij 4 °C en binnen twee weken gebruiken. - Maken van hepatocyte rijpings medium bestaande uit hepatocyten medium aangevuld met 1% van een alternatieve aanvulling op L-glutamine, 10 μM hydrocortison 21-hemisuccinaat natriumzout (HCC), 1% penicillaire/streptomycine (eindconcentraties bij 100 IE/mL en respectievelijk 100 μg/mL). Voor elke gemiddelde verandering, het vereiste volume aanvullen met OSM en HGF (eindconcentraties bij respectievelijk 20 ng/mL en 10 ng/mL).
Opmerking: Bewaar de kolf op 4 °C en gebruik deze binnen twee weken. - Maak hepatocyten onderhouds medium bestaande uit William's E medium aangevuld met 10% Knockout serum vervanging, bestaande uit 1% van een alternatieve aanvulling op L-glutamine, 1% penicileen/streptomycine (eindconcentraties bij 100 IE/mL en 100 μg/mL, respectievelijk). Voor elke gemiddelde verandering, het vereiste volume aanvullen met HGF, EGF, bFGF en VEGF (eindconcentratie van elke groeifactor op 10 ng/mL).
Opmerking: Bewaar de kolf op 4 °C en gebruik deze binnen twee weken.
- Controleer hepatosphere Formation 24 h post zaaien en initiëren hepatocyte differentiatie. Verwijder voorzichtig het mTeSR1 medium en vervang het door 1 mL vers endoderm differentiatie medium aangevuld met 100 ng/mL activine A en 50 ng/mL Wnt3a.
- Verandering aangevuld endoderm priming medium elke 24 h voor 3 dagen voor hESCs. Als u met hiPSCs werkt, Verleng deze fase dan nog eens 2 dagen om de media aan te vullen met activine a (100ng/mL) alleen.
- Na definitieve endoderm inductie, overschakelen naar hepatoblast differentiatie medium voor hepatoblast specificatie gedurende 5 dagen vervangen van het medium om de 2 dagen en voer de laatste wijziging op de laatste dag van de hepatoblast specificatie.
- Breng hepatosferen over in de poly-HEMA gecoate putten.
- Was de cellen eenmaal met hepatocyte maturatie medium zonder supplementen na het verwijderen van KSR/DMSO medium en voeg 1 mL hepatocyte maturatie medium aangevuld met 10 ng/mL HGF en 20 ng/mL OSM.
- Til met behulp van een P1000-Pipet de hepatosferen van de agarose-microplaat op door de oplossing meerdere malen omhoog en omlaag te pipetteren.
- Breng het medium met de hepatosferen over naar een poly-HEMA gecoat goed.
- Was de agarose-microplaat met 1 mL hepatocyte maturatie medium aangevuld met 10 ng/mL HGF en 20 ng/mL OSM en breng het medium over naar de poly-HEMA gecoat goed.
- Herhaal stap 3.6.4 zo vaak mogelijk om alle hepatosferen van de agarose-microplaat over te brengen.
Opmerking: Het is van cruciaal belang om de oplossing met de hepatosferen voorzichtig omhoog en omlaag te pipetteren om beschadiging ervan te voorkomen.
- Voorzichtig aspireren overtollig medium zonder het verwijderen van hepatosferen met behulp van een P100 pipet tot ~ 1 mL medium met de hepatospheres blijft in de poly-HEMA gecoat goed.
- Verander het medium elke 48 h gedurende 12 dagen.
- Op dag 20 bij het werken met hESCs of dag 22 als u met hiPSCs werkt, schakelt u het medium in op hepatocyte Maintenance medium.
- Verwijder hepatocyte maturatie medium en spoel cellen eenmaal met hepatocyte onderhoudsmiddel zonder de supplementen. Voeg 1 mL hepatocyten onderhoudsmiddel toe, aangevuld met 10 ng/mL HGF, EGF, FGF en VEGF.
- Verander het medium voor vers hepatocyten onderhouds medium elke 48 h.
4. functionele analyse van lange termijn gekweekte 3D-Hepatosferen
- Overschakelen naar het maturatie medium van hepatocyten, aangevuld met 10 μM HCC, L-glutamine, 1% penicileen/streptomycine (eindconcentraties bij respectievelijk 100 I.E./ml en 100 μg/mL) en 10 ng/mL HGF 48 h voorafgaand aan het uitvoeren van de functionaalanalyse.
-
Analyseer hepatocyte metabole functie met behulp van cytochroom (CYP) P450 assays.
