Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Serum fri produktion af tredimensionale humane Hepatokugler fra pluripotente stamceller

doi: 10.3791/59965 Published: July 20, 2019

Summary

Denne protokol beskriver en tilgang til fremstilling af hepatokugler fra humane pluripotente stamceller ved hjælp af et defineret kultur system og celle selvsamling. Denne protokol er reproducerbar i en række cellelinjer, omkostningseffektiv og giver mulighed for produktion af stabile humane hepatospheres til biomedicinsk anvendelse.

Abstract

Udviklingen af vedvarende kilder til levervævet er nødvendig for at forbedre celle-baserede modellering, og udvikle humant væv til transplantation. Humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSCs) repræsenterer lovende kilder til menneskelige lever kugler. Vi har udviklet en serum fri og defineret metode til cellulær differentiering til at generere tredimensionelle menneskelige lever kugler dannet af humane pluripotente stamceller. En potentiel begrænsning af teknologien er produktionen af tætte kugler med dødt materiale indeni. For at omgå dette har vi ansat agopstået strips med mikrobrønde-teknologi på definerede celle tætheder til at kontrollere størrelsen af 3D-sfærerne, hvilket forhindrer generering af apoptotiske og/eller nekrotiske kerner.  Især de sfærer genereret af vores tilgang viser leverfunktion og stabil fænotype, der repræsenterer en værdifuld ressource for grundlæggende og anvendt videnskabelig forskning. Vi mener, at vores tilgang kunne bruges som en platform teknologi til at udvikle yderligere væv til at modellere og behandle sygdomme hos mennesker og i fremtiden kan tillade generering af humant væv med komplekse væv arkitektur.

Introduction

Menneskelige pluripotente stamcellernes evne til at forny sig selv, samtidig med at pluristyrken bevares, giver mulighed for at producere humane celletyper og væv efter behov. hpscs er blevet effektivt differentieret i hepatocyte-lignende celler (hlcs) ved hjælp af to-dimensionelle (2D) overholder kultur systemer1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Disse systemer er blevet anvendt til succesmodel monogen sygdom, virus livscyklus, Drug induceret leverskade (DILI), føtal udsættelse for toksiner og ikke-alkoholiske fedt leversygdom (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Men disse modeller besidder nogle ulemper, som begrænser deres rutine brug. Disse omfatter føtal markør udtryk, ustabil fænotype og dårlig vævs arkitektur16,17,18,19, som også kunne begrænse ekstrapolation til organfunktion in vivo.

For at overvinde disse begrænsninger, tre-dimensionelle (3D) differentiering platforme er blevet udviklet til at efterligne in vivo væv arkitektur. Selv om disse tilgange gør det muligt, er afhængige af brugen af animalske afledte produkter og matricer til at drive vævs Genesis20,21,22, begrænse opskalering og udbredt anvendelse.

Her har vi detaljerede procedurer for at generere store mængder af 3D-hepatokugler fra hPSCs ved hjælp af definerede materialer og celle selvsamling. Især væv genereret af vores procedure forbliver funktionel i mere end et år i cellekultur og er i stand til at understøtte leverfunktion in vivo23.

Sammenfattende giver vores definerede differentierings metode mulighed for at fremprovokere stabile humane hepatotoksfærer fra både humane embryonale stamceller (hESCs) og inducerede pluripotente stamceller (iPSCs). Vi mener, at den beskrevne procedure repræsenterer et betydeligt gennembrud i produktionen af 3D-hepatospheres til grundlæggende og anvendt videnskabelig forskning.

Protocol

1. klargøring af Agopstået mikropladen forme

Bemærk: Medier, der anvendes til disse eksperimenter, skal være sterile og ved stuetemperatur (RT) for cellekultur.

  1. Forbered 2% agopstået forme.
    1. 2 g lavsmeltnings temperaturer opløses i 100 mL steriliseret destilleret vand. Opvarm forsigtigt i en mikrobølgeovn med interval rystelser for at opløse fuldstændigt.
    2. Tilsæt 520 μL smeltet agopstået til en 256-brønd format skimmel og lad det størkne.
    3. Overfør hver agopstået mikroplade til en enkelt brønd af en 12-brønd plade.
    4. Tilsæt 1,5 mL 1x Dulbecco's fosfat-Buffered saltvand (DPBS) med ca2 +/mg2 + til hver brønd, og fjern luftboblerne fra mikrobrøndene ved forsigtigt at pipettere op og ned flere gange ved hjælp af en P1000-pipettespids. Dette udføres for at sikre ensartet celle såning.
      Bemærk: Agopstået mikroplader kan opbevares i op til 6 måneder ved 4 °C i 1x DPBS.

