Summary
We presenteren een protocol voor het gebruik van een proteïne-Microarray die is geconstrueerd door het afdrukken van influenza-antigenen op nitrocellulose gecoate dia's om gelijktijdig sonde serum te gebruiken voor meervoudige antilichaam isotypes tegen meer dan 250 antigenen van verschillende virusstammen, dus het meten van de breedte van serum antilichamen over virus subtypen mogelijk te maken.
Abstract
Het influenzavirus blijft wereldwijd een belangrijke oorzaak van sterfte door de beperkte effectiviteit van de momenteel beschikbare vaccins. Een belangrijke uitdaging voor de ontwikkeling van universele influenzavaccins is een hoge antigene diversiteit als gevolg van antigene drift. Het overwinnen van deze uitdaging vereist nieuwe onderzoeksinstrumenten om de breedte van serum antilichamen gericht tegen veel virusstammen over verschillende antigene subtypen te meten. Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van de breedte van serum antilichamen tegen diverse influenzavirus stammen met behulp van een eiwit microarray van influenza antigenen.
Deze influenza antigeen Microarray wordt geconstrueerd door het afdrukken van gezuiverde gemaggljutininovuju en neuraminidase antigenen op een membraan met nitrocellulose coating met behulp van een microarray printer. Menselijke sera worden geïnineerd op de microarray om antilichamen tegen de influenza-antigenen te binden. Quantum-Dot-geconjugeerde secundaire antilichamen worden gebruikt om gelijktijdig IgG-en IgA-antilichamen te detecteren die aan elk antigeen op de microarray zijn gebonden. Kwantitatieve antilichaam binding wordt gemeten als fluorescentie intensiteit met behulp van een draagbare Imager. Representatieve resultaten tonen aan dat de reproduceerbaarheid van de assay bij het meten van subtype-en kruisreactieve influenza-antilichamen in menselijke sera wordt aangetoond.
Vergeleken met traditionele methoden zoals ELISA, biedt de influenza antigeen Microarray een multiplexed benadering met een hoge doorvoer die in staat is om honderden sera te testen op meervoudige antilichaam isotypes tegen honderden antigenen in een kort tijdsbestek, en heeft dus toepassingen bij sero-surveillance en vaccin ontwikkeling. Een beperking is het onvermogen om bindende antilichamen te onderscheiden van neutraliserende antilichamen.
Introduction
Het influenzavirus is verantwoordelijk voor een verlies van 20.000.000 levensjaren per jaar door overlijden of invaliditeit, waaronder 1% van alle sterfgevallen wereldwijd elk jaar, met onevenredige gevolgen voor ouderen en populaties in de tropen en ontwikkelingslanden1, 2,3. Naast de ziektelast van seizoensgebonden epidemieën, kan de opkomst van nieuwe influenzastammen via genetische re-assortiment hetzij natuurlijk in gemeenschappelijke gastheren of kunstmatig voor bioterrorisme leiden tot wereldwijde pandemieën met snelle verspreiding en hoge letaliteit 4 , 5. Hoewel er momenteel talrijke influenzavaccins beschikbaar zijn, wordt de effectiviteit ervan beperkt door het subtype specificiteit6, wat de noodzaak creëert om universele influenzavaccins te ontwikkelen die langdurige immuniteit tegen meerdere virussen verlenen stammen7.
Een belangrijke uitdaging voor de ontwikkeling van universele griepvaccins is een hoge antigene diversiteit over stammen. De antigene specificiteit van de huidige vaccins gecombineerd met antigene variatie van circulerende virussen creëert een mismatch tussen vaccinstammen en circulerende stammen. Dit geeft een evolutionaire voordeel ten gunste van verdere genetische drift weg van vaccinstammen tijdens een epidemie, waardoor de werkzaamheid van het vaccin vaak tot minder dan 50%8,9wordt beperkt. Een extra bron van antigene mismatch is ei-adaptieve virale mutaties gegenereerd tijdens de vervaardiging van vaccins, die leiden tot antilichamen die slecht binden aan circulerende virussen10,11.
Het overwinnen van deze uitdaging van hoge antigene diversiteit zal nieuwe onderzoeksinstrumenten vereisen om de breedte van reeds bestaande en ontlokken immuunresponsen te karakteriseren over klinisch relevante antigene varianten in serum en mucosale specimens. De momenteel beschikbare methoden, waaronder hemagglutinatie remming (HAI), microneutralisatie (MN) en traditionele ELISA, zijn beperkt tot het opsporen van antilichamen tegen een enkele virusstam op een tijdstip, zodat het gebruik voor detectie van meervoudige antilichaam isotypes tegen meerdere virusstammen snel uitlaten beschikbaar klinisch monster en laboratorium middelen. Bovendien, HAI en MN vereisen levende virus cultuur die alleen beschikbaar in gespecialiseerde laboratoria.