- Vervang medium door 1 mL vers hepatocyte maturatie medium aangevuld met 50 μM luciferin-6'-pentafluoro-BENZYL ether (luciferin-PFBE) substraat om CYP3A basale activiteit te detecteren of 100 μM luciferin-methyl ether (luciferin-ME) substraat om CYP1A2 te detecteren basale activiteit (aantal replicaten = 3). Gebruik weefselkweek media als een negatieve controle.
Opmerking: Om te voorkomen dat Kruisreactiviteit, het is aanbevolen om niet te gebruiken dezelfde putten met 3D-hepatosferen om verschillende CYP P450 activiteiten te testen, maar om ze uit te voeren in individuele putten. - Incuberen de cellen voor 24 uur bij 37 ° C.
- Verzamel de supernatanten met een P100 pipetpunt en voer de test uit volgens de instructies van de fabrikant.
- Meet de relatieve niveaus van de basale activiteit en Normaliseer tot per mg eiwit zoals bepaald door de bicinchoninic acid assay (BCA).
- Vervang medium door 1 mL vers hepatocyte maturatie medium aangevuld met 50 μM luciferin-6'-pentafluoro-BENZYL ether (luciferin-PFBE) substraat om CYP3A basale activiteit te detecteren of 100 μM luciferin-methyl ether (luciferin-ME) substraat om CYP1A2 te detecteren basale activiteit (aantal replicaten = 3). Gebruik weefselkweek media als een negatieve controle.
-
Test serumeiwit productie met behulp van enzym-linked immunosorbent assay (ELISA).
- Vervang medium door 1 mL vers hepatocyte maturatie medium aangevuld met 10 ng/mL HGF en 20 ng/mL OSM (aantal replicaten = 3). Gebruik weefselkweek media als een negatieve controle.
- Incuberen de cellen voor 24 uur bij 37 ° C.
- Verzamel de supernatant met behulp van een P100 pipetpunt en meet de relatieve niveaus van de serumproteïne productie volgens de instructies van de fabrikant.
- Normaliseren tot per mg eiwit zoals bepaald door de BCA-test.
5. immunocytochemie
-
Bereiding van paraffine secties met lever bolletjes.
- Was de hepatosferen drie keer met 1x DPBS.
- Bevestig de hepatosferen met ijskoude methanol gedurende 30 minuten.
- Was drie keer met 1x DPBS.
- Sluit de hepatosferen in 300 μL van een getemperde oplossing van 2% agarose opgelost in H2O met behulp van een lege put van een 24-put plaat als een mal en laat het stollen gedurende 30 minuten.
- Integreer de agarose met hepatosferen in paraffine.
- Sectie het paraffine blok met vaste hepatosferen in 4 μm dikke delen met behulp van een microtoom.
-
De-waxen en rehydratatie van de secties.
Opmerking: gebruik verse oplossingen wanneer dat mogelijk is. Gebruik geen oplossingen die langer dan een week op de kleurings goot zijn geweest.- Plaats secties in een diaprek.
- Dompel het schuif rooster onder met secties in een kleurenbak met 300 mL xyleen gedurende 5 min.
- Herhaal stap 5.2.2.
- Dompel je onder in absolute ethanol voor 20 sec.
- Dompel onder in 95% ethanol voor 20 sec.
- Dompel onder in 90% ethanol voor 20 sec.
- Dompel onder in 80% ethanol voor 20 sec.
- Dompel onder in 70% ethanol voor 20 sec.
- Hydrateer de delen met water gedurende 5 min.
Opmerking: Houd de dia's in hetzelfde schuif rooster en verplaats deze van de ene kleurenbak naar de volgende. Het gebruikte volume (over het algemeen ~ 300 mL) is afhankelijk van de grootte van de kleurings goot.
-
Antigeen opvraging van paraffine secties met lever bolletjes.
- Verwarm de-gewaxt en gerehydrateerde delen in 1x tris-EDTA (TE) pH 9,0 bufferoplossing gedurende 15 minuten in een magnetron bij 800 W.
- Laat de monsters afkoelen door ze gedurende 5 minuten in kraanwater te dompelen.
-
Immunokleuring.
- Inincuberen van dia's met blokkerende oplossing van PBS met 0,1% Polysorbaat 20 (PBS/T)/10% BSA voor 1 uur bij RT.
- Vervang de blokkerende oplossing door het juiste primaire antilichaam verdund in PBS/T/1% BSA en inincuberen bij 4 °C met zachte opwinding 's nachts.
- Spoel cellen met PBS/T gedurende 5 minuten en herhaal drie keer.
