Summary
Her presenterer vi en kirurgisk protokoll i kaniner med sikte på å vurdere bein substitusjon materialer i form av bein regenerering kapasiteter. Ved å bruke PEEK sylindere fast på kanin hodeskaller, osteoconduction, osteoinduction, Osteogenesis og vasculogenesis indusert av materialene kan evalueres enten på Live eller euthanized dyr.
Abstract
Det grunn-prinsippet av kaninen calvarial modell er å avle ny Ben tissue loddrett på toppen av det kortikale del av hodeskallen. Denne modellen tillater vurdering av bein substitusjon materialer for oral og kraniofacial bein regenerering i form av bein vekst og neovascularization støtte. Når dyrene er anesthetized og ventilert (endotrakeal intubering), fire sylindere laget av polyeter Eter keton (PEEK) er skrudd på skallen, på begge sider av medianen og koronale sting. Fem intramedullær hull er boret i benet området avgrenset av hver sylinder, slik at tilstrømningen av benmargceller. Materialet prøvene er plassert i sylindere som er så lukket. Til slutt er operasjonsstedet sutured, og dyrene våkner. Bone vekst kan vurderes på levende dyr ved hjelp av microtomography. En gang dyrene er euthanized, Ben oppblomstringen og neovascularization kanskje være vurdert av benytter microtomography, immun-histologi og immunofluorescence. Ettersom evalueringen av et materiale krever maksimal standardisering og kalibrering, vises den calvarial modellen ideelt. Tilgang er veldig enkelt, kalibrering og standardisering er tilrettelagt ved bruk av definerte sylindere og fire prøver kan vurderes samtidig. Videre, bo tomografi kanskje bli brukt og til sist en stor nedgang inne dyrene å bli euthanized kanskje være foregripe.
Introduction
Den calvarial modellen av bein styrking ble utviklet på 90-tallet med sikte på å optimalisere begrepet guidet bein regenerering (GBR) i muntlig og kraniofacial kirurgisk domene. Det grunnleggende prinsippet i denne modellen er å vokse nytt bein vev vertikalt på toppen av den kortikale delen av skallen. For å gjøre dette, en reaktor (f. eks Titan-Dome,-sylinder eller-buret) er festet på skallen for å beskytte benet regenerering utført av en pode (f. eks, hydrogel, bein erstatning, etc.). Ved hjelp av denne modellen, Titan eller keramiske bur1,2,3,4,5,6, GBR membraner7,8,9 ,10, osteogen faktorer11,12,13,14,15,16,17, nye bein erstatninger12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 priser og , 25 priser og , 26 i , 27 andre priser , 28 flere , 29 eller mekanismen for neovascularization under bein regenerering prosessen30 ble vurdert.
Fra et translational synspunkt representerer calvarial modellen en en-vegg defekt som kan sammenlignes med en klasse IV defekt i kjeven31. Målet er å dyrke nye bein over et kortikale område, uten noen lateral støtte fra endogene bein vegger. Modellen er således ekstremt streng og vurderer det virkelige potensialet til vertikal osteoconduction over den kortikale delen av benet. Hvis modellen som beskrives her, hovedsakelig er dedikert til vurderingen av osteoconduction i bein erstatninger, kan Osteogenesis og/eller osteoinduction også vurderes, i tillegg til vasculogenesis1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.
I all vesentlighet for etikken, praktisk og økonomisk anledninger, det calvarial modell var bebygget inne kaninen i hvilket benet metabolisme og struktur er helt relevant når sammenlignet med human32. Av de 30 referansene sitert ovenfor, 80% brukte kanin calvarial modell1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, og dermed demonstrere relevansen av denne dyre modellen. I 2008, den Busenlechner gruppen overført calvarial modellen til grisen, slik at sammenligningen av åtte bein erstatninger samtidig20 (sammenlignet med to bein erstatninger med kaninen). På den annen side, vår gruppe overført kaninen calvarial modellen til sau. Kort sagt, Titanium kupler ble plassert på sau hodeskaller å karakterisere osteoconduction av en ny 3D-trykt bein erstatning. Disse studiene tillot oss å utvikle og mestre calvarial modellen og dens analyse16,21.
De tre siste studiene sitert16,20,21, sammen med flere andre undersøkelser12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, bekreftet det store potensialet i calvarial-modellen som en screening og karakterisering Modell. Men selv om resultatene innhentet var ganske tilfredsstillende, de også påpekt noen begrensninger: (1) bruk av Titan kupler, som hindret røntgen spredning og i sin tur Live Micro-CT bruk. Disse kunne ikke fjernes før histologiske behandling, tvinger forskerne til å legge inn prøvene i Poly (metyl akrylat) harpiks (PMMA). De resulterende analysene ble derfor i stor grad begrenset til topografi. (2) høye økonomiske kostnader, spesielt på grunn av kostnadene for dyrene, og kostnader knyttet til logistikk, vedlikehold og kirurgi av dyrene. (3) vanskeligheter med å oppnå etiske godkjenninger for store dyr.