Eiwit Microarrays, die mogelijk bestaan uit maximaal duizenden antigenen die worden gedrukt op glaasjes met nitrocellulose coating zoals afgebeeld in Figuur 1, kunnen deze noodzaak vullen12. Deze micro arrays kunnen worden geproduceerd en geprobed op een hoge doorvoer wijze tijdens het nuttigen van kleine hoeveelheden klinisch monster om kwantitatieve antilichaam Isotype/subtype niveaus tegen elk afzonderlijk antigeen op de array te bepalen. Deze benadering van antigeen detectie is toegepast op diagnostische en vaccin ontwikkeling tegen meerdere infectieuze pathogenen13. Tot nu toe hebben we eiwit arrays geproduceerd voor meer dan 35 pathogenen, waaronder meer dan 60.000 in totaal uitgedrukt eiwitten en gebruikten ze om meer dan 30.000 menselijke sera te sonde van geïnfecteerde en controlepersonen. Een recent ontwikkeld Portable Imaging platform voor Microarray slides heeft deze methodologie toegankelijker gemaakt voor de eindgebruiker14.
Voortbouwend op uitgebreid vorig werk door meerdere bijdragers in het veld15,16,17,18,19, werd onlangs een influenza proteïne-Microarray ontwikkeld die meer dan 250 gezuiverde gemaggljutininovuju (ha) antigene varianten met vertegenwoordiging van alle 18 subtypen12,20. Met behulp van deze methodologie werd aangetoond dat een natuurlijke influenza infectie grotendeels reactieve IgG-en IgA-antilichamen tegen fylogenetisch gerelateerde HA-subtypen genereerde, terwijl intramusculaire Influenzavaccinatie alleen subtype-specifieke IgG- antilichamen21. Echter, het toevoegen van een adjuvans die Toll-achtige receptoren voor influenzavaccins activeert, werd aangetoond dat het de ontdoelde IgG-antilichaamrespons over HA-subtypen in dierstudies22verbreed.
Deze Microarray wordt momenteel gebruikt voor het onderzoeken van sera verzameld uit een prospectieve cohortstudie van studenten die werden gevolgd voor influenza infectie. Hier wordt de methodologie van de influenza antigeen Microarray met demonstratie van de reproduceerbaarheid van de assay voor het opsporen van subtype-specifieke en kruisreactieve antilichamen in een subset van specimens van deze studie gerapporteerd.
Protocol
Alle menselijke sera worden behandeld en afgevoerd volgens goedgekeurde institutionele protocollen voor bioveiligheid met gebruik van beschermende persoonlijke apparatuur. Alle laboratoriummedewerkers die aan dit protocol deelnemen, hebben opleiding op het gebied van bioveiligheid en onderzoek ethiek ontvangen.
1. Maak influenza antigeen micro arrays
-
Ontwerp en verkrijg antigeen set voor Microarray
- Verkrijgen van uitgedrukt en gezuiverd eiwit antigenen als gelyofiliseerd poeder.
-
Antigenen afdrukken op microarray-dia's
- Reconstitueer elk gelyofiliseerd antigeen tot een concentratie van 0,1 mg/mL in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,001% tween-20 (T-PBS). Breng 10 μL van elk gereconstitueerd antigeen over in afzonderlijke putjes van een onbehandelde 384-goed vlakke bodemplaat.
- Print antigenen met behulp van een microarray-printer (de microarray-printer die in deze studie wordt gebruikt, is niet langer commercieel beschikbaar, Zie discussie) met laag volume-spotting pinnen die antigeen in het monster kanaal aspireren en storten via directe contact-en capillaire werking op 16-pad nitrocellulose gecoate glasplaten.
- Program meer de afdruksoftware (bijv. Gridder) met de configuratie van de bron plaat en de druk parameters.
- Gebruik het keuzemenu om de naam te selecteren van het plaat type dat met deze afdrukmethode wordt gebruikt. Gebruik voor deze studie een onbehandelde 384-goed vlakke bodemplaat.
- Selecteer het tekstvak naast het aantal platen en typ het aantal voorbeeld platen dat in dit afdruk protocol wordt gebruikt. Voor deze studie, gebruik 1 plaat.
