Summary
Parasponia andersonii är ett snabbväxande tropiskt träd som tillhör cannabis familjen (Cannabaceae) och kan bilda kvävefixerande rotknölar i samband med Rhizobium. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för omvänd genetiska analyser i P. andersonii baserat på Agrobacterium tumefaciens-medierad stabil transformation och CRISPR/Cas9-baserad genom redigering.
Abstract
Parasponia andersonii är ett snabbväxande tropiskt träd som tillhör cannabis familjen (Cannabaceae). Tillsammans med 4 ytterligare arter, det utgör den enda kända icke-balen härstamning kunna etablera en kvävefixerande knöl symbios med Rhizobium. Jämförande studier mellan baljväxter och P. andersonii kan ge värdefull insikt i de genetiska nätverk underliggande rot knöl bildas. För att underlätta jämförande studier, sekvenserade vi nyligen P. andersonii genom och etablerade Agrobacterium tumefaciens-medierad stabil transformation och CRISPR/Cas9-baserad genom redigering. Här ger vi en detaljerad beskrivning av omvandling och genomredigering förfaranden som utvecklats för P. andersonii. Dessutom beskriver vi procedurer för utsäde grobarhet och karakterisering av symbiotiska fenotyper. Med hjälp av detta protokoll kan stabila transgena muterade linjer genereras under en period av 2-3 månader. Vegetativt in vitro-spridning av T0 transgena linjer gör det möjligt att inleda fenotypnings experiment vid 4 månader efter en. tumefaciens samodling. Därför tar detta protokoll bara marginellt längre än den övergående Agrobacterium rhizogenes-baserade rotomvandlings metod tillgänglig för P. andersonii, men erbjuder flera tydliga fördelar. Tillsammans, de förfaranden som beskrivs här tillåter P. andersonii att användas som en forskningsmodell för studier som syftar till att förstå symbiotiska föreningar samt potentiellt andra aspekter av biologi i detta tropiska träd.
Introduction
Parasponia andersonii är ett tropiskt träd tillhörande cannabis familjen (Cannabaceae) och är infödd till Papua Nya Guinea och flera Stillahavsöarna1,2,3. Tillsammans med 4 ytterligare Parasponia arter, den representerar den enda icke-balanser härstamning som kan etablera en kvävefixerande knöl symbios med Rhizobia. Denna symbios är väl studerat i baljväxter (Fabaceae) modeller Medicago minor och Lotus japonicus, vilket har resulterat i att förvärva detaljerad kunskap om den molekylära genetiska karaktären av knöl bildas och fungerande4. Dessutom, det visades att roten knöl symbios i baljväxter grundas på mycket äldre, och utbredd arbuskulära bildar mykorrhiza symbios5. Phylogenomic jämförelser tyder på att kvävefixerande knöl symbioser av baljväxter, Parasponia, liksom, den så kallade actinorhizal växtarter som värd diazotrofiska frankia bakterier, har en gemensam evolutionära ursprung 6,7,8. För att avgöra om de gener som identifierats vara inblandade i balannodule bildas är en del av en bevarad genetisk grund, studier på icke-balanväxter arter är viktiga. För detta ändamål föreslår vi att använda P. andersonii som en jämförande forskningsmodell, tillsammans med baljväxter, för att identifiera de centrala genetiska nätverk underliggande rot knöl bildas och fungerar.
P. andersonii är en pionjär som finns på sluttningarna av vulkaniska kullar. Den kan möta tillväxthastigheter på 45 cm per månad och nå längder på upp till 10 meter9. P. andersonii träd är vind-pollineras, som underlättas av bildandet av separata manliga och kvinnliga blommor3,10. Vi sekvenserade nyligen och kommenterade diploida arvsmassan (2n = 20; 560 MB/1C) av P. andersonii, och monterade utkast till genomsekvenser av ytterligare två parasponia -arter; P. rigida och p. rugosa6. Detta avslöjade ~ 35 000 P. andersonii gen modeller som kan klustras i > 20000 ortogrupper tillsammans med gener från M. minor, sojabönor (Glycine max), Arabidopsis thaliana, Woodland Strawberry ( Fragaria smultron), trema orientalis, svart bomull poppel (Populus trichocarpa) och eucalypt (Eucalyptus grandis)6. Dessutom, transkriptome jämförelser mellan M. minor och P. andersonii identifierade en uppsättning 290 förmodade orthologues som visar en nodule-förstärkt uttryck mönster i båda arterna6. Detta ger en utmärkt resurs för jämförande studier.
För att studera gen funktionen i P. andersonii rötter och noduli, ett protokoll för Agrobacterium rhizogenes-medierad rot omvandling har upprättats11. Med hjälp av detta protokoll, sammansatta växter som bär transgena rötter kan genereras i en relativt kort tidsram. Denna metod är, också, allmänt tillämpas i balen-symbios forskning12,13,14. Nackdelen med denna metod är dock att endast rötter omvandlas och att varje transgen rot representerar en oberoende transformationshändelse, vilket resulterar i betydande variation. Omvandlingen är också övergående och transgena linjer kan inte upprätthållas. Detta gör en. rhizogenes-baserad rot omvandling mindre LÄMPAD för CRISPR/Cas9-medierad genom redigering. Dessutom, A. rhizogenes överför sin rot inducerande Locus (ROL) gener till växtgenomet, som en gång uttryckte störa hormon homeostas15. Detta gör att studera rollen av växthormoner i A. rhizogenes-transformerade rötter utmanande. För att övervinna dessa begränsningar, vi nyligen utvecklat ett protokoll för Agrobacterium tumefaciens-baserad omvandling och CRISPR/Cas9-medierad mutesis av P. andersonii10.
Här ger vi en detaljerad beskrivning av a. tumefaciens-baserade omvandlings procedur och omvänd genetik pipeline utvecklad för P. andersonii. Dessutom tillhandahåller vi protokoll för nedströms hantering av transgena plantlets, inklusive analyser för att studera symbiotiska interaktioner. Med hjälp av protokollet som beskrivs här, kan flera transgena linjer genereras i en 2-3 månaders period. I kombination med CRISPR/Cas9-medierad mutagenes, detta möjliggör effektiv generering av knockout Mutant linjer. Dessa Mutant linjer kan vegetativt förökas in vitro-10,16,17, vilket gör att tillräckligt material som skall genereras för att starta fenotypisk karakterisering vid 4 månader efter omvandlingsförfarandet har inletts10. Tillsammans, denna uppsättning förfaranden bör tillåta varje labb att anta P. andersonii som en forskningsmodell för studier som syftar till att förstå rhizobial och bildar mykorrhiza föreningar, samt potentiellt andra aspekter av biologi i denna tropiska träd.
Protocol
1. Grow P. andersonii träd i växthuset
-
Germinate P. andersonii WU1 frön18.
- Använd färska Parasponia bär eller Blötlägg torkade bär i vatten för 2 h att rehydrera. Squash bär på en bit av silkespapper eller gnugga mot insidan av en te SIL att ta bort fröna.
- Desinficera frön med hjälp av kommersiella blekmedel (~ 4% hypoklorit) för 15-20 min och därefter tvätta fröna 6 gånger med hjälp av steriliserat vatten.
- Överför fröna till sterila 200 μL PCR-rör. Fyll rören med steriliserat vatten, så att fröna är helt nedsänkt. Inkubera rören i 10 dagar i en termocycler som kör följande program: 30 cykler (7 ° c för 4 h, 28 ° c för 4 h). Använd inte ett uppvärmt lock, eftersom detta kan döda frön.
- Förbered SH-0-plattorna (se tabell 1). Överför fröna till SH-0 tallrikar och inkubera vid 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt. Stäng plattorna med 2 lager elastisk tätnings folie för att förhindra torkning under inkubering vid 28 ° c.
- Efter plantor har utvecklat sin första uppsättning av sanna blad (~ 3-4 veckor efter inkubering vid 28 ° c), överföra plantor till krukor fyllda med kommersiell krukväxtjord och täcka plantorna med en genomskinlig plast kopp för att förhindra uttorkning. Placera krukor i en 28 ° c klimatrum eller växthus, ~ 85% RH, under en 16 h:8 h dag: Night regim.
- Efter 1 vecka, ta bort genomskinlig plast kopp. Vattna krukor regelbundet och när träden växer större komplement med gödningsmedel för att upprätthålla tillväxten.
2. kloning av konstruktioner för CRISPR/Cas9-medierad mutagenes av P. andersonii
Anmärkning: Standard binära omvandlings vektorer kan användas för den stabila omvandlingen av P. andersonii. Här, som ett exempel, är ett förfarande för att generera konstruktioner för CRISPR/Cas9-medierad mutagenes med hjälp av modulär kloning (t. ex., Golden Gate)19.
- Identifiera guide RNA målsekvenser för genen (s) av intresse, med hjälp av bioinformatik programvara med en inbyggd CRISPR designverktyg. Välj guide RNA-sekvenser ligger vid 5 '-slutet av kodning sekvens av målet genen att öka risken för att få full Knockouts. Se till att kontrollera om off-mål effekter genom att söka mot P. andersonii Genome6.