2. såning af humane pluripotente stamceller i Agopstået Microwell-plader

  1. Klargøring af cellesuspension
    1. Aspirer mediet fra en udifferentieret kultur af hPSCs som tidligere beskrevet8.
      Bemærk: hpscs dyrkes på LN-521 i mTeSR1 med mediet ændret hver 24 h, og urerne regelmæssigt, når cellerne nå 75% til 85% af confluency som tidligere beskrevet8.
    2. Cellerne skylles med 5 mL RT 1x DPBS uden ca2 +/mg2 + , og bufferen fjernes.
    3. Tilsæt 5 mL 1x-celle dissociations reagens (tabel over materialer) til cellerne og Tillad celle dissociation ved at inkubere celler ved 37 °c i 6-8 min.
      Bemærk: For at stoppe reaktionen, undersøge celle løsrivelse under mikroskopet. Cellerne skal adskilles delvist fra pladen. Forlæng inkubationen for en ekstra 1-2 min., hvis længere tid er påkrævet.
    4. Stop reaktionen ved at fjerne celle dissociations reagenset og tilsæt 5 mL frisk mTeSR1 medium suppleret med 10 μM Rho-associeret kinase (ROCK) inhibitor Y27632 til cellerne. Dissociér celler ved pipettering op og ned flere gange ved hjælp af en P1000-pipettespids.
    5. Tæl de levedygtige celler ved hjælp af en hemocytometer og trypan og et blå farvning udelukkelse. Forbered derefter cellesuspensionen ved den ønskede koncentration.
    6. Beregn det samlede antal celler, der skal bruges. For 3D hepatosphere differentiering, frø 3,84 x 105 celler pr agopstået mikropladen til at generere sfæroider med 100-150 μm i diameter.
    7. Det ønskede antal celler overføres til et sterilt 15 mL eller 50 mL centrifugeglas, og røret centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved rt for at pille cellerne.
    8. Aspirér og kassér supernatanten og resuspender cellerne i mTeSR1 medium plus 10 μM ROCK inhibitor Y27632. Celle pellet fortyndes i et passende volumen medium til en endelig koncentration på 2,1 x 106 celler/ml.
  2. Såning af cellerne til de forberedte agopstået mikroplader
    Bemærk:
    hvis du bruger køleskab-opbevarede mikroplader, skal du anbringe dem i celle inkubator ved 37 °c i mindst en time før brug og aspirere 1X DPBS fra brønden før celle såning.
    1. Tilsæt 190 μL af cellesuspensionen til den agopstået microwell.
    2. Efter såning returneres pladerne til celle inkubator ved 37 °C og 5% CO2 for 2 h for at tillade cellerne at bosætte sig.
    3. Efter 2 timer tilsættes 1 mL frisk og varm mTeSR1 medium suppleret med 10 μM ROCK inhibitor Y27632 til hver brønd.
    4. Returner pladerne til celle inkubator ved 37 °C og 5% CO2 for 24 h og undersøge dannelsen af kugler den næste dag for at tillade cellerne at vedhæfte.

