Summary
Biz farklı virüs suşları 250 üzerinde antijenler karşı birden fazla antikor izotürler için aynı anda prob serum nitroselüloz kaplı slaytlar üzerine baskı grip antijenleri tarafından inşa edilen bir protein mikroarray kullanmak için bir protokol sunuyoruz, böylece virüs alt türleri arasında serum antikorları genişliği ölçümü izin.
Abstract
Grip virüsü, şu anda mevcut aşıların sınırlı etkinliğini nedeniyle Dünya çapında önemli bir mortalite nedeni olarak kalır. Evrensel grip aşıları gelişimine önemli bir zorluk antijenik drift kaynaklanan yüksek antijenik çeşitlilik. Bu zorluk üstesinden farklı antijenik alt türleri arasında birçok virüs suşları karşı yönlendirilmiş serum antikorların genişliğini ölçmek için yeni araştırma araçları gerektirir. Burada, çeşitli grip virüsü suşları karşı serum antikorlarının kapsamını analiz etmek için bir protokol sunar, bir protein mikrodizi grip antijenleri kullanarak.
Bu grip antijen mikrodizisi, Mikroarray yazıcı kullanılarak arıtılmış hemagglutinin ve nöraminidaz antijenleri nitroselüloz kaplı bir membran üzerine yazdırarak inşa edilir. İnsan serumu, grip antijenlerine karşı antikorları bağlamak için Mikroarray üzerinde inkübe edilir. Quantum-dot-konjuge ikincil antikorlar aynı anda microarray üzerinde her antijeni bağlayan IgG ve IgA antikorları algılamak için kullanılır. Nicel antikor bağlama, taşınabilir bir görüntü kullanarak floresan yoğunluğu olarak ölçülür. Temsili sonuçlar, insan serumunda alt türe özel ve çapraz reaktif grip antikorlarının ölçümünde tahlil yeniden üretilebilirliği göstermek için gösterilir.
ELISA gibi geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, grip antijen mikrodizisi, kısa zaman diliminde yüzlerce antijene karşı birden fazla antikor izottipi için yüzlerce sera testi yapabilen yüksek verimlilik sağlayan çok yönlü bir yaklaşım sağlar ve böylece sero-gözetim ve aşı geliştirme uygulamaları. Bir sınırlama, bağlayıcı antikorların nötralize antikorları ayırt etmek için yetersizlik olduğunu.
Introduction
Grip virüsü, her yıl dünya çapındaki tüm ölümlerin% 1 'ini, tropik bölgelerde yaşlı ve nüfus üzerindeki orantısız etkileri ve gelişmekte olan dünya1' i içeren ölüm veya özürlülüğe göre yıllık 20.000.000 yaşam yılı kaybına karşı sorumludur. 2,3. Mevsimlik salgın hastalıkların yükünü ek olarak, yeni grip suşlarının genetik yeniden çeşitlendirme yoluyla ortaya çıkması ya doğal olarak ortak konaklarda ya da yapay olarak biyoterörizm için dünya çapında pandemiler Hızlı Spread ve yüksek darlık yol açabilir 4 , 5. süre sayısız grip aşıları Şu anda mevcut, onların etkinliğini alt özgüllüğü ile sınırlıdır6, çoklu virüs karşı uzun ömürlü bağışıklık görüşmek evrensel grip aşıları geliştirmek için ihtiyaç oluşturma suşları7.
Evrensel grip aşıları gelişimi için önemli bir zorluk suşları arasında yüksek antijenik çeşitlilik. Dolaşım virüslerinin antijenik varyasyonu ile birlikte mevcut aşıların antijenik özgüllüğü aşı suşları ve sirkülasyon suşları arasında bir uyuşmazlık oluşturur. Bu, bir salgın sırasında aşı suşları uzak daha fazla genetik drift lehine bir evrimsel avantajı confers, aşı etkinliğini genellikle az 50%8,9sınırlandırmak. Antijenik uyuşmazlığın ek bir kaynağı, aşı üretimi sırasında oluşturulan yumurta adaptif viral mutasyonlardır ve bu da virüslerin10,11.
Yüksek antijenik çeşitlilik bu zorluk üstesinden yeni araştırma araçları serum ve mukozal örneklerinde klinik olarak ilgili antijenik türevleri arasında önceden mevcut ve elicited immün tepkiler genişliğini karakterize gerektirir. Hemaglütinasyon inhibisyonu (HAI), microneutralization (MN) ve geleneksel ELISA dahil olmak üzere şu anda mevcut yöntemler, bir defada tek bir virüs gerileme karşı antikorları tespit sınırlıdır, bu yüzden birden fazla antikor izotypes tespiti için kullanımı birden fazla virüs suşları hızlı bir şekilde mevcut klinik numune ve laboratuar kaynaklarını tükenme karşı. Ayrıca, HAı ve MN sadece özel laboratuvarlarda kullanılabilir canlı virüs kültürü gerektirir.