- Inincuberen met het geschikte secundaire antilichaam, verdund in PBS/T/1% BSA en inincuberen in het donker bij RT voor 1 uur met zachte opwinding.
Opmerking: De geoptimaliseerde primaire en secundaire antilichamen staan in de lijst van materialen. - Spoel cellen met PBS/T gedurende 5 minuten en herhaal drie keer.
- Voeg 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) toe aan de cellen volgens de instructies van de fabrikant en plaats een glazen dekglaasje zachtjes om luchtbellen te verminderen. Houd vaste cellen bij 4 °C in het donker. Observeer de kleuring onder een microscoop met de juiste filter-en fluorescentielamp.
Opmerking: Bewaar de platen bij 4 °c in het donker tot beeldvorming.
Representative Results
Driedimensionale aggregaten uit de embryonale stamcel lijn (H9) of de geïnduceerde pluripotente stamcel lijn (P106) werden met behulp van onze gedefinieerde procedure gedifferentieerd naar de hepatocyte Lineage (Figuur 1). Pluripotente stamcellen werden voor het eerst geprimeerd naar definitieve endoderm voorafgaand aan de hepatoblast-specificatie. Hierna werden hepatoblasten gerijpt in 3D-hepatosferen die gedurende maximaal één jaar23in cultuur konden worden gehouden.
Om de structuur van 3D-bollen te bestuderen, werden 30 dagen oude hESC-of iPSC-afgeleide bollen vastgesteld, gesectioneerd en gekleurd om de aanwezigheid van eiwitten, uitgedrukt in hepatocyten en mesenchymale cellen, te detecteren. Hepatocyte Nuclear factor 4 alpha (HNF4α) en mesenchymale marker vimentin werden gebruikt, waarbij de aanwezigheid van een buitenste laag werd onthuld, bestaande uit hepatocyten zoals cellen rond een kern van mesenchymale cellen (Figuur 2). We volgden deze experimenten analyse van de uitdrukking van eiwitten uitgedrukt in hepatocyten: albumine, CYP3A en E-cadherin. Immunokleuring toonde aan dat de uitdrukking van deze eiwitten beperkt was tot de buitenste laag van de bollen (Figuur 3).
Functionele analyses van de hepatosferen werden uitgevoerd in dag 30 culturen. CYP1A2 en CYP3A zijn belangrijke enzymen binnen de functionele hepatocyten. Hun activiteit werd beoordeeld met behulp van gevestigde assays. H9-afgeleide hepatosferen vertoonden CYP3A-activiteit van 220.375 ± 74514 RLU/mL/mg eiwit en CYP1A2-activiteit van 732.440 ± 33.330 RLU/mL/mg eiwit (Figuur 4A). CYP3A-activiteit in P106-afgeleide hepatosferen was 132117 ± 43.391 RLU/mL/mg eiwit en CYP1A2-activiteit was 409.907 ± 121.723 RLU/mL/mg eiwit (Figuur 4B). In vergelijking met twee batches van menselijke primaire hepatocyten, 3D lever bollen weergegeven respectabele niveaus van CYP activiteit10.
Analyse van de synthese en secretie van albumine en Alfa-fetoproteïne (AFP) onthulde dat H9 afgeleide hepatobolletjes uitgescheiden 683,9 ± 84 en 159 ± 20 ng/mL/24 h/mg eiwit van albumine en alpha-fetoproteïne, respectievelijk (Figuur 5A). Overwegende dat P106-afgeleide hepatosferen 497 ± 41 en 756 ± 24 ng/mL/24 h/mg eiwit van albumine en alpha-fetoproteïne uitgescheiden (Figuur 5B).
