Summary
Här presenterar vi ett kirurgiskt protokoll på kaniner med syfte att bedöma benersättningsmaterial i form av benregenereringskapacitet. Genom att använda PEEK cylindrar fast på kanin dödskallar, osteoconduction, osteoinduktion, osteogenesis och vasculogenesis induceras av materialen kan utvärderas antingen på levande eller euthanized djur.
Abstract
Den grundläggande principen för kanincalvarial modellen är att odla ny benvävnad vertikalt ovanpå den kortikala delen av skallen. Denna modell möjliggör bedömning av ben ersättning material för oral och kraniofacial ben förnyelse i form av bentillväxt och kärlnybildning stöd. När djuren är sövda och ventilerade (endotrakeal intubation), fyra cylindrar gjorda av polyetereterketon (PEEK) skruvas på skallen, på båda sidor av median och koronala suturer. Fem intramedullära hål borras inom det ben område som avgränsas av varje cylinder, vilket möjliggör inflöde av benmärgsceller. Materialproverna placeras i de cylindrar som sedan stängs. Slutligen, den kirurgiska webbplatsen sys, och djur är vakna. Bentillväxt kan bedömas på levande djur med hjälp av mikrotomografi. När djuren är euthanized, bentillväxt och kärlnybildning kan utvärderas med hjälp av mikrotomografi, immunhistologi och immunofluorescensering. Som utvärderingen av ett materiellt kräver maximum standardisering och kalibrering, calvarial modellerar verkar ideal. Tillgången är mycket enkel, kalibrering och standardisering underlättas genom användning av definierade cylindrar och fyra prov kan bedömas samtidigt. Dessutom kan levande tomografi användas och i slutändan en stor minskning av djur som skall euthanized kan förutses.
Introduction
Den calvarial modell av ben förstoring utvecklades på 90-talet i syfte att optimera begreppet guidad ben förnyelse (GBR) i den orala och kraniofaciala kirurgiska domänen. Den grundläggande principen för denna modell är att odla ny benvävnad vertikalt ovanpå den kortikala delen av skallen. För att göra detta, en reaktor (t. ex., Titan-Dome,-cylinder eller-bur) är fast på skallen för att skydda ben förnyelse utförs av ett transplantat (t. ex., hydrogel, bensubstitut, etc.). Med hjälp av denna modell, Titan eller keramiska burar1,2,3,4,5,6, GBR membran7,8,9 ,10, Osteogena faktorer11,12,13,14,15,16,17, nytt ben substitut12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 eller mekanismen för kärlnybildning under benregenereringsprocessen30 bedömdes.
Från en translationell synvinkel, den calvarial modellen representerar en en-vägg defekt som kan jämföras med en klass IV defekt i käken31. Målet är att odla nytt ben över en kortikal yta, utan någon lateral stöd från endogena ben väggar. Modellen är således ytterst stringent och bedömer den verkliga potentialen hos vertikal osteoöverledning över den kortikala delen av benet. Om den modell som beskrivs häri främst är avsedd för bedömning av osteoöverledning i ben ersättningar, kan osteogenes och/eller osteoinduktion också bedömas, liksom vasculogenesis1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.
I huvudsak av etiska, praktiska och ekonomiska skäl, den calvarial modellen utvecklades i kanin där benmetabolism och struktur är ganska relevant jämfört med Human32. Av de 30 ovannämnda referenserna använde 80% kaninkalvarial modell1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, vilket visar relevansen av denna djurmodell. I 2008, Busenlechner gruppen överfört calvarial modell till gris, för att möjliggöra en jämförelse av åtta ben ersättningar samtidigt20 (jämfört med två ben ersättningar med kanin). Å andra sidan, vår grupp överfört kanin calvarial modell till får. I korthet placerades Titan kupoler på fårskallar för att karakterisera osteoconduction av en ny 3D-tryckt ben ersättning. Dessa studier tillät oss att utveckla och behärska calvarial modellen och dess analys16,21.
