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Developmental Biology

प्लरिपॉवर स्टेम सेल से तीन आयामी मानव Hepatospheres के सीरम मुक्त उत्पादन

doi: 10.3791/59965 Published: July 20, 2019

Summary

इस प्रोटोकॉल एक परिभाषित संस्कृति प्रणाली और सेल आत्म विधानसभा का उपयोग कर मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से hepatospheres उत्पादन करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करता है. इस प्रोटोकॉल सेल लाइनों की एक संख्या में reproduible है, लागत प्रभावी और जैव चिकित्सा आवेदन के लिए स्थिर मानव hepatospheres के उत्पादन की अनुमति देता है.

Abstract

जिगर के ऊतकों के अक्षय स्रोतों के विकास के लिए सेल आधारित मॉडलिंग में सुधार, और प्रत्यारोपण के लिए मानव ऊतक विकसित करने की आवश्यकता है. मानव भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) मानव जिगर क्षेत्रों के आशाजनक स्रोतों का प्रतिनिधित्व करते हैं. हम मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से गठित तीन आयामी मानव जिगर क्षेत्रों उत्पन्न करने के लिए सेलुलर भेदभाव की एक सीरम मुक्त और परिभाषित विधि विकसित की है. प्रौद्योगिकी की एक संभावित सीमा के अंदर मृत सामग्री के साथ घने क्षेत्रों का उत्पादन है. इस को दरकिनार करने के लिए, हमने 3डी गोलों के आकार को नियंत्रित करने के लिए परिभाषित सेल घनत्व पर एग्रोस माइक्रोवेल प्रौद्योगिकी का उपयोग किया है, जो एपोप्टोटिक और/या नेक्रोटिक कोर की पीढ़ी को रोकता है।  विशेष रूप से, हमारे दृष्टिकोण द्वारा उत्पन्न क्षेत्रों जिगर समारोह और स्थिर phenotype प्रदर्शन, बुनियादी और लागू वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन का प्रतिनिधित्व. हमें विश्वास है कि हमारे दृष्टिकोण एक मंच प्रौद्योगिकी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है मॉडल और मानव रोग का इलाज करने के लिए और आगे के ऊतकों को विकसित करने के लिए और भविष्य में जटिल ऊतक वास्तुकला के साथ मानव ऊतक की पीढ़ी की अनुमति हो सकती है.

Introduction

मानव pluripotent स्टेम सेल (एचपीएससी) की क्षमता स्वयं को नवीनीकृत करने के लिए, जबकि pluripotency बनाए रखने, मांग पर मानव सेल प्रकार और ऊतकों का उत्पादन करने का अवसर प्रदान करता है. एचपीएससी को दो आयामी (2 डी) अनुलग्न संस्कृति प्रणालियों1,2,3,4,5,6 का उपयोग करके हेपाटोसाइट-जैसे कोशिकाओं (एचएलसी) में कुशलता पूर्वक विभेदित किया गया है। ,7,8,9,10. इन प्रणालियों को सफलतापूर्वक मोनोजेनिक रोग मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, वायरस जीवन चक्र, दवा प्रेरित जिगर की चोट (DILI), विषाक्त पदार्थों और गैर शराबी फैटी लीवर रोग के लिए भ्रूण जोखिम (NAFLD)11,12,13 ,14,15. हालांकि, इन मॉडलों के पास कुछ कमियां हैं, जो उनके नियमित उपयोग को सीमित करती हैं। उन भ्रूण मार्कर अभिव्यक्ति, अस्थिर phenotype और गरीब ऊतक वास्तुकला16,17,18,19, जो भी विवो में अंग समारोह के लिए extrapolation सीमा सकता है शामिल हैं.

इन सीमाओं को दूर करने के लिए, तीन आयामी (3 डी) भेदभाव प्लेटफार्मों vivo ऊतक वास्तुकला में नकल करने के लिए विकसित किया गया है. हालांकि सक्षम करने, उन दृष्टिकोण ऊतक उत्पत्ति ड्राइव करने के लिए पशु व्युत्पन्न उत्पादों और matrices के उपयोग पर भरोसा करते हैं20,21,22, सीमित पैमाने पर अप और व्यापक आवेदन.

यहाँ, हम परिभाषित सामग्री और सेल आत्म विधानसभा का उपयोग कर hPSCs से 3 डी hepatospheres की बड़ी मात्रा में उत्पन्न करने के लिए प्रक्रियाओं का विस्तार. विशेष रूप से, हमारी प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न ऊतक सेल संस्कृति में एक वर्ष से अधिक के लिए कार्यात्मक रहता है और विवो23में जिगर समारोह का समर्थन करने में सक्षम है।

संक्षेप में, हमारे परिभाषित भेदभाव दृष्टिकोण दोनों मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) से स्थिर मानव hepatospheres की पीढ़ी की अनुमति देता है. हमारा मानना है कि वर्णित प्रक्रिया बुनियादी और लागू वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए 3 डी hepatospheres की पीढ़ी में एक महत्वपूर्ण सफलता का प्रतिनिधित्व करता है.