3. differentiering af hPSCs til 3D-Hepatospheres på Agopstået mikrobrønde

  1. Fremstilling af poly 2-hydroxyethyl methacrylat (Poly-HEMA) belagte brønde
    1. 2 g poly-HEMA opløses i 100 mL 95% ethanol. Opløsningen omrøres natten over med en kogeplade ved 55 °C. Tilsæt 250 μL poly-HEMA opløsning pr. brønd af en 24-brønd plade og tør natten over ved 60 °C ved hjælp af en ovn.
  2. Forberedelse af differentierings mediet
    1. Forbered en 1.000 x stamopløsning af menneskelig aktivitet ved at opløse menneskelig aktivitet et lyofiliseret protein i steril 0,2% bovint serumalbumin (BSA)/DPBS til en endelig koncentration på 100 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.
    2. Forbered en 1.000 x stamopløsning af Wnt3a ved at opløse muse Wnt3a lyofiliseret protein i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Brug på 1:200.
    3. Forbered en 1.000 x stamopløsning af menneskelig hepatocytter vækstfaktor (HGF) ved at opløse humant HGF lyofiliseret protein i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.
    4. Der forberedes en 1.000 x stamopløsning af oncostatin M (OSM) ved at opløse OSM i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 20 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.
    5. Forbered en 1000x stamopløsning af epitelial vækstfaktor (EGF) ved at opløse det lyofiliserede protein i steril 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.
    6. Forbered en 1.000 x stamopløsning af grundlæggende fibroblast vækstfaktor (bFGF) ved at opløse det lyofiliserede protein i sterile 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.
    7. Forbered en 1.000 x stamopløsning af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) ved at opløse det lyofiliserede protein i 0,2% BSA/DPBS til en endelig koncentration på 10 μg/mL. Opbevares ved-20 °C i små aliquoter. Bruges på 1:1000.
    8. Gør endoderm differentiering medium bestående af Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) basal medium suppleret med 2% B27 supplement (50x, uden insulin), og 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer: 100 IU/mL og 100 μg/mL, henholdsvis). Med mindre andet er angivet, skal der ved hver medium ændring suppleres med Wnt3a og Activity A i en endelig koncentration på henholdsvis 50 ng/mL og 100 ng/mL.
      Bemærk: Opbevares ved 4 °C og anvendes inden for to uger.
    9. Gør hepatoblast differentierings medium bestående af knockout Dulbecco's modificerede Eagle medium (KO-DMEM) med 20% knockout serum udskiftning (KOSR) og suppleret med 0,5% af et alternativt supplement til L-glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoethanol, 1% dimethylsulfoxid (DMSO) og 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer ved henholdsvis 100 IE/mL og 100 μg/mL). Filter under vakuum.
      Bemærk: Opbevares ved 4 °C og anvendes inden for to uger.
    10. Gøre hepatocyt modning medium bestående af hepatocyt medium suppleret med 1% af en alternativ supplement til L-glutamin, 10 μM hydrocortison 21-hemisuccinat natriumsalt (HCC), 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer ved 100 iu/ml og henholdsvis 100 μg/mL). For hver medium ændring, supplere den krævede volumen med OSM og HGF (endelige koncentrationer ved 20 ng/mL og 10 ng/mL, hhv.).
      Bemærk: Opbevar bestanden ved 4 °C, og brug den inden for to uger.
    11. Gør hepatocyt vedligeholdelses medium bestående af William's E medium suppleret med 10% knockout serum udskiftning, bestående af 1% af et alternativt supplement til L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer ved 100 IU/mL og 100 μg/mL, henholdsvis). For hver medium ændring, supplere den nødvendige mængde med HGF, EGF, bFGF og VEGF (den endelige koncentration af hver vækstfaktor på 10 ng/mL).
      Bemærk: Opbevar bestanden ved 4 °C, og brug den inden for to uger.
  3. Kontrollere hepatosphere dannelse 24 h efter såning og initiere hepatocyt differentiering. Fjern forsigtigt mTeSR1 mediet og Udskift det med 1 mL frisk endoderm differentierings medium suppleret med 100 ng/mL Activity A og 50 ng/mL Wnt3a.
  4. Ændring suppleret endoderm priming medium hver 24 h i 3 dage for hESCs. Når du arbejder med hiPSCs, forlænge denne fase i yderligere 2 dage supplere medierne med Activity A (100ng/mL) alene.
  5. Efter definitive endoderm induktion, skifte til hepatoblast differentiering medium for hepatoblast specifikation for 5 dage udskiftning af mediet hver 2 dage og udføre den sidste ændring på den sidste dag i hepatoblast specifikation.
  6. Overfør hepatokugler til poly-HEMA coatede brønde.
    1. Vask cellerne en gang med hepatocyt modning medium uden kosttilskud efter fjernelse KSR/DMSO medium og tilsæt 1 ml hepatocyt modning medium suppleret med 10 ng/ml hgf og 20 ng/ml OSM.
    2. Brug en P1000-pipette til at løfte hepatosfærerne fra den agopstået mikroplade ved at pipettere op og ned i opløsningen flere gange.
    3. Overfør mediet indeholdende hepatosfærerne til en poly-HEMA belagt godt.
    4. Vask agopstået mikropladen ved hjælp af 1 mL hepatocyt modning medium suppleret med 10 ng/mL HGF og 20 ng/mL OSM og overføre mediet til poly-HEMA belagt godt.
    5. Gentag trin 3.6.4 så mange gange som muligt for at overføre alle hepatosfærerne fra den agopstået mikroplade.
      Bemærk: Det er vigtigt omhyggeligt at pipettere op og ned i opløsningen, der indeholder hepatoksfærerne, for at undgå at beskadige dem.
  7. Aspirér forsigtigt overskydende medium uden at fjerne hepatospheres ved hjælp af en P100 pipette, indtil ~ 1 mL medium indeholdende hepatosfærerne forbliver i Poly-HEMA belagt godt.
  8. Skift mediet hver 48 h i 12 dage.
  9. På dag 20, når du arbejder med hESCs eller dag 22, hvis du arbejder med hipscs, skal du skifte medium til hepatocyt Maintenance medium.
    1. Fjern hepatocyt modning medium og vaske celler en gang med hepatocyt vedligeholdelse medium uden kosttilskud. Tilsæt 1 mL hepatocyt vedligeholdelses medium suppleret med 10 ng/mL HGF, EGF, FGF og VEGF.
  10. Skift medium for frisk hepatocyt vedligeholdelse medium hver 48 h.