De tre sista studierna citerade16,20,21, tillsammans med flera andra utredningar12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, bekräftade den stora potentialen hos den calvariala modellen som en screening och karakterisering Modell. Men även om de erhållna resultaten var ganska tillfredsställande, påpekade de också vissa begränsningar: (1) användningen av Titan kupoler, som förhindrade röntgen diffusion och i sin tur levande mikro-CT-användning. Dessa kunde inte tas bort före histologisk bearbetning, tvinga forskarna att bädda in proverna i poly (metylmetakrylat) harts (PMMA). De resulterande analyserna var därför till stor del begränsade till topografi. (2) höga finansiella kostnader, särskilt på grund av kostnaden för djuren, och kostnader i samband med logistik, underhåll och kirurgi av djuren. (3) svårigheter att få etiska godkännanden för stora djur.
En nyligen studie av Polo, et al.26 till stor del förbättrat modellen på kanin. Titan kupoler ersattes med stängbara cylindrar som kunde fyllas med en konstant volym av material. Fyra av dessa cylindrar placerades på kanin dödskallar. Vid slutförandet kunde cylindrarna tas bort så att biopsier var metallfria och introducerade mycket mer flexibilitet när det gällde prov bearbetningen. Kaninen calvarial modell blev attraktiv för samtidig testning med lägre kostnader, enkel djurhantering och underlättande av provbearbetning. Genom att dra nytta av den senaste tidens utveckling har vi förbättrat modellen ytterligare genom att ersätta Titan med PEEK för att tillverka cylindrar, vilket möjliggör röntgendiffusion och användning av mikrotomografi på levande djur.
I denna artikel kommer vi att beskriva anestesi och kirurgi processer och Visa exempel på utgångar som kan erhållas med hjälp av detta protokoll, dvs (Immuno-) histologi, histomorphometry, Live och ex vivo mikrotomografi för att utvärdera mekanismerna av ben förnyelse och kvantifiera den nya ben syntesen som stöds av bensubstitut material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I enlighet med schweiziska rättsliga krav godkändes protokollet av en akademisk kommitté och övervakades av kantonala och federala veterinärmyndigheter (auktorisationer n ° GE/165/16 och GE/100/18).
1. särskilda anordningar och djur
-
Cylindrar
- Maskin cylindrar med laterala stabiliserande flikar av PEEK för att ha innerdiameter på 5 mm, ytterdiameter på 8 mm och en höjd av 5 mm (figur 1).
- Maskin PEEK mössor med en design gör det möjligt att klippa exakt på toppen av cylindern (tjocklek 1 mm).
- Sterilisera PEEK cylindrar och mössor genom autoklav före operationen.
-
Skruvar
- Använd självborrande mikroskruvar (tillverkade av kommersiellt rent titan (grad 5)) för att fixera cylindrarna (1,2 mm i diameter, 4 mm i längd). Sterilisera genom autoklav före operationen.
-
Djur
- Köp tre månader gamla nya Zeeland vita kaniner (manliga eller kvinnliga), väger ~ 2,5 kg vardera.
Anmärkning: vi erhöll kaniner genom avel vid universitetet i Genève.
- Köp tre månader gamla nya Zeeland vita kaniner (manliga eller kvinnliga), väger ~ 2,5 kg vardera.
2. kirurgi
- Kirurgisk bricka
- Håll skalpels, sax, två pinps, periost hiss, sprutor (1, 2, 5, 50 ml), kirurgisk motor, runda kirurgiska Burs (0,8 mm diameter), nålar, steril saltlösning, fyra cylindrar, åtta skruvar, och skruvmejsel redo.
- Preklinisk behandling
- Acclimate djuren en vecka före operationen.
- Ge en Profylaktisk antibiotika dagligen (5 – 10 mg/kg genom munnen (PO)) med början 2 h före kirurgi upp till 3 dagar efter operationen.
- Anestesi och intubation
- Sedate djuren genom intramuskulär (IM) injektion av ketamin (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) + xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Vänta ~ 20 min för djuren att sova
djupt (komplett muskulös Atony).