Şekil 1' de gösterildiği gibi nitroselüloz kaplı slaytlara basılmış binlerce antijenden oluşan protein mikrodizileri, bu gereksinimi12' ye doldurabilir. Bu mikrodiziler, dizi üzerindeki her bir antijen karşı nicel antikor izottibi/alt tip düzeylerini belirlemek için küçük miktarlarda klinik numuneyi tüketirken yüksek verimlilik olarak üretilen ve probed edilebilir. Antijen keşfi için bu yaklaşım, birden fazla bulaşıcı patojenlere karşı tanı ve aşı gelişimine uygulanmıştır13. Bugüne kadar, 60.000 toplam ifade proteinleri dahil 35 üzerinde patojenler için protein mikrodiziler üretti ve virüslü ve kontrol bireylerinden 30.000 insan serası üzerinde araştırma yapmak için bunları kullandı. Mikroarray slaytlar için son zamanlarda geliştirilen taşınabilir görüntüleme platformu Bu metodoloji Son Kullanıcı14daha erişilebilir hale gelmiştir.
15, 16,17,18,19, bir grip protein mikroarray alanında birden fazla katkı tarafından kapsamlı bir önceki çalışma üzerine bina son zamanlarda üzerinde içeren geliştirilmiştir 250 saf hemagglutinin (ha) antijenik türevleri tüm 18 alt türlerinin temsili ile12,20. Bu metodolojisi kullanarak, doğal bir grip enfeksiyonu, filenetik olarak ilgili ha alt türlerine karşı geniş reaktif IgG ve IgA antikorları oluşturmak için gösterildi, bir intramusküler grip aşısı sadece Subtype özgü IgG üretirken antikorlar21. Ancak, grip aşıları için Toll-benzeri reseptörleri aktive bir adjuvan ekleyerek hayvan çalışmaları22' de ha alt türleri arasında elicited IgG antikor tepkisi genişletmek için gösterildi.
Bu mikrodizi Şu anda grip enfeksiyonu için takip edilen kolej öğrencilerinin prospektif kohort çalışmasında toplanan sera prob için kullanılmaktadır. Burada, bu çalışmada numunelerin bir alt kümesindeki alt tip ve çapraz-reaktif antikorları algılamak için assay tekrarlanabilirlik gösterimi ile grip antijen mikrodizinin metodolojisi bildirilmiştir.
Protocol
Tüm insan sera koruyucu kişisel ekipman kullanımı ile Biyogüvenlik için onaylanmış kurumsal protokollere göre ele ve bertaraf edilir. Bu protokole katılan tüm laboratuar personeli Biyogüvenlik ve araştırma etiği alanında eğitim almıştır.
1. grip antijen mikrodiziler üret
-
Mikroarray için antijen seti tasarlama ve elde etme
- Likofilized toz olarak ifade edilen ve arıtılmış protein antijenleri elde.
-
Antijenleri Mikroarray slaytlar üzerine yazdırın
- Her likofilized antijeni, 0,1 mg/mL 'Lik fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile 0,001% Tween-20 (T-PBS) konsantrasyonuna yeniden oluşturur. % 10 μL her reconstituted antijen bir tedavi edilmemiş 384-Well düz alt plaka bireysel kuyuları için aktarın.
- Mikrodizi yazıcı kullanarak antijenleri yazdırın (Bu çalışmada kullanılan Mikroarray yazıcı artık ticari olarak kullanılabilir değildir, tartışmakonusuna bakın) düşük hacimli mikrodizi tespit pimleri ile örnek kanala antijen Aspire ve doğrudan üzerinden mevduat 16-Pad nitroselüloz kaplı cam slaytlar üzerine temas ve kapiller eylem.
- Baskı yazılımını (örneğin, Gridder) kaynak plaka konfigürasyonu ve yazdırma parametreleriyle programlamak.
- Bu yazdırma yöntemiyle kullanılacak plaka türünün adını seçmek için açılır menüyü kullanın. Bu çalışmada, tedavi edilmeyen 384-Well düz alt plaka kullanın.
- Plaka sayısı 'nın yanındaki metin kutusunu seçin ve bu yazdırma protokolünde kullanılacak örnek plaka sayısını yazın. Bu çalışmada, 1 plaka kullanın.
- Bu yöntemle kullanılacak bir pin yapılandırmasını seçin. Bu çalışmada 8 pin konfigürasyonu kullanın.
