Summary
Her præsenterer vi en kirurgisk protokol i kaniner med det formål at vurdere knogle substitutions materialer i form af knogle regenereringskapacitet. Ved at bruge Peek cylindre fastgjort på kanin kranier, osteoledning, osteoinduktion, osteogenesis og vasculogenesis induceret af materialerne kan evalueres enten på levende eller aflives dyr.
Abstract
Det grundlæggende princip for kanin calvarial model er at dyrke nye knoglevæv vertikalt på toppen af den kortikale del af kraniet. Denne model giver mulighed for vurdering af knogle substitutions materialer til oral og kraniofacial knogle regenerering i form af knoglevækst og neovascularization støtte. Når dyrene er bedøvet og ventileret (endotracheal intubation), er fire cylindre lavet af Polyether også ether keton (PEEK) skruet på kraniet, på begge sider af median og koronal suturer. Fem intramedullære huller er boret i knogle området afgrænset af hver cylinder, tillader tilstrømning af knoglemarvsceller. Materialeprøverne anbringes i cylindrene, som derefter lukkes. Endelig er operationsstedet sutureret, og dyrene vågner. Knoglevækst kan vurderes på levende dyr ved hjælp af mikrotomografi. Når dyrene er euthanized, knoglevækst og neovaskularisering kan evalueres ved hjælp af mikrotomografi, immun-histologi og immunofluorescens. Da vurderingen af et materiale kræver maksimal standardisering og kalibrering, synes den calvariale model at være ideel. Adgang er meget let, kalibrering og standardisering lettes ved brug af definerede cylindre og fire prøver kan vurderes samtidigt. Desuden kan levende tomografi anvendes, og i sidste ende kan der forventes et stort fald i dyr, der skal aflives.
Introduction
Den calvariale model af knogle augmentation blev udviklet i 90 ' er med det formål at optimere begrebet guidet knogle Regeneration (GBR) i den mundtlige og kraniofacial kirurgisk domæne. Det grundlæggende princip i denne model er at dyrke nye knoglevæv vertikalt på toppen af den kortikale del af kraniet. For at gøre dette fastgøres en reaktor (f. eks. titanium kuppel,-cylinder eller-bur) på kraniet for at beskytte knogle regenereringen udført af et transplantat (f. eks. hydrogel, knogle erstatning osv.). Ved hjælp af denne model, titanium eller keramiske bure1,2,3,4,5,6, GBR membraner7,8,9 ,10, osteogene faktorer11,12,13,14,15,16,17, ny knogle erstatninger12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 eller mekanismen for neovascularization under knogle regenereringsprocessen30 blev vurderet.
Fra et translationelt synspunkt repræsenterer den calvariale model en One-Wall defekt, der kan sammenlignes med en klasse IV defekt i kæben31. Målet er at dyrke nye knogler over et kortikalt område, uden nogen lateral støtte fra endogene knogle vægge. Modellen er således ekstremt stringent og vurderer det reelle potentiale af vertikal osteoledning over den kortikale del af knoglen. Hvis den model, der er beskrevet heri, primært er dedikeret til vurdering af osteoledning i knogle erstatninger, kan osteogenesen og/eller osteoinduktion også vurderes, samt vasculogenesis1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.
Hovedsagelig af etiske, praktiske og økonomiske årsager, den calvariale model blev udviklet i kanin, hvor knogle metabolisme og struktur er ganske relevant i forhold til menneskelige32. Af de 30 nævnte henvisninger anvendte 80% kanin calvarial model1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, hvilket viser relevansen af denne dyremodel. I 2008 overførte Busenlechner-koncernen den kalvariale model til grisen for at muliggøre sammenligning af otte knogle erstatninger samtidigt20 (sammenlignet med to knogle erstatninger med kanin). På den anden side, vores gruppe overført kanin calvarial model til får. Kort sagt, titanium kupler blev placeret på får kranier til at karakterisere osteoconduction af en ny 3D-trykt knogle erstatning. Disse undersøgelser tillod os at udvikle og mestre calvarial model og dens analyse16,21.
De sidste tre undersøgelser henviste til16,20 og21sammen med flere andre undersøgelser12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, bekræftede det store potentiale af calvarial model som en screening og karakterisering Model. Men selv om de opnåede resultater var ganske tilfredsstillende, påpegede de også nogle begrænsninger: (1) brugen af titanium kupler, som forhindrede røntgen diffusion og til gengæld levende mikro-CT brug. Disse kunne ikke fjernes før histologisk behandling, hvilket tvinger forskerne til at integrere prøverne i poly (methylmethacrylat) harpiks (PMMA). De resulterende analyser var derfor i vid udstrækning begrænset til topografi. (2) høje finansielle omkostninger, især på grund af dyrenes omkostninger, og omkostninger i forbindelse med logistik, vedligeholdelse og kirurgi af dyrene. (3) vanskeligheder med at indhente etiske godkendelser for store dyr.