Obs: denna premedicinering kommer att möjliggöra en enkel, snabb och smärtfri intubation process. Djup analgesi och anestesi induceras enligt beskrivningen i steg 2.3.8. - Placera en intravenös (IV) kanyl i den marginella venen från örat och håll den stängd tills intubation är avslutad.
Anmärkning: denna IV-linje kommer att användas för att parfymera fentanyl och propofol för djup smärtlindring respektive anestesi (se steg 2.3.8). - Upprätthålla anestesi genom att förse 5% sevofluran i rent syre tills intubation utförs.
Anmärkning: detta steg är nödvändigt endast om djuret visar tecken på uppvaknande (ögonrörelser, muskulös sammandragningar). - Anesthetize luftstrupen lokalt genom att spraya 10% lidokain. Placera kaninen i liggande läge och bibehålla huvudet i vertikal förlängning.
- Skjut den första endotrakealtub med liten diameter (2,5 mm) i kanin luftstrupen tills luftflöde kan höras i röret. Detta kommer att öppna struphuvudet och underlätta införandet av den definitiva röret.
- Sätt i en guide (intubation kateter) i röret för att fixera röret i luftstrupen. Ta bort röret med liten diameter och skjut det slutgiltiga endotrakealröret (4,9 mm) på handledningen.
- Ta bort guiden och Blås upp ballongen i slutet av endotrakealröret för att försegla och blockera enheten i luftstrupen. Röret kommer att stanna på plats, men det kan säkras genom att använda en spets knuten runt pannan. Ventilera omedelbart (7 mL/kg, frekvens 40/min) djuret med 3% sevofluran i rent syre.
- Kontinuerligt parfymera (öron venen) fentanyl (0,01 mg/mL, 2 – 4 mL/h) för att inducera analgesi, 2 – 4 mg/kg (2%) propofol (20 mg/mL, 4 – 8 mL/h) för att inducera anestesi och 4 mL/kg/timme av Ringers acetat för att bibehålla ISO-volymetriska tillstånd.
- Placera en änd tarms temperatur sond. Också övervaka hjärtfunktion, temperatur och syremättnad under hela processen.
- Kontrollera djupet av anestesi genom att övervaka autonom andning; om djuret uppvisar tecken på autonom andning, dispensera en liten bolus av propofol och fentanyl.
- Sedate djuren genom intramuskulär (IM) injektion av ketamin (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) + xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Vänta ~ 20 min för djuren att sova
- Iordningställande av plats
- Placera kaninen på en uppvärmd pad (39 ° c) täckt av en madrass pad (för att undvika brännskador) på kirurgi bordet. Raka hårbotten.
- Applicera en smörj gel på ögonen för att undvika irritation och torrhet. Desinficera platsen genom att skrubba huden med povidon jod (10%). Sedan drapera kaninen med en steril kirurgisk drapera och klippa ut en tillgång område för skallen.
- Desinficera operationsstället med povidon jod (10%) för en andra gång. Applicera en smörj gel på ögonen för att undvika irritation och torrhet.
- Förbered en draperad tabell (steril drapera) på vilken du vill placera hela kirurgiska facket.
- Kirurgisk webbplats öppning
- Anesthetize lokalt med en subkutan (SC) injektion av lidokain 2% (1 mL) på skallen.
- Incise genom huden (med en skalpell) längs calvarial sagittal linje, från omloppsbanor till den yttre occipital förhöjning (~ 4 cm i längd). Se till att periostet är incised.
- Försiktigt lyfta periostet (med en periost hiss) på båda sidor av snittet. Skölj området med steril saltlösning.
- Cylinder placering
- Lokalisera median-och koronala suturer på skallen (figur 2A, B). Observera att dessa anatomiska linjer bildar ett kors. Cylindrarna kommer att placeras i varje kvadranter definieras av korset, se till att kanten av cylindern är inte över suturen (figur 2C).