- Kaynak uzaklıkların (Yönetim bölümünde kalibre edilen) slayt kaynağı ve slaytlarda yazdırma pimlerini Yazdırmaya başlayacağı konum arasındaki mesafeler (X ve Y-yönlerde) olduğundan emin olun.
- Dizi tasarımı sekmesini kullanarak, dizilerin boyutunu ve şeklini (nokta aralığı ve subarray başına nokta sayısı) tanımlayın. Bu çalışmada, 8 pin kullanılarak 18x18 formatında 16 Pad kaydırağı üzerine 324 lekeler (300 μm aralıkla 180 μm çapı) yazdırın.
- Yazdırma pimlerini alma ve örnekleri dağıtma parametrelerini seçin. Bu çalışmada, her pin 250 nL antijen solüsyonu ve 40 spotların her biri için 1 nL yazdırır (tüm 8 pin için toplam 20 slayt)
- Pin temizleme protokolünü ve Blot protokolünü yapılandırın. Bu çalışmada, her pin antijen yazdırır, steril ddH2O sonicated yıkama kabı içinde daldırılır ve sonra sonraki antijeni aspiratlar.
- Örnek blokların slaytlara yazdırıldığı sırayı tanımlayın. Dizi yazılımı, her microarray içinde antijenleri düzenini açıklamak için bir açıklama eklenmiş kılavuz dizini (. GAL) dosyası oluşturur.
Not: üst satır, görüntüleme sırasında ızgaraları yönlendirmek için (görüntüleme sırasında kullanılan tüm dalga boylarında, örneğin Qdot 585 nm streptavidin Konjugat ve Qdot 800 Nm streptavidin konjugatın karışımı) işaretlemiştir için kullanılır. Uzun baskı çalışmaları için, kaynak plakasında antijenler düzenli olarak yukarı ve aşağı pipetleme ve sonra santrifüpleme veya yeni kaynak plakası hazırlanabilir ve kullanılabilir olarak yeniden askıya alınabilir.
- Baskı yazılımını (örneğin, Gridder) kaynak plaka konfigürasyonu ve yazdırma parametreleriyle programlamak.
- Işık geçirmez bir kutuya probed Mikroarray slaytlar yerleştirin ve uzun süreli depolama için oda sıcaklığında bir kurutucu kabine tutun.
Not: protokol bu noktada süresiz olarak duraklatılmış olabilir.
-
Kalite kontrol kontrolü gerçekleştirin (Poly-histidin etiketlerini gerektirir)
- Adım 2.1.1-2.1.2 ve Şekil 2' de açıklandığı gibi engelleme tampon ile slayt prob odaları ve rehydrate takın.
- Filtrelenmiş 1x engelleme tamponunun içinde fare monoklonal Poly-onun antikor 1:100 seyreltin.
Not: saf olmayan protein antijenleri (örn. in vitro transkripsiyon ve çeviri sisteminde) doğrudan mikrodiziler yazdırmak için kullanılırsa, 1:10 oranı ile protein ifade sisteminin (örn., e. coli lysate) bileşenlerini ekleyin. Bu bileşenlere yönelik herhangi bir antikorları engellemek için serum seyreltme için kullanılan tampon engelleme. - Ekleme 100 μL seyreltilmiş Poly-onun antikor her slayt odası için aspirasyon sonra dizi Pad içeren ve 2 saat oda sıcaklığında veya gece 4 ° g Shaker üzerinde inkük. Adım 2.2.1 ' de açıklandığı gibi, 3x T-TBS tampon ile yıkayın. Seyreltilmiş biotin-konjuate keçi Anti-fare IgG ikincil antikor 1:200 tampon engelleme, aspirasyon sonra iyi başına 100 μL ekleyin ve Shaker üzerinde oda sıcaklığında 1 h için inkübasyon. T-TBS tampon ile 3x yıkayın.
- Seyreltici Qdot 585 nm streptavidin Konjugat için 4 nM tampon engelleme, eklemek 100 μL başına iyi aspirasyon, ve kuluçka 1 h oda sıcaklığında Shaker. 3 T-TBS tampon ile ve sonra bir kez TBS tampon (Tween olmadan) ile yıkayın.
- 2.2.5-3.1.2 adımında açıklandığı gibi slaytları ayırabilir ve ölçebilirsiniz.
Not: protein antijenleri bu kalite kontrol protokolünü kullanmak için onun10 etiketlerini içermesi gerekir. Alternatif olarak, farklı bir etiket dahil ise, kalite kontrol kontrolü bu etiket için antikor veya ligand ile gerçekleştirilebilir.
2. mikrodiziler kullanarak grip antikorları için prob sera
-
Antikor ciltleme için mikrodiziler üzerinde sera inkübe
- Klipsleri kullanarak ve Şekil 3' te gösterildiği gibi çerçevelere yerleştirmek için mikro dizi slaytları takın.