4. funktionel analyse af langsigtede kulturperler 3D Hepatospheres

  1. Skift til hepatocyt modning medium suppleret med 10 μM HCC, L-glutamin, 1% penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer ved 100 IU/mL og 100 μg/mL, henholdsvis) og 10 ng/mL HGF 48 h forud for udførelse af funktionelle analyse.
  2. Analysér hepatocyt metaboliske funktion ved hjælp af cytochrom (CYP) P450 assays.
    1. Udskift medium med 1 mL frisk hepatocyt modnings medium suppleret med 50 μM luciferin-6'-pentafluoro-benzyl ether (luciferin-PFBE) substrat til påvisning af CYP3A basal aktivitet eller 100 μM luciferin-methylether (luciferin-ME) substrat til påvisning af CYP1A2 basal aktivitet (antal replikater = 3). Brug vævskultur medier som en negativ kontrol.
      Bemærk: For at undgå Cross-reaktivitet, anbefales det ikke at bruge de samme brønde, der indeholder 3D hepatospheres at teste forskellige CYP P450 aktiviteter, men at udføre dem i individuelle brønde.
    2. Inkuber cellerne i 24 timer ved 37 ° C.
    3. Supernatanterne opsamles ved hjælp af en P100-pipettespids, og analysen udføres som angivet i producentens anvisninger.
    4. Måle de relative niveauer af basal aktivitet og normalisere til per mg protein som bestemt af bicinchonininsyre assay (BCA).
  3. Test serumprotein produktion ved hjælp af enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA).
    1. Udskift medium med 1 mL frisk hepatocyt modnings medium suppleret med 10 ng/mL HGF og 20 ng/mL OSM (antal replikater = 3). Brug vævskultur medier som en negativ kontrol.
    2. Inkuber cellerne i 24 timer ved 37 ° C.
    3. Opsaml supernatanten ved hjælp af en P100 pipettespids, og mål de relative niveauer af serumprotein produktion som pr. producentens anvisninger.
    4. Normalisere til per mg protein som bestemt af BCA assay.