Protocol

1. अगारोस माइक्रोप्लेट मोल्ड्स की तैयारी

नोट: इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया मीडिया बाँझ और कक्ष के तापमान पर होना चाहिए (आरटी) सेल संस्कृति के लिए.

  1. 2% agarose मोल्ड तैयार करें.
    1. 2 ग्राम कम पिघलने वाले तापमान को 100 एमएल बंध्याकृत आसुत जल में घोल लें। पूरी तरह से भंग करने के लिए अंतराल मिलाते हुए के साथ एक माइक्रोवेव में सावधानी से गर्मी।
    2. एक 256 अच्छी तरह से प्रारूप मोल्ड करने के लिए पिघल agarose के 520 $L जोड़ें और ठोस करने के लिए छोड़ दें।
    3. प्रत्येक आगारोस माइक्रोप्लेट को 12-वेल प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें।
    4. Ca2 +/Mg2 + के साथ 1.5 एमएल जोड़ें 1.5 एमएल जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे कई बार एक P1000 पाइपेट टिप का उपयोग करके microwells से हवा के बुलबुले को हटा दें। यह एक समान सेल बोने सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है।
      नोट: Agarose microplates अप करने के लिए 6 महीने के लिए 1x DPBS में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

2. आगारोस माइक्रोवेल प्लेट्स में मानव प्लरिपॉवर स्टेम सेल सीडिंग

  1. सेल निलंबन की तैयारी
    1. एच पी एस सी की एक अलग संस्कृति से माध्यम को प्रेरित करें जैसा कि पहले8वर्णित किया गया था .
      नोट: hPSCs MTeSR1 में LN-521 पर सुसंस्कृत कर रहे हैं मध्यम हर 24 ज बदल के साथ, और नियमितरूप से पारित एक बार कोशिकाओं को 75% तक पहुंच संगम के 85% के रूप में पहले 8 वर्णित .
    2. Ca2 +/Mg2 + बिना RT 1x DPBS के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं कुल्ला और बफर हटा दें।
    3. कोशिकाओं में 1x सेल वियोजन अभिकर्मक (सामग्रीकीसारणी) का 5 एमएल जोड़ें तथा कोशिकाओं को 6-8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इन्क्यूबेट करके कोशिका वियोजन की अनुमति दें।
      नोट: प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिका टुकड़ी की जांच करें। कोशिकाओं को आंशिक रूप से प्लेट से अलग किया जाना चाहिए। यदि अधिक समय की आवश्यकता हो तो अतिरिक्त 1-2 मिनट के लिए ऊष्मायन बढ़ाएं।
    4. सेल वियोजन अभिकर्मक को हटाने के द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो और कोशिकाओं के लिए 10 डिग्री एम रो संबद्ध kinase (रॉक) अवरोध करनेवाला Y27632 के साथ पूरक ताजा mTeSR1 मध्यम के 5 एमएल जोड़ें। P1000 पिपेट टिप का उपयोग करके कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को अलग करें।
    5. एक हेमोसाइटोमीटर और trypan नीले धुंधला बहिष्करण का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना. इसके बाद, आवश्यक एकाग्रता पर सेल निलंबन तैयार करें।
    6. आवश्यक कक्षों की कुल संख्या की गणना करें. 3 डी hepatosphere भेदभाव के लिए, बीज 3.84 x 105 कोशिकाओं agarose microplate प्रति व्यास में 100-150 डिग्री के साथ गोलाभ उत्पन्न करने के लिए।
    7. कोशिकाओं की वांछित संख्या को एक बाँझ 15 एमएल या 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को गोली लगाने के लिए आरटी में 5 मिनट के लिए ट्यूब को 200 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें।
    8. Aspirate और supernatant त्यागें और mTeSR1 मध्यम प्लस 10 डिग्री एम रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 में कोशिकाओं को फिर से निलंबित. 2ण्1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए माध्यम की उपयुक्त आयतन में कोशिका गोली को निरूपित करना।
  2. तैयार एग्रोस माइक्रोप्लेट्स को कोशिकाओं को सीडिंग करना
    नोट:
    यदि फ्रिज-स्टोर्ड एग्रोस माइक्रोप्लेट ्स्ड का उपयोग करते हैं, तो उन्हें सेल इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, उपयोग करने से पहले कम से कम एक घंटे के लिए और सेल सीडिंग से पहले अच्छी तरह से 1x DPBS को प्रेरित करें।
    1. एग्रोस माइक्रोवेल में सेल निलंबन के 190 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    2. बोने के बाद, कोशिकाओं को व्यवस्थित करने की अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को 2 एच पर प्लेटों को वापस करें।
    3. 2 ज के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 के साथ पूरक ताजा और गर्म mTeSR1 मध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
    4. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर तथा 5% ब्व्2 को 24 ज के लिए प्लेटों को लौटाएं और कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए अगले दिन गोलों के निर्माण की जाँच करें।