Not: Mikroarray Pad 'e her zaman Hands ve Instruments dokunmadan kaçının. Slaytların Pad tarafı yukarı ve sağ üst köşedeki küçük çentik ile yönlendirilmiş olduğundan emin olun. - Filtrelenmiş 1x engelleme tamponunun başına 100 μL ile rehidrat mikro dizi slaytları ve 100 μL engelleme tamponunun içinde serum 1:100 seyreltici (tedavi edilmeyen 96-kuyu plakaları veya 2 mL tüpler kullanılabilir). 100-250 rpm 'de orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ayrı olarak kapalı çerçeveler ve seyreltilmiş sera içinde rehidrat mikro dizi slaytlar kulkayın. Shaker üzerinde benzer şekilde tüm sonraki inkübasyon adımlarını gerçekleştirin.
Not: sera, donma-çözülme döngülerini en aza indirmek için uzun süreli depolama için-80 °c ' de seyreltilmemeli ve dondurulmuş olmalıdır Slayt odaları yeniden montajı gerektiren herhangi bir sızıntı tespit etmek için bu adımda dikkatlice slayt odaları gözlemlemek. - İkincil toplama yastığı ile bir vakum hattına bağlı pipet uçları kullanarak, her bir odanın köşesinden engelleyici tamponları dikkatli bir şekilde pedli dokunmadan Aspire. Benzer şekilde sonraki tüm aspirasyon adımlarını gerçekleştirin. Pedleri kurutmak için izin vermek için aspirasyon sonra hızlı bir şekilde pedleri seyreltilmiş sera ekleyin.
- Nemli kağıt havluları ile çevrili ve buharlaşma önlemek için mühürlü ikincil bir kap içinde tepsiler içine çerçeveleri yer. Gece 4 °C ' de sallanan Shaker üzerinde kulkayın (alternatif olarak, 100-250 rpm 'de orbital Shaker üzerinde oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edebilirsiniz).
- Klipsleri kullanarak ve Şekil 3' te gösterildiği gibi çerçevelere yerleştirmek için mikro dizi slaytları takın.
-
Kuantum-nokta-konjuli ikincil antikorlar ile etiket bağlı serum antikorları
- Yukarıda açıklandığı gibi dikkatlice odalardan aspirate sera, T-TBS tampon başına 100 μL ekleyin (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 ddH2O pH 7,5 ve filtrelenmiş olarak ayarlanabilir, ticari olarak elde edilebilir), ve orbital Shaker üzerinde 5 dakika boyunca inkük 100-250 rpm. Bu yıkama adımını toplam 3x olarak tekrarlayın (sonraki tüm yıkama adımları benzer şekilde gerçekleştirilir).
- Tampon engelleyici olarak 1 μM ' ye seyreltilmiş ikincil antikorların karışımı hazırlayın ve homojenliği korumak için kullanım öncesi ve sırasında pipetleme yaparak iyice karıştırın.
Not: tahlil reproducibility korumak için, her ikincil antikor aynı toplu denemeler arasında veri Niceliksel karşılaştırma planlandığı için tüm yoklama deneyler için kullanılmalıdır. İkincil antikor spesifik konsantrasyon yakınlık bağlı olarak farklı olması gerekebilir; kullanılabilir olduğunda üreticinin protokollerini takip edin. - Son yıkamadan sonra odalarından aspirate tampon, ikincil antikor karışımı iyi başına 100 μL ekleyin ve Shaker üzerinde oda sıcaklığında 2 h için inkübe.
- İkinci antikor karışımı aspirate 3x T-TBS tampon ile yıkayın ve sonra TBS tampon ile bir kez yıkayın (Tween olmadan).
- Yastıklar dokunmadan önlemek için dikkatlice odalarından dissemble Mikroarray slaytlar, hafifçe süzülmüş DDH2O ile durulayın ve 50 ml tüpler yerleştirerek kuru ve 10 dakika için 500 x g santrifüpleme.
- Probed mikro dizi slaytları ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin ve uzun süreli depolama için oda sıcaklığında bir kurutucu kabininde tutun.
Not: protokol, bu noktada en fazla 1 hafta duraklatılmış olabilir.
3. mikrodizi içinde antijenlere antikor bağlayıcılığı ölçmek
-
Antikor bağlayıcılığı ölçmek için mikro dizi slaytları görselleştirin ve spot floresan yoğunluğunu ölçün
- Dahili yazılım ile taşınabilir Görüntüleyici kullanarak Mikroarray slaytlar görüntüleri elde.
- Görüntüleyici Yapılandır sekmesinde, uygun slayt yapılandırmasını seçin. Bu çalışma için 16-Pad slaytlar kullanın.