- Placera den första cylindern på den vänstra övre kvadranten (vänster frontal ben), och försök att lägga enheten platt. Fix i position med starka handtryck och skruva en mikro-skruv, tills motståndet känns. Se till att skruvhuvudet är i jämnhöjd med ytan på cylinder fliken.
- Upprepa samma procedur på den andra fliken för att fixera cylindern tätt på skallen. Säkerställ att cylindern är hermetiskt fixerad i benet.
- Upprepa proceduren på höger övre kvartalet (höger frontal ben), vänster nedre kvartalet (vänster parietala ben) och höger nedre kvartalet (höger parietala ben).
- Ben borrning av 5 intramedullära hål inom området som är omskrivet av cylindrarna (figur 1)
- Borra ett intramedullärt hål under saltlösning bevattning (0,8 mm i diameter, ~ 1 mm på djupet) med en rund bur på benet, i mitten av området omskriven av cylindern. Se till att blödningen visas.
- Borra ytterligare två intramedullära hål längs axeln som passerar genom de två flikskruvarna, vid innerkanterna av cylindern. Längs den vinkelräta yxan, borra ytterligare två intramedullära hål vid de inre kanterna av cylindern. Se till att blödningen visas.
- Upprepa operationen inom de tre andra cylindrarna.
- Påfyllnings cylindrar med materialprover och tak (figur 3)
- Förbered önskat benersättningsmaterial enligt tillverkarens instruktioner eller materialspecifikationer.
- Fyll den första cylindern till brädden med material provet och Stäng cylindern genom att montera locket. Upprepa processen i de 3 andra cylindrarna.
- Stängning av kirurgisk plats
- Stäng huden ovanför cylindrarna med en intermittent icke resorberbar sutur.
- Applicera ett spraybart förband på såret.
3. postkirurgisk behandling
- Stoppa analgesi och anestesi (propofol och fentanyl per fusions arrest) tillförsel och kontrollera återhämtningen av autonom andning.
- Stoppa ventilationen när djuret har återhämtat autonom andning. Underhålla djuret under rent syre innan fullständig uppvaknande.
- Injicera buprenorfinhydroklorid SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/mL, 0,67 mL/kg) och Upprepa injektionen var 6: e timme i 3 dagar som postkirurgisk analgesi.
- Överför djuret till sitt vanliga hölje med vatten och fullständig matning.
- Ta bort suturer efter ca 10 dagar av sårläkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den modell som beskrivs häri är tillägnad bedömningen av osteoconduction i ben ersättningar. Osteogenes och-eller osteoinduktion av ben ersättningar antingen (pre-) cellulariserad eller laddad med bioaktiva molekyler kan också bedömas, samt vasculogenesis1,2,3,4, ,5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , elva , 12 , 13 , fjorton , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. en kinetisk studie kan användas, från 3 dagar upp till 3 månader efter operationen beroende på de mekanismer och utgångar som ska analyseras. En klassisk tidslinje som tillåter beskrivningar i början och i mitten av tiden är: 2, 4, 6, 8 och 12 veckor. Observera att minst 6 prover per tidspunkt är obligatoriskt för att få betydande resultat. Varje prov som skall testas måste placeras minst en gång i varje position på skallen per tidspunkt (slumpmässig allokering). Slutligen måste simulerade prover (t. ex. cylindrar fyllda med koagulerat blod) inkluderas i protokollet34.
När operationen är avslutad, bentillväxt kan övervakas vid olika tidpunkter genom att använda bentomografi på levande djur. Ett exempel visas i figur 4a, B. Ytterligare analys kräver djur som ska offras (dödlig intravenös injektion av 150 mg/kg pentobarbital (100 mg/mL). Efter dödshjälp är proverna sektionerade och flaskorna avlägsnas omsorgsfullt (figur 5). Biopsier är fixerade med en lösning av fosfatbuffrad saltlösning och 4% formaldehyd. Bentillväxt kan sedan bedömas med hjälp av mikrotomografi (figur 4 C, D). Prover kan också behandlas för (immun-) histologisk färgning. Histomorphometric analys och specifika infärgning är då möjligt att slutföra analysen mer specifikt (figur 6).