Figuur 1 : Stapsgewijze differentiatie procedure om 3D-hepatosferen van hESCs te genereren. Blauwe haakjes vertegenwoordigen dagen van differentiatie voor hiPSCs. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Structurele reorganisatie van 3D-hepatosferen. Representatieve beelden van de uitdrukking van hepatocyte Nuclear factor 4 alpha (HNF4α-Green) en vimentin (rood) in (a) H9-afgeleide 3D-hepatosferen en (B) P106-afgeleide 3D-hepatosferen en hun overeenkomstige immunoglobuline G (IgG)-besturingselementen . Schaal staven vertegenwoordigen 60 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Evaluatie van hepatische marker expressie in 3D hepatosferen. Representatieve beelden van de uitdrukking van hepatocyten markers-albumine, CYP3A, E-cadherin en hun overeenkomstige IgG-controles in (a) H9-en (B) P106-afgeleide 3D-hepatosferen. Schaal staven = 60 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Cytochroom P450-functie in 3D-hepatosferen. Meting van de cytochroom P450 1A2-en 3A-activiteit in (a) H9-afgeleide 3D-hepatosferen en (B) P106-afgeleide 3D-hepatosferen. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van drie biologische replicaten en de foutbalken representeren de standaarddeviatie (SD). Activiteit wordt geciteerd als relatieve licht eenheden (RLU) per mL per mg eiwit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Analyse van hepatosphere eiwit secretie. De secretie van albumine en alpha-fetoprotein (AFP) werd geanalyseerd in (a) H9-afgeleide 3D-hepatosferen en (B) P106-afgeleide 3D-hepatosferen. De gegevens zijn representatief voor drie biologische replicaten en de foutbalken vertegenwoordigen de SD. uitgescheiden eiwit wordt geciteerd als nanogram eiwit per mL per 24 h per mg eiwit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
De ontwikkeling van gedefinieerde en xeno-vrije systemen voor de productie van menselijke hepatosferen in 3D is vereist voor zowel in vitro als in vivo inspanningen. Op dit moment worden de meeste hepatocyte-differentiatie benaderingen van menselijke pluripotente stamcellen uitgevoerd in twee dimensionale aanhankende culturen. Deze omgevingen missen veel van de omgevings aanwijzingen die betrokken zijn bij weefsel genese en homeostase, waaronder; van Cell interacties, matrix productie en remodeling, resulterend in slechte vertaling naar de in vivo biologie18,19.
Als gevolg daarvan, onderzoek is gericht op alternatieve benaderingen voor het genereren van hepatosferen van pluripotente stamcellen. Een aantal 3D-studies hebben het veld gevorderd, maar die zijn afhankelijk van dierlijke producten20,22,24 om ondersteuning te bieden en/of het gebruik van menselijk weefsel21,22 die compliceert technologie scale-up en compromissen experimentele reproduceerbaarheid en toepassing.
De procedure beschreven in ons artikel (Figuur 1) is gedefinieerd, efficiënt, zeer reproduceerbaar en kosteneffectief, waardoor de productie van functionele lever bollen, die functioneel blijven over een jaar in vitro en bieden kritische lever ondersteuning in vivo14. Belangrijk is dat dit platform de gebruiker in staat stelt om de grootte van de 3D-lever bollen te regelen, waardoor de vorming van dichte necrotische centra en verlies van fenotype wordt beperkt.
De overdracht van de 3D-hepatosferen naar de poly-HEMA gecoate platen vormt een cruciale stap in dit protocol. Het is belangrijk om in deze fase van de procedure zachtjes te Pipetteer om beschadiging van de bol te voorkomen. Bovendien moeten de veranderingen in de media zorgvuldig worden uitgevoerd om afschuiving en vervorming van de bol-structuur te voorkomen.
In deze studies, 3D hepatosferen weergegeven een georganiseerde structuur (Figuur 2 en Figuur 3), cytochroom P450-functie (Figuur 4) en uitgescheiden lever eiwitten, met inbegrip van albumine en alpha-fetoprotein (Figuur 5). Deze procedure is met succes uitgevoerd in vier pluripotente stamcellen lijnen met vergelijkbare uitkomsten. Vooruitkijkend, kan deze technologie worden gebruikt als een platform om verdere endodermale en mesenchymale weefsels met complexe architecturen te ontwikkelen.
Disclosures
David C. Hay is medeoprichter en aandeelhouder van Stemnovate Ltd en HigherSteaks Ltd. De rest van de auteurs verklaart dat zij geen belangenconflicten hebben met betrekking tot het onderwerp of de materialen die in dit artikel worden besproken.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund met Awards van het Britse regeneratieve geneeskunde platform (MRC MR/L022974/1) en het kantoor van de Chief Scientist (TCS/16/37).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture and functional assays | |||
| Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
| HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
| Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
| Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
| Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
| Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
| Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
| P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
| Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
| Equipment | |||
| Microwave | Bosch | ||
| Microtome | Leika | RM2125RT | |
| Oven | Thermoscientific | ||
| Antibodies | |||
| Primary antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
| CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
| E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
| IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
| Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |
References
- Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26 (4), 894-902 (2008).
- Hannan, N. R., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14 (2), 237-252 (2014).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
- Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
- Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170362 (2018).
- Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
- Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91 (11), 3633-3643 (2017).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3127-3136 (2010).
- Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63 (4), 934-942 (2015).
- Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4 (20), 3433-3442 (2016).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22 (5), 456-472 (2017).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9 (1), (2014).
- Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9 (2), 396-409 (2014).
- Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
- Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).
- Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