Anmärkning: Använd 2 sgRNAs per målgen, företrädesvis 200-300 BP isär. Detta kan generera borttagningar som kan identifieras genom PCR och därefter av agaros gel elektrofores. - Generera nivå 1 Golden Gate konstruktioner som innehåller sgRNA sekvenser.
- Design primers att förstärka varje enskild sgRNA genom att sätta in 20 BP guide sekvens vid placeringen av N(20) i följande primer sekvens: 5 '-TGTGGTCTCAATTGN(20) gttttagagctagaaatagcaag-3 '.
Anmärkning: om guidesekvensen är lika med GN(19), ta bort G vid 5 ' slutet av guidesekvensen innan du sätter i primersekvensen. - PCR förstärka sgrnas från pICH86966:: AtU6p:: sgRNA_PDS20 använda de främre primers som utformats i steg 2.2.1 och Universal Reverse primer: 5 '-tgtggtctcaagcgtaatgccaactttgtac-3 '. Använd ett värmestabilt DNA-polymeras med hög exakthet och följande PCR-villkor: 98 ° c i 30 s; 30 cykler (98 ° c för 10 s; 53 ° c för 20 s; 72 ° c för 10 s); 72 ° c för 7 min. lyckade PCR-reaktioner ger en 165 BP amplicon.
- Column-renar PCR-amplikon med hjälp av en kommersiell PCR-rening kit. Därefter ställer du in Golden Gate-reaktioner för att klona sgRNAs bakom Arabidopsis thaliana ATU6P liten RNA-promotor: 10 ng av sgRNA PCR-amplicon, 150 ng av pICSL01009:: AtU6p20, 60 ng av lämplig nivå 1 acceptorvektor, 2 μl T4 ligasbuffert, 2 μL 0,1% av bovint serumalbumin (BSA), 0,5 μL av BsaI, 0,5 μL T4 Ligase, fyll till 20 μL med ultrarent vatten. Se till att alla sgRNAs är klonade i samma riktning för att förhindra hårnål formation.
- Inkubera reaktioner i en termocycler som kör följande program: 37 ° c i 20 s; 26 cykler (37 ° c i 3 min; 16 ° c i 4 min); 50 ° c i 5 min; 80 ° c i 5 min. omvandla Golden Gate reaktioner på Escherichia coli och tallrik på lb medium21 innehållande ampicillin (50 mg/l), X-gal (200 mg/l) och IPTG (1 mm).
Anmärkning: Bered stamlösningar av IPTG och X-gal i ultrarent vatten respektive dimetylformamid. Filter sterilisera ampicillin och IPTG lagerlösningar och lagra alla bestånd vid-20 ° c. Använd handskar vid hantering av dimetylformamid. - Välj vita kolonier och isolera plasmider med hjälp av en kommersiell plasmid isolerings sats. Sekvens kontrollera isolerade plasmider innan du fortsätter med Golden Gate nivå 2 församling.
- Design primers att förstärka varje enskild sgRNA genom att sätta in 20 BP guide sekvens vid placeringen av N(20) i följande primer sekvens: 5 '-TGTGGTCTCAATTGN(20) gttttagagctagaaatagcaag-3 '.
- Montera nivå 2 Golden Gate konstruktioner för den stabila omvandlingen.
- Utför en Golden Gate reaktion med nivå 1 AtU6p:: sgRNA konstruktioner (som genereras i avsnitt 2,2) samt pICH47802::nptII, pICH47742:: 35SPro:: Ωnls-ACas9:: 35Ster, nivå 2 acceptor pICSL4723 och lämplig länkare (se Engler et al.22). Utför reaktioner enligt följande: Använd ~ 100 fmol av varje givare vektor och ~ 20 fmol av acceptorn vektor och tillsätt 2 μL T4 Ligase buffert, 2 μL av 0,1% BSA, 0,5 μL av BpiI, 0,5 μL av T4 Ligase, fyll till 20 μL med ultra-rent vatten.
Anmärkning: nivån 1 plasmider pICH47802::nptII, pICH47742:: 35SPro:: ωnls-aCas9:: 35Ster måste först klonas (se kompletterande fil 1), som beskrivs för sgrnas under avsnitt 2,220,22 ,23. - Inkubera reaktionerna enligt steg 2.2.4 och omvandla dem till E. coli. Fat på LB-medium innehållande kanamycin. Nästa dag, Välj vita kolonier och isolera plasmider. Bestäm rätt plasmid församling genom begränsning-rötnings analys.
- Utför en Golden Gate reaktion med nivå 1 AtU6p:: sgRNA konstruktioner (som genereras i avsnitt 2,2) samt pICH47802::nptII, pICH47742:: 35SPro:: Ωnls-ACas9:: 35Ster, nivå 2 acceptor pICSL4723 och lämplig länkare (se Engler et al.22). Utför reaktioner enligt följande: Använd ~ 100 fmol av varje givare vektor och ~ 20 fmol av acceptorn vektor och tillsätt 2 μL T4 Ligase buffert, 2 μL av 0,1% BSA, 0,5 μL av BpiI, 0,5 μL av T4 Ligase, fyll till 20 μL med ultra-rent vatten.
- Omvandla nivå 2 konstruktioner till Agrobacterium tumefaciens stam AGL124.
3. stabil omvandling av P. andersonii
- Inokulera 2 LB plattor som innehåller lämpliga antibiotika med A. tumefaciens stam AGL1 omvandlas med konstruktionen av intresse. Inkubera plattorna vid 28 ° c i 2 dagar.
- Skörda unga grenar från växthusodlade träd. Använd ca 5 grenar av 5-8 cm i längd för varje omvandling. Se till att endast använda friska icke-infekterade grenar. Ta bort bladen genom att skära dem som sådan att ~ 1 cm2 av bladvävnad är kvar i slutet av varje petiole. Kassera bladen.
- Desinficera vävnad i 15 min med 1:1-utspädda kommersiella blekmedel (~ 2% hypoklorit efter utspädning) som innehåller några droppar polysorbat 20. Skölj sedan vävnaden 6 gånger med autoklaverat vatten.
Anmärkning: detta steg, liksom, följande steg måste utföras i ett laminärt ner-Flow skåp för att hålla vävnaden steril. - Återsuspendera a. tumefaciens celler från 1-2-plattor i 25 ml infiltrations medium (se tabell 1) som innehåller acetospruta (20 mg/L) och en nonjontensid (0,001% v/v) för att nå en optisk densitet (OD600) på ~ 5.
Anmärkning: Bered acetospruta en stamlösning i 70% etanol och förvara vid-20 ° c. Den nonjoniska tensiden måste vara filtersteriliserad innan den läggs till infiltrations mediet. - Skär både stammen och bladskaft vävnad i bitar av ~ 1 cm i längd inuti A. tumefaciens suspension, vilket skapar nya sår på båda sidor. Lämna vävnad bitar i A. tumefaciens suspension för 10-30 min.
- Förbered det böka mediet (se tabell 1) och tillsätt acetospruta (20 mg/L) efter autoklavering. Torr vävnad bitar på en steril bit filtrerpapper och placera den på mediet (~ 10 explants/tallrik). Inkubera plattorna i mörker vid 21 ° c i 2 dagar.
Obs: låt mediet svalna till ~ 60 ° c innan du lägger acetospruta en. - Efter 2 dagar, inspektera plattor för svamp eller uppenbar bakteriell kontaminering (andra bakterier än A. tumefaciens). Kontaminerade plåtar måste kasseras.
- Bered vätskan SH-10 medium (se tabell 1). Tillsätt polysorbat 20 (0,01%, v/v) efter autoklavering. Överför Vävnadsdelar till 10 mL SH-10 innehållande polysorbat 20. Under en period på minst 10 min, försiktigt agitera varje 2-3 min att tvätta vävnaden.
- Tvätta ytterligare två gånger med Fresh SH-10 innehållande polysorbat 20. Dessa tider, en 2-3 min inkubationstid per tvättsteg är nog.
- Förbered det böka mediet (se tabell 1). Efter autoklavering, tillsätt Cefotaxim (300 mg/L) och kanamycin (50 mg/L) och häll plattor. För sekundära transformationer (transformationer av transgena kanamycin-resistenta linjer), applicera hygromycin (15 mg/L) val.
- Torr vävnad bitar på sterila bitar av filtrerpapper. Efteråt, överföra vävnad bitar till plattorna bereds i steg 3,9.
- Inkubera plattorna i 7 dagar vid 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt. Varje 2 dagar kontrollera plattorna för svamp-eller bakterieförorening och överdriven tillväxt av A. tumefaciens. I händelse av kontaminering, överför icke-infekterade bitar till en ny tallrik.
- Efter 7 dagar, överför Vävnadsdelar till föröknings mediet (se tabell 1) som innehåller Cefotaxim (300 mg/l) och kanamycin (50 mg/l). Inkubera plattorna vid 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt. Uppdatera plattorna en gång i veckan tills transgena skott utvecklas. Se till att endast överföra icke-infekterade vävnad bitar till färska plattor. Kassera bitar som är igenväxta av A. tumefaciens.