- Selecteer een pincode configuratie die u met deze methode wilt gebruiken. Gebruik voor deze studie een 8-polige configuratie.
- Zorg ervoor dat de oorsprong verschuivingen zijn de afstanden (in de X-en Y-richtingen) tussen de oorsprong van de dia (die is gekalibreerd in de sectie administratief) en de locatie waar de afdrukken pinnen zal beginnen met afdrukken op de dia's.
- Definieer met behulp van het tabblad matrix ontwerp de grootte en vorm van de matrices (punt afstand en aantal puntjes per subarray). Voor deze studie, afdrukken 324 vlekken (180 μm diameter met 300 μm afstand) op 16-pad dia's in een 18 x 18 formaat met behulp van 8 pinnen.
- Selecteer de parameters voor het ophalen van de afdruk pennen en het doseren van monsters. Voor deze studie, elke pin het 250 nl van antigeen oplossing en drukt 1 nl op elk van 40 vlekken (totaal van 20 dia's voor alle 8 pinnen)
- Configureer het PIN-reinigings protocol en het blotting-protocol. Voor deze studie, elke pin afdrukken antigeen, wordt gedoopt in steriele DDH2O in gesoniceerde Wash container, en vervolgens het volgende antigeen.
- Definieer de volgorde waarin de voorbeeld blokken op de dia's worden afgedrukt. De array-software zal een raster indexbestand (. Gal) met aantekeningen maken om de rangschikking van antigenen binnen elke Microarray te beschrijven.
Opmerking: de bovenste rij wordt gebruikt voor fiduciaire (met fluorescentie bij alle golflengten die worden gebruikt bij beeldvorming, bijv. mix van Qdot 585 nm streptavidine conjugaat en Qdot 800 nm streptavidine geconjugeerde in deze studie) om rasters te oriënteren tijdens beeldvorming. Voor lange druk runs kunnen antigenen in de bron plaat periodiek opnieuw worden opgehangen door pipetteren op en neer en vervolgens centrifugeren, of nieuwe bron plaat kunnen worden voorbereid en gebruikt.
- Program meer de afdruksoftware (bijv. Gridder) met de configuratie van de bron plaat en de druk parameters.
- Plaats de niet-gepropade Microarray glaasjes in een lichtwerende doos en bewaar in een exsiccator kast bij kamertemperatuur voor langdurige opslag.
Opmerking: het protocol kan op dit moment voor onbepaalde tijd worden onderbroken.
-
Voer kwaliteitscontrole uit (poly-histidine-Tags vereist)
- Bevestig de dia aan het aftasten van de kamers en hydrateer met de blokkerende buffer zoals beschreven in stap 2.1.1-2.1.2 en weergegeven in Figuur 2.
- Verdun de muis monoklonaal poly-zijn antilichaam 1:100 in gefilterde 1x blokkerende buffer.
Opmerking: als niet-gezuiverde eiwit antigenen (bijv. uitgedrukt in in vitro transcriptie en vertaalsysteem) direct worden gebruikt om micro arrays af te drukken, voeg dan componenten van het eiwit expressie systeem (bijv. e. coli lysaat) toe in een verhouding van 1:10 met de blokkerende buffer die wordt gebruikt voor serumverdunning om eventuele antilichamen tegen deze componenten te blokkeren. - Voeg 100 μL verdund poly-his-antilichaam toe aan elke schuif kamer met array pad na aspiratie en inbroed gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of gedurende een nacht bij 4 °C op Shaker. Was 3x met T-TBS buffer zoals beschreven in stap 2.2.1. Verdun Biotine-geconjugeerde geit anti-muis IgG secundair antilichaam 1:200 in blokkerende buffer, voeg 100 μL per put na aspiratie, en incuberen voor 1 h bij kamertemperatuur op Shaker. Was 3x met T-TBS buffer.
- Verdun Qdot 585 nm streptavidine geconjugeerde tot 4 nM in blokkerende buffer, voeg 100 μL toe per put na aspiratie, en incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op Shaker. Was 3x met T-TBS buffer, en dan eenmaal met TBS buffer (zonder tween).
- Stap en kwantificeren dia's zoals beschreven in stap 2.2.5 – 3.1.2.
Opmerking: proteïne-antigenen moeten zijn10 -tags bevatten om dit kwaliteitscontrole protocol te gebruiken. Als alternatief, als een andere tag is opgenomen, kan kwaliteitscontrole worden uitgevoerd met antilichamen of ligand voor die tag.