En nylig undersøgelse af Polo, et al.26 stort set forbedret modellen på kanin. Titanium kupler blev erstattet af tørre cylindre, der kunne fyldes med en konstant mængde materiale. Fire af disse cylindre blev anbragt på kanin kranier. Ved afslutningen kunne cylindrene fjernes, så biopsier var metalfri, hvilket indførte meget mere fleksibilitet i forbindelse med prøve behandling. Den kanin kalvariale model blev attraktiv for samtidige test med lavere omkostninger, nem håndtering af dyr og lettelse af prøve behandling. Ved at udnytte denne seneste udvikling har vi forbedret modellen yderligere ved at udskifte titanium med PEEK for at producere cylindre og derved tillade røntgen diffusion og brug af mikrotomografi på levende dyr.
I denne artikel vil vi beskrive anæstesi og kirurgi processer og vise eksempler på output, der kan opnås ved hjælp af denne protokol, dvs (immuno-) histologi, histomorphometry, levende og ex vivo mikrotomografi til at evaluere mekanismerne i knogle regenerering og kvantificere den nye knogle syntese understøttet af knogle erstatningsmaterialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I overensstemmelse med de schweiziske lovkrav blev protokollen godkendt af et akademisk udvalg og overvåget af de kantonale og føderale veterinærmyndigheder (godkendelser n ° GE/165/16 og GE/100/18).
1. specifikke anordninger og dyr
-
Cylindre
- Maskin cylindre med laterale stabiliserende faner ud af PEEK har en indvendig diameter på 5 mm, en udvendig diameter på 8 mm og en højde på 5 mm (figur 1).
- Machine PEEK caps med et design gør det muligt at klippe præcist på toppen af cylinderen (tykkelse 1 mm).
- Steriliser PEEK cylindre og caps ved autoklave Rens før operationen.
-
Skruer
- Brug selvborende mikro skruer (lavet af kommerciel Pure Titanium (grad 5)) til at fastgøre cylindrene (1,2 mm i diameter, 4 mm i længden). Steriliseres ved autoklave iser før operationen.
-
Dyr
- Køb tre måneder gamle New Zealand hvide kaniner (mand eller kvinde), vejer ~ 2,5 kg hver.
Bemærk: vi fik kaniner ved avl på universitetet i Genève.
- Køb tre måneder gamle New Zealand hvide kaniner (mand eller kvinde), vejer ~ 2,5 kg hver.
2. kirurgi
- Kirurgisk bakke
- Hold Scalpels, saks, to pincet, periost elevator, sprøjter (1, 2, 5, 50 ml), kirurgisk motor, runde kirurgiske BURS (0,8 mm diameter), nåle, steril saltvand, fire cylindre, otte skruer, og skruetrækker klar.
- Præklinisk behandling
- Acclimate dyrene en uge før operationen.
- Give en profylaktisk antibiotikum dagligt (5 – 10 mg/kg gennem munden (PO)) starter 2 h før kirurgi op til 3 dage efter operationen.
- Anæstesi og intubation
- Sedate dyrene ved intramuskulær (IM) injektion af ketamin (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) + xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Vent ~ 20 min for dyrene at sove
dybt (komplet muskuløs atony).
Bemærk: denne præmedicinering vil give mulighed for en enkel, hurtig og smertefri intubationsproces. Dyb analgesi og anæstesi induceres som beskrevet i trin 2.3.8. - Placer en intravenøs (IV) kanyle i den marginale vene fra øret, og hold den lukket, indtil intubation er afsluttet.
Bemærk: denne IV linje vil tjene til at perfuse fentanyl og propofol for dyb analgesi og anæstesi, henholdsvis (Se trin 2.3.8). - Vedligehold anæstesi ved at levere 5% Sevofluran i ren ilt, indtil intubation udføres.
Bemærk: dette trin er kun nødvendigt, hvis dyret viser tegn på opvågning (øjenbevægelser, muskelsammentrækninger). - Anæstetisere luftrør lokalt ved sprøjtning 10% lidocain. Placer kaninen i udsat position og opretholde hovedet i lodret forlængelse.
- Skub den første endotracheal tubus tube med lille diameter (2,5 mm) ind i kanin luftrør, indtil luftstrømmen kan høres i røret. Dette vil åbne strubehovedet og lette indsættelsen af den definitive tube.
- Indsæt en guide (intubation kateter) i røret for at fastsætte positionen af røret i luftrør. Fjern røret med lille diameter, og skub det definitive endotracheal tubus-rør (4,9 mm) på føringen.