- När putatively-transgena skott är ≥ 1 cm i längd, skära skott och odla dem självständigt i föröknings mediet som innehåller Cefotaxim (300 mg/L) och kanamycin (50 mg/L). För att säkerställa att skotten representerar oberoende transformanter, ta bara en enda shoot från varje sida av en explant.
- Vegetativt propagera putatively-transgena skott som beskrivs i steg 5,2.
4. genotypning av Putatively-transgena skott
- Design primers spänner över sgRNA erkännande webbplats (er). Om du vill tillåta PCR-amplikon-sekvensering väljer du primers 150-250 BP bort från sgrna erkännande webbplats (er).
- Skär en löv spets (~ 5 mm) från varje transgena skjuta att genotypas. Också, skörda en Wild-typkontroll prov.
- Utför 50 μL PCR-reaktioner med primers som utformats i steg 4,1 och ett kommersiellt kit för att direkt förstärka DNA från växtprover. Alternativt kan PCR-reaktioner utföras på renat DNA med hjälp av en HiFi-polymeras.
- Separata PCR amplikonerna på en 1,5-2% aguppstod gel.
- Analysera resultaten från gel elektrofores. Sök efter prover som producerar flera band (mer än 1 allel) och PCR amplikonerna med olika storlekar från vildtyp, vilket indikerar närvaron av medelstora indels.
- Sekvens PCR amplikonerna att identifiera de exakta mutationer. För prover som producerar en enda PCR-amplikon kan PCR-produkter sekvenseras direkt. Prover som producerar mer än 1 band efter gel elektrofores eller som verkar vara heterozygot efter direkt sekvensering av PCR-amplicon, måste klonas i en trubbig-end kloning vektor först. Därefter sekvens flera kloner för varje prov för att identifiera alla möjliga alleler som finns i provet.
- Justera sekvenserings resultat till genen av intresse och inspektera justeringen för att söka efter mutationer nära sgRNA målwebbplats (er). Därefter kontrollera om dessa mutationer skapa frameskift. Kassera linjer med > 2 alleler och linjer som innehåller mutationer i ramen.
- Markera flera rader för vidare analys.
- Sprid markerade rader enligt beskrivningen i steg 5,2.
- När linjer har utvecklat flera nya skott, ta nya prover från ≥ 3 blad tips och upprepa steg 4.3-4.7. Avgöra om de mutationer som finns i vart och ett av proverna med ursprung i samma linje och det ursprungliga PCR-provet är identiska. Linjer som ger samma mutationer i alla prover är homogent muterade och kan användas för ytterligare experiment. Ignorera rader som inte ger samma resultat som dessa linjer är chimeric.
5. beredning av rotade P. andersonii plantlets för experiment
-
Initiera en ny vävnad kultur linje av P. andersonii.
- Skörda axillär knoppar, unga oavsiktliga skott eller löv vävnad från friska träd. Alternativt kan plantor användas som utgångsmaterial.
- Desinficera vävnad med 1:1-utspädda kommersiella blekmedel (~ 2% hypoklorit efter utspädning) som innehåller några droppar polysorbat 20 för 15 min. efteråt, skölj vävnaden 6 gånger med autoklaverat vatten.
Anmärkning: detta steg, liksom, följande steg måste utföras inuti en laminär Downflow eller laminärt använder skåp för att hålla vävnaden steril. - Överför vävnad till föröknings mediet (se tabell 1). Stäng plattor med 2 skikt av elastisk tätning folie och inkubera plattor vid 28 ° c, 16 h: 8 timmar dag natt.
- Inspektera plattorna varannan dag under de första 2 veckorna för att säkerställa att vävnaden är fri från svamp-eller bakterieförorening.
- Propagera vävnad genom att placera ~ 10 skott på en ny platta av förökning medium och Stäng plattan med 2 skikt av elastisk tätning folie. Inkubera plattorna vid 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt. Upprepa detta steg var fjärde vecka.
- När skott är > 1 cm i längd, skära skott på deras bas och placera dem på böka medium (se tabell 1). Cirka 10 skott kan placeras på en enda böka plattan. Position skjuter upprätt genom att sätta den basala spetsen av fotograferingen i mediet. Rötter visas vid 10-14 dagar efter inkubering av plattorna vid 28 ° c, 16 h:8 h dag: natt.
Anmärkning: inte rota alla skott men hålla en del för vävnadsodling förökning (se steg 5,2).
6. nodulation av P. andersonii plantlets i krukor
-
Förbered bakterier inoculum.
- Inokulera 10 mL flytande YEM-medium (se tabell 2) från en enda koloni Mesorhizobium plurifarium BOR26 och inkubera vid 28 ° c i 2 dagar.
Obs: M. plurifarium BOR2 är att föredra eftersom det effektivt nodulates P. andersonii. Men andra bakterier stammar kan också användas för nodulationen av P. andersonii (t. ex. bradyrhizobium elkanii WUR325, bakterier tropici CIAT89926,27 eller bradyrhizobium SP. Kelud2A4). - Använd 10 mL-kulturen för att Inokulera en större volym flytande YEM-medium. Volymen av denna kultur är beroende av antalet krukor som behöver inokuleras.
- Bered flytande EKM-medium (se tabell 3, tabellen 4). Centrifugera bakteriekulturen i 10 min vid 3 500 x g för att skörda cellerna. Därefter Återsuspendera den bakteriella pelleten i flytande EKM (Använd ungefär samma volym som den ursprungliga YEM-kulturen) och Bestäm den optiska densiteten (OD600).
- Inokulera 10 mL flytande YEM-medium (se tabell 2) från en enda koloni Mesorhizobium plurifarium BOR26 och inkubera vid 28 ° c i 2 dagar.
- För ~ 20 krukor, Förbered 3 L flytande EKM medium och Inokulera med den rhizobial suspensionen beredd i steg 6.1.3. för att nå OD600 = 0,025.
- Blanda 3 L EKM innehållande former med 1 250 g perlit. Därefter, tillsätt 210 g av denna blandning till sterila genomskinlig polypropen krukor. Alternativt, i stället för perlit, använda sand som ett substrat för nodulationen assays.
- Plant 1-3 P. andersonii plantlets i varje pott. Förbered också flera krukor som innehåller P. andersonii plantlets transformerade med CRISPR-Control-konstruktionen (se kompletterande tabell 1). Väga flera krukor för att kunna bestämma vattenförlust under experimentet. Täck botten av varje kruka för att skydda rötterna från ljus exponering.
- Inkubera krukor i ett klimatanpassat tillväxtrum (28 ° c, 16 h:8 h dag: natt) för 4-6 veckor. En gång i veckan, väga flera krukor för att bestämma vattenförlust. Om vattenförlusten överstiger 10 mL, komplettera med ultra-rent vatten för att kompensera för förlusten.
- Efter 4-6 veckor, rengör rötterna från perlit och bestämma knöl nummer med hjälp av en kikare för att undersöka nodulationen effektivitet.
7. nodulation av P. andersonii plantlets på tallrikar
-
Förbered cellofan membran 28.
- Skär cellofan membranet för att passa in i en kvadrat 12 cm x 12 cm petriskål. Skär membranen lite kortare på toppen för att ge utrymme för skotten att växa.
- För att öka permeabiliteten av cellofan membran, koka membranen i EDTA lösning (1 g/L) för 20 min. efteråt, skölj minst 6x med demineraliserat vatten för att avlägsna EDTA.
Obs: eftersom det torra membranet tenderar att rynka vid kontakt med vatten, dränka de torra membranen en efter en i lösningen. - Ordna membranen horisontellt i ett tunt lager av vatten i en rund glasplatta. Sterilisera membranen genom att Autoklavera två gånger.
- Placera 1 autoklaverat cellofan membran på en kvadrat 12 x 12 cm petriskål som innehåller agar-stelnat EKM-medium (se tabell 3, tabell 4). Placera två 3-veckors gamla rotade P. andersonii plantlets (se avsnitt 5) eller 4-veckors gamla plantor (se avsnitt 1,1) på toppen av membranet. Se till att bara plocka plantlets eller plantor med rötter som har vit rot tips, vilket indikerar att dessa rötter växer fortfarande.
- Täck varsamt rötterna med en andra cellofan membran, skapa ett smörgås skikt. Försegla plattan med 3 lager av elastisk tätning folie. Linda den nedre halvan av plattorna med aluminiumfolie, för att täcka rötterna från ljus exponering.
- Inkubera plattorna i ett klimatiserat tillväxtrum (28 ° c, 16 h:8 h dag: natt) för 3-4 veckor. Markera positionen för rottipsen för att följa rottillväxten över tid.
- Om EKM plattorna börjar torka ut på grund av långvarig inkubation, överföra växterna till färska EKM plattor några dagar före bakteriell inympning.
- Förbered bakterien inokulum som beskrivs i steg 6,1.