2. sonde sera voor influenza antilichamen met behulp van micro arrays
-
Incubate sera op micro arrays voor antilichaam binding
- Koppel Microarray dia's aan kamers met behulp van clips en plaats ze in frames zoals weergegeven in Figuur 3.
Opmerking: Vermijd altijd het aanraken van de microarray pad met handen en instrumenten. Zorg ervoor dat de dia's zijn georiënteerd met de pad zijde omhoog en de kleine inkeping in de rechterbovenhoek. - Rehydraat Microarray-dia's met 100 μL per put van gefilterde 1-blokkerende buffer en Verdun serum 1:100 in 100 μL blokkerende buffer (kan onbehandelde 96-goed platen of 2 mL buizen gebruiken). Inincuberen beide rehydrateerde Microarray glaasjes in bedekte frames en verdunde sera afzonderlijk gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op het rondschudapparaat bij 100-250 rpm. Voer alle daaropvolgende incubatie stappen op dezelfde manier uit op de shaker.
Opmerking: sera moeten worden gealicteerd en bevroren bij-80 °C voor langdurige opslag om vries dooi cycli te minimaliseren en moeten worden gecentrifugeerd om deeltjes vóór gebruik te verwijderen. Observeer de schuif kamers zorgvuldig tijdens en na deze stap om lekkages op te sporen waarvoor Hermontage van de schuif kamers nodig is. - Gebruik pipetpunten die zijn aangesloten op een Vacuümleiding met de secundaire opvangkolf en zuig de blokkeerbuffer voorzichtig uit de hoek van elke kamer zonder dat u de pads aanraakt. Voer alle daaropvolgende aspiratie stappen op dezelfde manier uit. Voeg na de aspiratie snel verdunde sera toe aan de pads om de pads niet te laten drogen.
- Plaats bedekte frames in trays in een secundaire container, omringd door vochtige papieren handdoeken en verzegeld om verdamping te voorkomen. Inincuberen 's nachts bij 4 ° c op Rocking Shaker (alternatief, kan inincuberen voor 2 h bij kamertemperatuur op de rondschudder bij 100-250 rpm).
- Koppel Microarray dia's aan kamers met behulp van clips en plaats ze in frames zoals weergegeven in Figuur 3.
-
Met een label gebonden serum antilichamen met kwantum-dot-geconjugeerde secundaire antilichamen
- Aspirate sera van kamers zorgvuldig zoals hierboven beschreven, voeg toe 100 μL per put van T-TBS buffer (20 mM tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 in ddH2O aangepast aan pH 7,5 en gefilterd, kan commercieel worden verkregen), en inincuberen gedurende 5 min op orbitaal Shaker bij 100-250 rpm. Herhaal deze Wash stap in totaal 3x (alle daaropvolgende wasstappen worden op dezelfde manier uitgevoerd).
- Bereid mengsel van secundaire antilichamen verdund tot 1 μM in blokkerende buffer en meng grondig door pipetteren voorafgaand aan en tijdens gebruik om de homogeniteit te behouden.
Opmerking: om de reproduceerbaarheid van de assay te handhaven, moet dezelfde partij van elk secundair antilichaam worden gebruikt voor alle indringende experimenten waarvoor kwantitatieve vergelijking van gegevens tussen experimenten is gepland. De specifieke concentratie van secundair antilichaam moet mogelijk worden gevarieerd, afhankelijk van de affiniteit; Volg de protocollen van de fabrikant wanneer deze beschikbaar zijn. - Aspiratie buffer van de kamers na de laatste wasbeurt, voeg 100 μL per put van het secundaire antilichaam mengsel toe en incuberen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op Shaker.
- Aspirate secundair antilichaam mengsel 3 x met T-TBS buffer, en vervolgens wassen met TBS buffer (zonder tween).
- Stap Microarray schuift van kamers voorzichtig om aanraakt pads te vermijden, spoel zachtjes met gefilterde ddH2O en droog door in 50 ml buizen en centrifugeren bij 500 x g gedurende 10 minuten te plaatsen.
- Plaats doorzochte Microarray glaasjes in een lichtwerende doos en bewaar in een exsiccator kast bij kamertemperatuur voor lange termijn opslag.
Opmerking: het protocol kan op dit moment tot 1 week worden onderbroken.
3. kwantificeren antilichamen binding aan antigenen binnen Microarray
-
Visualiseer Microarray dia's en Kwantificeer de intensiteit van de spot fluorescentie om antilichaam binding te meten
- Verkrijg afbeeldingen van Microarray-dia's met behulp van de draagbare Imager met ingebouwde software.