5. immunocytokemi

  1. Tilberedning af paraffin sektioner indeholdende hepatospheres.
    1. Vask hepatosfærerne tre gange med 1x DPBS.
    2. Fastgør hepatosfærerne med iskold methanol i 30 min.
    3. Vask tre gange med 1x DPBS.
    4. Integrer hepatosfærerne i 300 μL af en hærdet opløsning på 2% agopstået opløst i H2O ved hjælp af en tom brønd af en 24-brønd plade som en skimmel og lad den størkne i 30 min.
    5. Integrer den agopstået indeholdende hepatospheres i paraffin.
    6. Afsnittet paraffin blokken indeholdende faste hepatokugler i 4 μm tykke sektioner ved hjælp af en mikrotom.
  2. De-voksning og rehydrering af sektionerne.
    Bemærk:
    brug friske løsninger, når det er muligt. Brug ikke opløsninger, der har været på farvnings truget i mere end en uge.
    1. Placer sektioner i et slide rack.
    2. Nedsænk glide stativet med sektioner i en farvnings skinne, der indeholder 300 mL xylen i 5 min.
    3. Gentag trin 5.2.2.
    4. Nedsænk i absolut ethanol for 20 s.
    5. Nedsænk i 95% ethanol for 20 s.
    6. Nedsænk i 90% ethanol for 20 s.
    7. Nedsænk i 80% ethanol for 20 s.
    8. Nedsænk i 70% ethanol for 20 s.
    9. Rehydrere sektionerne med vand i 5 min.
      Bemærk: Vedligehold diasene i samme slide rack, og flyt dem fra en farvnings skinne til den næste. Den anvendte mængde (generelt ~ 300 mL) afhænger af størrelsen af farvnings truget.
  3. Antigen udtagning af paraffin sektioner indeholdende hepatospheres.
    1. Varme de-voksede og rehydrerede sektioner i 1x Tris-EDTA (TE) pH 9,0 bufferopløsning til 15 min i en mikrobølgeovn ved 800 W.
    2. Afkøl prøverne ved at fordybe dem i vand fra hanen i 5 min.
  4. Immun.
    1. Incubate glider med en blokerende opløsning fremstillet af PBS med 0,1% Polysorbat 20 (PBS/T)/10% BSA i 1 time ved RT.
    2. Udskift blokerende opløsning med det relevante primære antistof fortyndet i PBS/T/1% BSA og Inkuber ved 4 °C med blid agitation natten over.
    3. Vask cellerne med PBS/T i 5 min. og Gentag tre gange.
    4. Inkubatér med det relevante sekundære antistof fortyndet i PBS/T/1% BSA og Inkuber i mørket ved RT i 1 time med blid agitation.
      Bemærk: De optimerede primære og sekundære antistoffer er opført i tabel over materialer.
    5. Vask cellerne med PBS/T i 5 min. og Gentag tre gange.
    6. Tilsæt 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) til cellerne i henhold til producentens anvisninger, og Placer forsigtigt en glas dækseddel for at reducere luftbobler. Opbevar faste celler ved 4 °C i mørke. Observere farvning under et mikroskop med passende filter og fluorescerende lampe.
      Bemærk: Opbevar plader ved 4 °c i mørke indtil billeddannelse.

Representative Results

Tredimensionale aggregater fra embryonale stamcelle linje (H9) eller den inducerede pluripotente stamcelle linje (P106) blev differentieret i forhold til hepatocyt Lineage ved hjælp af vores definerede procedure (figur 1). Pluripotente stamceller blev først primet mod definitive endoderm før hepatoblast-specifikationen. Efter dette, hepatoblaster blev modnet i 3D hepatspheres, som kunne opretholdes i kulturen i op til et år23.

For at studere strukturen i 3D-kugler blev 30 daggamle hESC-eller iPSC-afledte kugler fastgjort, skåret og plettet for at påvise tilstedeværelsen af proteiner udtrykt i hepatocytter og mesenchymale celler. Hepatocyt nuklear faktor 4 Alpha (HNF4α) og mesenchymal markør vimentin blev anvendt, afslører tilstedeværelsen af et ydre lag bestående af hepatocyt som celler omkring en kerne af mesenchymal celler (figur 2). Vi fulgte disse eksperimenter analysere ekspression af proteiner udtrykt i hepatocytter: albumin, CYP3A og E-cadherin. Immunofarvning afslørede, at ekspression af disse proteiner var begrænset til det yderste lag af sfærer (figur 3).

Funktionelle analyser af hepatosfærerne blev udført i dag 30 kulturer. CYP1A2 og CYP3A er vigtige enzymer inden for funktionelle hepatocytter. Deres aktivitet blev vurderet ved hjælp af etablerede assays. H9-afledte hepatokugler udviste CYP3A-aktivitet på 220.375 ± 74514 RLU/mL/mg protein og CYP1A2 aktivitet på 732.440 ± 33.330 RLU/mL/mg protein (figur 4A). CYP3A-aktiviteten i P106-afledte hepatokugler var 132117 ± 43.391 RLU/mL/mg protein, og CYP1A2-aktiviteten var 409.907 ± 121.723 RLU/mL/mg protein (figur 4B). Sammenlignet med to partier af humane primære hepatocytter, 3D lever kugler vises respektable niveauer af CYP aktivitet10.

Analyse af syntesen og sekretionen af albumin og alpha-fetoprotein (AFP) afslørede, at H9-afledte hepatospheres udskilt 683,9 ± 84 og 159 ± 20 ng/mL/24 t/mg protein af albumin og alpha-fetoprotein henholdsvis (figur 5A). Der henviser til, at P106-afledte hepatosfærer udskilt 497 ± 41 og 756 ± 24 ng/mL/24 t/mg protein af albumin og alfa-fetoprotein (figur 5B).