En fersk studie av Polo, et al.26 i stor grad forbedret modellen på kaninen. Titanium kupler ble erstattet av lukkes sylindere som kunne fylles med et konstant volum av materiale. Fire av disse sylindere ble plassert på kanin hodeskaller. Ved ferdigstillelse, kan sylindere fjernes slik at biopsier var metall-fri, innføre mye mer fleksibilitet om prøven behandling. Kaninen calvarial modell ble attraktiv for samtidig tester med lavere omkostningene, lett dyr handling og tilrettelegging av eksemplar bearbeiding. Dra nytte av disse siste utviklingen, har vi ytterligere forbedret modellen ved å erstatte Titan med PEEK å produsere sylindere, og dermed gir røntgen spredning og bruk av microtomography på levende dyr.
I denne artikkelen vil vi beskrive anestesi og kirurgi prosesser og viser eksempler på utganger som kan fås ved hjelp av denne protokollen, dvs., (Immuno-) histologi, histomorphometry, live og ex vivo microtomography å evaluere mekanismer av bein regenerering og kvantifisere den nye bein syntese støttes av bein erstatning materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I tråd med sveitsiske juridiske krav ble protokollen godkjent av en akademisk komité og overvåket av kantonale og føderale veterinær myndigheter (autorisasjoner n ° GE/165/16 og GE/100/18).
1. bestemte enheter og dyr
-
Sylindere
- Maskin sylindere med lateral stabiliserende tabs ut av PEEK å ha indre diameter på 5 mm, ytre diameter på 8 mm og en høyde på 5 mm (figur 1).
- Maskin PEEK caps med en design som tillater å klemme presist på toppen av sylinderen (tykkelse 1 mm).
- Sterilisere PEEK sylindere og caps av autoklavering før kirurgi.
-
Skruer
- Bruk selv-boring mikro skruer (laget av kommersielle ren Titan (grad 5)) for å fikse sylindere (1,2 mm i diameter, 4 mm i lengde). Steriliseres ved autoklavering før operasjonen.
-
Dyr
- Kjøp tre måneder gamle New Zealand hvite kaniner (mann eller kvinne), veiing ~ 2,5 kg hver.
Merk: vi fikk kaniner ved avl ved Universitetet i Genève.
- Kjøp tre måneder gamle New Zealand hvite kaniner (mann eller kvinne), veiing ~ 2,5 kg hver.
2. kirurgi
- Kirurgisk brett
- Hold skalpeller, saks, to pinsett, periostal Heis, sprøyter (1, 2, 5, 50 mL), kirurgisk motor, rund kirurgisk Burs (0,8 mm diameter), nåler, steril saltvann, fire sylindere, åtte skruer, og skrutrekker klar.
- Prekliniske behandling
- Acclimate dyrene en uke før kirurgi.
- Gi en forebyggende antibiotika daglig (5-10 mg/kg gjennom munnen (PO)) starter 2 timer før operasjonen opp til 3 dager etter operasjonen.
- Anestesi og intubering
- Sedate dyrene ved intramuskulær (IM) injeksjon av ketamin (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) + xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Vent ~ 20 min for dyrene å sove
dypt (komplett muskuløse Atony).
Merk: denne premedisinering vil tillate en enkel, rask og smertefri intubering prosess. Deep analgesi og anestesi er indusert som beskrevet i trinn 2.3.8. - Plasser en intravenøs (IV) kanyle i den marginale venen fra øret, og hold den lukket til intubering er ferdig.
Merk: denne IV linjen vil tjene til perfuse fentanyl og propofol for dyp analgesi og anestesi, henholdsvis (se trinn 2.3.8). - Opprettholde anestesi ved å forsyne 5% desflurane i rent oksygen til intubering er utført.
Merk: dette trinnet er nødvendig bare hvis dyret viser tegn til oppvåkning (øyebevegelser, muskelsammentrekninger). - Bedøve luftrøret lokalt ved å sprøyte 10% lidokain. Plasser kaninen i liggende posisjon og opprettholde hodet i Vertikal forlengelse.
- Skyv den første endotrakeal rør med liten diameter (2,5 mm) inn i kanin luftrøret til luftstrømmen kan høres i røret. Dette vil åpne strupen og tilrettelegge for innsetting av den definitive røret.
- Sett inn en støttelinje (intubering kateter) i røret for å feste posisjonen til røret i luftrøret. Fjern den lille diameter røret og skyv den definitive endotrakeal røret (4,9 mm) på føreren.