- In de Imager configureren tabblad, selecteert u de juiste dia-configuratie. Voor deze studie, gebruik 16-pad dia's.
- Selecteer in het tabblad Image Control het juiste fluorescerende kanaal en pas de versterking, de belichtingstijd en de acquisitie tijd aan, afhankelijk van de reactiviteit van de sera om optimale beelden te verkrijgen. Voor deze studie waren de fluorescerende kanalen voor IgA en IgG respectievelijk 585 nm en 800 nm, en imaging-instellingen waren winst van 50, belichtingstijd van 500 MS en acquisitie tijd van 1 s.
- Klik op Capture om het proces van het verwerven van de afbeelding te starten.
Opmerking: Microarray-dia's kunnen opnieuw worden gefotografeerd op meerdere instellingen zonder degradatie van het signaal, zolang ze donker en droog zijn opgeslagen. Andere beeldvormingssystemen kunnen worden gebruikt als deze compatibel zijn met de dia's.
- Detecteer array spots met behulp van rasters die zijn georiënteerd op basis van de fiducial-markeringen en meet de steunintensiteit als mediaan van de pixel intensiteit minus de achtergrond die wordt gemeten rond vlekken. Voer dit kwantificerings algoritme in batch uit met behulp van de ingebouwde Imager-software, die het. Gal-bestand gebruikt dat in stap 1.2.2 is gebouwd om de steunintensiteiten aan afzonderlijke antigenen op elke Microarray aan te sluiten.
- Upload het. Gal-bestand in het deelvenster bestands info door de map op de computer te selecteren en de map op te geven waarin de analyse-uitvoerbestanden moeten worden opgeslagen in de sectie analyse opties .
- Open in het tabblad Image Control een van de verkregen afbeeldingen die moeten worden gekwantificeerd en selecteer de knop automatisch in de rechterbovenhoek.
- In de sectie array analyse in de rechterbenedenhoek maakt u een fiducial-sjabloon volgens de instructies van de software.
- Klik op de batch analyse, selecteer de map die de te kwantificeren afbeeldingen bevat en selecteer de fiducial-sjabloon die in de vorige stap is gemaakt. De software analyseert elk beeld en kwantificeert de steunintensiteit.
Opmerking: deze stap genereert een. CSV-bestand met spot intensiteiten die de antilichamen kwantificeren in elk serummonster dat aan elk afzonderlijk antigeen bindt op de Microarray die vervolgens kan worden gemanipuleerd in spreadsheet manipulatie of analyse software.
- Analyseer RAW-gegevens om antilichaam binding te vergelijken met antigenen en over serummonsters. Voor deze studie werden IgA-en IgG-antilichamen gemeten als 585 nm en 800 nm fluorescerende vlek intensiteiten vergeleken met alle antigenen tussen 2 onafhankelijke uitvoeringen van het experiment met verschillende dia's op verschillende dagen, en correlatieanalyse werd uitgevoerd om reproduceerbaarheid van de assay meten.
Opmerking: voor niet-gezuiverde eiwitten die worden afgedrukt als expressie mengsel, moet gegevensanalyse beginnen met achtergrond aftrekken van een geen DNA-controle.
- Verkrijg afbeeldingen van Microarray-dia's met behulp van de draagbare Imager met ingebouwde software.
Representative Results
Als demonstratie van het protocol werden de baseline sera onderzocht door 16 individuen binnen een prospectieve cohortstudie van studenten gevolgd voor influenza infectie op het influenza antigen Microarray. Om de reproduceerbaarheid van de assay te demonstreren, werden deze specimens tweemaal geproreven, op verschillende dia's en op verschillende dagen.
Voor deze studie, gezuiverde influenza antigenen met zijn10 Tags werden verkregen van commerciële leverancier (Zie tabel van de materialen) en medewerkers. Deze antigenen omvatten 251 totaal HA antigenen, met 63 bolvormige hoofddomeinen (HA1) en 186 volledige eiwitten (HA0), met inbegrip van 96 monomere HA0 eiwitten en 90 getrimeriseerde HA0 eiwitten met gesmolten trimerization ("foldon") domein23. Een volledige lijst van antigenen en controles die in deze studie worden gebruikt, is opgenomen als een aanvullend dossier. Voor deze studie waren secundaire antilichamen die werden gebruikt geit anti-humaan IgG geconjugeerd met kwantum stippen die uitstralen bij 800 nm (GAH-IgG-Q800) en geit anti-humane IgA geconjugeerd aan Quantum Dot die op 585 nm uitstraalt (GAH-IgA-Q585) voor multiplex detectie van IgG-en IgA-antilichamen als weergegeven in Figuur 3. IgG-en IgA-antilichaam binding aan verschillende subtypen en moleculaire vormen van influenza-HA-antigenen werden vergeleken voor sera die werden verkregen uit het hierboven beschreven klinisch cohort.