Figure 1
Figur 1 : Trinvis differentiering procedure til at generere 3D hepatospheres fra hESCs. Blå parenteser repræsenterer dage med differentiering for hiPSCs. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Strukturel reorganisering af 3D-hepatospheres. Repræsentative billeder af ekspression af hepatocyt nuklear faktor 4 Alpha (HNF4α-Green) og vimentin (rød) i (A) H9-afledte 3D hepatospheres og (B) P106-afledte 3D hepatspheres og deres tilsvarende immunglobulin G (IgG) Kontroller . Skala søjler repræsenterer 60 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Evaluering af lever markør udtryk i 3D hepatospheres. Repræsentative billeder af ekspression af hepatocyt markører-albumin, CYP3A, E-cadherin og deres tilsvarende IgG-Kontroller i (A) H9-og (B) P106-afledte 3D-hepatospheres. Skala stænger = 60 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Cytochrom P450 funktion i 3D hepatospheres. Måling af cytochrom P450 1A2 og 3A aktivitet i (A) H9-afledte 3D hepatospheres og (B) P106-afledte 3D hepatspheres. Dataene repræsenterer middelværdien af tre biologiske replikater, og fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen (SD). Aktivitet er angivet som relative lysenheder (RLU) pr. mL pr. mg protein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Analyse af hepatosphere protein sekretion. Udskillelsen af albumin og alpha-fetoprotein (AFP) blev analyseret i (A) H9-afledte 3D hepatospheres og (B) P106-afledte 3D hepatspheres. Dataene er repræsentative for tre biologiske replikater, og fejl stængerne repræsenterer SD. udskilt protein er citeret som nanogram protein pr. mL pr. 24 timer pr. mg protein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Udviklingen af definerede og Xeno-fri systemer til at producere humane hepatspheres i 3D er nødvendig for både in vitro og in vivo bestræbelser. På nuværende tidspunkt de fleste hepatocyt differentiering tilgange fra humane pluripotente stamceller udføres i to dimensionelle tilhængere kulturer. Disse miljøer mangler mange af de miljømæssige signaler involveret i væv Genesis og homøostase, som omfatter; Heterotypiske celle interaktioner, matrix produktion og Remodeling, hvilket resulterer i dårlig oversættelse til in vivo biologi18,19.

Som et resultat, forskning har fokuseret på alternative tilgange til at generere hepatospheres fra pluripotente stamceller. En række 3D-undersøgelser har fremmet marken, men de er afhængige af animalske produkter20,22,24 for at yde støtte og/eller kræve anvendelse af humant væv21,22 hvilket komplicerer teknologi opskalering og kompromitterer eksperimentel reproducerbarhed og anvendelse.

Den procedure, der er beskrevet i vores artikel (figur 1), er defineret, effektiv, meget reproducerbar og omkostningseffektiv, hvilket gør det muligt at fremstille funktionelle lever kugler, som forbliver funktionelle over et år in vitro og giver kritisk lever støtte i vivo14. Vigtigere, denne platform giver brugeren mulighed for at kontrollere størrelsen af 3D leveren kugler, begrænse dannelsen af tætte nekrotiske Centre og tab af phenotype.

Overførslen af 3D-hepatosfærerne til poly-HEMA-belagte plader udgør et kritisk skridt i denne protokol. Det er vigtigt at pipetten forsigtigt på dette trin i proceduren for at undgå at beskadige kuglen. Desuden skal medieændringer udføres omhyggeligt for at undgå forskydnings stress og forvrængning af kugle strukturen.

I disse undersøgelser, 3D hepatospheres vist en organiseret struktur (figur 2 og figur 3), cytochrom P450 funktion (figur 4) og udskilles lever proteiner, herunder albumin og alpha-fetoprotein (figur 5). Denne procedure er blevet udført med succes i fire pluripotente stamceller linjer med sammenlignelige resultater. Når man ser fremad, kan denne teknologi anvendes som en platform til at udvikle yderligere epitel og mesenchymal væv med komplekse arkitekturer.