- Ta bort den översta cellofan membranet och tillämpa 1 ml bakterier kultur (OD600 = 0,025) till rötterna. Därefter, placera en ny cellofan membran på inokulerade rötter. Wrap utsidan av plattan med aluminiumfolie för att täcka rötterna från ljus exponering.
- Efter 4 veckor, undersöka knöl siffror med hjälp av en kikare för att bestämma nodulationen effektivitet.
8. nodulation av P. andersonii plantor i påsar
- Germinate P. andersonii frön som beskrivs i avsnitt 1,1. Efter hjärtbladen har helt dykt upp (~ 12 dagar på SH-0 tallrikar vid 28 ° c), överföra plantor till påsar.
- För att förbereda påsarna, riva den vikta delen av pappersveken och tillsätt 7 mL modifierat EKM-medium (se tabell 3, tabell 4).
- Sätt 1 eller 2 plantor genom att placera rötterna i mellan båda pappersark som utgör papperet veken och den främre plastfolie av påsen.
- Skydda rötterna från ljus exponering, genom att vika aluminiumfolie runt påsen. Suspendera påsar i en plastlåda täckt med ett genomskinligt lock för att bibehålla hög luftfuktighet. Placera boxen i ett klimatrum (28 ° c, 16 h:8 h dag: natt).
- Kompensera för vatten avdunstning genom att tillsätta Sterilt ultrarent vatten, så att papperet veken förblir fuktigt (Undvik stående vatten i botten av påsen). Efter den första veckan, detta kräver i allmänhet att tillsätta 2-3 ml var 4 dagar.
- Förbered bakterien inokulum som beskrivs i steg 6,1.
- Efter plantor har odlats för 10-12 dagar i påsar, Inokulera rotsystemet med 500 μl av bakterier kultur (OD600 = 0,025).
- Följ knöl formation genom tiden. Fyra veckor efter Inympning, noduli kan räknas och skördas för att bestämma nodulationen effektivitet.
9. nodule Cytoarchitecture analys
- Samla 10-15 noduli i en 2 mL tub innehållande fixativ (5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,2). Applicera vakuum för 1/2-1 h och inkubera över natten vid 4 ° c. Under denna period, proverna sjunker till botten av röret.
Anmärkning: fixativ lösning kan förvaras vid 4 ° c för ~ 2-4 veckor före användning. Se till att bära handskar när du arbetar med vävnad fixativ. - Tvätta nodulerna 2x med 0,1 M fosfatbuffert, pH 7,2. Applicera 10 min mellanrum mellan varje tvättsteg.
- Dehydrera proverna genom att därefter inkuberas i 30%, 50%, 70% och 100% etanol. För att säkerställa att allt vatten avlägsnas från proverna upprepar du 100% etanol steg 3x. Applicera 10 min mellanrum mellan varje dehydratiseringsteg.
- Förbered polymerisation blandning I (PM-I) genom att tillsätta 1 förpackning med härdare I till 2,5 mL av PEG400 blandat med 100 mL HEMA (2-hydroxyethyl metakrylat)-baserad harts lösning. Rör om lösningen för ~ 15 min för att helt lösa upp härdare I. Därefter lagra PM-I vid-20 ° c.
- Ta bort etanolen från steg 9,3. och infiltrera proverna i följande ordning: PM-I:100% etanol (1:3, v/v), PM-I:100% etanol (1:1, v/v) och PM-I:100% etanol (3:1, v/v). Inkubera proverna i varje lösning vid RT för 1/2-1 h eller tills proverna sjunker till botten.
- Inkubera prover över natten vid 4 ° c i 100% PM-I lösning.
- Förbered polymerisation blandning II genom att blanda PM-I och Hardener II i en 15:1 (v/v) förhållande. Fyll plast mögel med polymerisation lösning, orientera proverna horisontellt på botten av mögel, och täck med en bit elastisk tätning folie. Undvik bildandet av luftbubblor.
Obs: eftersom lösningen börjar polymerisera vid exponering för RT, försök att orientera proverna så snabbt som möjligt i plast hållaren. Polymerisation är avslutad efter övernattning inkubering vid RT, eller 1 h vid 37 ° c. - Ta bort det elastiska tätnings folielocket från steg 9,7 och placera en hållare till de polymeriserade proverna. För att montera hållaren på proverna, lös 10 mL metylmetakrylatbaserat harts pulver i 5 mL metylmetakrylatbaserad hartslösning. Lägg snabbt till lösningen i hålet i toppen av hållaren.
Anmärkning: utför polymeriseringssteget i rök huven (~ 30 min vid RT). - Mikrotom sektions prov till en tjocklek av 4-5 μm. Placera ett Mikroskop glida på en 58 ° c värmeplatta och tillsätt en stor droppe vatten till varje bild. Placera sektionerna på toppen av vattnet. När vattnet har avdunsta, kommer sektionerna att följa bilden.
- Fläcken glider genom att doppa i 0,05% (w/v) toluidin blå för 2 min. Skölj sedan glasen 3x med ultrarent vatten. Diabilder kan observeras med hjälp av ett ljus fälts Mikroskop.
10. mycorrhization av P. andersonii plantlets
-
Förbered rhizagi av den här sporer inokulum
- Förbered en bunt polyester vävda filter med följande storlekar (uppifrån och ned): 210 μm, 120 μm, och 36 μm maskstorlek.
- Pipettera över erforderlig mängd av en kommersiell spor suspension på högen av polyesterfilter. Skölj filtren 3x med 100 mL autoklaverat demineraliserat vatten. Sporer behålls på ytan av 36 μm filtret.
Anmärkning: Förbered Spore-fjädringen i det laminära tvär flödes skåpet för att förhindra kontaminering. - Demontera polyesterstacken och Behåll endast 36 μm-filtret. Upprepa tvättsteget med autoklaverat demineraliserat vatten i minst 6x.
- Placera filtret på en petriskål och återsuspendera sporer i autoklaverat demineraliserat vatten. Använd en volym vatten som är lika med volymen av Spore-fjädringen som används i steg 10.1.2. Överför Spore-fjädringen till ett sterilt rör genom pipettering.
- Placera 5 droppar 20 μL av Spore suspensionen på en glasfiber Slide och räkna antalet sporer med ett ljust fält Mikroskop. Konvertera Spore räknas till ett förhållande av sporer/mL och späd Spore suspensionen tills den når 250 sporer/mL. Förvara Spore-fjädringen vid 4 ° c.
- Utföra mycorrhization analys. För detta ändamål, tillsätt 800 g av autoklaverad sand kompletterad med 70 mL 1/2-Hoagland medium till sterila genomskinlig polypropen krukor (se tabellerna 5-6). Blanda sand och medium direkt i potten genom att skaka kraftigt.
- Placera en p. andersonii plantlet i varje kruka och Pipettera 1 ml av Spore suspensionen direkt på roten av P. andersonii plantlet. Se till att inkludera flera krukor som innehåller P. andersonii plantlets omvandlas med en CRISPR-kontroll konstruktion (se kompletterande tabell 1).
- Inkubera krukor i en klimatiserad tillväxt rum (28 ° c, 16 h:8 h dag: natt) i 6 veckor.
- Ta ut växterna från krukorna och tvätta rötterna med rinnande vatten för att avlägsna så mycket sand som möjligt.
- Skär rötter i 1 cm långa bitar och koka roten bitarna i 10% KOH (w/v) för 20 min vid 90 ° c. Därefter, placera kokt rötter på en cell SIL med en 100 μm maskstorlek och skölj 3x med 50 mL vatten.
- Fläcken rötter med 0,05% (w/v) trypan blå i lactoglycerol (300 mL mjölksyra; 300 mL glycerol, och 400 mL avmineraliserat vatten) i 5 min vid 90 ° c i ett vattenbad eller värmeblock. Därefter, överföra rötter till 30% glycerol. Rotproverna kan lagras på RT.
- Placera 15-25 rotfragment på en enda Mikroskop bild. Tillsätt 30% glycerol och täck med ett täckglas och tryck på tills rot bitarna blir platta. Observera rotfragment med hjälp av en ljus-fält Mikroskop och värdering bildar mykorrhiza koloniseringen.
Anmärkning: en metod för att göra mål mycorrhization beskrivs enligt Trouvelot et al.29. Den här metoden använder flera klasser (% F,% M och% A), vilket möjliggör snabb uppskattning av nivån på bildar mykorrhiza kolonisering av varje rotfragment och överflöd av arbuscules.
Representative Results
P. andersonii tRees kan odlas i ett betingat växthus vid 28 ° c och ~ 85% relativ luftfuktighet (figur 1a). Under dessa förhållanden, träd börjar blomning vid 6-9 månader efter plantering. Hona P. andersonii blommor producerar bär som var och en innehåller ett enda frö. Under mogningen, Bären ändra färg; först från grönt till vitt och därefter från vitt till brunt (figur 1b). Frön som utvinns ur de mogna bruna Bären, gror väl efter en 10-dagars temperaturcykel och en 7-dagars inkubering på SH-0 tallrikar (figur 1c). Grorade frön fortsätter att utvecklas till unga plantor som kan användas för experiment efter ~ 4 veckor (figur 1d).
Vi har tidigare visat att petioler och segment av unga P. andersonii stjälkar kan effektivt omvandlas med hjälp av A. tumefaciens stam AGL110. I början av omvandlings proceduren samodlas vävnadens djur med A. tumefaciens i 2 dagar vid 21 ° c (figur 2A). Långvarig samodling resulterar i överkoloniseringen av vävnadens djur av A. tumefaciens och bör därför förhindras (figur 2b). Efter samodling, vävnad djur överförs till selektiv media, som främjar utväxt av transformerad vävnad. Två till tre veckor senare observeras i allmänhet små gröna mikro-Calli längs den ursprungliga sårytan (figur 2C). Dessa Calli bör fortsätta att växa och utveckla 1 eller mer putativt omvandlas skott på 6-8 veckor efter omvandlingen förfarandet har inletts (figur 2D). I detta skede, omvandlings effektivitet varierar vanligtvis från ~ 10-30% för transformationer initieras med vävnad djur tas från mogna och delvis vedartade grenar (tabell 7). Om transformationer initieras med djur tagna från unga och snabbt växande tips av grenar som ännu inte bär blommor, omvandlings effektivitet av ~ 65-75% kan uppnås (tabell 7). Ibland, vitaktig Calli bildas på sidan av en explantat som inte är i kontakt med mediet och, därför, inte upplever kanamycin urval. Dessa Calli är ofta inte transgena och alla skott som bildas från dessa Calli kommer i allmänhet blekmedel och dö efter direkt kontakt med kanamycin-innehållande medium (figur 2e). Om omvandlingsfrekvensen är låg och/eller om utgångsmaterialet var suboptimalt, kan vävnads bitarna bli bruna (figur 2F) och drabbas av Överspridning genom A. tumefaciens (figur 2g). För att förhindra A. tumefaciens från att sprida och överodla närliggande djur, krävs regelbunden förfriskning av mediet, och allvarligt infekterade djur måste avlägsnas. När enskilda transgena skott placeras i föröknings mediet, överspridning av A. tumefaciens är i allmänhet inte förekommer längre (figur 2H). Transgena skott kan multipliceras genom in vitro-spridning, vilket kommer att ge upphov till tiotals skott under en period av en månad (figur 3a-B). Dessa skott kan placeras på böka medium, som bör inducera rotbildning efter ~ 2 veckor (figur 3C-D). Rotade plantlets kan därefter användas för experiment.
För att skapa knockout Mutant linjer, vi använder sig av CRISPR/Cas9-medierad mutagenes. För detta ändamål använder vi en binär vektor som innehåller kanamycin resistensgenen nptII, en Cas9-kodningssekvens som drivs av CaMV35S promotorn och 2 sgRNAs per målgen som uttrycks från ATU6P små RNA-promotorn20. En grafisk representation av konstruktionen som används för CRISPR/Cas9-medierad mutagenes av P. andersonii finns i figur 4a. Med denna metod, genomredigering observeras i ~ 40% av putatively-omvandlas skott10. För att identifiera muterade linjer, är putativt omvandlas skott genotypade för mutationer på sgRNA målwebbplats (er) med primers spänner över den riktade regionen. Ett exempel på förväntade resultat ges i diagram 4. Som framgår av fotot taget efter gel elektrofores, producerar flera prover en PCR-amplikon med liknande storlek som vildtyp (figur 4b). Dessa växter kan innehålla små indels som inte kan visualiseras av aguppstod gel elektrofores eller förbli oredigerad av Cas9 enzymet. Flera prover ger dessutom olika storlek från Wild-typen (t. ex. linjerna 2, 4, 7 och 8 i figur 4b). I dessa rader, 1 (linjer 4, 7 och 8) eller båda (linje 2) alleler innehåller större indels som lätt kan visualiseras. Den exakta karaktären av mutationer på målplatsen (s) avslöjas efter PCR-amplikon sekvensering. Som framgår av figur 4c, både små indels av 1-4 BP, liksom, större borttagningar kan erhållas efter CRISPR/Cas9 mutagenes. I figur 4cär sekvensen av linje 1 identisk med den för Wild-typen, vilket indikerar att den här linjen har flytt av redigeringen och därför bör kasseras. Bland de linjer som innehåller mutationer, heterozygot, homozygot och BI-allelic mutanter kan identifieras (figur 4c). Men heterozygot mutanter är i allmänhet sällsynta10. Homozygot eller bi-allelic knockout mutanter kan spridas vegetativt för att få tillräckligt med material för fenotypisk analys. Eftersom fenotypisk analys utförs i T0 -generationen är det viktigt att kontrollera om muterade linjer kan vara chimära. För detta ändamål måste genotypning upprepas på minst tre olika prover tagna från varje mutantlinje. Om genotypningen är identisk med varandra och det ursprungliga genotypprovet (t. ex. linje 8 i figur 4D), är linjen homogent muterad och kan användas för vidare analys. Om genotypningen skiljer sig mellan oberoende prover (t. ex. linje 4 i figur 4D), är den muterade linjen dock chimär och måste kasseras.
Inympning av P. andersonii med M. plurifarium BOR2 resulterar i bildandet av rotknölar (figur 5). Som framgår av figur 5afördelas dessa noduler längs rotsystemet. Knölar av P. andersonii är ljusbruna i färgen men kan lätt diskrimineras från rot vävnaden baserat på deras form (Figur 5b). Inympning experiment i krukor och efterföljande tillväxt för 4-6 veckor resulterar typiskt i bildandet av ~ 10-30 knutor (figur 6a). Ett liknande antal knölar bildas efter inympning av EKM plattodlas P. andersonii plantlets vid 4 veckor efter inympning (figur 6a). I påsar, P. andersonii plantor bildar typiskt ~ 5-15 knölar vid 5 veckor efter inympning (figur 5C-D, 6a). För att analysera knöl cytoarchitecture, noduli kan sektioneras och observeras med hjälp av ljus-fältmikroskopi. Bild 6b visar ett exempel på en längsgående sektion genom mitten av en P. andersonii nodule. Detta avsnitt visar den centrala vaskulära bunt av en P. andersonii knöl, som flankeras av knöl lober som innehåller infekterade celler (figur 6b).
P. andersonii plantlets kan också mycorrhized. Efter 6 veckors inokulering med R...., mykorrhizal koloniseringsfrekvens når normalt > 80% (figur 6c). Vid denna tidpunkt, i allmänhet ~ 30% av cellerna innehåller arbuscules (figur 6C). En representativ bild av ett P. andersonii -rotsegment som innehåller arbuscles visas i figur 6d.