- Fjern føreren og blås opp ballongen ved enden av endotrakeal røret for å forsegle og blokkere enheten i luftrøret. Røret vil holde seg på plass, men det kan være sikret ved hjelp av en blonder knyttet rundt pannen. Ventiler umiddelbart (7 mL/kg, frekvens på 40/min) dyret med 3% desflurane i rent oksygen.
- Kontinuerlig perfuse (øre vene) fentanyl (0,01 mg/mL, 2 – 4 mL/h) for å indusere analgesi, 2 – 4 mg/kg av (2%) propofol (20 mg/mL, 4 – 8 mL/h) for å indusere anestesi, og 4 mL/kg/h av ringer acetate for å opprettholde ISO-volumforhold.
- Plasser en temperatur sonde i endetarmen. Også overvåke hjertefunksjon, temperatur og oksygenmetning under hele prosessen.
- Kontrollere dybden av anestesi ved å overvåke autonome puste; Hvis dyret viser tegn på autonom pusting, dispensere en liten bolus av propofol og fentanyl.
- Sedate dyrene ved intramuskulær (IM) injeksjon av ketamin (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) + xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Vent ~ 20 min for dyrene å sove
- Forberedelse av nettstedet
- Plasser kaninen på en oppvarmet pad (39 ° c) dekket av en mattress pad (for å unngå brannskader) på operasjonsbordet. Barbere hodebunnen.
- Påfør en smøring gel på øynene for å unngå irritasjon og tørrhet. Desinfisere området ved å skrubbe huden med povidon jod (10%). Deretter går kaninen med en steril kirurgisk gardin og klipper ut et adgangs område for hodeskallen.
- Desinfisere operasjonsstedet med povidon jod (10%) for andre gang. Påfør en smøring gel på øynene for å unngå irritasjon og tørrhet.
- Forbered en drapert bord (sterile drapert) for å plassere hele kirurgisk brett.
- Åpning av operasjons sted
- Bedøve lokalt med en subkutan (SC) injeksjon av lidokain 2% (1 mL) på skallen.
- Incise gjennom huden (med en skalpell) langs calvarial sagittal linje, fra banene til den eksterne occipital protuberance (~ 4 cm i lengde). Kontroller at periosteum er radert.
- Løft periosteum forsiktig (med en periostal heis) på begge sider av snittet. Skyll området med sterilt saltvann.
- Plassering av sylinder
- Finn median og koronale sting på skallen (figur 2a, B). Merk at disse anatomiske linjer danner et kors. Sylindere vil bli plassert i hver av kvadranter definert av korset, slik at kanten av sylinderen er ikke over Sutur (figur 2C).
- Plasser den første sylinderen på venstre øvre kvadrant (venstre front ben), og prøv å legge enheten flatt. Fix i posisjon med sterke håndtrykk og skru en mikro-skrue, til motstanden er filt. Kontroller at skruen hodet er flush med overflaten av sylinderen kategorien.
- Gjenta samme prosedyre på den andre kategorien for å fikse sylinderen tett på skallen. Pass på at sylinderen er hermetisk festet til benet.
- Gjenta prosedyren på høyre øvre kvartal (høyre frontal bein), venstre nedre kvartal (venstre parietal bein) og høyre lavere kvartal (høyre parietal bein).
- Bein boring av 5 intramedullær hull innenfor området omskrevet av sylindere (figur 1)
- Bor et intramedullær hull under saltvann vanning (0,8 mm i diameter, ~ 1 mm i dybden) med en rund bur på benet, i midten av området omskrevet av sylinderen. Kontroller at blødningen vises.
- Drill to intramedullær hull langs aksen som passerer gjennom de to kategori skruene, i de indre kantene av sylinderen. Langs den vinkelrette øksen, bore to intramedullær hull i de indre kantene av sylinderen. Kontroller at blødningen vises.
- Gjenta operasjonen innenfor de tre andre sylindere.
- Fylle sylindere med Material prøver og capping (figur 3)
- Forbered ønsket bein erstatnings materiale i henhold til produsentens instruksjoner eller materialspesifikasjoner.
- Fyll den første sylinderen til randen med den materielle prøven og Lukk sylinderen ved å montere hetten. Gjenta prosessen i de 3 andre sylindere.
- Nedleggelse av operasjons sted
- Lukk huden over sylindere med en intermitterende ikke-resorbable Sutur.
- Påfør en spraybare dressing på såret.
3. post-kirurgisk behandling
- Stopp analgesi og anestesi (propofol og fentanyl-sikring) forsyning og sjekke utvinning av autonome pusting.
- Stopp ventilasjonen når dyret har gjenvunnet autonom pusting. Opprettholde dyret under ren oksygen før fullstendig oppvåkning.
- Injiser med buprenorfin (0,02 mg/kg, 0,03 mg/mL, 0,67 mL/kg) og gjenta injeksjonen hver sjette time i 3 dager som etter kirurgiske analgesi.