3. आगरोस माइक्रोवेल्स पर 3 डी हेपैटोस्फीयर्स को एचपीएससी को अलग करना

  1. पॉली 2-हाइड्रोक्सीएथिल मेथाक्रिलेट (पॉली-हेमा) लेपित कुओं की तैयारी
    1. 95% इथेनॉल के 100 एमएल में 2 ग्राम पॉली-हेमा को भंग करें। 55 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट का उपयोग कर रात भर समाधान हिलाओ। एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से पाली हेमा समाधान के 250 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और एक ओवन का उपयोग कर 60 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सूखी।
  2. विभेदक माध्यम की तैयारी
    1. बाँझ में मानव activin एक lyophilized प्रोटीन भंग द्वारा मानव activin एक 1,000x स्टॉक समाधान तैयार 0.2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA)/DPBS की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 100 g/ -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे एलिकोट्स में स्टोर करें। 1:1,000 पर प्रयोग करें.
    2. बाँझ में माउस Wnt3a lyophilized प्रोटीन भंग द्वारा Wnt3a के एक 1,000x स्टॉक समाधान तैयार 0.2% बीएसए / -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे एलिकोट्स में स्टोर करें। 1:200 पर प्रयोग करें.
    3. मानव hepatocyte वृद्धि कारक (HGF) के एक 1,000x स्टॉक समाधान बाँझ में मानव HGF lyophilized प्रोटीन भंग द्वारा तैयार 0.2% बीएसए / -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे एलिकोट्स में स्टोर करें। 1:1,000 पर प्रयोग करें.
    4. 20 ग्राम/एमएल की अंतिम सांद्रता के लिए बाँझ 0.2% बीएसए/डीपीबीएस में OSM भंग करके oncostatin M (OSM) का 1,000x स्टॉक समाधान तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे एलिकोट्स में स्टोर करें। 1:1,000 पर प्रयोग करें.
    5. उपकला विकास कारक (EGF) के एक 1000x स्टॉक समाधान बाँझ में lyophilized प्रोटीन भंग द्वारा तैयार 0.2% बीएसए / -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे एलिकोट्स में स्टोर करें। 1:1,000 पर प्रयोग करें.
    6. बाँझ में lyophilized प्रोटीन भंग द्वारा बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (bFGF) का एक 1,000x स्टॉक समाधान तैयार 0.2% बीएसए / -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे एलिकोट्स में स्टोर करें। 1:1,000 पर प्रयोग करें.
    7. संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) के एक 1,000x स्टॉक समाधान 0.2% बीएसए /DPBS में lyophilized प्रोटीन भंग द्वारा 10 g/mL की एक अंतिम एकाग्रता के लिए तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे एलिकोट्स में स्टोर करें। 1:1,000 पर प्रयोग करें.
    8. एंडोडर्म विभेदन माध्यम Roswell पार्क मेमोरियल संस्थान 1640 (RPMI 1640) बेसल मध्यम 2% B27 पूरक (50x, इंसुलिन के बिना) के साथ पूरक, और 1% पेनिसिलिन / क्रमशः)। जब तक संकेत नहीं दिया, प्रत्येक मध्यम परिवर्तन पर, क्रमशः 50 एनजी/एमएल और 100 एनजी/एमएल की अंतिम सांद्रता में Wnt3a और activin A के साथ आवश्यक मात्रा के पूरक।
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और दो सप्ताह के भीतर उपयोग करें।
    9. Hepatoblast भेदभाव माध्यम नॉकआउट Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (KO-DMEM) के साथ 20% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन (KOSR) और एल-ग्लूटामाइन के लिए एक वैकल्पिक पूरक के 0.5% के साथ पूरक, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), 0.1 एमएम बीटा-मरकैप्टोथेनोल, 1% डाइमेथिल सल्फाइड (डीएमएसओ), और 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम सांद्रता 100 IU/mL और 100 g/एमएल पर क्रमशः)। वैक्यूम के तहत फ़िल्टर.
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और दो सप्ताह के भीतर उपयोग करें।
    10. हेपेटोसाइट परिपक्वता माध्यम बनाने के लिए हेपेटोसाइट मध्यम एल-ग्लूटामाइन के लिए एक वैकल्पिक पूरक के 1% के साथ पूरक, 10 डिग्री एम hydrocortisone 21-hemisuccinate सोडियम नमक (HCC), 1% पेनिसिलिन / 100 g/एमएल, क्रमशः). प्रत्येक मध्यम परिवर्तन के लिए, OSM और HGF के साथ आवश्यक मात्रा के पूरक (अंतिम सांद्रता पर 20 ng/mL और 10 ng/mL, क्रमशः).
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर स्टोर और दो सप्ताह के भीतर उपयोग करें.
    11. विलियम के ई मध्यम 10% नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन के साथ पूरक हेपेटोसाइट रखरखाव माध्यम बनाओ, जिसमें एल-ग्लूटामाइन के लिए एक वैकल्पिक पूरक का 1%, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम सांद्रता 100 IU/mL और 100 g/mL पर, क्रमशः)। प्रत्येक मध्यम परिवर्तन के लिए, HGF के साथ आवश्यक मात्रा के पूरक, EGF, bFGF और VEGF (प्रत्येक वृद्धि कारक के अंतिम एकाग्रता पर 10 एनजी /
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर स्टोर और दो सप्ताह के भीतर उपयोग करें.
  3. hepatosphere गठन की जाँच करें 24 एच के बाद बोने और hepatocyte भेदभाव आरंभ. ध्यान से mTeSR1 माध्यम निकालें और ताजा endoderm भेदभाव मध्यम के 1 एमएल के साथ बदलें 100 ng/mL activin ए और 50 ng/mL Wnt3a के साथ पूरक.
  4. परिवर्तन पूरक endoderm प्राइमिंग माध्यम हर 24 घंटे के लिए 3 दिन के लिए hESCs. HIPSCs के साथ काम करते समय, एक और 2 दिनों के लिए इस चरण का विस्तार activin A (100ng/mL) अकेले के साथ मीडिया के पूरक.
  5. निश्चित एंडोडर्म प्रेरण के बाद, हेपाटोब्लास्ट विभेदन माध्यम के लिए स्विच 5 दिनों के लिए हर 2 दिन मध्यम की जगह और hepatoblast विनिर्देश के अंतिम दिन पर अंतिम परिवर्तन प्रदर्शन करते हैं।
  6. बहु-हेमा लेपित कुओं में हेपैटोस्फिक्स को स्थानांतरित करें।
    1. केएसआर/डीएमएसओ माध्यम को हटाने के बाद पूरक के बिना एक बार हेपेटोसाइट परिपक्वता माध्यम के साथ कोशिकाओं को धो लें और 1 एमएल हेपेटोसाइट परिपक्वता माध्यम जोड़ें 10 एनजी/एमएल एचजीएफ और 20 एनजी/
    2. एक P1000 पिपेट का उपयोग करना, ऊपर और नीचे समाधान कई बार पाइपिंग द्वारा agarose microplate से hepatospheres उठा.
    3. एक पाली हेमा लेपित अच्छी तरह से करने के लिए hepatospheres युक्त माध्यम स्थानांतरण.
    4. 1 एमएल हेपाटोसाइट परिपक्वता माध्यम का उपयोग करके अग्रोसो माइक्रोप्लेट को धोलें 10 एनजी/एमएल एचजीएफ और 20 एनजी/एमएल ओएसएम के साथ पूरक और मध्यम को पाली-हेमा लेपित अच्छी तरह से स्थानांतरित करें।
    5. चरण 3.6.4 को यथासंभव कई बार दोहराएं ताकि सभी हेपैटोस्फीयरकोस माइक्रोप्लेट से स्थानांतरित किया जा सके।
      नोट: उन्हें नुकसान से बचने के लिए हेपैटोस्फीयर्स युक्त समाधान को ध्यान से पिपेट अप और नीचे करना महत्वपूर्ण है।
  7. ध्यान से hepatospheres को हटाने के बिना अतिरिक्त मध्यम aspirate जब तक एक P100 pipette का उपयोग करके मध्यम के $ 1 एमएल युक्त hepatospheres पाली-हेमा लेपित अच्छी तरह से में रहता है.
  8. 12 दिनों के लिए हर 48 एच माध्यम बदलें.
  9. 20 दिन में जब hESCs या दिन 22 के साथ काम कर रहे हैं अगर hiPSCs के साथ काम कर रहे हैं, हेपाटोसाइट रखरखाव माध्यम के लिए माध्यम स्विच.
    1. पूरक के बिना hepatocyte रखरखाव माध्यम hepatocyte रखरखाव माध्यम के साथ एक बार hepatocyte परिपक्वता मध्यम निकालें और कोशिकाओं को धोने. जोड़ें 1 एमएल hepatocyte रखरखाव मध्यम के साथ पूरक 10 NG/mL HGF, EGF, FGF और VEGF.
  10. ताजा hepatocyte रखरखाव माध्यम के लिए माध्यम बदलें हर 48 ज.

4. दीर्घकालिक संस्कृति वाले 3 डी हेपैटोस्फीयर्स का कार्यात्मक विश्लेषण

  1. हेपाटोसाइट परिपक्वता माध्यम के लिए स्विच 10 डिग्री एम एचसीसी, एल-ग्लूटामाइन, 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (अंतिम सांद्रता 100 IU/mL और 100g/mL पर, क्रमशः) और 10 एनजी/एमएल एचजीएफ 48 एचजीएफ 48 एचएचएफ कार्यात्मक विश्लेषण करने से पहले।
  2. साइटोक्रोम (CYP) P450 assays का उपयोग कर hepatocyte चयापचय समारोह का विश्लेषण करें.
    1. सीवाईपी3ए बेसल गतिविधि या 100 डिग्री ल्यूसिफरिन-मेथिल ईथर (ल्यूसिफरिन-एमई) का पता लगाने के लिए उपस्तर 50 डिग्री सेल्सियस लुसिफेरिन-6'-पेंटाफ्लोरो-बेन्जिल ईथर (ल्यूसिफरिन-पीएफबीई) सबस्ट्रेट के साथ 1 एमएल के साथ मध्यम को बदलें आधारी क्रियाकलाप (प्रतिकृतियों की संख्या ] 3)। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ऊतक संस्कृति मीडिया का प्रयोग करें.
      नोट: आदेश में पार प्रतिक्रिया से बचने के लिए, यह अलग CYP P450 गतिविधियों का परीक्षण करने के लिए, लेकिन उन्हें व्यक्तिगत कुओं में प्रदर्शन करने के लिए 3 डी hepatospheres युक्त एक ही कुओं का उपयोग नहीं करने के लिए सिफारिश की है।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    3. एक P100 पिपेट टिप का उपयोग कर supernatants लीजिए और निर्माता के निर्देशों के अनुसार परख बाहर ले.
    4. बेसल गतिविधि के सापेक्ष स्तर को मापने और bicinoninic एसिड परख (BCA) द्वारा निर्धारित के रूप में मिलीग्राम प्रोटीन प्रति सामान्य.
  3. परीक्षण सीरम प्रोटीन उत्पादन एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसमोरेन्ट परख (एलिसा) का उपयोग कर।
    1. 10 ng/mL HGF और 20 ng/mL OSM (प्रतिकृति की संख्या ] 3) के साथ पूरक ताजा hepatocyte परिपक्वता माध्यम के 1 एमएल के साथ मध्यम बदलें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में ऊतक संस्कृति मीडिया का प्रयोग करें.
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    3. एक P100 पिपेट टिप का उपयोग कर supernatant ले लीजिए और निर्माता के निर्देशों के अनुसार सीरम प्रोटीन उत्पादन के रिश्तेदार स्तर को मापने।
    4. बीसीए परख द्वारा निर्धारित के रूप में मिलीग्राम प्रोटीन प्रति सामान्य.

5. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री

  1. हेपैटोस्फीयर्स युक्त पैराफिन वर्गों की तैयारी।
    1. 1x DPBS के साथ तीन बार hepatospheres धो लें.
    2. 30 मिनट के लिए बर्फ ठंडा मेथनॉल के साथ hepatospheres को ठीक करें।
    3. 1x DPBS के साथ तीन बार धो लें.
    4. 2% agarose के एक टेम्पर्ड समाधान के 300 $L में hepatospheres एम्बेड एच2ओ में भंग एक मोल्ड के रूप में एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक खाली अच्छी तरह से उपयोग कर और यह 30 मिनट के लिए ठोस करने के लिए छोड़ दें.
    5. पैराफिन में हेपैटोस्फीयर्स युक्त अग्रोरोस को एम्बेड करें।
    6. एक माइक्रोटोम का उपयोग करते हुए 4 डिग्री मीटर मोटी वर्गों में स्थिर हेपैटोस्फीयरयुक्त पैराफिन ब्लॉक को खंड करें।
  2. वर्गों के डी-वैक्सिंग और पुनर्जलीकरण।
    नोट:
    जब भी यह संभव हो ताजा समाधान का प्रयोग करें। उन समाधानों का उपयोग न करें जो एक सप्ताह से अधिक समय तक धुंधला गर्त पर रहे हैं।
    1. एक स्लाइड रैक में वर्गों रखें.
    2. 5 मिनट के लिए xylene के 300 एमएल युक्त एक धुंधला गर्त में वर्गों युक्त स्लाइड रैक विसर्जित कर दिया।
    3. चरण 5.2.2 दोहराएँ.
    4. 20 s के लिए पूर्ण इथेनॉल में विसर्जित कर दिया।
    5. 20 s के लिए 95% इथेनॉल में विसर्जित कर दिया।
    6. 20 s के लिए 90% इथेनॉल में विसर्जित कर दिया।
    7. 20 s के लिए 80% इथेनॉल में विसर्जित कर दिया।
    8. 20 s के लिए 70% इथेनॉल में विसर्जित कर दिया।
    9. 5 मिनट के लिए पानी के साथ वर्गों को फिर से हाइड्रेट करें।
      नोट: एक ही स्लाइड रैक में स्लाइड बनाए रखें और इसे एक धुंधला गर्त से अगले एक करने के लिए ले जाएँ। मात्रा का इस्तेमाल किया (आम तौर पर $ 300 एमएल) धुंधला गर्त के आकार पर निर्भर करता है.
  3. हेपैटोस्फीयर्स वाले पैराफिन वर्गों की एंटीजन पुनः प्राप्ति।
    1. गर्मी de-waxed और rehydrated वर्गों में 1x Tris-EDTA (टीई) पीएच 9.0 बफर समाधान के लिए 15 मिनट के लिए एक माइक्रोवेव में 800 W.
    2. 5 मिनट के लिए नल के पानी में डुबोकर नमूनों को ठंडा करें।
  4. इम्यूनोस्टेनिंग.
    1. आरटी में 1 एच के लिए 0.1% पॉलीसोर्बेट 20 (पीबीएस/टी)/10% बीएसए के साथ पीबीएस के बने ब्लॉकिंग समाधान के साथ इनक्यूबेट स्लाइड।
    2. पीबीएस/टी/1% बीएसए में पतला उचित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध समाधान को बदलें और रात भर कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. 5 मिनट के लिए पीबीएस /टी के साथ कोशिकाओं को धोएं और तीन बार दोहराएं।
    4. पीबीएस/टी/1% बीएसए में पतला उचित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट और कोमल आंदोलन के साथ 1 एच के लिए आरटी में अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
      नोट: अनुकूलित प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध होते हैं।
    5. 5 मिनट के लिए पीबीएस /टी के साथ कोशिकाओं को धोएं और तीन बार दोहराएं।
    6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं के लिए 4',6-diamidino-2-फेनिलिनो (डीएपीआई) जोड़ें और हवा के बुलबुले को कम करने के लिए धीरे से एक ग्लास कवरस्लिप रखें। स्थिर कोशिकाओं को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। उचित फिल्टर और फ्लोरोसेंट दीपक के साथ एक माइक्रोस्कोप के नीचे धुंधला निरीक्षण करें।
      नोट:इमेजिंग तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें स्टोर करें।

Representative Results

भ्रूणीय स्टेम सेल लाइन (एच 9) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल लाइन (P106) से त्रि-आयामी समुच्चय हमारी परिभाषित प्रक्रिया का उपयोग करhe-cytocyte वंश की ओर विभेदित किया गया (चित्र 1)। Puripotent स्टेम सेल पहले hepatoblast विनिर्देश से पहले निश्चित endoderm की ओर primed थे. इसके बाद, हेपैटोब्लास्ट्स को 3 डी हेपैटोस्फीयर्स में परिपक्व कर दिया गया था जिसे23वर्ष तक संस्कृति में बनाए रखा जा सकता था .

3डी गोलों की संरचना का अध्ययन करने के लिए, हेपेटोसाइट्स और मेसेन्काइमल कोशिकाओं में व्यक्त प्रोटीन की उपस्थिति का पता लगाने के लिए 30 दिन पुराने हेसेक- या आईपीएसएससी व्युत्पन्न क्षेत्रों को स्थिर, अनुभागित और दागित किया गया था। हेपाटोसाइट नाभिकीय कारक 4 अल्फा (HNF4]) और मेसेनकाइमल मार्कर विमेनटिन कार्यरत थे, जो मेसेन्काइमल कोशिकाओं के एक कोर के आसपास की कोशिकाओं की तरह हेपेटोसाइट से बना एक बाहरी परत की उपस्थिति का खुलासा करते थे (चित्र 2)। हम इन प्रयोगों का पालन hepatocytes में व्यक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण: एल्बुमिन, CYP3A और ई-cadherin. रोग-प्रतिरक्षण से पता चला कि इन प्रोटीनों की अभिव्यक्ति गोले की बाहरी परत तक सीमित थी (चित्र 3)।

hepatospheres के कार्यात्मक विश्लेषण दिन 30 संस्कृतियों में प्रदर्शन किया गया. CYP1A2 और CYP3A कार्यात्मक hepatocytes के भीतर महत्वपूर्ण एंजाइमों रहे हैं. उनकी गतिविधि स्थापित परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. H9-derived hepatospheres 220,375 की CYP3A गतिविधि का प्रदर्शन किया - 74514 RLU/mL/mg प्रोटीन और CYP1A2 गतिविधि 732,440 - 33,330 RLU/mL/mg प्रोटीन (चित्र 4) की गतिविधि. P106 व्युत्पन्न hepatospheres में CYP3A गतिविधि 132117 था - 43,391 RLU/mL/mg प्रोटीन और CYP1A2 गतिविधि 409,907 था 121,723 RLU/mL/mg प्रोटीन (चित्रा 4बी) था. जब मानव प्राथमिक hepatocytes के दो बैचों के साथ तुलना में, 3 डी जिगर क्षेत्रों CYP गतिविधि10के सम्मानजनक स्तर प्रदर्शित किया.

एल्बुमिन और अल्फा-फेटोप्रोटीन (एएफपी) के संश्लेषण और स्राव के विश्लेषण से पता चला है कि एच 9 व्युत्पन्न हेपैटोस्फीयर्स 683.9 - 84 और 159 - 20 एनजी/एमएल/24 एच/एमजी प्रोटीन एल्बुमिन और अल्फा-फेटोप्रोटीन का क्रमशः (चित्र 5) स्रावित हुआ। जबकि P106-व्युत्पन्न hepatospheres स्रावित 497 - 41 और 756 - 24 ng/m/24 h/mg प्रोटीन के एल्बुमिन और अल्फा-फीटोप्रोटीन, क्रमशः (चित्र 5बी)।

Figure 1
चित्र 1 : चरणवार भेदभाव प्रक्रिया hESCs से 3 डी hepatospheres उत्पन्न करने के लिए। ब्लू कोष्ठक hiPSCs के लिए भेदभाव के दिनों का प्रतिनिधित्व करते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : 3 डी hepatospheres के संरचनात्मक पुनर्गठन. हेपैटोसाइट परमाणु कारक की अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि छवियों 4 अल्फा (HNF4 $ -हरे) और vimentin (लाल) में (ए ) H9 व्युत्पन्न 3 डी hepatospheres और (बी) P106 व्युत्पन्न 3 डी hepatospheres और उनके इसी इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) नियंत्रण . स्केल बार 60 डिग्री मीटर का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : 3 डी hepatospheres में यकृत मार्कर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन. hepatocyte मार्करों की अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि छवियों - Albumin, CYP3A, ई-cadherin और उनके इसी IGG नियंत्रण में(ए) H9- और (बी) P106 व्युत्पन्न 3 डी hepatospheres. स्केल बार ] 60 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : 3 डी hepatospheres में Cytochrome P450 समारोह. साइटोक्रोम P450 1A2 और 3A गतिविधि में () H9 व्युत्पन्न 3 डी hepatospheres और (बी) P106 व्युत्पन्न 3 डी hepatospheres के मापन. डेटा तीन जैविक प्रतिकृतियां का माध्य का प्रतिनिधित्व करता है, और त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं. क्रियाकलाप को सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरएलयू) प्रति एमएल प्रोटीन के रूप में उद्धृत किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : hepatosphere प्रोटीन स्राव का विश्लेषण. एल्बुमिन और अल्फा-फेटोप्रोटीन (एएफपी) के स्राव काविश्लेषण (ए ) एच 9 व्युत्पन्न 3 डी हेपेटोस्फीयर्स और (बी ) पी 106 व्युत्पन्न 3 डी हेपेटोस्फियाल्स में किया गया था। डेटा तीन जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधि है, और त्रुटि सलाखों एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं गुप्त प्रोटीन प्रति एमएल प्रोटीन के नैनोग्राम के रूप में उद्धृत किया गया है 24 प्रति मिलीग्राम प्रोटीन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

3 डी में मानव hepatospheres का उत्पादन करने के लिए परिभाषित और विदेशी मुक्त प्रणालियों के विकास दोनों इन विट्रो में और विवो प्रयासों के लिए आवश्यक है। वर्तमान में मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से सबसे hepatocyte भेदभाव दृष्टिकोण दो आयामी अनुयायियों संस्कृतियों में प्रदर्शन कर रहे हैं. इन वातावरण ऊतक उत्पत्ति और homeostasis जो शामिल में शामिल पर्यावरण संकेतों के कई कमी; विषमप्ररूपी कोशिका अन्योन्यक्रिया, मैट्रिक्स उत्पादन और पुन: तैयार करना,जिसके परिणामस्वरूप विवो जीव विज्ञान 18,19में खराब अनुवाद होता है।

एक परिणाम के रूप में, अनुसंधान वैकल्पिक दृष्टिकोण पर ध्यान केंद्रित किया है pluripotent स्टेम कोशिकाओं से hepatospheres उत्पन्न करने के लिए. 3 डी अध्ययन के एक नंबर क्षेत्र उन्नत है, लेकिन उन पशु उत्पादों पर निर्भर कर रहे हैं 20,22,24 सहायता प्रदान करने के लिए और / प्रौद्योगिकी पैमाने पर अप और समझौता प्रयोगात्मक reproducibility और आवेदन.

हमारे लेख में वर्णित प्रक्रिया (चित्र 1) परिभाषित किया गया है, कुशल, अत्यधिक reproditible और लागत प्रभावी, कार्यात्मक जिगर क्षेत्रों के उत्पादन की अनुमति है, जो इन विट्रो में एक वर्ष से अधिक कार्यात्मक रहते हैं और में महत्वपूर्ण जिगर का समर्थन प्रदान विवो14| महत्वपूर्ण बात, इस मंच उपयोगकर्ता 3 डी जिगर क्षेत्रों के आकार को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है, घने नेक्रोटिक केन्द्रों के गठन और phenotype के नुकसान को सीमित.

पाली हेमा लेपित प्लेटों के लिए 3 डी hepatospheres के हस्तांतरण इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है. क्षेत्र को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए प्रक्रिया में इस स्तर पर धीरे से पिपेट करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, मीडिया परिवर्तन ध्यान से कतरनी तनाव और क्षेत्र संरचना के विरूपण से बचने के लिए किया जाना चाहिए.

इन अध्ययनों में, 3D hepatospheres एक संगठित संरचना प्रदर्शित (चित्र 2 और चित्र 3), साइटोक्रोम P450 समारोह ( चित्र4) और स्रावित जिगर प्रोटीन, एल्बुमिन और अल्फा-फेटोप्रोटीन सहित (चित्र 5) . इस प्रक्रिया को सफलतापूर्वक तुलनीय परिणामों के साथ चार pluripotent स्टेम सेल लाइनों में किया गया है. आगे देखते हुए, इस तकनीक को जटिल आर्किटेक्चर के साथ आगे एंडोडर्मल और मेसेन्काइमल ऊतकों को विकसित करने के लिए एक मंच के रूप में नियोजित किया जा सकता है।

Disclosures

डेविड सी हे एक सह संस्थापक और स्टेमनोवाट लिमिटेड और HigherSteaks लिमिटेड के शेयरधारक है. बाकी लेखक प्रमाणित करते हैं कि इस लेख में चर्चा की गई विषय या सामग्री में उनकी रुचि का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को यूके पुनर्योजी चिकित्सा प्लेटफार्म (एमआरसी एमआर/L022974/1) और मुख्य वैज्ञानिक कार्यालय (टीसीएस/16/37) से पुरस्कारों के साथ समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture and functional assays
Agarose Fisher Bioreagents 10766834
B27 supplement  Life Technologies  12587-010
beta-mercaptoethanol Life Technologies  31350
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich  A2058 
DAPI  Invitrogen D1306
DMSO  Sigma-Aldrich  D5879
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher  14190250
DPBS with Calcium and Magnesium ThermoFisher  14040133
Gentle cell dissociation reagent STEMCELL Technologies  7174
GlutaMax  Life Technologies  35050
HepatoZYME-SFM Life Technologies    17705021
Human Activin A  Peprotech  120-14E
Human Alpha Fetoprotein ELISA Alpha Diagnostics 500
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor Peprotech  100-18B
Human Epithelial Gropwth Factor Peprotech  236-EG
Human Hepatocyte Growth Factor Peprotech  100-39
Human Oncostatin M  Peprotech  300-10
Human Recombinant Laminin 521  BioLamina  LN521-02
Human Serum Albumin ELISA Alpha Diagnostics 1190
Human Vascular Growth Factor Bio-techne 293-VE
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich  H4881
Knockout DMEM  Life Technologies  10829
Knockout Serum Replacement  Life Technologies  10828
Micro-mold spheroids  Sigma-Aldrich  Z764000
mTeSR1 medium  STEMCELL Technologies  5850
Non-essential amino acids  Life Technologies  11140
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System Promega V8771
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System Promega V8801
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life Technologies  15140122
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate)  Sigma-Aldrich  P3932
Recombinant mouse Wnt3a  Bio-techne 1324-WN-500/CF
RPMI 1640  Life Technologies  21875
Equipment
Microwave Bosch
Microtome Leika RM2125RT
Oven Thermoscientific
Antibodies
Primary antibodies
Albumin  Sigma-Aldrich  A6684  1:100 (mouse)
CYP3A4 University of Dundee University of Dundee 1:200 (sheep)
E-cadherin Abcam ab76055 1:200 (mouse)
HNF-4α Santa Cruz sc-8987 1:100 (rabbit)
IgG DAKO X0943 1:400
Vimentin DAKO M0725 1:100 (sheep)

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References

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प्लरिपॉवर स्टेम सेल से तीन आयामी मानव Hepatospheres के सीरम मुक्त उत्पादन
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Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O'Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).More

Lucendo-Villarin, B., Rashidi, H., Alhaque, S., Fischer, L., Meseguer-Ripolles, J., Wang, Y., O'Farrelly, C., Themis, M., Hay, D. C. Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (149), e59965, doi:10.3791/59965 (2019).

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