- Fjern hjælpelinjen, og pust ballonen i enden af endotracheal tubus røret for at forsegle og blokere enheden ind i luftrøret. Røret vil blive på plads, men det kan være sikret ved hjælp af en blonder bundet omkring panden. Straks ventilere (7 mL/kg, hyppighed 40/min) dyret med 3% Sevofluran i ren ilt.
- Kontinuerlig perfuse (øre vene) fentanyl (0,01 mg/mL, 2 – 4 mL/h) for at inducere analgesi, 2 – 4 mg/kg af (2%) propofol (20 mg/mL, 4 – 8 mL/t) for at inducere anæstesi og 4 mL/kg/time af Ringer's acetat for at opretholde ISO-volumetriske betingelser.
- Placer en rektal temperatursonde. Også overvåge hjertefunktion, temperatur og iltmætning under hele processen.
- Kontroller dybden af anæstesi ved at overvåge autonome vejrtrækning; hvis dyret viser tegn på autonom vejrtrækning, skal der dispenserer en lille bolt af propofol og fentanyl.
- Sedate dyrene ved intramuskulær (IM) injektion af ketamin (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) + xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Vent ~ 20 min for dyrene at sove
- Forberedelse af byggepladsen
- Anbring kaninen på en opvarmet pude (39 °C) dækket af en madras pude (for at undgå forbrændinger) på operationsbordet. Barberer hovedbunden.
- Påfør en smøre gel på øjnene for at undgå irritation og tørhed. Desinficer siden ved at skrubbe huden med povidon jod (10%). Derefter drapere kanin med en steril kirurgisk drapere og skåret ud et adgangsområde til kraniet.
- Desinficer operationsstedet med povidon jod (10%) for anden gang. Påfør en smøre gel på øjnene for at undgå irritation og tørhed.
- Forbered et draperet bord (steril Drape), hvor den komplette kirurgiske bakke skal placeres.
- Kirurgisk site åbning
- Anæstetize lokalt med en subkutan (SC) injektion af lidocain 2% (1 mL) på kraniet.
- Incise gennem huden (med en skalpel) langs calvarial sagittale linje, fra kredsløb til den eksterne occipital protuberance (~ 4 cm i længden). Sørg for, at periosteum er indsnit.
- Løft forsigtigt periosteum (med en periost elevator) på begge sider af snittet. Skyl stedet med sterilt saltvand.
- Cylinder placering
- Find de mediane og koronale suturer på kraniet (figur 2a, B). Bemærk, at disse anatomiske linjer danner et kors. Cylindrene vil blive anbragt i hver af de kvadranter, der er defineret af korset, hvilket sikrer, at kanten af cylinderen ikke er over suturen (figur 2c).
- Placer den første cylinder på venstre øvre kvadrant (venstre frontal knogle), og prøv at lægge enheden fladt. Fix i positionen med stærkt håndtryk og skru en mikro-skrue, indtil modstanden føles. Sørg for, at skruehovedet flugter med overfladen af cylinder fanen.
- Gentag samme procedure på den anden fane for at fastgøre cylinderen stramt på kraniet. Sørg for, at cylinderen er hermetisk fastgjort til knoglen.
- Gentag proceduren på højre øvre fjerdedel (højre frontal knogle), venstre nedre kvartal (venstre parietal knogle) og højre nedre kvartal (højre parietal knogle).
- Knogle boring af 5 intramedullære huller inden for det område, som cylindrene har afgrænset (figur 1)
- Bore et intramedullær hul under saltvand vanding (0,8 mm i diameter, ~ 1 mm i dybden) med en rund bur på knoglen, i midten af området afgrænset af cylinderen. Sørg for, at blødningen opstår.
- Bor to flere intramedullære huller langs aksen passerer gennem de to tab skruer, ved de indvendige kanter af cylinderen. Langs den vinkelrette økse, bor to mere intramedullære huller ved de indvendige kanter af cylinderen. Sørg for, at blødningen opstår.
- Gentag operationen inden for de tre andre cylindre.
- Påfyldning af cylindre med materialeprøver og capping (figur 3)
- Forbered det ønskede knogleerstatningsmateriale i henhold til producentens anvisninger eller materiale specifikationer.
- Fyld den første cylinder til randen med materiale prøven og luk cylinderen ved at montere hætten. Gentag processen i de 3 andre cylindre.
- Lukning af operationssted
- Luk huden over cylindrene med en intermitterende ikke-resorbbar sutur.
- Påfør en sprøjtbar dressing på såret.
3. post-kirurgisk behandling
- Stop analgesi og anæstesi (propofol og fentanyl perfusion anholdelse) levering og kontrollere inddrivelse af autonome vejrtrækning.
- Stop ventilationen, når dyret har genvundet autonom vejrtrækning. Opretholde dyret under ren ilt før fuldstændig opvågning.
- Injicér buprenorphin-hydrochlorid (0,02 mg/kg, 0,03 mg/mL, 0,67 mL/kg), og Gentag injektionen hver 6 h i 3 dage som post-kirurgisk analgesi.
- Overfør dyret til det sædvanlige hus med vand og fuld fodring.
- Fjern suturerne efter ca. 10 dages sårheling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den model, der er beskrevet heri, er dedikeret til vurdering af osteoledning i knogle erstatninger. Osteogenesen og-eller osteoinduktion af knogle erstatninger enten (præ-) cellulariseret eller fyldt med bioaktive molekyler kan også vurderes, samt vasculogenesis1,2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. der kan anvendes en kinetisk undersøgelse fra 3 dage op til 3 måneder efter operationen afhængigt af de mekanismer og udgange, der skal analyseres. En klassisk tidslinje tillader beskrivelser på tidlige og midt-tid er: 2, 4, 6, 8 og 12 uger. Bemærk, at mindst 6 prøver pr. tidspunkt er obligatorisk for at opnå væsentlige resultater. Hver prøve, der skal testes, skal anbringes mindst én gang i hver position på kraniet pr. tidspunkt (tilfældig fordeling). Endelig skal der optages Sham-prøver (f. eks. cylindre fyldt med koaguleret blod) i protokol34.
Når operationen er afsluttet, knoglevækst kan overvåges på forskellige tidspunkter ved hjælp af knogle tomografi på levende dyr. Et eksempel er vist i figur 4a, B. Yderligere analyse kræver dyr, der skal ofres (dødelig intravenøs injektion af 150 mg/kg pentobarbital (100 mg/mL). Efter eutanasi, prøver er sektioneret og cylindre fjernes forsigtigt (figur 5). Biopsier er fastgjort med en opløsning af fosfat-bufferet saltvand og 4% formaldehyd. Knoglevækst kan derefter vurderes ved hjælp af mikrotomografi (figur 4 C, D). Prøverne kan også forarbejdes til (immun-) histologisk farvning. Histomorphometrisk analyse og specifikke faringer er så muligt at gennemføre analysen mere specifikt (figur 6).
Figur 1: specifikationer for Peek cylindre. To huller (0,8 mm i diameter) blev boret på de laterale stabiliserende faner til skrue. Positionerne for de 5 intramedullære huller (0,8 mm i diameter), der skal bores på kraniet i det område, der afgrænses af cylinderen, markeres med røde cirkler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativt billede af kanin kraniet og placering af cylindrene. Billeder viser median og koronal suturer på kanin kraniet afgrænse venstre-højre parietal og frontal knogler (A,B). Placering af cylindrene på begge sider af suturerne (C). Skala stænger = 5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentativt billede af cylindre fast, fyldt og kapret. Billede, der viser fire cylindre fastgjort på kraniet af en kanin med titanium skruer. Inden for området afgrænset af hver cylinder, blev 5 intramedullære huller (0,8 mm i diameter, ~ 1 mm i dybden) boret under kunstvanding med en rund bur til at tillade knogle celle migration. Cylindrene blev fyldt med forskellige knogle erstatnings prøver (kalibrerede volumener) før capping (en lukket cylinder vises kun). Skala bar = 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative billeder fra microtomographic (Micro-CT) analyse. Med det endelige mål at vurdere knoglevækst udført af knogle erstatninger, 4 cylindre blev fastgjort på et kanin kranium med titanium skruer og fyldt med knogle erstatningsmaterialer. A) levende billeddannelse: todimensionel tværgående scanning (14 min, 99 kV/88 μA med en opløsning på 20 μm) af en cylinder efter 12 uger. (B) tre-dimensionelle (3D) rekonstruktion fra levende mikro-CT-analyse på 4 uger (røde cirkler: knogle erstatninger i cylindre; rød pil: kontrol, hvor cylinderen er fyldt med koaguleret blod). (C,D) Efter eutanasi (12 uger) blev cylindrene fjernet før fiksering og Micro-CT-analyse. C) 2D-tværgående scanning (57 min., 99 kV/88 μA med en opløsning på 10 μm) af en cylinder og 3D-rekonstruktion af den totale nye knogle i cylinderen (D). Knogle substitut partikler (rød), ny knogle (grøn) og knogle seng (gul) vises. Skala stænger = 2 mm venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative billeder af en biopsi ved 4 uger. Efter eutanasi (4 uger) blev prøverne blok opdelte, og cylindrene blev fjernet før fiksering i 4% formalin, mikro-CT-analyse og histologisk behandling. Scale bar = 5mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentative billeder af (immun-) histologiske sektioner. Med det endelige mål at vurdere knoglevækst og neovascularization udført af knogle erstatninger, 4 cylindre blev fastgjort på et kanin kranium med titanium skruer og fyldt med knogle erstatninger. Efter eutanasi (12 uger) blev cylindrene fjernet før fiksering og histologisk behandling. (A) Masson-Goldner farvning (50x): knogle erstatning fremstår som Mauve partikler omgivet af ny knogle i grøn. B) udsnittene blev scannet og forarbejdet til digital ekstraktion af knogle substitut materiale, således at den nye knogle (rød) let kunne kvantificeres. C) immun farvning af CD31 (pile), en typisk markør for endotelceller og neovasculariseringsproces. (D) Immunofluorescent farvning (grøn) af en meget neovascularized zone, hvor nogle nye kapillærer stærkt Express CD31 (Arrow). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den model, der er beskrevet heri, er enkel og bør udvikles ganske let, så længe alle trinene følges, og udstyret er egnet. Da den beskrevne protokol er en kirurgisk metode, ser alle trinene ud til at være kritiske og skal følges korrekt. Det er afgørende at være uddannet til dyreforsøg, især i kanin håndtering og anæstesi. Tøv ikke med at bede om professionel bedøvelse og dyrlægehjælp. Det er afgørende at insistere på den daglige visuelle overvågning af dyr før og efter sutur fjernelse. Selv om huden fra kraniet er tyk, rigelig og løs, inducerer cylindernes fiksering store spændinger. Hvis suturerne fjernes for tidligt, kan såret genåbne og vil kræve en uge mere af suturering og en ny antibiotisk behandling. I tilfælde af dehiscens ud af sårlinjen, vil kirurgen nødt til at overveje, om suturering er muligt eller ej. Hvis ikke, skal prøve afstødning overvejes.
Ud over de kritiske trin, der er beskrevet i afsnittet protokol, kan nedenstående oplysninger være nyttige i forbindelse med korrekt implementering af denne protokol. Fra et teknisk synspunkt, som kaniner anvendes er unge og små, er det vigtigt at bruge en to-trins intubation, som beskrevet i protokollen. Den anden (og sidste) tube er for stor til at blive brugt i første intubation, og der er en reel risiko for "forkert måde", der kan være skadelige eller endda dødelig.
Afhængigt af de testede materialer kan det være interessant at tage nogle friske blodprøver fra øret IV linje, der allerede er placeret. Dette kunne give en god metode til at pre-infuse knogleerstatningsmateriale med naturlige celler og vækstfaktorer. Frisk koaguleret blod kan også give en ideel Sham prøve.
Den måde, de intramedullære huller bores på, bør være meget nyttige for fremtidig histologisk behandling og histomorphometrisk analyse. I realiteten, så længe hullerne er (i) på samme sted, (II) biopsier er tilsvarende orienteret og (III) skæreprocessen er standardiseret (dvs., samme tykkelse, samme snitniveau), de felter, der evalueres er ækvivalente og deres sammenligning er meget Relevante. Som et spørgsmål om standardisering, kan det være af reel interesse at kalibrere mængden-mængden af materiale til at fylde cylinderen, og at forberede det på forhånd, på en steril måde.
Ud fra et videnskabeligt synspunkt kan det, afhængigt af de testede produkter eller hypoteser, være vigtigt at undgå at placere cylindrene på knogle suturer. Nogle specifikke stamceller er til stede i disse strukturer35, forskellig fra de mesenchymal knogle stamceller, der er involveret i mekanismerne i Intramembranous ossifikation, dvs knogle regenerering proces stødt på Orofacial område. Derfor kan der opstå en reel skævhed i tilfælde af fejl.
En af de største fordele ved den calvariale model er brugen af levende mikrotomografi, hvormed knoglevæksten kan følges på et enkelt dyr som en longitudinel undersøgelse. Denne strategi kan i vid udstrækning nedbringe antallet af euthaniserede dyr og derfor respektere "3R-reglen"36. Afhængigt af den anvendte mikrotomograf enhed (opløsning, plads til rådighed for dyret), variationer vil forekomme i form af strategi for anæstesi (IV, gas, etc.), samt i billedopløsningen og relevansen af den resulterende analyse.
Vi bruger rutinemæssigt en mikrotomograf dedikeret til dyreforsøg (f. eks. Quantum GX) til rutinemæssig kontrol. Et typisk eksperiment starter med en sedation, som beskrevet i trin 2.3.1. Anæstesi vedligeholdes derefter med 2% isofluran i ren ilt. Dette gør det muligt for dyret at trække vejret roligt under en scanningstid på ca. 14 min (99 kV/88 μA med en opløsning på 20 μm); Dette er tilstrækkeligt til at kontrollere grundparametrene (engraftment, cylinder fiksation, semikvantitativ analyse af knoglevæksten osv.). Når man ser for en præcis kvalitativ og kvantitativ analyse, en meget fin tuning af scanningen tid, opløsning, anæstesi og dyre positionering vil være behov for.
Eksisterende modeller udviklet til vurdering af osteoconduction, osteogenesis, osteoinduktion samt vasculogenesis, er talrige, især i Orofacial felt. På grund af etiske og økonomiske overvejelser, vil vores formål være begrænset til kanin eller mindre dyr. Bortset fra kraniet er de steder, hvor materialet kan prøves, mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, dias48 eller de skarp stikkontakter (efter tænder udvinding)49,50,51. Rotter, mus, marsvin og kaniner kan anvendes til hver af de modeller, der er beskrevet nedenfor. Kort sagt, en kritisk defekt er boret (eller en sokkel er skabt af skarp ekstraktion), fyldt med materiale prøven og derefter dækket af en membran. Bortset fra det indlysende faktum, at kun to prøver kan testes på hver af disse steder (en prøve pr. kæbe side eller pr skarp sokkel), de kirurgiske procedurer er også stort set vanskeligere og invasive. Adgang til webstedet er begrænset, og hvis man bruger rotte eller mus, er vanskeligheden yderligere forøget med størrelsen af dyrene. Endelig er den kritiske størrelse af fejlene (dvs. dimensioner, der ikke tillader en spontan knogle regenerering) ikke veldefinerede og varierer fra det ene dyr til det andet.
Ud over disse generelle virkninger kan der opstå særlige begrænsninger afhængigt af den anatomiske placering, der er underkastet defekten, og den efterfølgende analyse. Som et eksempel, i mandibulær model, tænder rødder er til stede inden for defekten. Dette kan forstyrre materialet og ændre knogle regenereringsprocessen. Defekten kunne placeres mere fikseres på Ramus, men i så fald ville knoglen være meget tynd (to corticals fastgjort med en ekstremt tynd medulær plads) og den resulterende defekt volumen kan være for lille45,46, 47. i betragtning af disse eksempler på begrænsninger og afhængigt af modellen kan der forventes store afvigelser med hensyn til det materiale volumen, der skal testes, kvaliteten og mængden af indsamlede data.
Da vurderingen af et materiale kræver maksimalt standardisering og kalibrering, synes den calvariale model at være ideel. Adgang er meget let, kalibrering og standardisering lettes ved brug af definerede cylindre og 4 prøver kan vurderes samtidigt. Desuden kan levende tomografi anvendes, og endelig kan der forventes et stort fald i dyr, der skal aflives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne står i gæld til Geistlich AG (Wolhusen, CH) og osteology Foundation (Lucerne, CH) (Grant n ° 18-049) for deres støtte, samt global D (Brignais, FR) for at levere skruerne. En særlig tak går til Dr. B. Schaefer fra Geistlich. Vi er også taknemmelige for Eliane DuBois og Claire Herrmann for deres fremragende histologiske behandling og deres dyrebare råd. Endelig, vi varmt anerkender Xavier Belin, Sylvie roulet og hele holdet af pr Walid Habre, "eksperimentel kirurgi DPT", for deres bemærkelsesværdige tekniske bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Enrofloxacine Baytril 10% | Bayer | Antibiotic | |
| Fentanyl | Bischel | For analgesia | |
| Ketalar 50mg/ml | Pfizer | Ketamine for anesthesia | |
| Lidohex | Bichsel | Lubricating gel for the eyes | |
| Opsite | Smith and Nephew | 66004978 | Sprayable dressing |
| Povidone iodine 10%, Betadine | Mundipharma | anti-infective agent | |
| Propofol 2% | Braun | 3538710 | For anesthesia |
| Rapidocain 2% | sintetica | Local anesthesia | |
| Ringer-acetate | Fresenius Kabi | Volume compensation | |
| Rompun 2% | Bayer | Xylazin for anesthesia | |
| Sevoflurane 5% | Abbvie | For anesthesia | |
| Sterile saline | Sintetica | ||
| Temgesic | Reckitt Benckiser | Buprenorphine hydrochloride, analgesia | |
| Thiopental Inresa | Ospediala | For anesthesia | |
| Xylocaine 10% spray | Astra Zeneca | For intubation | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fresenius Vial pilot C | Imexmed | Infusion pump | |
| Heated pad | Harvard Apparatus | ||
| Suction dominant 50 | Medela | ||
| Suction tubing Optimus | Promedical | 80342.2 | |
| Surgical motor | Schick dental | Qube | Drilling of intramedullary holes |
| Ventilation | Maquet Servo1 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Cylinders and caps | Boutyplast | Customized | composition: PEEK (poly ether ether ketone) |
| Manual self-retaining shaft | GlobalD | ACT1K | |
| Mobile handle for self-retaining shaft | GlobalD | MTM | |
| Self- drilling screws | GlobalD | VA1.2KL4 | cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tray | |||
| Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm | Covidien | 86233 | For intubation |
| Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm | Covidien | 107-35G | For intubation |
| Ethicon prolene 4-0 | Ehticon | 8581H | Non-resorbable suture |
| Forceps | Marcel Blanc | BD027R | 145 mm |
| Intubation catheter | Cook medical | Guide for intubation | |
| Needlle holder | Marcel Blanc | BM008R | |
| Needles BD Microlance3 | Becton Dickinson | 300300/304622 | 26G; 18G |
| Periosteal | HU-Friedy | P9X | |
| Round surgical burs | Patterson | 78000 | 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes |
| Scalpel | Swann-Morton | n°10 and n°15 | |
| Scissors | Marcel Blanc | 00657 | 180 mm |
| Syringes Omnifix | Braun | 4616057V | 5ml, 10ml and 50ml |
| Venflon G22 | Braun | 42690985-01 | Vasofix safety for the ear iv line |
References
- Anderud, J., et al. Guided bone augmentation using a ceramic space-maintaining device. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology and Oral Radiology. 118 (5), 532-538 (2014).
- Lundgren, A. K., Lundgren, D., Hammerle, C. H., Nyman, S., Sennerby, L. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clinical Oral Implants Research. 11 (2), 99-106 (2000).
- Lundgren, D., Lundgren, A. K., Sennerby, L., Nyman, S. Augmentation of intramembraneous bone beyond the skeletal envelope using an occlusive titanium barrier. An experimental study in the rabbit. Clinical Oral Implants Research. 6 (2), 67-72 (1995).
- Slotte, C., Lundgren, D. Impact of cortical perforations of contiguous donor bone in a guided bone augmentation procedure: an experimental study in the rabbit skull. Clinical Implant Dentistry and Relat Research. 4 (1), 1-10 (2002).
- Tamura, T., et al. Three-dimensional evaluation for augmented bone using guided bone regeneration. Journal of Periodontal Research. 40 (3), 269-276 (2005).
- Yamada, Y., et al. Correlation in the densities of augmented and existing bone in guided bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 23 (7), 837-845 (2012).
- Chierico, A., et al. Electrically charged GTAM membranes stimulate osteogenesis in rabbit calvarial defects. Clinical Oral Implants Research. 10 (5), 415-424 (1999).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of the permeability of shields with autologous bone grafts on bone augmentation. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (6), e386-e392 (2013).
- Ito, K., Nanba, K., Murai, S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. Journal of Periodontology. 69 (11), 1229-1237 (1998).
- Lee, Y. M., et al. Enhanced bone augmentation by controlled release of recombinant human bone morphogenetic protein-2 from bioabsorbable membranes. Journal of Periodontology. 74 (6), 865-872 (2003).
- Fugl, A., et al. S-nitroso albumin enhances bone formation in a rabbit calvaria model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 43 (3), 381-386 (2014).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of self-assembling peptide hydrogel scaffold on bone regeneration with recombinant human bone morphogenetic protein-2. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (5), e283-e289 (2013).
- Ito, K., et al. Effects of ipriflavone on augmented bone using a guided bone regeneration procedure. Clinical Oral Implants Research. 18 (1), 60-68 (2007).
- Jung, R. E., Hammerle, C. H., Kokovic, V., Weber, F. E. Bone regeneration using a synthetic matrix containing a parathyroid hormone peptide combined with a grafting material. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 22 (2), 258-266 (2007).
- Minegishi, T., et al. Effects of ipriflavone on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvaria. Journal of Oral Science. 44 (1), 7-11 (2002).
- Moussa, M., et al. Medium-Term Function of a 3D Printed TCP/HA Structure as a New Osteoconductive Scaffold for Vertical Bone Augmentation: A Simulation by BMP-2 Activation. Materials. 8 (5), 2174-2190 (2015).
- Thoma, D. S., Kruse, A., Ghayor, C., Jung, R. E., Weber, F. E. Bone augmentation using a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute materials with and without recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clinical Oral Implants Research. 26 (5), 592-598 (2014).
- Busenlechner, D., et al. Resorption of deproteinized bovine bone mineral in a porcine calvaria augmentation model. Clinical Oral Implants Research. 23 (1), 95-99 (2012).
- Busenlechner, D., et al. Paste-like inorganic bone matrix: preclinical testing of a prototype preparation in the porcine calvaria. Clinical Oral Implants Research. 20 (10), 1099-1104 (2009).
- Busenlechner, D., et al. Simultaneous in vivo comparison of bone substitutes in a guided bone regeneration model. Biomaterials. 29 (22), 3195-3200 (2008).
- Carrel, J. P., et al. A 3D printed TCP/HA structure as a new osteoconductive scaffold for vertical bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 55-62 (2016).
- Murai, M., et al. Effects of different sizes of beta-tricalcium phosphate particles on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Dental Materials Journal. 25 (1), 87-96 (2006).
- Nishida, T., et al. Effects of bioactive glass on bone augmentation within a titanium cap in rabbit parietal bone. Journal of Periodontology. 77 (6), 983-989 (2006).
- Nyan, M., et al. Feasibility of alpha tricalcium phosphate for vertical bone augmentation. Journal of Investigating and Clinical Dentistry. 5 (2), 109-116 (2012).
- Polimeni, G., et al. Histopathological observations of a polylactic acid-based device intended for guided bone/tissue regeneration. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 99-105 (2008).
- Polo, C. I., et al. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 2 associated with a variety of bone substitutes on vertical guided bone regeneration in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 84 (3), 360-370 (2013).
- Slotte, C., Lundgren, D., Burgos, P. M. Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 18 (6), 795-806 (2003).
- Tamimi, F. M., et al. Bone augmentation in rabbit calvariae: comparative study between Bio-Oss and a novel beta-TCP/DCPD granulate. Journal of Clinical Periodontology. 33 (12), 922-928 (2006).
- Torres, J., et al. Effect of solely applied platelet-rich plasma on osseous regeneration compared to Bio-Oss: a morphometric and densitometric study on rabbit calvaria. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 106-112 (2008).
- Yamada, Y., et al. Angiogenesis in newly augmented bone observed in rabbit calvarium using a titanium cap. Clinical Oral Implants Research. 19 (10), 1003-1009 (2008).
- Cordaro, L., Terheyden, H. ITI Treatment Guide. Wismeijer, D., Chen, S., Buser, D. 7, Quintessence. (2014).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
- Min, S., et al. Effects of marrow penetration on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 78 (10), 1978-1984 (2007).
- Braun, T. M. Ch. 4. Osteology guidelines for oral and maxillofacial regeneration Preclinical models for translational research. Giannobile, W. V., Nevins, M. , Quintessence publishing. 31-43 (2011).
- Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial Suture-Derived Stem Cells and Their Contribution to Cranial Bone Repair. Frontiers in Physiology. 8, 956 (2017).
- Russel, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. , Universities Federation for Animal Welfare. (1959).
- Asvanund, P., Chunhabundit, P. Alveolar bone regeneration by implantation of nacre and B-tricalcium phosphate in guinea pig. Implant Dentistry. 21 (3), 248-253 (2012).
- Gielkens, P. F., et al. Gore-Tex as barrier membranes in rat mandibular defects: an evaluation by microradiography and micro-CT. Clinical Oral Implants Research. 19 (5), 516-521 (2008).
- Lioubavina, N., Kostopoulos, L., Wenzel, A., Karring, T. Long-term stability of jaw bone tuberosities formed by "guided tissue regeneration". Clinical Oral Implants Research. 10 (6), 477-486 (1999).
- Mardas, N., Kostopoulos, L., Stavropoulos, A., Karring, T. Osteogenesis by guided tissue regeneration and demineralized bone matrix. Journal of Clinical Periodontology. 30 (3), 176-183 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Mardas, N., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone used as an adjunct to guided bone augmentation: an experimental study in the rat. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 3 (3), 156-165 (2001).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone (Bio-Oss) and bioactive glass (Biogran) arrest bone formation when used as an adjunct to guided tissue regeneration (GTR): an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 30 (7), 636-643 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Fate of bone formed by guided tissue regeneration with or without grafting of Bio-Oss or Biogran. An experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 31 (1), 30-39 (2004).
- Stavropoulos, A., Nyengaard, J. R., Kostopoulos, L., Karring, T. Implant placement in bone formed beyond the skeletal envelope by means of guided tissue regeneration: an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 32 (10), 1108-1115 (2005).
- Thomaidis, V., et al. Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size. Medical Science Monitor. 14 (4), (2008).
- Zhang, J. C., et al. The repair of critical-size defects with porous hydroxyapatite/polyamide nanocomposite: an experimental study in rabbit mandibles. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 39 (5), 469-477 (2010).
- Zhang, X., et al. Osteoconductive effectiveness of bone graft derived from antler cancellous bone: an experimental study in the rabbit mandible defect model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 41 (11), 1330-1337 (2012).
- Bronoosh, P., et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on healing of mandibular bone defects: an experimental study in rabbits. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 277-284 (2015).
- Gomes, F. V., et al. Low-level laser therapy improves peri-implant bone formation: resonance frequency, electron microscopy, and stereology findings in a rabbit model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 245-251 (2014).
- Lalani, Z., et al. Spatial and temporal localization of secretory IgA in healing tooth extraction sockets in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 62 (4), 466-472 (2004).
- Osorio, L. B., et al. Post-extraction evaluation of sockets with one plate loss--a microtomographic and histological study. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 31-38 (2014).