Figur 1: representativa bilder av en P. andersonii träd, frön och plantor. (A) sex månader gamla P. andersonii träd som odlas i krukväxtjord i ett växthus konditioneras vid 28 ° c. Brepresentativ bild föreställande P. andersonii -bär i olika mogningsstadier. Young P. andersonii bär (omogna) kommer att ändra färg från grönt till vitt och slutligen till brunt (mogen) vid mognaden. C) P. andersonii frön inkuberas på SH-0 medium i 1 vecka. En svart cirkel indikerar en gror fröplanta. Dfyra veckor gamla plantor av P. andersonii som odlas i sh-0 medium. Skalstreck är lika med 25 cm i (a) och 1 cm i (B-D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa bilder av djur i olika stadier av det stabila omvandlingsförfarandet. A) explantsommedodlas med A. tumefaciens. Bexplant överväxt av A. tumefaciens under de första 2 veckorna efter omvandlingen. (C) transgena mikro-Callus bildas nära såret platsen för en explantat på 2,5 veckor efter samodling. (D) representativ bild av en explantat på 6 veckor efter samodling som visar uppkomsten av skott från (transgena) Calli. (E) representativ bild av ett skott som blir vitaktigt och så småningom dör när det i direkt kontakt med kanamycin-innehållande medium. Detta shoot är mest sannolikt icke-transgena och flydde kanamycin val när den är ansluten till explant. Frepresentativ bild av ett icke framgångsrikt omvandlat explant. Grepresentativ bild av en utan framgång omvandlad explantat överväxt av A. tumefaciens. HSingle transgena skott som odlas på föröknings medium 8 veckor efter samodling med A. tumefaciens. Skalstreck lika 2,5 mm. rutor som innehåller gröna bockmarkeringar eller röda kors indikerar lyckad eller misslyckad omvandling av explants respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa bilder av in vitro - för ökning. A skott somodlas på föröknings mediet. Bilden togs 1 vecka efter att plattorna uppdaterades. B) skott som odlas på föröknings mediet. Bilden togs 4 veckor efter att plattorna uppdaterades. (C) Nyskurna skott placerade på böka medium. (D) skott inkuberas på böka medium i 2 veckor. Notera närvaron av rötter. Skalstreck är lika med 2,5 cm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa resultat efter genotypning av P. andersonii T0 transgena CRISPR/Cas9 Mutant Lines. (A) representativ karta över en binär vektor som används för CRISPR/Cas9-medierad mutagenes av P. andersonii. B) representativt resultat efter PCR-baserad genotypning av potentiella CRISPR/Cas9 Mutant-linjer med hjälp av primers som spänner över sgrna-målplatsen (-erna). Visas är en bild efter aguppstod gel elektrofores av amplicons. Prover tagna från enskilda transgena linjer indikeras med siffror. Wild Type (WT) och ingen mallkontroll (NTC) indikerar körfält som innehåller positiva respektive negativa kontroller. C) schematisk representation av muterade alleler som erhållits efter CRISPR/Cas9-medierad genredigering. Markerade i blått och rött färger är sgRNA målplatser och PAM sekvenser, respektive. D) representativt resultat efter PCR-baserad screening för potentiella chimära muterade linjer. Visas är en bild efter aguppstod gel elektrofores av 3 enskilda prover tagna från Mutant linjer 4 och 8. Observera att transgena Mutant linje 4 är chimeric. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa bilder av nodulationstester i tallrikar och påsar. (A) nodulering på plattor som innehåller agar-STELNAT EKM medium och inokuleras med M. plurifarium BOR2 i 4 veckor. Brepresentativ bild av ett P. andersonii -rotknöl. Bilden togs vid 4 veckor efter inympning med M. plurifarium BOR2. C) nodulering i påsar som innehåller flytande EKM-medium. Plantor inokulerades med Bradyrhizobium SP. Kelud2A4 i 5 veckor. Drepresentativ bild av en fullständig inställning som används för nodulering i påsar. Skalstreck är lika med 2,5 cm i (a, C), 1 mm i (B) och 5 cm i (D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativa resultat av den nodulationen och mycorrhization analyser. (A) representativt stapeldiagram som visar antalet knölar bildade per planta vid 4 veckors inokulering med M. plurifarium BOR2 i krukor eller på tallrikar och vid 5 veckors inympning med bradyrhizobium SP. Kelud2A4 i påsar. Data motsvarar medelvärdet ± SD (n = 10). Brepresentativ bild av en längsgående sektion genom en knöl bildad 4 veckor efter inokulering med M. plurifarium BOR2. Avsnittet färgas med toluidinblått. (C) representativt stapeldiagram som visar kvantifiering av mycorrhization. Variabler som kvantifierats enligt Trouvelot et al.29 är F, frekvensen av analyserade rotfragment som är mycorrhized; M, intensiteten av infektionen; A, överflödet av mogna arbuscules i det totala rotsystemet. Mycorrhization kvantifierades vid 6 veckor efter inympning med R. DAOM197198 (stam). Data motsvarar medelvärdet ± SD (n = 10). (D) representativ bild av mogna arbuscules närvarande i P. andersonii root kortikala celler vid 6 veckor efter inympning med R. Skalstreck lika med 75 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Sammansatta | SH-0 | SH-10 | Föröknings medium | Rooting medium | Infiltrations medium |
| SH-basal salt medium | 3,2 g | 3,2 g | 3,2 g | 3,2 g | 3,2 g |
| SH-vitamin blandning | 1 g | 1 g | 1 g | 1 g | 1 g |
| Sackaros | - | 10 g | 20 g | 10 g | 10 g |
| BAP (1 mg/mL) | - | - | 1 mL (4,44 μM) | - | - |
| IBA (1 mg/mL) | - | - | 100 μL (0,49 μM) | 1 mL (4,92 μM) | - |
| NAA (1 mg/mL) | - | - | - | 100 μL (0,54 μM) | - |
| 1 M MES pH = 5,8 | 3 mL | 3 mL | 3 mL | 3 mL | 3 mL |
| 1 M KOH | Justera pH till 5,8 | Justera pH till 5,8 | Justera pH till 5,8 | Justera pH till 5,8 | Justera pH till 5,8 |
| Daishin agar | 8 g | - | 8 g | 8 g | - |
Tabell 1: sammansättningen av Schenk-Hildebrandt-baserade30 medier som används för odling av P. andersonii plantor, stabil omvandling, och in vitro -spridning. Lös upp fasta föreningar i 750 mL ultrarent vatten innan du lägger till flytande lager. Efteråt, fyll hela mediet till 1 L. Förbered BAP, IBA, NAA lager i 0,1 M KOH och lagra vid-20 oC.
| Före autoklavering: | ||
| Sammansatta | Mängd per liter | Slutliga koncentrationen |
| Mannitol | 5 g | 27,45 mM |
| Na-glukonat | 5 g | 22,92 mM |
| Jästextrakt | 0,5 g | - |
| MgSO4· 7h2O | 0,2 g | 0,81 mM |
| Nacl | 0,1 g | 1,71 mM |
| K2HPO4 | 0,5 g | 2,87 mM |
| Efter autoklavering: | ||
| Sammansatta | Mängd per liter | Slutliga koncentrationen |
| 1,5 M CaCl2 | 1 mL | 1,5 mM |
Tabell 2: sammansättning av jäst-mannitol (YEM) medium som används för odling av Rhizobium. Justera pH till 7,0 och fyll med ultra-rent vatten till 1 L. Tillsätt 15 g mikroagar före autoklavering för att förbereda det agar-stelnade YEM-mediet.
| Före autoklavering: | |||
| Sammansatta | Lager koncentration | Mängd per liter medium | Slutliga koncentrationen |
| KH2Po4 | 0,44 M | Tillsätt 2 mL | 0,88 mM |
| K2HPO4 | 1,03 M | Tillsätt 2 mL | 2,07 mM |
| 500x Micro-Elements stamlösning | - | Tillsätt 2 mL | - |
| MES pH = 6,6 | 1 M | Tillsätt 3 mL | 3 mM |
| Hcl | 1 M | Justera pH till 6,6 | - |
| Ultrarent vatten | - | Fyll till 990 mL | - |
| Efter autoklavering: | |||
| Sammansatta | Lager koncentration | Mängd per liter medium | Slutliga koncentrationen |
| MgSO4· 7h2O | 1,04 M | 2 mL | 2,08 mM |
| Na2so4 | 0,35 M | 2 mL | 0,70 mM |
| NH4No3 | 0,18 M | 2 mL | 0,36 mM |
| CaCl2· 2H2O | 0,75 M | 2 mL | 1,5 mM |
| Fe (III)-citrat | 27 mM | 2 mL | 54 μM |
Tabell 3: sammansättning av 1 L modifierad EKM medium31 används för P. andersonii nodulationen assay. Sammansättningen av 500x Micro-Elements stamlösning listas i tabell 4. För att förbereda 2% agar-stelnat EKM medium, tillsätt 20 g Daishin agar före autoklavering. Autoklav den MgSO4· 7h2o, na2så4, CaCl2· 2H2o, och FE (III)-citrat lager att sterilisera. Filter sterilisera NH4No3 Stock lösning för att sterilisera.
| Sammansatta | Mängd per liter | Lager koncentration |
| MnSO4 | 500 mg | 3,31 mM |
| ZnSO4· 7h2O | 125 mg | 0,43 mM |
| CuSO4· 5H2O | 125 mg | 0,83 mM |
| H3bo3 | 125 mg | 2,02 mM |
| Na2MoO4· 2H2O | 50 mg | 0,21 mM |
Tabell 4: sammansättningen av 500x-mikroelementens stamlösning som används för beredning av modifierat EKM-medium. Förvara mikroelementens stamlösning vid 4 ° c.
| Föreningar | Lager koncentration | Mängd per liter medium | Slutliga koncentrationen |
| K2HPO4 | 20 mM | 1 mL | 0,2 mM |
| NH4No3 | 0,28 M | 10 mL | 2,8 mM |
| MgSO4 | 40 mM | 10 mL | 0,4 mM |
| K2so4 | 40 mM | 10 mL | 0,4 mM |
| Fe (II)-EDTA | 9 mM | 10 mL | 0,9 mM |
| CaCl2 | 80 mM | 10 mL | 0,8 mM |
| 50x Micro-Elements stamlösning | - | 10 mL | - |
Tabell 5: sammansättning av 1/2-Hoagland32 medium som används för mycorrhization analyser. Sammansättningen av 50x Micro-Elements stamlösning är listad i tabell 6. Förbered FE (II)-EDTA lösning genom att kombinera FeSO4· 7h2O (9 mm) och na2· EDTA (9 mM) i 1 stamlösning och förvara vid 4 ° c. Justera pH-värdet för mediet till 6,1 med 1 M KOH och fyll med Ultra-Pure vatten till 1 L.
| Föreningar | Mängd per liter | Lager koncentration |
| H3bo3 | 71,1 mg | 1,15 mM |
| MnCl2· 4h2O | 44,5 mg | 0,22 mM |
| CuSO4· 5H2O | 3,7 mg | 23,18 μM |
| ZnCl2 | 10,2 mg | 74,84 μM |
| Na2Moo4· 2H2O | 1,2 mg | 4,96 μM |
Tabell 6: sammansättningen av 50x Micro-Elements stamlösning som används för att förbereda 1/2-Hoagland medium.
| Age of djur | Omvandlings effektivitet |
| Unga | 69,4 ± 6,2% (n = 2) |
| Mogna | 18,3 ± 10,2% (n = 15) |
Tabell 7: omvandlings effektivitet för P. andersonii. Här definieras omvandlings effektivitet som den procentuella andelen av djur som bildar minst 1 transgena förhårdnader eller shoot. Omvandlings effektivitet gjordes vid 6 veckor efter omvandling och avbildas som medelvärde ± SD. n anger antalet omvandlings experiment från vilka omvandlings effektiviteten bestämdes.