De resulterende heatmap wordt weergegeven in Figuur 4 met grafische weergave in Figuur 5. In deze cijfers zijn alleen de klinisch relevante subtypen met hoge representatie op de array gelabeld om ruimte te besparen, met "+" die alle resterende subtypen van een hoger getal aangeeft, en kleine of minder goed vertegenwoordigde subtypen opgenomen zoals besteld (bijv. h2 tussen H1 en H3). Een volledige lijst van stammen en subtypen op de array is opgenomen als aanvullend bestand. Deze gegevens tonen aan dat antilichamen tegen de hoofdgroep van HA subtype-specifiek zijn met verwachte hoge hoeveelheid antilichamen tegen klinisch voorkomende stammen (H1N1, H3N2 en B) en lage hoeveelheid antilichamen tegen andere stammen. Echter, antilichamen tegen de hele HA, die het stalken domein omvat, zijn meer cross-reactieve over subtypen, en dit effect lijkt te worden verhoogd wanneer de hele HA wordt getrimeriseerd. Dit resultaat is niet onverwacht, want de hele HA omvat de stem-regio, die sterk wordt geconconserde over subtypen. Daarom zijn antilichamen tegen hele HA-moleculen van niet-klinische subtypen (bijv. H5 en H7) waarschijnlijk anti-stam antilichamen die oorspronkelijk zijn opgewekt tegen klinische subtypen (bijv. H1 en H3) die cross-reageren met de stem-gebieden van de andere HA-subtypen. op de array. Dit punt illustreert het belang van het opnemen van zowel het hoofd HA als het gehele molecuul HA op de array om onderscheid te maken tussen antilichamen tegen het hoofd en de stem-gebieden die verschillende reactiviteits profielen vertonen.
De assay toont een goede reproduceerbaarheid over de indringende runs. De tweede run toont iets lagere IgG antilichamen over alle stammen, hoewel het patroon tussen de stammen consistent is. Deze lichte afname aan de overkant is waarschijnlijk te wijten aan batch-naar-batch variabiliteit in het secundaire antilichaam, die werd veranderd tussen runs voor IgG, maar niet voor IgA. Zoals in het protocol is opgemerkt, wordt daarom aanbevolen om dezelfde partij van elk secundair antilichaam te gebruiken voor experimenten waarbij kwantitatieve vergelijking wordt gepland. Als er verschillende partijen antilichamen nodig zijn vanwege een groot aantal te testen monsters, raden we aan om gedeelde monsters tussen experimentele runs met verschillende antilichaambatches te gebruiken om kwantitatieve vergelijking met correctie mogelijk te maken.
Figuur 1: schematische eiwit-microarray. Elke dia bevat meerdere pads met elk een enkele array, die bestaat uit honderden antigenen gedrukt op vlekken in een rooster, waarbij elke plek met één antigeen geadsorreven op de 3-dimensionale topografie van het nitrocellulose oppervlak waarop antilichamen van serum zijn gebonden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: schematische voorstelling van influenza antigeen Microarray Printing en indringende protocol. Van links naar rechts wordt Microarray bedrukt met nitrocellulose-gecoate dia's, die worden gebruikt om sera te sonde voor IgG-en IgA-antilichamen met behulp van kwantumgeconjugeerde secundaire antilichamen, met plaatjes met een draagbare Imager en resultaten geanalyseerd Genereer een heatmap. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: procedure voor het bevestigen van de indringende kamer aan de microarray Slide. Van A tot Fwordt de indringende kamer boven op de dia geplaatst in de juiste richting, bevestigd aan de dia met behulp van horizontale clips aan de zijkanten en in de indringende lade geplaatst. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve resultaten van influenza antigeen Microarray. Heat Maps vertegenwoordigen antigeen-specifieke antilichaamresponsen, waarbij elke rij een enkel antigeen bevat dat is gerangschikt door molecuul, subtype en stam, en elke kolom die een indringende run van één specimen weergeeft, gerangschikt naar antilichaam Isotype en run (a, Wit = 0, zwart = 20000, rood = 40000 fluorescentie intensiteit). De antigeen subtypen, met inbegrip van alle gemaggljutininovuju subtypen van 1 tot 18 en alle neuraminidase subtypen van 1 tot 10 worden verticaal gerangschikt en aan de linkerzijde gelabeld. Een vergelijking van de intensiteit van de fluorescentie tussen twee uitvoeringen toont een goede assay reproduceerbaarheid door lineaire regressie voor IgA (B) en IgG (C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: breedte van serum antilichamen gemeten op influenza antigeen Microarray. De serum IgA (a) en IgG (B) zijn gegroepeerd op de moleculaire vormen en SUBTYPEN van ha en na, om een hoge SPECIFICITEIT van de ha-hoofdgroep antilichamen voor klinische subtypen en hoge Kruisreactiviteit van hele ha en getrimeriseerde hele ha-antilichamen met opname van de stalken-regio. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend bestand: lijst van antigenen op influenza antigen Microarray. Inhoud wordt getoond voor alle 324 vlekken op de array, inclusief blanks, fiduciaire, Controls (humaan IgG en IgA en anti-humaan IgG en IgA op 0,1 mg/mL en 0,3 mg/mL), en antigenen met informatie over bron, moleculaire vorm, subtype en stam. Afkortingen zijn als volgt: voor bron, Sino = Sino Biological Inc., FKL = Florian Krammer laboratorium; voor moleculaire vorm, HA1 = hoofd HA, HA0 = hele HA, HA2 = stalken ha, NP = nucleoproteïne. Voor antigenen afkomstig van Sino Biological Inc. worden catalogusnummers getoond; voor antigenen afkomstig van Krammer laboratorium, antigeen-Id's worden vermeld. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het hier beschreven influenza antigeen microarray protocol is aanpasbaar aan elk project dat een analyse van antilichaamresponsen op vele antigenen vereist. Het microarray-platform kan worden gebruikt met elke gewenste set van proteïne-antigenen, uitgedrukt in elk systeem dat 0,1 mg/mL of hogere opbrengst kan bereiken met of zonder zuivering zoals eerder beschreven12. Als niet-gezuiverde proteïne-antigenen (bijvoorbeeld uitgedrukt in in vitro transcriptie-en vertaalsysteem) direct worden gebruikt om micro arrays af te drukken, moeten de componenten van het eiwit expressie systeem (bijv. e. coli lysaat) 1:10 worden toegevoegd aan de blokkerende buffer die wordt gebruikt voor verdunning van sera en antilichamen van de kwaliteitscontrole om antilichamen tegen deze componenten te blokkeren. Dia-configuraties zijn beschikbaar met een lager aantal grotere pads op elke dia voor een hoger aantal antigenen per array. Voor deze studie gebruikten we een Gene machines OmniGrid 100 Microarray printer die pinnen gebruikt die rechtstreeks contact maken met het nitrocellulose oppervlak om vlekken op de array te deponeren. Hoewel deze Microarray-printer niet meer in de handel verkrijgbaar is, kunnen andere in de handel verkrijgbare Microarray-printers in dit protocol worden gebruikt, maar kunnen er aangepaste pinnen (contact-of contactloze) en software nodig zijn en moet er voldoende spot resolutie en compatibiliteit met slides en Imager. Afhankelijk van de reactiviteit van sera kunnen verdunningen van 1:50 tot 1:400 worden gebruikt. Serum vrije buffer kan worden gebruikt als een negatieve controle, terwijl monoklonale antilichamen bekend om te binden aan antigeen kunnen worden gebruikt als een positieve controle.
Gebruikers moeten zich bewust zijn van een aantal problemen met het oplossen van problemen. Het doel van de kwaliteitscontrole is het gebruik van antilichamen tegen de his-tag om te controleren op eventuele antigenen waarvoor het afdrukken niet gelukt is. Alle spots die consequent een laag signaal geven in de kwaliteitscontrole van meerdere arrays, zijn waarschijnlijk onvoldoende antigeen gedrukt. Mogelijke redenen zijn aggregatie of precipitatie of antigeen in bron plaat of slecht contact tussen de print PIN en Microarray Slide vanwege de variabele dikte van nitrocellulose pad. Op dit punt voeren we geen assay normalisering uit op basis van kwantitatieve resultaten van de kwaliteitscontrole, gezien het feit dat de gedetecteerde binding van anti-zijn antilichamen kan worden beïnvloed door de beschikbaarheid van deze tag, die afhangt van de 3-dimensionale conformatie specifiek voor elk antigeen.