- Görüntü kontrol sekmesinde, uygun floresan kanalı seçin ve optimum görüntüleri elde etmek için sera reaktivitesine bağlı olarak kazanç, pozlama süresi ve edinme süresini ayarlayın. Bu çalışma için, IgA ve IgG için floresan kanallar sırasıyla 585 nm ve 800 Nm ve görüntüleme ayarları 50, 500 MS pozlama süresi ve 1 s edinme süresi elde edildi.
- Görüntüyü edinme sürecini başlatmak için yakalama tıklayın.
Not: Mikroarray slaytlar karanlık ve kuru saklandığı sürece sinyal bozulması olmadan birden fazla ayar yeniden görüntülenmiş olabilir. Diğer görüntüleme sistemleri, slaytlarla uyumlu ise kullanılabilir.
- Dizi noktalarını, fiducial işaretçileri temel alan ızgaraları kullanarak algılayın ve Spotlar arasında ölçülen piksel yoğunluğu eksi arka plan olarak spot yoğunluğunu ölçün. Her microarray üzerinde bireysel antijenlere spot yoğunlukları bağlamak için adım 1.2.2 ' de oluşturulmuş. GAL dosyasını kullanan yerleşik görüntü yazılımı kullanarak toplu olarak bu miktarın algoritmasını gerçekleştirin.
- Dosya bilgileri panelinde, bilgisayardaki klasöründen seçerek. GAL dosyasını karşıya yükleyin ve analiz çıkış dosyalarının çözümleme seçenekleri bölümünde kaydedileceği klasörü belirtin.
- Görüntü denetimi sekmesinde, elde edilen görüntülerden birini açın ve sağ üst köşedeki Otomatik düğmeyi seçin.
- Sağ alt köşedeki dizi analizi bölümünde, yazılım tarafından belirtildiği gibi bir fiducial şablonu oluşturun.
- Toplu çözümleme'ye tıklayın, niceleyecek görüntüleri içeren klasörü seçin ve önceki adımda oluşturulan fiducial şablonunu seçin. Yazılım her görüntüyü analiz eder ve spot yoğunluğunu nicelik gösterir.
Not: Bu adım, daha sonra elektronik tablo manipülasyon veya analiz yazılımında manipüle edilebilir mikrodizi üzerinde her bir antijen bağlamak her serum numunesi içinde antikor ölçücü spot yoğunlukları içeren bir. csv dosyası oluşturur.
- Antijenler arasında ve serum numuneleri arasında anti-Body bağlamayı karşılaştırmak için ham verileri analiz edin. Bu çalışmada, 585 nm ve 800 Nm floresan spot yoğunlukları olarak ölçülen IgA ve IgG antikorları, farklı günlerde farklı slaytlar kullanarak denemenin 2 bağımsız çalışması arasındaki tüm antijenler arasında karşılaştırıldı ve korelasyon analizi gerçekleştirildi Ölçme assay yeniden üretilebilirliği.
Not: ifade karışımı olarak baskılı olmayan saflaştırılmış proteinler Için, veri analizi hiçbir DNA kontrolünde arka plan çıkarma ile başlamalıdır.
- Dahili yazılım ile taşınabilir Görüntüleyici kullanarak Mikroarray slaytlar görüntüleri elde.
Representative Results
Protokolün bir gösterimi olarak, temel sera grip antijen mikrodizi üzerinde grip enfeksiyonu için takip kolej öğrencileri bir prospektif kohort çalışma içinde 16 birey tarafından tespit edildi. Tahlil reproducibility göstermek için, bu numuneler iki kez, farklı slaytlar ve farklı günlerde probed edildi.
Bu çalışmada, onun10 etiketlerini içeren saflaştırılmış grip antijenleri ticari satıcıdan (bkz. malzeme tablosuna) ve ortak çalışanlara alınmıştır. Bu antijenler dahil 251 Total ha antijenleri, ile 63 küresel kafa alanları (HA1) ve 186 tam uzunluklu proteinler (HA0), dahil olmak üzere 96 monomerik HA0 proteinleri ve 90 trimerized HA0 proteinleri içeren trimerization ("foldon") etki alanı23. Bu çalışmada kullanılan antijenler ve kontrollerin tam listesi ek dosyaolarak dahildir. Bu çalışma için, ikincil antikorlar kullanılan keçi anti-insan IgG kuantum nokta yayan 800 Nm (GAH-IgG-Q800) ve keçi anti-human IgA konjuated kuantum nokta yayan olarak 585 Nm (GAH-IgA-Q585) IgG ve IgA antikorların Multiplex tespiti için konjugated olarak Şekil 3' te gösterilir. Yukarıda açıklanan klinik kohort elde edilen sera için IgG ve IgA antikor farklı alt türlerinden ve grip ha antijenlerin moleküler formları bağlama karşılaştırıldı.
Elde edilen ısı haritası şekil 5' te grafik gösterimi ile Şekil 4 ' te gösterilir. Bu rakamlar, sadece dizi yüksek temsili ile klinik olarak ilgili alt türleri, "+" daha yüksek sayıda kalan tüm alt türleri ve küçük veya daha az iyi temsil edilen alt türleri sipariş olarak dahil alan kaydetmek için etiketli (örneğin, arasında H2 H1 ve H3). Dizi üzerindeki suşların ve alt türlerinin tam listesi ek dosyaolarak eklenmiştir. Bu veriler, HA baş grubuna antikorlar klinik olarak yaygın suşları (H1N1, H3N2 ve B) ve diğer suşları antikorların düşük miktarda antikorların beklenen yüksek miktarda Subtype özgü olduğunu göstermektedir. Ancak, SAP etki alanı içeren tüm ha, antikorlar, alt türler arasında daha fazla çapraz reaktif, ve bu efekt tüm ha trimerized olduğunda artırılmış gibi görünüyor. Tüm HA kök bölge içerir, bu sonuç beklenmeyen değil, hangi son derece alt türler arasında kullanılabilir. Bu nedenle, klinik olmayan alt türlerinden (örneğin, H5 ve H7) tüm HA moleküllerine karşı antikorlar, aslen diğer HA alt türlerinin kök bölgeleri ile çapraz reaksiyon gösteren klinik alt türlerine (örn., H1 ve H3) karşı kaynaklanan anti-kök antikorları temsil eder. . Bu noktada, kafa ve farklı reaktivite profillerini gösteren kök bölgeler için antikorlar arasında ayırt etmek için dizi üzerinde kafa HA ve tüm molekül HA dahil olmak üzere önemini göstermektedir.
Testin yoklama çalışır arasında iyi yeniden üretilebilirliği gösterir. İkinci çalışma tüm suşlar arasında biraz daha düşük IgG antikorları gösterir, ancak suşların arasındaki desen tutarlı. Bu genelinde-Board hafif düşüş büyük olasılıkla ikincil antikor, IgA için değil IgG için çalışır arasında değiştirildi toplu-toplu değişkenlik kaynaklanmaktadır. Böylece, protokolde belirtildiği gibi, her ikincil antikor aynı toplu kullanmak için hangi nicel karşılaştırma planlandığı arasında herhangi bir deney için tavsiye edilir. Test edilecek numunelerin yüksek sayıda nedeniyle antikor farklı toplu gerekli ise, biz düzeltme ile niceliksel karşılaştırma için izin vermek için farklı antikor gruplar ile deneysel çalışır arasında paylaşılan örnekleri dahil önerilir.
Şekil 1: protein mikrodizinin şematik. Her slayt, bir ızgara içinde düzenlenmiş lekeler üzerine basılmış yüzlerce antijenden oluşan tek bir dizi ile her biri birden fazla Pad içerir, nitroselüloz yüzeyinin 3 boyutlu topografyası üzerine bir antijen adsoryat içeren her nokta Serum antikorları bağlanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: grip antijen Mikroarray baskı ve yoklama protokolünün şematik. Soldan sağa, Mikroarray nitroselüloz kaplı slaytlar üzerine kullanılarak yazdırılır, hangi IgG ve IgA antikorlar için sera Probe kuantum-nokta-konjuge ikincil antikorları kullanarak, slaytlar ile görüntülenmiş bir taşınabilir Görüntüleyici kullanarak, ve sonuçlar analiz için kullanılır bir ısı haritası üretir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Mikroarray slaytına prob odası iliştirme prosedürü. A 'dan F'ye kadar, prob odası, kenarlarda yatay klipler kullanarak slayta bağlı ve prob tepsisine yerleştirilen doğru yönde slayt üstüne yerleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: grip antijen mikrodizinin temsili sonuçları. Isı haritaları, her satır molekül, alt ve gerinim tarafından düzenlenmiş tek bir antijen temsil eden, antijen özgü antikor yanıtlarını temsil eder ve tek bir numunenin bir prob çalışmasını temsil eden her sütun, Anti-Body izotype ve çalışma tarafından düzenlenmiş (a, Beyaz = 0, siyah = 20000, kırmızı = 40000 floresan yoğunluğu). 1 ' den 18 ' e kadar tüm hemagglutinin alt tipleri ve 1 ' den 10 ' a kadar olan tüm nöraminidaz alt tipleri dahil olmak üzere antijen alt tipleri dikey olarak düzenlenmiştir ve soldaki etiketli. İki çalışma arasındaki floresans yoğunluğunun karşılaştırılması IgA (B) ve IgG (C) için doğrusal regresyon ile iyi tahlil yeniden üretilebilirliği gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: grip antijen mikrodizi üzerinde ölçülen serum antikorlarının genişliği. Serum IgA (A) ve IgG (B), ha ve na moleküler formlar ve alt türler tarafından, KLINIK alt türler için ha baş grup antikorlarının yüksek özgüllüğü ve bütün ha 'nın yüksek çapraz reaktivitesi ve trimerized tüm ha antikorları ile birlikte gruplandırılır. SAP bölgenin eklenmesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Ek dosya: grip antijen microarray üzerinde antijenler listesi. İçerik, boşluklar, fiducials, kontroller (insan IgG ve IgA ve anti-insan IgG ve IS 0,1 mg/ml ve 0,3 mg/ml), ve antijenleri dahil olmak üzere dizideki tüm 324 noktalar için gösterilen kaynak, moleküler form, alt ve gerinim hakkında bilgi. Kısaltmalar aşağıdaki gibidir: kaynak için, sino = sino biyolojik A.ş., FKL = Florian kraymer Laboratuvarı; Moleküler form için, HA1 = Head HA, HA0 = bütün HA, HA2 = SAP HA, NP = nükloprotein. Çin biyolojik A.ş. kaynaklı antijenler için, katalog numaraları gösterilir; kraymer laboratuar kaynaklı antijenler için, antijen kimlikleri listelenir. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Burada açıklanan grip antijen mikro dizi Protokolü birçok antijenlere antikor yanıtlarını analiz gerektiren herhangi bir projeye uyarlanabilir. Mikrodizi platformu, daha önce12' de açıklanan şekilde veya arıtma olmadan 0,1 mg/ml veya daha yüksek verim elde edebilir herhangi bir sistemde ifade edilen herhangi bir protein antijen kümesi ile kullanılabilir. Eğer non-saf protein antijenleri (örneğin, in vitro transkripsiyon ve çeviri sistemi) doğrudan mikrodiziler yazdırmak için kullanılır, protein ifade sisteminin bileşenleri (örn., e. coli lysate) eklenmesi gerekir 1:10 engelleme için kullanılan tampon Bu bileşenlere yönelik herhangi bir antikorun engellenmesini sağlamak için sera ve kalite kontrol antikorlarının seyreltilmesi. Slayt yapılandırmaları, dizi başına daha yüksek sayıda antijen yerleştirmek için her slayda daha düşük sayıda daha büyük pedlerle kullanılabilir. Bu çalışmada, biz bir genemachines OmniGrid 100 Mikroarray Yazıcı doğrudan dizi üzerinde lekeler mevduat nitroselüloz yüzeyi temas iğne kullanır kullandık. Bu mikro dizi yazıcı artık ticari olarak kullanılabilir durumdayken, ticari olarak kullanılabilen diğer mikro dizi yazıcılar Bu protokolde kullanılabilir ancak özel pin (temas veya temas dışı) ve yazılım gerektirebilir ve yeterli spot çözünürlüğe sahip olmalıdır ve slayt ve Görüntüleyici ile uyumluluk. Sera reaktivitesine bağlı olarak, 1:50 ila 1:400 arasında dilüsyonlar kullanılabilir. Serum içermeyen tampon negatif kontrol olarak kullanılabilir, antijen bağlamak için bilinen monoklonal antikorlar olumlu bir kontrol olarak kullanılabilir.
Kullanıcılar birkaç sorun giderme sorunlarının farkında olmalıdır. Onun etiketi için antikorlar kullanarak kalite kontrol kontrol amacı baskı başarılı değildi herhangi bir antijenler kontrol etmektir. Sürekli olarak düşük sinyal kalite kontrol kontrol birden çok dizi büyük olasılıkla vermek herhangi bir nokta yetersiz antijen yazdırılan temsil eder. Olası nedenler arasında toplama veya yağış veya antijen kaynak plaka veya düşük temas baskı pin ve Mikroarray slayt arasında değişken kalınlık nedeniyle nitroselüloz Pad. Bu noktada, biz test normalleştirme kalite kontrol kontrol kantitatif sonuçlara dayalı gerçekleştirmeyin, Anti-onun antikorların tespit bağlayıcı bu etiketin kullanılabilirliği tarafından etkilenebilir verilen, hangi 3 boyutlu konformasyona bağlıdır Her antijen için özeldir.
Grip antijen mikrodizisi, ELISA gibi geleneksel yöntemlerin üzerinde çeşitli avantajlar sağlar ve HAI ve mn gibi fonksiyonel nitelikteki işlevlere tamamlayıcı niteliktedir. 16-Pad protein mikroarray, 1 μL serumdan yaklaşık 300 antijenlere karşı aynı anda birden fazla izotipteki antikorları ölçmek için kapasite ile örnek koruyucu bir teknolojidir. Antijenlerin sayısı, slaytlar başına pedlerin sayısını azaltarak binlerce kişi tarafından artırılabilir. Multiplexed assay de personel zaman ve sarf kaynakları yedek, sera yüzlerce antikorlar için probed olabilir verilen 2 gün, ve slaytlar ve reaktifler dışında tüm materyaller yeniden kullanılabilir böylece plastik atık büyük miktarlarda üretmeyin.
Mikroarray yazıcılar yaygın olarak dağıtılamayabilir, Mikroarray slaytlar merkezi bir konumda yazdırılabilir ve sonra yoklama için son kullanıcıya taşınır. Yoklama için gerekli tek ekipman düşük maliyetli ve taşınabilir Görüntüleyici. Bu protokol yaygınlaştırılması amacı bu tekniğin kullanımı daha yaygın hale getirmek için.
Grip antijen mikrodizinin ana sınırlamaları, algılanan antikorların fonksiyonunu ve kinetiği karakterize edeememesidir. Mikrodizi, her antijen için bir poliklonal bağlayıcı antikorlar kümesi algılıyor. Bu antikorlar HAI ve MN assays içinde nötralize virüs işlevsel olmayabilir veya olabilir. Ancak, HaI ve mn testlerde influenza kuş alt türlerine karşı antikorlar için test etmek için yüksek seviyeli Biyogüvenlik dolapları ile özel tesisler için ilişkili ihtiyaç ile canlı virüs kültürü gerektirir, protein mikroarray canlı virüs içermez ise Böylece herhangi bir temel laboratuvarda kullanılabilir. Bağlayıcı kinetik ile ilgili olarak, her antijen tek bir konsantrasyon içeren bir dizi ile probed serum tek bir seyreltme antijen bağlamak tüm antikorlar üzerinde toplanan miktar ve benzeşimi bileşik temsil eden tek bir veri noktası verir . Antijen-antikor bağlama kinetiği tam olarak çözmek için, birden fazla antijen konsantrasyonları ve/veya seraların seri dilleri gereklidir.
Bu sınırlamalara rağmen, grip antijen mikrodizisi, verimlilik ve kullanılabilirlik içinde daha sınırlı olan fonksiyonel niteliklerini tamamlayabilir antijenik peyzaj genelinde grip antikorların genişliğini karakterize etmek için yararlı bir araçtır.
Disclosures
Yazarların açıklamaları yok.
Acknowledgments
Yazarlar University of Maryland ıRB Protokolü altında insan sera toplamak için Prof Don Milton (Enstitü uygulamalı kamu sağlığı, Maryland Üniversitesi, College Park, MD, ABD) kabul etmek istiyorum #313842 DARPA N66001-18-2-4015 P00001 tarafından finanse edilir. Yazarlar ayrıca odni ıerpa DJF-15-1200-K-0001725 tarafından finanse edilen trimerized ha ve na antijenleri sağlamak için Prof. Florian kraymer (Icahn Medicine, mt. Sinai, NY, ABD) kabul etmek istiyorum. S. Khan kısmen ulusal araştırma kaynakları merkezi ve translasyonel Bilimler, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Grant KL2 TR001416 aracılığıyla Ulusal Merkezi tarafından desteklenir. İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka NıH resmi görüşlerini temsil etmez.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
| 1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
| ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
| Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
| HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
| Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
| Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
| ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
| ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
| ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
| Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
| Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
| Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |
References
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).
- Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation. Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).
- Li, L., et al. Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review. American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).
- Fauci, A. S. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).
- Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks. PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).
- Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. Vaccines for preventing influenza in healthy adults. Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269 (2018).
- Erbelding, E. J., et al. A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Xie, H., et al. H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps. Scientific Reports. 5, 15279 (2015).
- Tricco, A. C., et al. Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis. BMC Medicine. 11, 153 (2013).
- Katz, J. M., Webster, R. G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs. Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).
- Zost, S. J., et al. Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).
- Liang, L., Felgner, P. L. A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).
- Jain, A., et al. Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays. Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).
- Desbien, A. L., et al. Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses. Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).
- Mace, C. R., et al. Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens. Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).
- Koopmans, M., et al. Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray. Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).
- Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology. PLoS One. 10 (8), e0134484 (2015).
- Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards. Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Nakajima, R., et al. Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies. mSphere. 3 (6), (2018).
- Van Hoeven, N., et al. A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Scientific Reports. 7, 46426 (2017).
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7 (8), e43603 (2012).