Kompletterande fil 1: översikt över nivå 1 och nivå 2 konstruktioner som används för CRISPR/Cas9 mutagenes. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Baljväxter och det avlägset besläktade Cannabaceae släktet parasponia representerar de enda två kladerna av växtarter som kan etablera ett endosymbiotiskt förhållande med kvävefixerande former och rotknölar. Jämförande studier mellan arter av båda kladerna är mycket relevanta för att ge insikter i de centrala genetiska nätverk som möjliggör denna symbios. För närvarande, genetiska studier görs främst i baljväxter; speciellt de två modell arterna M. minor och L. japonicus. För att ge en ytterligare experimentell plattform och underlätta jämförande studier med en nodulating icke-balanväxter, beskriver vi här ett detaljerat protokoll för stabil omvandling och omvänd genetiska analyser i P. andersonii. Det presenterade protokollet använder in vitro-spridning av T0 transgena P. andersonii -linjer, vilket gör det möjligt att inleda fenotypisk analys inom 4 månader efter samodling av A. tumefaciens . Detta är betydligt snabbare än nuvarande protokoll som har fastställts för stabil omvandling av baljväxter33. Detta gör P. andersonii en attraktiv forskningsmodell.
Det protokoll som beskrivs här innehåller flera kritiska steg. Den första gäller utsäde grobarhet. För att förbereda P. andersonii frön för grobarhet, frön måste isoleras från bären. Detta görs genom att gnugga Bären på en bit av silkespapper eller mot insidan av en tesil. Detta förfarande måste utföras försiktigt för att förhindra skador på utsäde pälsen. Om frö pälsen blir skadad, kan blekmedel in i utsäde under sterilisering, vilket minskar utsäde lönsamhet. För att bryta utsäde dormancy, frön utsätts för en 10-dagars temperaturcykel. Men trots denna behandling är grobarheten inte helt synkroniserad. Generellt, de första fröna visar rot uppkomst efter 7 dagar, men andra kan ta flera dagar längre tid att gro.
Kritiska punkter i omvandlingsförfarandet gäller valet av utgångsmaterial och varaktigheten av samodling steg. För att uppnå effektiv omvandling, är det bäst att använda friska och unga stammar eller bladskaft av icke-sterila växthusodling växter som utgångsmaterial. För att inducera tillväxten av unga grenar, är det tillrådligt att trimma Parasponia träd varje 2-3 månader och uppdatera träd en gång om året. Dessutom måste samodling steg endast utföras för 2 dagar. Långvarig samodling främjar över-kolonisering av vävnad djur av A. tumefaciens och i allmänhet minskar omvandlings effektiviteten. För att förhindra överkolonisering av A. tumefaciens är det också viktigt att regelbundet uppdatera plattorna på vilka djur odlas. I fall överkolonisering inträffar, vävnad djur kan tvättas (se avsnitt 3,8) för att ta bort A. tumefaciens celler. Vi rekommenderar att lägga blekmedel till SH-10 lösning som används för tvättning (slutlig koncentration: ~ 2% hypoklorit). Det är viktigt att notera att detta ytterligare tvättsteg kanske inte fungerar på tungt smittade djur (figur 2b). Om en omvandling med en CRISPR/Cas9-konstruktion ger endast ett begränsat antal putsat-transformerade skott eller om mutagenes av en viss gen förväntas orsaka problem i regenerering, är det tillrådligt att inkludera en tom vektor kontroll konstruktion som den positiva kontrollen. Slutligen är det viktigt att se till att alla transgena linjer som väljs är resultatet av oberoende T-DNA-integrationsevenemang. Därför instruerar vi att ta bara en enda putatively-transgena skjuta från varje sida av en explant. Vi inser dock att detta minskar det potentiella antalet oberoende linjer. Om många linjer krävs, kan forskarna besluta att separera putatively omvandlad Calli från den ursprungliga djur när dessa Calli är ≥ 2 mm i storlek och kultur dessa Calli självständigt. På detta sätt kan flera linjer isoleras från varje explant, vilket höjer antalet potentiella transgena linjer.
I det aktuella protokollet sprids transgena linjer av P. andersonii vegetativt genom in vitro-spridning. Fördelen med detta är att många transgena plantlets kan genereras i en relativt kort tidsperiod. Men denna metod har också flera begränsningar. För det första är upprätthållandet av T0 transgena linjer genom in vitro-spridning arbetsintensiva och kan resultera i oönskade genetiska eller epigenetiska förändringar34,35. För det andra, T0 linjer innehåller fortfarande en kopia av t-DNA, inklusive antibiotikaresistens kassetten. Detta begränsar antalet möjliga omtransformeringar, eftersom olika markerings markörer krävs för varje omomvandling. För närvarande har vi bara testat omvandling med kanamycin eller hygromycin urval (data som inte visas). Dessutom komplierar närvaron av Cas9-kodningssekvensen och sgRNAs i T0 transgena linjer kompletterings studier. Kompletterings analyser är möjliga men kräver att sgRNA målwebbplats (er) muteras som sådan att genredigering av komplemen konstruktionen förhindras. För det tredje, en nackdel med att arbeta med T0 linjer är att CRISPR/Cas9 mutanter kan vara chimeric. För att förhindra fenotypisk analys av chimär Mutant linjer, rekommenderar vi att upprepa genotypning analys efter in vitro-spridning på minst 3 olika skott. Även om antalet chimär mutanter som erhållits med hjälp av protokollet som beskrivs här är begränsad, de är ibland observeras10. För att övervinna begränsningarna av att arbeta med T0 linjer, P. andersonii Mutant linjer kan spridas Generativt. P. andersonii träd är tvåbyggare och vind-pollinerade2. Detta innebär att varje transgen linje måste manipuleras så att manliga och kvinnliga blommor produceras på en enda individ, och därefter odlas som sådan att kors pollinering inte förekommer. Som P. andersonii är ett snabbväxande träd det kräver en stor mängd utrymme i ett tropiskt växthus (28 ° c, ~ 85% relativ fuktighet). Därför, även om det är tekniskt möjligt, generativ utbredning av P. andersonii transgena linjer är logistiskt utmanande.
I protokollet avsnitt, beskrev vi 3 metoder för nodulationen av P. andersonii. Fördelen med plattan och påsen system är att rötterna är lättillgängliga, vilket kan tillåta spot-inympning av bakterier och efter knöl bildas över tiden. Men plattan systemet är ganska arbetsintensiva, vilket gör det mindre lämpad för storskaliga nodulationen experiment. En nackdel med påsen systemet är att det är svårt att förhindra svampangrepp. Påsar är inte sterila, och därför svamp tillväxt observeras ofta på den övre halvan av påsen. Emellertid, detta påverkar inte P. andersonii tillväxt, och därför inte stör nodulationen analyser. Dessutom är påsen systemet endast lämplig för plantor. Trots flera försök, har vi inte kunnat odla plantlets erhålls genom in vitro-förökning i påsar.
Den P. andersonii omvänd genetik pipeline som beskrivs här erbjuder en betydande förbättring jämfört med den befintliga a. rhizogenes-baserade rot omvandling metod11. Med hjälp av de beskrivna procedurerna kan stabila transgena linjer genereras effektivt och kan upprätthållas via in vitro-spridning. I motsats, A. rhizogenes omvandling är övergående och endast resulterar i bildandet av transgena rötter. Eftersom varje transgen rot resultat från en oberoende omvandling, A. rhizogenes omvandling-baserade analyser lider av betydande fenotypisk variation. Denna variation är mycket mindre i händelse av stabila linjer, även in vitro-spridning skapar också en viss nivå av variation. På grund av denna reducerade variation och det faktum att flera plantlets skulle kunna fenotypas för varje stabil linje, är stabila linjer mer lämpade för kvantitativa analyser jämfört med A. rhizogenes-transformerade rötter. Dessutom är den stabila omvandlingen inte beroende av införandet av A. rhizogenes root inducerande Locus (ROL) som påverkar endogena hormonbalansen15. Därför är stabila linjer bättre lämpade för omvänd genetisk analys av gener involverade i hormon homeostas jämfört med A. rhizogenes-transformerade rötter. En mer allmän fördel av P. andersonii som forskningsmodell är att den inte upplever en nyligen hela genomduplicering (wgd). Den baljväxter papilionoideae under familj, som omfattar modellen baljfrukter M. minor och L. japonicus, liksom Salicaceae (Beställ Malpighiales) som innehåller modellen trädet Populus trichocarpa erfarna wgds ~ 65 miljoner år sedan36,37. Många paralogous genkopior till följd av dessa wgds behålls i genomen hos av M. minor, L. japonicus och P. trichocarpa37,38,39, vilket skapar redundans som kan komplicera omvända genetiska analyser. Som p. andersonii inte upplever en nyligen wgd, omvänd genetiska analyser på P. andersonii kan vara mindre påverkas av redundant funktion av paralogous genkopior.
Sammantaget ger vi ett detaljerat protokoll för omvänd genetisk analys i P. andersonii. Med hjälp av detta protokoll kan enstaka muterade linjer effektivt genereras inom en tidsram på 2-3 månader10. Detta protokoll kan utökas för att skapa högre ordningens mutanter genom multiplexering av sgrnas som riktar sig mot olika gener samtidigt, vilket visas för andra växtarter40,41,42. Dessutom är den stabila omvandlings procedur som beskrivs här inte begränsad till CRISPR/Cas9 gen inriktning, utan kan också användas för att introducera andra typer av konstruktioner (t. ex. för promotorn-reporter-analyser, ektopisk uttryck eller trans- komplementarisering). Vi etablerade P. andersonii som en jämförande forskningsmodell för att studera mutualistiska symbioser med kvävefixerande former eller endomycorrhizal svampar. Men de protokoll som beskrivs här ger också verktyg för att studera andra aspekter av biologi i denna tropiska träd, såsom trä formation, utveckling av bi-sexuella blommor eller biosyntesen av Cannabaceae-specifika sekundära metaboliter.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna mark youles, Sophien kamoun och Sylvestre Marillonnet för att göra Golden Gate kloning delar tillgängliga via Addgene databasen. Dessutom skulle vi vilja tacka E. James, P. Hadobas, och T. J. Higgens för P. andersonii frön. Detta arbete stöddes av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO-VICI Grant 865.13.001; NWO-Open Competition Grant 819.01.007) och Republiken Indonesiens ministerium för forskning, teknik och högre utbildning (RISET-PRO Grant 8245-ID).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sigma-Aldrich | N0640 | NAA | |
| Duchefa Biochemie | M1503.0250 | MES | |
| Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone | |
| Duchefa Biochemie | X1402.1000 | X-Gal | |
| Merck | 101236 | For nucleic acid electrophoresis gel | |
| - | - | Pouches box material, hangers | |
| Merck | 101188 | NH4NO3 | |
| Sigma-Aldrich | B3408-1G | BAP | |
| Merck | 100156 | H3BO3 | |
| Thermo-Fisher | ER1011 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly | |
| Thermo-Fisher | 15561020 | Used in Golden Gate cloning assembly | |
| Merck | 137101 | CaCl2·2H2O | |
| Duchefa Biochemie | C0111.0025 | C16H16N5O7S2Na | |
| Thermo-Fisher | K1231 | Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure | |
| Agronutrition | AP2011 | Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay | |
| Merck | 102790 | CuSO4·5H2O | |
| Duchefa Biochemie | D1004.1000 | Used for plant tissue culture agar-based medium | |
| Merck | 105101 | K2HPO4 | |
| VWR Chemicals | 20302.293 | Na2·EDTA | |
| Duchefa Biochemie | M0803.1000 | C6H14O6 | |
| Thermo-Fisher | ER0291 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly | |
| Merck | 100983 | C2H5OH | |
| VWR Chemicals | BDH9232-500G | EDTA | |
| Sigma-Aldrich | Z377600-1PAK | Cellophane membrane | |
| Biomatters, Ltd. | R9 or higher | Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs | |
| Mega International | - | Technical information at https://mega-international.com/tech-info/ | |
| Sigma-Aldrich | 65882 | Used for fixating nodule tissues | |
| VWR Chemicals | 24385.295 | - | |
| Vink | 219341 | Pouches box material, bottom part | |
| Leica Biosystems | 14702218311 | Used as a template for plastic embedding | |
| Merck | 100317 | HCl | |
| Sigma-Aldrich | I5386-1G | IBA | |
| Merck | 103862 | C6H5FeO7 | |
| Merck | 103965 | FeSO4O·7H2O | |
| Duchefa Biochemie | I1401.0005 | IPTG | |
| Duchefa Biochemie | K0126.0010 | ||
| Sigma-Aldrich | L2000 | ||
| Merck | 105886 | MgSO4O·7H2O | |
| Merck | 105934 | MnCl2·4H2O | |
| Merck | 102786 | MnSO4O | |
| Duchefa Biochemie | M1002.1000 | Used for bacterial culture agar-based medium | |
| Manutan | 92007687 | Pouches material | |
| Paraxisdienst | 130774 | Elastic sealing foil | |
| Pull Rhenen | Agra-Perlite No.3 | Used as growing substrate in pots for nodulation assay | |
| VWR Chemicals | 391-0581 | Used as container for cellophane membranes | |
| Thermo-Fisher | F130WH | For genotyping transgenic lines | |
| Addgene | 50337 | Level 0 terminator, 3’UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus) | |
| Addgene | 48017 | End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor | |
| Addgene | 48018 | End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor | |
| Addgene | 48001 | Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation | |
| Addgene | 48007 | Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation | |
| Addgene | 50268 | Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5’UTR, Ω (Tobacco Mosaic Virus) | |
| Addgene | 46966 | Used for designing CRISPR/Cas9 module | |
| Addgene | 46968 | Used for designing CRISPR/Cas9 module | |
| Addgene | 50334 | Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette | |
| Topzeven | - | Used as filters for washing spore suspension | |
| Sigma-Aldrich | 8.17003 | PEG400 | |
| Duchefa Biochemie | E1674.0001 | Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings | |
| Merck | 104871 | KH2PO4 | |
| Merck | 105033 | KOH | |
| Merck | 105153 | K2SO4O | |
| Van Leusden b.v. | - | Used as growing substrate for mychorrhization assay | |
| Duchefa Biochemie | S0225.0050 | SH-basal salt medium | |
| Duchefa Biochemie | S0411.0250 | SH-vitamin mixture | |
| Lehle Seeds | VIS-02 | Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation | |
| Merck | 137017 | NaCl | |
| VWR Chemicals | 89230-072 | C6H11NaO7 | |
| Merck | 106521 | Na2MoO4·2H2O | |
| Merck | 106574 | Na2HPO4·7H2O | |
| Merck | 567549 | NaH2PO4·H2O | |
| Sigma-Aldrich | 239313 | Na2SO4O | |
| Duchefa Biochemie | S0809.5000 | C12H22O11 | |
| Thermo-Fisher | B69 | Used in Golden Gate cloning assembly | |
| Thermo-Fisher | EL0013 | Used in Golden Gate cloning assembly | |
| Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64708806 | Methyl methacrylate-based resin powder | |
| Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64709003 | HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution | |
| Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 66022678 | Methyl methacrylate-based resin solution | |
| Merck | 1159300025 | ||
| Acros | 189350250 | ||
| VWR Chemicals | 663684B | Polysorbate 20 | |
| Stout Perspex | - | pouches box material, lid | |
| Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | ||
| Merck | 108816 | ZnCl2 | |
| Alfa Aesar | 33399 | ZnSO4O·7H2O |
References
- Clason, E. W. THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA). Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).
- Soepadmo, E. Ulmaceae. Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).
- Becking, J. H. The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia. Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).
- Oldroyd, G. E. D. Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants. Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).
- Gutjahr, C., Parniske, M. Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).
- van Velzen, R., et al. Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).
- van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation. Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).
- Griesmann, M., et al. Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis. Science. 1743, eaat1743 (2018).
- Becking, J. H. Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae). Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).
- van Zeijl, A., et al. CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes. Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).
- Cao, Q., et al. Efficiency of Agrobacterium rhizogenes–mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent. Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).
- Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).
- Nilsson, O., Olsson, O. Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots. Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).
- Davey, M. R., et al. Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium. Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).
- Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia. Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).
- Op den Camp, R., et al. LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia. Science. 331, 909-912 (2011).
- Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs. PLOS ONE. 6, e16765 (2011).
- Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).
- Bertani, G. Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli. Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).
- Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).
- Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).
- Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium. Biotechnology. 9, 963-967 (1991).
- Op den Camp, R. H. M., et al. N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).
- Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli. Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).
- Martinez-Romero, E., et al. Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).
- Felten, J., et al. The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling. Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).
- Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. Mesure du taux de mycorhization VA d’un systeme radiculaire. Recherche de methods d’estimation ayant une signification fonctionnelle. Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).
- Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).
- Becking, J. H. The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions. Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).
- Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).
- Wang, K. Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, Humana Press. (2015).
- Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. Epigenetics in plant tissue culture. Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).
- Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. Somaclonal variation — a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).
- Cannon, S. B., et al. Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).
- Tuskan, G. A., et al. The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray). Science. 313, 1596-1604 (2006).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520 (2011).
- Sato, S., et al. Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus. DNA Research. 15, 227-239 (2008).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).
- Lowder, L. G., et al. A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation. Plant Physiology. 169, 971 (2015).
- van Zeijl, A. Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , Wageningen University. (2017).