De influenza antigeen Microarray biedt verschillende voordelen ten opzichte van traditionele methoden zoals ELISA en is complementair aan functionele assays zoals HAI en MN. De 16-pad proteïne Microarray is een sample-sparende technologie met capaciteit om antilichamen van meerdere isotypes tegelijkertijd te meten tegen ongeveer 300 antigenen uit 1 μL serum. Het aantal antigenen kan worden verhoogd tot de duizenden door het verminderen van het aantal pads per dia's. De Multiplexed assay spaart ook personeels tijd en verbruiksmaterialen, gezien het feit dat honderden sera in 2 dagen kunnen worden gebruikt voor antilichamen, en alle andere stoffen dan dia's en reagentia opnieuw bruikbaar zijn, dus geen grote hoeveelheden kunststofafval genereren.
Hoewel Microarray-printers mogelijk niet op grote schaal worden gedistribueerd, kunnen Microarray-dia's op een gecentraliseerde locatie worden afgedrukt en vervolgens naar de eindgebruiker worden getransporteerd voor het scannen. De enige apparatuur die nodig is voor het indringende is de goedkope en draagbare Imager. Het doel van het verspreiden van dit protocol is het gebruik van deze techniek meer in het algemeen te benutten.
De belangrijkste beperkingen van de influenza antigeen Microarray zijn het onvermogen om de functie en kinetiek van de gedetecteerde antilichamen te karakteriseren. De microarray detecteert een polyklonale verzameling van bindende antilichamen voor elk antigeen. Deze antilichamen kunnen al dan niet functioneel zijn in neutraliserend virus in HAI en MN assays. Hai en MN assays vereisen echter een levende virus cultuur met bijbehorende behoefte aan gespecialiseerde faciliteiten met hoogwaardige bioveiligheidskasten om te testen op antilichamen tegen aviaire subtypen van influenza, terwijl de proteïne Microarray geen levend virus omvat componenten dus kan worden gebruikt in elk basis laboratorium. Met betrekking tot de bindende kinetiek levert een enkelvoudige verdunning van een serum met een array met één enkele concentratie van elk antigeen een enkel gegevenspunt op, dat een samenstelling van hoeveelheid en affiniteit vertegenwoordigt die wordt gesommeerd over alle antilichamen die aan het antigeen binden . Om de bindende kinetiek van antilichaam-antilichamen volledig op te lossen, zijn meerdere antigeen concentraties en/of seriële verdunningen van sera nodig.
Ondanks deze beperkingen is de influenza antigen Microarray een nuttig hulpmiddel om de breedte van influenza antilichamen in het antigene landschap te karakteriseren die functionele testen kunnen aanvullen die beperkter zijn in doorvoer en beschikbaarheid.
Disclosures
De auteurs hebben geen informatie.
Acknowledgments
De auteurs zouden graag willen erkennen Prof. Don Milton (Institute of Applied Public Health, University of Maryland, College Park, MD, USA) voor het verzamelen van de menselijke Sera onder de Universiteit van Maryland IRB protocol #313842 gefinancierd door DARPA N66001-18-2-4015 P00001. De auteurs willen ook Prof. Florian Krammer (Icahn school of Medicine, MT. Sinai, NY, USA) erkennen voor het verstrekken van getrimeriseerde HA-en NA-antigenen die worden gefinancierd door ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. S. Khan wordt gedeeltelijk ondersteund door het National Center for Research resources en het National Center for voortschrijdende translationele wetenschappen, National Institutes of Health, via Grant KL2 TR001416. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
| 1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
| ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
| Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
| HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
| Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
| Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
| ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
| ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
| ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
| Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
| Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
| Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |
References
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).
- Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation. Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).
- Li, L., et al. Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review. American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).
- Fauci, A. S. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).
- Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks. PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).
- Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. Vaccines for preventing influenza in healthy adults. Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269 (2018).
- Erbelding, E. J., et al. A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Xie, H., et al. H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps. Scientific Reports. 5, 15279 (2015).
- Tricco, A. C., et al. Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis. BMC Medicine. 11, 153 (2013).
- Katz, J. M., Webster, R. G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs. Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).
- Zost, S. J., et al. Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).
- Liang, L., Felgner, P. L. A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).
- Jain, A., et al. Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays. Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).
- Desbien, A. L., et al. Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses. Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).
- Mace, C. R., et al. Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens. Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).
- Koopmans, M., et al. Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray. Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).
- Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology. PLoS One. 10 (8), e0134484 (2015).
- Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards. Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Nakajima, R., et al. Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies. mSphere. 3 (6), (2018).
- Van Hoeven, N., et al. A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Scientific Reports. 7, 46426 (2017).
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7 (8), e43603 (2012).