Disclosures

David C. Hay er medstifter af og aktionær i Stemnovate Ltd og HigherSteaks Ltd. Resten af forfatterne bekræfter, at de ikke har nogen interessekonflikter i det emne eller materiale, der diskuteres i denne artikel.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet med priser fra den britiske regenerative Medicine platform (MRC MR/L022974/1) og den ledende videnskabsmands kontor (TCS/16/37).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture and functional assays
Agarose Fisher Bioreagents 10766834
B27 supplement  Life Technologies  12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies  31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A2058 
DAPI  Invitrogen D1306
DMSO  Sigma-Aldrich  D5879
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher  14190250
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher  14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies  7174
GlutaMax  Life Technologies  35050
HepatoZYME-SFM Life Technologies    17705021
Human Activin A  Peprotech  120-14E
Human Alpha Fetoprotein ELISA Alpha Diagnostics 500
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor Peprotech  100-18B
Human Epithelial Gropwth Factor Peprotech  236-EG
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech  100-39
Human Oncostatin M  Peprotech  300-10
Human Recombinant Laminin 521  BioLamina  LN521-02
Human Serum Albumin ELISA Alpha Diagnostics 1190
Human Vascular Growth Factor Bio-techne 293-VE
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich  H4881
Knockout DMEM  Life Technologies  10829
Knockout Serum Replacement  Life Technologies  10828
Micro-mold spheroids  Sigma-Aldrich  Z764000
mTeSR1 medium  STEMCELL Technologies  5850
Non-essential amino acids  Life Technologies  11140
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies  15140122
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate)  Sigma-Aldrich  P3932
Recombinant mouse Wnt3a  Bio-techne 1324-WN-500/CF
RPMI 1640  Life Technologies  21875
Equipment
Microwave Bosch
Microtome Leika RM2125RT
Oven Thermoscientific
Antibodies
Primary antibodies
Albumin  Sigma-Aldrich  A6684  1:100 (mouse)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:100 (rabbit)
IgG DAKO X0943 1:400
Vimentin DAKO M0725 1:100 (sheep)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning and Stem Cells. 9, (1), 51-62 (2007).
  2. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (34), 12301-12306 (2008).
  3. Hay, D. C., et al. Efficient Differentiation of Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells Exhibiting Markers Recapitulating Liver Development In vivo. STEM CELLS. 26, (4), 894-902 (2008).
  4. Hannan, N. R., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte like cells from human pluripotent stem cells. Nature protocols. 8, (2), 430-437 (2013).
  5. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, (2), 237-252 (2014).
  6. Sullivan, G. J., et al. Generation of Functional Human Hepatic Endoderm from Human iPS cells. Hepatology. 51, (1), 329-335 (2010).
  7. Si-Tayeb, K., et al. Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-like Cells from Induced Pluripotent Stem Cells. Hepatology. 51, (1), 297-305 (2010).
  8. Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), (2017).
  9. Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
  10. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5, (6), 1250-1262 (2015).
  11. Zhou, X., et al. Modulating Innate Immunity Improves Hepatitis C Virus Infection and Replication in Stem Cell-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 3, (1), 204-214 (2014).
  12. Lyall, M. J., et al. Modelling non-alcoholic fatty liver disease in human hepatocyte-like cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373, (1750), 20170362 (2018).
  13. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5, (6), 764-772 (2016).
  14. Lucendo-Villarin, B., et al. Modelling foetal exposure to maternal smoking using hepatoblasts from pluripotent stem cells. Archives of Toxicology. 91, (11), 3633-3643 (2017).
  15. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120, (9), 3127-3136 (2010).
  16. Godoy, P., et al. Gene networks and transcription factor motifs defining the differentiation of stem cells into hepatocyte-like cells. Journal of Hepatology. 63, (4), 934-942 (2015).
  17. Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Cameron, K., Hay, D. C. Pluripotent stem cell derived hepatocytes: using materials to define cellular differentiation and tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B, Materials for Biology and Medicine. 4, (20), 3433-3442 (2016).
  18. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. Slas Discovery. 22, (5), 456-472 (2017).
  19. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12, (4), 207-218 (2014).
  20. Gieseck, R. L., et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture. PLoS ONE. 9, (1), (2014).
  21. Takebe, T., et al. Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature Protocols. 9, (2), 396-409 (2014).
  22. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546, (7659), 533-538 (2017).
  23. Rashidi, H., et al. 3D human hepatospheres from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo. Archives of Toxicology. 92, (10), 3117-3129 (2018).
  24. Takebe, T., et al. Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 21, (10), 2661-2670 (2017).
Serum fri produktion af tredimensionale humane Hepatokugler fra pluripotente stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O'Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).More

Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O'Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter