Neuroscience

评估由三角刺激引起的由Locus Coeruleus介导的觉醒中与学生相关的变化

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/59970

Maria Paola Tramonti Fantozzi*¹, Tommaso Banfi*^2,3, Vincenzo De Cicco*¹, Massimo Barresi⁴, Enrico Cataldo⁵, Davide De Cicco¹, Luca Bruschini⁶, Paola d'Ascanio¹, Gastone Ciuti^2,3, Ugo Faraguna^1,7, Diego Manzoni¹

¹Department of Translational Research and of New Surgical and Medical Technologies, University of Pisa, ²The BioRobotics Institute, Scuola Superiore Sant'Anna, ³Department of Excellence in Robotics & AI, Scuola Superiore Sant'Anna, ⁴Institut des Maladie Neurodegeneratives, University of Bordeaux, ⁵Department of Physics, University of Pisa, ⁶Department of Surgical, Medical, Molecular Pathology and Critical Care Medicine, University of Pisa, ⁷Department of Developmental Neuroscience, IRCCS Foundation Stella Maris

* These authors contributed equally

Summary

为了验证三元对认知表现的影响是否涉及位点性球菌活动，提出了两个协议，旨在评估咀嚼引起的性能和与任务相关的学生大小变化之间的可能相关性。这些协议可应用于怀疑原点贡献的条件。

Abstract

目前的科学文献提供了证据，证明与咀嚼相关的三叉体感觉运动活动可能会影响觉醒、注意力和认知表现。这些影响可能是由于三叉星系统与上升性视网膜激活系统（ARAS）的广泛连接，而基拉图（LC）的角质神经元属于这个系统。LC神经元包含对整个大脑的投影，并且已知它们的放电随学生大小共同变化。LC 激活对于引发与任务相关的突起体炎是必要的。如果咀嚼对认知性能的影响由LC调节，那么有理由期望认知性能的变化与任务相关突起系统的变化相关。这里提出了两种新颖的协议来验证这一假设，并证明咀嚼效果不能归因于特定的运动激活。在这两种协议中，在特定任务期间观察到的性能和学生大小变化都会在 2 分钟之后记录在 2 分钟之后和半小时内记录：a）无活动、b）有节奏、双边握把、c）双边咀嚼软颗粒和 d）双边咀嚼硬颗粒。第一个协议测量在数字矩阵中显示的目标数字的识别性能级别。由于学生大小记录由适当的学生表记录，该测速仪会妨碍视力以确保恒定的照明水平，因此在触觉任务期间会评估与任务相关的霉菌病。该协议的结果表明，1）咀嚼引起的性能和任务相关的突起病的变化是相关的，2）性能和突动都不能通过手柄增强。在第二个协议中，使用可穿戴的孔径计可以测量同一任务期间的学生大小变化和性能，从而获得关于LC参与认知活动三元效应的更有力的证据。这两种协议都运行在比萨大学ARAS的发现者朱塞佩·莫鲁齐教授的历史办公室。

Introduction

在人类中，众所周知，咀嚼会加速认知^{处理1，2，}并改善^{觉醒3，4，}^注意5，学习和^{记忆6，7。}这些影响与缩短皮质事件相关电^位8的延迟和增加几个皮质和皮下^结构2，9的灌注增加有关。

在颅神经内，最相关的信息维持皮质去同步和唤醒是由三叉^纤维10携带，可能是由于强烈的三叉线连接到上升的视网膜激活系统（ARAS）11 。在ARAS结构中，球位（LC）接收三元位^输入11，调制^{唤醒12，13，}其活动与学生大小14，15，16，17，18。虽然LC休息活动与认知表现之间的关系是复杂的，但与任务相关的LC活动的增强导致觉醒^相关的19名学生心肌^炎20和增强认知^性能21。LC活动与学生大小之间存在可靠的共性差异，后者目前被认为是22、23、24、25、26的中央诺瑞纳活性的代理。

传感器运动三叉叶分支的不对称激活诱导学生不对称（双子^{座）27，28，}确认三角-科鲁里亚连接的强度。如果LC参与咀嚼对认知表现的刺激作用，它可能会影响平行的任务相关的突起症，这是在任务期间LC相发生数激活的指标。它还可能影响性能，因此，咀嚼引起的性能变化与支数症之间存在相关性。此外，如果三叉体效应是特定的，咀嚼效果应该大于那些由另一个有节奏的运动任务引起的。为了检验这些假设，特此提出了两个实验方案。它们基于认知表现和学生大小的综合测量，在短暂的咀嚼活动前后进行。这些协议利用一个测试，包括查找数字关注^矩阵29中显示的目标数，以及非目标数字。此测试验证专注和认知性能。

这些协议的总体目标是说明三元刺激会引起认知性能的具体变化，这不能具体归因于电机命令的生成，并且与LC介导的与学生相关的变化有关觉醒。该协议的应用扩展到所有行为条件，其中可以测量性能，并怀疑 LC 的参与。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

所有步骤都遵循比萨大学道德委员会的指导方针。

1. 参与者招聘

根据研究的具体目标（即正常受试者和/或患者、男性和/或女性、年轻人和/或老年人）招募受试者群体。

2. 材料准备

准备软颗粒;使用市售口香糖（材料表;初始硬度=20肖氏OO）。
准备硬颗粒;使用硅橡胶颗粒（材料表;恒定硬度= 60肖氏OO）³⁰。
为抓手任务准备一个抗应力球。使用聚氨酯泡沫制成的球（材料表;恒定硬度=30肖氏OO30）³⁰。
准备一个唐拉姆拼图（材料表;件数=七），用于执行触觉任务。

3. 实验流程图

协议 1 的流程图
1. 评估认知（矩阵）测试中的基线性能（参见第 4.1 节）。
2. 评估静止的学生大小（见第 4.2 节）（没有要求受试者的活动）（T0，控制）。
3. 基于唐拉姆（T0，控制）在触觉任务期间评估学生大小。
  1. 从拼图中取出其中一块，并将其放在受试者的手中。
  2. 要求受试者将作品放回拼图中，而不看拼图。
4. 根据步骤 3.1.4.1-3.1.4.4，要求每个受试者进行三项特定活动 2 分钟或休息 2 分钟。要求受试者在不同日期（课间2~3天）的单独会话中执行这些活动。
  1. 要求受试者咀嚼自管软颗粒2分钟，让他/她自发地选择咀嚼速率和嘴边咀嚼。咀嚼1分钟后，要求他/她改变咀嚼面（和颗粒）。
  2. 要求受试者咀嚼自我管理的硬颗粒2分钟。1分钟后，要求他/她改变咀嚼面（但不是颗粒）。
  3. 要求受试者根据自己选择的速度和手部进行2分钟的抗压力球（握把运动）的有节奏挤压。1分钟后，让受试者换手。
  4. 要求受试者休息2分钟（无活动）。
5. 在每个步骤（3.1.4.1~3.1.4.4）结束后，评估矩阵测试中的表现以及静止和触觉任务（T7）中的学生大小。
  注：术语"休息"意味着在学生大小测量期间，受试者是放松的。术语"触觉任务期间"是指在学生尺寸测量期间，受试者正在执行基于 tangram 的任务。
6. 每步结束 30 分钟（3.1.4.1~3.1.4.4），在休息和触觉任务（T37）期间评估性能和学生大小。
协议 2 的流程图
1. 在受试者休息时评估学生大小（T0，控制;见第4.3节）。
2. 评估认知（矩阵）测试中的基线性能，同时测试学生大小（T0，控制）。
3. 根据步骤 3.2.3.1~3.2.3.4，要求每个受试者进行三项特定活动 2 分钟或休息 2 分钟。要求受试者在不同日期（课间2~3天）的单独会话中执行这些活动。
  1. 要求受试者咀嚼自管软颗粒2分钟，让他/她自发地选择咀嚼速率和嘴边咀嚼。咀嚼1分钟后，要求他/她改变咀嚼面（和颗粒）。
  2. 要求受试者咀嚼自我管理的硬颗粒2分钟。1分钟后，要求他/她改变咀嚼面（但不是颗粒）。
  3. 要求受试者在速率和自己选择的一侧进行2分钟的抗压力球（握把运动）的有节奏挤压。1分钟后，让受试者换手。
  4. 要求受试者放松（不活动）2分钟。
4. 在每个步骤（步骤 3.2.3.1~3.2.3.4）之后，在矩阵测试（T7）中评估学生在休息时的大小以及成绩和学生大小。
5. 每步结束后三十分钟（步骤 3.2.3.1~3.2.3.4），在矩阵测试（T37）中评估学生在休息时的大小以及成绩和学生大小。

4. 议定书1和2中的测量变量

认知性能
注：在这两个协议1和2中，使用基于改进版本的Spinnler-Tognoni数值矩阵^测试29的测试来测量认知性能。
1. 显示三个数字矩阵（10 x 10）打印在纸上的主题。然后，要求受试者按顺序扫描矩阵线，同时在 15 秒内用铅笔勾选尽可能多的目标数字（300 个显示的总显示数字中的 60 个目标）（图 1）。
2. 利用T0、T7和T37目标数不同位置的矩阵，避免引入与学习过程相关的混淆。
3. 离线评估性能指数（PI）、扫描率（SR）和错误率（ER），如下所示：PI = （目标数字在 15 s/15 中加下划线）;SR = （目标 + 15 秒扫描的非目标号码）/15;ER = （未命中的目标数 = 15 s 中带下划线的非目标数）/15。
协议 1 中的学生大小
1. 使用角膜表-学生技师（材料表）为学生尺寸测量准备主题，该表使用以下两个采集程序之一，防止对环境的视觉。
  1. 记录学生的单张相机拍摄（图2A，B），持续照明水平为40勒克斯，按下角膜图谱仪-学生技师上的特定按钮。摄像机与学生之间的最佳工作距离为 56 mm。
    注：单个测量就足够了，因为在恒定照明下测量的孔径的变异性较低。
  2. 对学生进行连续记录（采样速率 = 5 Hz;图2C，D）中的连续采集方式。放弃前 20-50 次测量（4⁄10 s），因为在此时间推移期间，孔径在增大（采集从以 40 勒克斯关闭孔照明开始）。对剩余测量值进行平均。
2. 在休息时分别记录左眼和右眼的孔径（步骤 3.1.2、3.1.5 和 3.1.6）。
3. 在触觉任务（步骤 3.1.3、3.1.5 和 3.1.6;左侧和右侧）期间记录学生大小。当使用单拍摄模式（步骤 4.2.1.1）时，在两个任务重复的第二次拍摄期间，在拼图表面探索开始时获取照片。在连续录制模式下（步骤 4.2.1.2），当拼图部分被放置到主体手中时，开始采集。
4. 通过直接获取软件显示的值（以毫米为单位），在静止和触觉任务期间评估脱机左孔和右孔大小。通过在触觉任务期间从学生大小中减去静止的小学生大小来计算与任务相关的霉菌病，并获取所有平均左-右值。
协议 2 中的学生大小
1. 使用可穿戴的孔径计/眼动仪（图3A），使用以下步骤，为学生尺寸测量准备受试者。
  1. 让受试者佩戴可穿戴的孔表。调整两个红外摄像机（图3A-2，3）的位置，安装在从框架（材料表）产生的杆上，使眼睛在摄像机的视野内和对焦。
  2. 获取学生的图像（采样率 = 120 Hz），这些图像由可穿戴学生仪随附的软件在线处理，并使用"平均"人眼的几何模型提供小孔直径（以毫米为单位）。忽略闪烁伪影。
  3. 使用安装在可穿戴孔表框架上的校准对数光传感器持续记录环境照明水平。使用安装在可穿戴孔径计上的正面 RGB 摄像机（图 3A-1）来记录用于研究注视行为的主题视场（采样率 = 30 Hz）。
2. 同时记录两个学生在休息时的大小20s（图3B）。
3. 记录学生的大小，而主题执行斯平勒-托格诺尼测试，以便同时记录学生规模和认知表现（步骤 3.2.2、3.2.4 和 3.2.5）。
4. 通过平均每个学生平均获取值（n = 2，400），在静止和 Spinnler-Tognoni 测试期间，通过计算脱机左和右学生大小。通过在矩阵测试期间从学生大小中减去静止的小学生大小，然后减去所有平均左-右值，计算与任务相关的突起病。
凝视位置
注：使用从第 4.3 节中获取的两个学生的图像在线重建固定点。实时处理采集的帧，并使用先前计算的传输函数³¹估计注视点，每个受试者佩戴眼动仪。
1. 如有必要，在执行协议 2 时，从学生图像重建注视位置。为此，在第 4.1 节中使用的矩阵表的四个角中添加四个计算机可检测视觉标记（ArUco 或仪器软件的 AprilTag 库）。
2. 允许校准系统（嵌入在眼动仪软件中，以及所使用的学生耳机中）获取数据，并评估映射固定点的传输功能的参数，从两个学生的图像开始。例如，请受试者凝视其视野中显示的预定义点序列（即矩阵表的四个角和工作表本身的中心），这些点由安装在框架上并面向视场的附加 RGB 摄像机同时记录。
3. 在矩阵测试期间记录学生大小。
4. 计算在主体视野的每个帧上显示为标记的离线注视位置。使用四个标记跟踪跨帧矩阵上的凝视位置。

5. 统计分析

使用重复措施ANOVA和统计软件包，在四种条件下（无活性、手柄、软颗粒、硬颗粒）三次（T0、T7、T37）分析学生在休息时和任务期间的大小、任务诱发的突生、PI、SR 和 ER。
使用重复措施 ANOVA，分析四个条件下（无活性、手柄、软颗粒、硬颗粒）两次（T7、T37）的变量变化。
运行方差分析时，如果软件指示数据分布不是球形的，则从输出的统计表中获取与温室-Geisser 对应的 p 值。
将 T7 和 T37 的性能变化（PI、SR、ER）与通过线性回归分析观察到的与任务相关的突起体发生的变化相关联。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

图 4显示了将协议 1 应用于单个主体（46 岁，女性）时获得的结果的代表性示例。PI 在咀嚼（T7）后很快增加（从 1.73 麻木/s 到 2.27 麻木/s）和软颗粒（从 1.67 麻木/s 到 1.87 麻木/s）（图 4A）。然而，30分钟后（T37），增加的性能只坚持硬颗粒。另一方面，缺乏活动和握把运动对性能有负面影响，从1.73麻木/秒下降到1.67麻木/秒，从1.6麻木/秒下降到1.53麻木/秒，在上次实验评估中，30分钟后出现恢复趋势。

如图4B所示，观察到与任务有关的突起体发生质相似的变化。在这种情况下，测量包括当受试者休息时随机采集的单个样本。在触觉任务中，记录了两个样本，但第一个样本被丢弃。或者，在仪器的连续采集模式下，在20秒内记录了100个样本，而前20-50个测量值被忽略，其余在去除眨眼伪像后平均（图2C，D）。个别样本密切反映平均值，因为在关闭眼睛照明后，学生大小达到非常稳定的4~10级（图2C，D）。图4和图5所示的数据在30个受试者中被复制，咀嚼和握把引起的变化都得到统计证实。另一方面，当受试者不参与任何活动时，在T7和T37的认知表现和突韦德里^沙30没有改变。

尽管以下事实表明，1）性能和支路炎记录在不同的任务中，2）图 5A，B中所示的 12 个实验点记录在 4 个单独的日期，但值得注意的是，在性能与任务相关的支路症之间观察到了很强的相关性（r = 0.939，p & 0.0005，y = 1.166x - 0.417）。从图5A中可以推断，这种关系是由于咀嚼硬颗粒和软颗粒引起的修改。更令人惊讶的是，在考虑与基线值相关的相应变化时，相关性也很明显（r = 0.924，p < 0.001，y = 1.210x = 0.101;图 5B.

在Tramonti Fantozzi^等人30的研究分析的30个受试者中，PI和mydriasiss在其中26个显著相关，相应回归线的斜率在0.310~1.327麻木/s/mm之间。22个受试者（坡度范围：0.390~1.408）的相应变化显著相关。

通过将PI的咀嚼引起的变化与仅在执行基质测试期间观察到的肌肉病变化联系起来，可以获得LC参与咀嚼对认知性能刺激作用的更有力的证据。这可以在协议2的更自然条件下实现，在协议2中，受试者在同时记录学生大小时进行矩阵测试（图6）。

图1：斯宾德勒-托格诺尼数值矩阵示例。测试包括识别每个矩阵上方指示的目标编号，这些数字已由受试者勾选。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2：协议 1 中单个主题的小学生大小记录示例。（A）记录学生在休息时的大小，单枪。（B）记录触觉任务、单次拍摄期间的学生大小。（C）连续记录20s的静止学生大小.（D）连续记录20s的触觉任务期间的学生大小。箭头表示有闪烁的文物。在（C）和（D）中，从分析中丢弃从时间 0 到时间 4 s 的数据。请点击此处查看此图的较大版本。

图 3：协议 2 中的学生大小记录示例。（A）穿着学生仪的受试者的照片.数字 1_3 表示三个摄像机的位置，允许行为（1）和学生大小（2-3）录制。（B）顶部跟踪：环境变亮的水平.中和下轨迹：在性能的斯宾德勒-托格诺尼矩阵测试期间左和右孔大小。请点击此处查看此图的较大版本。

图4：协议1中不同传感器运动活动引起的性能和任务相关突起病的变化。（A） PI 中的更改。（B）与任务有关的突起炎的变化.在（A）和（B）中，点、黑色方块、圆形和白色方块分别表示与咀嚼硬颗粒、咀嚼软颗粒、手柄和无活动相关的数据。每项活动共进行了2分钟，从时间5分钟到7分钟。请点击此处查看此图的较大版本。

图5：PI与任务相关的突起关系。（A）在图 4所示的不同活动期间在不同时间获得的 PI 值被绘制为与任务相关的突起的相应值的函数。（B）与 T0 相关的 PI 变化（评估为差异）已绘制为与任务相关的突起炎中相应变化的函数。在（A）和（B）中，点、黑方块、圆形和白色方块分别表示与咀嚼硬颗粒、咀嚼软颗粒、手柄和无活动相关的数据。虚线是所有数据点的回归线。请点击此处查看此图的较大版本。

图6：同时记录性能和与任务相关的突起。执行周到矩阵测试的受试者的单帧视图，取自安装在学生仪帧上的摄像头。右上角的内写显示两个学生同时的图像。绿色圆圈表示固定点。污点和圆圈淹没在学生身上是学生中心和轮廓，由跟踪系统对眼睛的视频进行评估。请点击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

本研究提出的方案涉及感觉运动三叉体活动对认知性能的急性影响以及LC在这一过程中的作用。这个话题有一定的相关性，考虑到1）在老化期间，咀嚼活性的恶化与认知衰减32，33，34;维护口腔健康的人不太容易出现神经退行性现象;2）闭塞和牙齿提取诱导神经退行性作用在动物在海马和皮质^水平35，^36，^37，^38，^39;3） LC对大脑施加营养作用，调节神经血管耦合，抑制神经炎症和β-淀粉样^{蛋白11、40}的积累;4）有证据表明，神经退行性疾病可以触发神经退行性过程在LC^{级11，40。}

协议1允许定义咀嚼对a）学习过程的具体影响，这些学习过程由连续重复的任务引起，b）其他类型的普通运动活动。此外，它确定性能变化与支路菌群之间是否存在相关性，后者被视为任务期间方正LC激活的指标。这一证据强烈表明，LC参与传感器运动三叉体激活的影响。特拉蒙蒂·范托齐^等人30日成功地应用了这一协议。如结果部分所示，它也可以用来评估表现对学生变化的依赖程度，这些变化与个别受试者的LC介导的觉醒有关。获得此测量（性能/LC激活）代表一个新的和重要的神经心理学变量，可以研究与性别，年龄，药物管理，和任何行为状况相关。

协议1的主要局限性是，在恒定变亮时进行学生大小测量，阻碍视力，并排除在矩阵扫描过程中引出的肌肉病的评估。这要求在不同的任务期间记录支突炎。此问题通过执行协议 2 得到解决，其中引入了带有光传感器的可穿戴孔表。通过这种方式，可以在同一任务中记录认知性能和突起病，为感觉运动活动对LC和性能的影响提供更令人信服的证据。这也有助于解决旨在将LC激活与行为状况相关的研究。为了正确应用协议2，必须注意保持恒定的环境照明水平和可穿戴仪器的初步校准。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了比萨大学的资助。我们感谢保罗·奥尔西尼先生、弗朗切斯科·蒙塔纳里先生和克里斯蒂娜·普奇夫人的宝贵技术援助，并感谢国际投资公司S.R.R.L.公司为玛丽亚·保拉·特拉蒙蒂·范托齐博士提供奖学金。最后，我们感谢 OCM 项目公司准备硬颗粒并执行硬度和弹簧恒定测量。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-stress ball	Artengo, Decathlon, France	TB600
Chewing gum	Vigorsol, Perfetti, Italy	Commercially available product
Infrared Camera-Wearable pupillometer	Pupil Labs, Berlin, Germany	Pupil Labs headset
Pupillographer	CSO, Florence, Italy	MOD i02, with chin support
Silicon rubber	Prochima, Italy	gls50
Software for pupil detection - wearable pupillometer	Pupil Labs, Berlin, Germany	Pupil Labs headset
Tangram Puzzle	Città del Sole srl, Milano, Italy	Tangram Puzzle
Wearable pupillometer	Pupil Labs, Berlin, Germany	Pupil labs model	Dimension of the frame: 13.5 cm x 15.5 cm