- Overfør dyret til sitt vanlige hus med vann og komplett fôring.
- Fjern sting etter ca 10 dager med sår helbredelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modellen som beskrives her, er dedikert til vurderingen av osteoconduction i bein erstatninger. Osteogenesis og-eller osteoinduction av bein erstatter enten (pre-) cellularized eller lastet med bioaktive molekyler kan også vurderes, samt vasculogenesis1,2,3,4, 5 andre priser , 6 andre priser , 7 andre er , 8 på alle , 9 andre priser , 10 andre , 11 flere , 12 flere , 13 på alle , 14 priser og priser , 15 priser og , 16 flere , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21 priser og , 22 av , 23 andre , 24 priser og , 25 priser og , 26 i , 27 andre priser , 28 flere , 29 flere , 30. en kinetisk studie kan brukes, fra 3 dager til 3 måneder etter operasjonen, avhengig av mekanismer og utganger som skal analyseres. En klassisk tidslinje som tillater beskrivelser på tidlig og midt-tid er: 2, 4, 6, 8 og 12 uker. Merk at minst 6 prøver per tidspunkt er obligatorisk for å oppnå betydelige resultater. Hver prøve som skal testes må plasseres minst én gang i hver posisjon på skallen per tid punkt (tilfeldig tildeling). Til slutt, humbug prøver (f. eks sylindere fylt med koagulert blod) må inkluderes i protokollen34.
En gang det kirurgi er fullført, Ben oppblomstringen kanskje være kontrollert for annerledes tid meningene av benytter Ben tomografi opp på bo dyrene. Et eksempel er vist i figur 4a, B. Ytterligere analyse krever at dyr blir ofret (dødelig intravenøs injeksjon av 150 mg/kg pentobarbital (100 mg/mL). Etter døds aktiv, er prøvene delt og sylindere forsiktig fjernet (figur 5). Biopsier er festet med en løsning av fosfat-bufret saltvann og 4% formaldehyd. Bone vekst kan da bli vurdert ved hjelp av microtomography (Figur 4 C, D). Prøvene kan også bli behandlet for (immune-) histologiske farging. Histomorphometric analyse og spesifikke farging er så mulig å fullføre analysen mer spesifikt (figur 6).
Figur 1: spesifikasjoner for Peek-sylindere. To hull (0,8 mm i diameter) ble boret på lateral stabilisere kategoriene for å skru. Posisjonene til de 5 intramedullær hullene (0,8 mm i diameter) som skal bores på skallen innenfor området avgrenset av sylinderen er merket med røde sirkler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative bilde av kaninen skallen og plassering av sylindere. Bilder som viser median og koronale sting på kanin skallen opptegning venstre-høyre parietal og frontal bein (A,B). Plassering av sylindere på begge sider av sting (C). Skala bars = 5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representativt bilde av sylindere fast, fylt og caped. Bilde som viser fire sylindere festet på skallen på en kanin med Titan skruer. Innenfor området avgrenset av hver sylinder, 5 intramedullær hull (0,8 mm i diameter, ~ 1 mm i dybden) ble boret under vanning med en rund bur for å tillate Ben celle migrasjon. Sylindere ble fylt med forskjellige bein erstatning prøver (kalibrert volumer) før capping (en lukket sylinder vises bare). Scale bar = 5 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representative bilder fra microtomographic (Micro-CT) analyse. Med det endelige målet å vurdere bein vekst utført av bein erstatninger, ble 4 sylindere festet på en kanin hodeskalle med Titan skruer og fylt med bein erstatnings materiale. (A) live Imaging: to-dimensjonal tverrgående skanning (14 min, 99 kv/88 μA med en oppløsning på 20 μm) av en sylinder på 12 uker. (B) tredimensjonal (3D) rekonstruksjon fra live Micro-CT analyse på 4 uker (røde sirkler: bein erstatninger i sylindere; rød pil: kontroll der sylinderen er fylt med koagulert blod). (C,D) Etter døds aktiv (12 uker), sylindere ble fjernet før fiksering og Micro-CT analyse. (C) 2D tverrgående skanning (57 min, 99 kv/88 μA med en oppløsning på 10 μm) av en sylinder og 3D-rekonstruksjon av det totale nye benet i sylinderen (D). Bein erstatnings partikler (rød), nye bein (grønn) og bein seng (gult) vises. Skala bars = 2 mm Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representative bilder av en biopsi på 4 uker. Etter døds kraft (4 uker), ble prøvene blokk-delt og sylindere ble fjernet før fiksering i 4% formalin, Micro-CT analyse og histologiske behandling. Scale bar = 5mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: representative bilder av (immune-) histologiske seksjoner. Med det endelige målet å vurdere bein vekst og neovascularization utført av bein erstatninger, ble 4 sylindere fast på en kanin hodeskalle med Titan skruer og fylt med bein erstatninger. Etter døds kraft (12 uker), sylindere ble fjernet før fiksering og histologiske behandling. (A) Masson-Goldner farging (50x): bein erstatning vises som lilla partikler omgitt av nye bein i grønt. (B) skivene ble skannet og behandlet for digital ekstraksjon av bein erstatnings materiale, slik at det nye benet (rød) kan være kvantifisert lett. (C) IMMUNOSTAINING av CD31 (piler), en typisk markør av endothelial celler og neovascularization prosessen. (D) Immunofluorescent farging (grønn) av en svært neovascularized sone der noen nye blodkar svært uttrykke CD31 (pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modellen er beskrevet her er enkel og bør utvikles ganske enkelt så lenge alle trinnene er fulgt og utstyret er egnet. Som protokollen beskrevet er en kirurgisk metode, alle trinnene vises kritisk og må følges riktig. Det er viktig å være trent for dyreforsøk, spesielt i kanin håndtering og anestesi. Ikke nøl med å be om profesjonell anesthetist og veterinær hjelp. Det er avgjørende å insistere på den daglige visuelle overvåking av dyr før og etter Sutur fjerning. Selv om huden fra skallen er tykk, rikelig og løs, er sylindere fiksering induserer store spenninger. Hvis sting fjernes for tidlig, kan såret gjenåpne og vil kreve enda en uke av suturing og en ny antibiotika behandling. I tilfelle dehiscence ut av såret linjen, vil kirurgen må vurdere om suturing er mulig eller ikke. Hvis ikke, vil prøve avslag må vurderes.
I tillegg til de kritiske trinnene som er beskrevet i protokoll delen, kan detaljene nedenfor være nyttige i riktig implementering av denne protokollen. Fra et teknisk synspunkt, som kaniner brukes er små og små, er det viktig å bruke en to-trinns intubering, som beskrevet i protokollen. Den andre (og siste) tube er for stor til å bli brukt i første intubering, og det er en reell risiko for "feil vei" som kan være skadelige eller dødelig.
Avhengig av materialene testet, kan det være interessant å ta noen friske blodprøve fra øret IV linje som allerede er plassert. Dette kan gi en god metode for å pre-sette mot benet erstatnings materiale med naturlige celler og vekstfaktorer. Fersk koagulert blod kan også gi en ideell humbug prøve.
Måten intramedullær hullene er boret bør være svært nyttig for fremtidig histologiske prosessering og histomorphometrical analyse. I praksis, så lenge hullene er (i) på samme sted, (II) biopsier er tilsvarende orientert og (III) skjære prosessen er standardisert (dvs. samme tykkelse, samme snitt nivå), de feltene som er evaluert er likeverdige og deres sammenligning er svært Relevant. Som et spørsmål om standardisering, kan det være av reell interesse å kalibrere volum-mengde materiale for å fylle sylinderen, og for å forberede det på forhånd, på en steril måte.
Fra et vitenskapelig synspunkt, avhengig av produktene eller hypotesen testet, kan det være viktig å unngå å plassere sylindere på bein sting. Noen spesifikke stamceller er til stede i disse strukturene35, forskjellig fra de mesenchymal bein stamceller som er involvert i mekanismer av Intramembranous forbening, dvs, benet gjenfødelse prosessen oppstått i Oroacial området. Derfor kan en reell skjevhet oppstå i tilfelle av misplacement.
En av de store fordelene med calvarial modellen er bruk av Live microtomography der bein vekst kan følges på et enkelt dyr som en langsgående studie. Denne strategien kan i stor grad redusere antall euthanized dyr og derfor respektere "3R regelen"36. Avhengig av microtomograph enheten som brukes (oppløsning, plass for dyret), vil variasjoner skje i form av strategi for anestesi (IV, gass, etc.), så vel som i bildet oppløsning og relevansen av den resulterende analysen.
Vi bruker rutinemessig en microtomograph dedikert til dyre eksperimenter (f.eks. Quantum GX) for rutinemessige kontroller. Et typisk eksperiment starter med en sedasjon, som beskrevet i trinn 2.3.1. Anestesi opprettholdes deretter med 2% isoflurane i rent oksygen. Dette gjør at dyret til å puste rolig under en skanning tid på ca 14 min (99 kV/88 μA med en oppløsning på 20 μm); Dette er tilstrekkelig for å kontrollere grunnleggende parametre (engraftment, sylinder fiksering, analyse analyse av bein vekst, etc.). Når du ser på en presis kvalitativ og kvantitativ analyse, en veldig finjustering av skanningen tid, oppløsning, anestesi og dyr posisjonering vil være nødvendig.
Eksisterende modeller utviklet for assessement av osteoconduction, Osteogenesis, osteoinduction så vel som vasculogenesis, er mange, spesielt i Oroacial feltet. På grunn av etiske og økonomiske hensyn, vil vårt formål være begrenset til kanin eller mindre dyr. Bortsett fra skallen, de stedene hvor materialet kan testes er mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, diastema48 eller skarpt Sockets (etter tennene ekstraksjon)49,50,51. Rotter, mus, marsvin og kaniner kan brukes for hver av modellene som er beskrevet nedenfor. Kort, en kritisk defekt er boret (eller en socket er opprettet av skarpt ekstraksjon), fylt med materialet prøven og deretter dekket av en membran. Bortsett fra det åpenbare faktum at bare to prøver kan testes i hver av disse stedene (en prøve per kjeven side eller per skarpt socket), de kirurgiske prosedyrene er også i stor grad vanskeligere og invasiv. Tilgang til området er begrenset, og hvis man bruker rotte eller mus, vanskeligheten er ytterligere økt med størrelsen på dyrene. Til slutt, den kritiske størrelsen på defekter (dvs. dimensjoner som ikke tillater en spontan bein regenerering) er ikke godt definert og varierer fra ett dyr til et annet.
I tillegg til disse generelle, kan spesifikke begrensninger oppstå avhengig av den anatomiske plasseringen utsatt for mangelen og til påfølgende analyse. Som et eksempel, i søvnapnéskinne modellen, er tennene røtter til stede i mangelen. Dette kan forstyrre materialet og endre bein regenerering prosessen. Mangelen kan plasseres mer distally på Ramus, men i så fall vil benet være svært tynn (to corticals festet med en ekstremt tynn medullær plass) og den resulterende defekt volum kan være for liten45,46, 47. gitt disse eksemplene på begrensninger og avhengig av modell, kan store avvik forventes i form av materielle volum som skal testes, kvalitet og mengde data innsamlet.
Som evalueringen av et materiale krever maksimalt standardisering og kalibrering, den calvarial modellen vises ideelt. Access er veldig enkelt, kalibrering og standardisering er tilrettelagt ved bruk av definerte sylindere og 4 prøver kan vurderes samtidig. Videre, bo tomografi kanskje bli brukt og til slutt en stor nedgang inne dyrene å bli euthanized kanskje være foregripe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne står i gjeld til Geistlich AG (Wolhusen, CH) og Osteologi Foundation (Lucerne, CH) (Grant n ° 18-049) for deres støtte, så vel som global D (Brignais, FR) for å gi skruene. En spesiell takk går til Dr B. Schaefer fra Geistlich. Vi er også takknemlige for Eliane Dubois og Claire Herrmann for deres utmerkede histologiske prosessering og deres dyrebare råd. Til slutt, Vi hjertelig erkjenner Xavier Belin, Sylvie Roulet og hele teamet av PR Walid Habre, "eksperimentell kirurgi DPT", for deres bemerkelsesverdige teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Enrofloxacine Baytril 10% | Bayer | Antibiotic | |
| Fentanyl | Bischel | For analgesia | |
| Ketalar 50mg/ml | Pfizer | Ketamine for anesthesia | |
| Lidohex | Bichsel | Lubricating gel for the eyes | |
| Opsite | Smith and Nephew | 66004978 | Sprayable dressing |
| Povidone iodine 10%, Betadine | Mundipharma | anti-infective agent | |
| Propofol 2% | Braun | 3538710 | For anesthesia |
| Rapidocain 2% | sintetica | Local anesthesia | |
| Ringer-acetate | Fresenius Kabi | Volume compensation | |
| Rompun 2% | Bayer | Xylazin for anesthesia | |
| Sevoflurane 5% | Abbvie | For anesthesia | |
| Sterile saline | Sintetica | ||
| Temgesic | Reckitt Benckiser | Buprenorphine hydrochloride, analgesia | |
| Thiopental Inresa | Ospediala | For anesthesia | |
| Xylocaine 10% spray | Astra Zeneca | For intubation | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fresenius Vial pilot C | Imexmed | Infusion pump | |
| Heated pad | Harvard Apparatus | ||
| Suction dominant 50 | Medela | ||
| Suction tubing Optimus | Promedical | 80342.2 | |
| Surgical motor | Schick dental | Qube | Drilling of intramedullary holes |
| Ventilation | Maquet Servo1 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Cylinders and caps | Boutyplast | Customized | composition: PEEK (poly ether ether ketone) |
| Manual self-retaining shaft | GlobalD | ACT1K | |
| Mobile handle for self-retaining shaft | GlobalD | MTM | |
| Self- drilling screws | GlobalD | VA1.2KL4 | cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tray | |||
| Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm | Covidien | 86233 | For intubation |
| Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm | Covidien | 107-35G | For intubation |
| Ethicon prolene 4-0 | Ehticon | 8581H | Non-resorbable suture |
| Forceps | Marcel Blanc | BD027R | 145 mm |
| Intubation catheter | Cook medical | Guide for intubation | |
| Needlle holder | Marcel Blanc | BM008R | |
| Needles BD Microlance3 | Becton Dickinson | 300300/304622 | 26G; 18G |
| Periosteal | HU-Friedy | P9X | |
| Round surgical burs | Patterson | 78000 | 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes |
| Scalpel | Swann-Morton | n°10 and n°15 | |
| Scissors | Marcel Blanc | 00657 | 180 mm |
| Syringes Omnifix | Braun | 4616057V | 5ml, 10ml and 50ml |
| Venflon G22 | Braun | 42690985-01 | Vasofix safety for the ear iv line |
References
- Anderud, J., et al. Guided bone augmentation using a ceramic space-maintaining device. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology and Oral Radiology. 118 (5), 532-538 (2014).
- Lundgren, A. K., Lundgren, D., Hammerle, C. H., Nyman, S., Sennerby, L. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clinical Oral Implants Research. 11 (2), 99-106 (2000).
- Lundgren, D., Lundgren, A. K., Sennerby, L., Nyman, S. Augmentation of intramembraneous bone beyond the skeletal envelope using an occlusive titanium barrier. An experimental study in the rabbit. Clinical Oral Implants Research. 6 (2), 67-72 (1995).
- Slotte, C., Lundgren, D. Impact of cortical perforations of contiguous donor bone in a guided bone augmentation procedure: an experimental study in the rabbit skull. Clinical Implant Dentistry and Relat Research. 4 (1), 1-10 (2002).
- Tamura, T., et al. Three-dimensional evaluation for augmented bone using guided bone regeneration. Journal of Periodontal Research. 40 (3), 269-276 (2005).
- Yamada, Y., et al. Correlation in the densities of augmented and existing bone in guided bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 23 (7), 837-845 (2012).
- Chierico, A., et al. Electrically charged GTAM membranes stimulate osteogenesis in rabbit calvarial defects. Clinical Oral Implants Research. 10 (5), 415-424 (1999).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of the permeability of shields with autologous bone grafts on bone augmentation. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (6), e386-e392 (2013).
- Ito, K., Nanba, K., Murai, S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. Journal of Periodontology. 69 (11), 1229-1237 (1998).
- Lee, Y. M., et al. Enhanced bone augmentation by controlled release of recombinant human bone morphogenetic protein-2 from bioabsorbable membranes. Journal of Periodontology. 74 (6), 865-872 (2003).
- Fugl, A., et al. S-nitroso albumin enhances bone formation in a rabbit calvaria model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 43 (3), 381-386 (2014).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of self-assembling peptide hydrogel scaffold on bone regeneration with recombinant human bone morphogenetic protein-2. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (5), e283-e289 (2013).
- Ito, K., et al. Effects of ipriflavone on augmented bone using a guided bone regeneration procedure. Clinical Oral Implants Research. 18 (1), 60-68 (2007).
- Jung, R. E., Hammerle, C. H., Kokovic, V., Weber, F. E. Bone regeneration using a synthetic matrix containing a parathyroid hormone peptide combined with a grafting material. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 22 (2), 258-266 (2007).
- Minegishi, T., et al. Effects of ipriflavone on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvaria. Journal of Oral Science. 44 (1), 7-11 (2002).
- Moussa, M., et al. Medium-Term Function of a 3D Printed TCP/HA Structure as a New Osteoconductive Scaffold for Vertical Bone Augmentation: A Simulation by BMP-2 Activation. Materials. 8 (5), 2174-2190 (2015).
- Thoma, D. S., Kruse, A., Ghayor, C., Jung, R. E., Weber, F. E. Bone augmentation using a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute materials with and without recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clinical Oral Implants Research. 26 (5), 592-598 (2014).
- Busenlechner, D., et al. Resorption of deproteinized bovine bone mineral in a porcine calvaria augmentation model. Clinical Oral Implants Research. 23 (1), 95-99 (2012).
- Busenlechner, D., et al. Paste-like inorganic bone matrix: preclinical testing of a prototype preparation in the porcine calvaria. Clinical Oral Implants Research. 20 (10), 1099-1104 (2009).
- Busenlechner, D., et al. Simultaneous in vivo comparison of bone substitutes in a guided bone regeneration model. Biomaterials. 29 (22), 3195-3200 (2008).
- Carrel, J. P., et al. A 3D printed TCP/HA structure as a new osteoconductive scaffold for vertical bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 55-62 (2016).
- Murai, M., et al. Effects of different sizes of beta-tricalcium phosphate particles on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Dental Materials Journal. 25 (1), 87-96 (2006).
- Nishida, T., et al. Effects of bioactive glass on bone augmentation within a titanium cap in rabbit parietal bone. Journal of Periodontology. 77 (6), 983-989 (2006).
- Nyan, M., et al. Feasibility of alpha tricalcium phosphate for vertical bone augmentation. Journal of Investigating and Clinical Dentistry. 5 (2), 109-116 (2012).
- Polimeni, G., et al. Histopathological observations of a polylactic acid-based device intended for guided bone/tissue regeneration. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 99-105 (2008).
- Polo, C. I., et al. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 2 associated with a variety of bone substitutes on vertical guided bone regeneration in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 84 (3), 360-370 (2013).
- Slotte, C., Lundgren, D., Burgos, P. M. Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 18 (6), 795-806 (2003).
- Tamimi, F. M., et al. Bone augmentation in rabbit calvariae: comparative study between Bio-Oss and a novel beta-TCP/DCPD granulate. Journal of Clinical Periodontology. 33 (12), 922-928 (2006).
- Torres, J., et al. Effect of solely applied platelet-rich plasma on osseous regeneration compared to Bio-Oss: a morphometric and densitometric study on rabbit calvaria. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 106-112 (2008).
- Yamada, Y., et al. Angiogenesis in newly augmented bone observed in rabbit calvarium using a titanium cap. Clinical Oral Implants Research. 19 (10), 1003-1009 (2008).
- Cordaro, L., Terheyden, H. ITI Treatment Guide. Wismeijer, D., Chen, S., Buser, D. 7, Quintessence. (2014).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
- Min, S., et al. Effects of marrow penetration on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 78 (10), 1978-1984 (2007).
- Braun, T. M. Ch. 4. Osteology guidelines for oral and maxillofacial regeneration Preclinical models for translational research. Giannobile, W. V., Nevins, M. , Quintessence publishing. 31-43 (2011).
- Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial Suture-Derived Stem Cells and Their Contribution to Cranial Bone Repair. Frontiers in Physiology. 8, 956 (2017).
- Russel, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. , Universities Federation for Animal Welfare. (1959).
- Asvanund, P., Chunhabundit, P. Alveolar bone regeneration by implantation of nacre and B-tricalcium phosphate in guinea pig. Implant Dentistry. 21 (3), 248-253 (2012).
- Gielkens, P. F., et al. Gore-Tex as barrier membranes in rat mandibular defects: an evaluation by microradiography and micro-CT. Clinical Oral Implants Research. 19 (5), 516-521 (2008).
- Lioubavina, N., Kostopoulos, L., Wenzel, A., Karring, T. Long-term stability of jaw bone tuberosities formed by "guided tissue regeneration". Clinical Oral Implants Research. 10 (6), 477-486 (1999).
- Mardas, N., Kostopoulos, L., Stavropoulos, A., Karring, T. Osteogenesis by guided tissue regeneration and demineralized bone matrix. Journal of Clinical Periodontology. 30 (3), 176-183 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Mardas, N., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone used as an adjunct to guided bone augmentation: an experimental study in the rat. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 3 (3), 156-165 (2001).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone (Bio-Oss) and bioactive glass (Biogran) arrest bone formation when used as an adjunct to guided tissue regeneration (GTR): an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 30 (7), 636-643 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Fate of bone formed by guided tissue regeneration with or without grafting of Bio-Oss or Biogran. An experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 31 (1), 30-39 (2004).
- Stavropoulos, A., Nyengaard, J. R., Kostopoulos, L., Karring, T. Implant placement in bone formed beyond the skeletal envelope by means of guided tissue regeneration: an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 32 (10), 1108-1115 (2005).
- Thomaidis, V., et al. Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size. Medical Science Monitor. 14 (4), (2008).
- Zhang, J. C., et al. The repair of critical-size defects with porous hydroxyapatite/polyamide nanocomposite: an experimental study in rabbit mandibles. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 39 (5), 469-477 (2010).
- Zhang, X., et al. Osteoconductive effectiveness of bone graft derived from antler cancellous bone: an experimental study in the rabbit mandible defect model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 41 (11), 1330-1337 (2012).
- Bronoosh, P., et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on healing of mandibular bone defects: an experimental study in rabbits. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 277-284 (2015).
- Gomes, F. V., et al. Low-level laser therapy improves peri-implant bone formation: resonance frequency, electron microscopy, and stereology findings in a rabbit model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 245-251 (2014).
- Lalani, Z., et al. Spatial and temporal localization of secretory IgA in healing tooth extraction sockets in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 62 (4), 466-472 (2004).
- Osorio, L. B., et al. Post-extraction evaluation of sockets with one plate loss--a microtomographic and histological study. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 31-38 (2014).