Figur 1: specifikationer för Peek-cylindrar. Två hål (0,8 mm i diameter) borrades på den laterala stabiliserande flikar för skruvning. Positionerna för de 5 intramedullära hålen (0,8 mm i diameter) som ska borras på skallen inom det område som avgränsas av cylindern markeras med röda cirklar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ bild av kaninskallen och placeringen av cylindrarna. Bilder som visar median och koronala suturer på kanin skalle avgränsande vänster-höger parietala och frontal ben (A,B). Placeringen av cylindrarna på båda sidor om suturer (C). Skalstreck = 5 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativ bild av cylindrar fasta, fyllda och kapade. Bild som visar fyra cylindrar fast på skallen av en kanin med titanskruvar. Inom det område som avgränsas av varje cylinder, 5 intramedullära hål (0,8 mm i diameter, ~ 1 mm på djupet) borrades under bevattning med en rund bur för att möjliggöra bencell migration. Cylindrarna fylldes med olika ben ersättnings prov (kalibrerade volymer) innan tak (en sluten cylinder visas endast). Scale bar = 5 mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representativa bilder från mikrotomografiska (Micro-CT) analys. Med det slutliga målet att bedöma bentillväxt som utförs av ben ersättningar, 4 cylindrar fastställdes på en kanin skalle med titanskruvar och fylld med ben substitut material. A) levande avbildning: tvådimensionell tvärgående skanning (14 min, 99 kv/88 μA med en upplösning på 20 μm) av en cylinder vid 12 veckor. (B) tredimensionell (3D) rekonstruktion från Live Micro-CT-analys vid 4 veckor (röda cirklar: Ben ersättningar i cylindrar; röd pil: kontroll där cylindern är fylld med koagulerat blod). (C,D) Efter eutanasi (12 veckor), cylindrar avlägsnades före fixering och mikro-CT-analys. (C) 2D tvärgående skanning (57 min, 99 kv/88 μA med en upplösning på 10 μm) av en cylinder och 3D-rekonstruktion av det totala nya benet i cylindern (D). Bensubstitut partiklar (röd), nya ben (grön) och benbädd (gul) visas. Skala barer = 2 mm vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa bilder av en biopsi vid 4 veckor. Efter eutanasi (4 veckor), prover var block-sektioneras och cylindrar togs bort före fixering i 4% formalin, mikro-CT-analys och histologisk bearbetning. Scale bar = 5mm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: representativa bilder av (immun-) histologiska avsnitt. Med det slutliga målet att bedöma bentillväxt och kärlnybildning som utförs av ben ersättningar, 4 cylindrar fastställdes på en kanin skalle med titanskruvar och fylld med ben ersättningar. Efter dödshjälp (12 veckor) avlägsnades cylindrar före fixering och histologisk bearbetning. (A) Masson-Goldner färgning (50x): Ben ersättning visas som mauve partiklar omgiven av nytt ben i grönt. (B) skivorna skannades och behandlades för digital utvinning av bensubstitut material så att det nya benet (röd) kunde kvantifieras lätt. C) IMMUNOFÄRGNING av CD31 (pilar), en typisk markör för endotelceller och neovaskulariserings processen. D) immunofluorescensfärgning (grön) av en mycket kärlnybildning zon där några nya kapillärer mycket Express CD31 (pil). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Modellen som beskrivs häri är enkel och bör utvecklas ganska lätt så länge som alla steg följs och utrustningen är lämplig. Som det beskrivna protokollet är en kirurgisk metod, alla steg verkar kritisk och måste följas korrekt. Det är viktigt att utbildas för djurförsök, särskilt i kanin hantering och anestesi. Tveka inte att be om professionell anestetist och veterinär hjälp. Det är viktigt att insistera på den dagliga visuella övervakningen av djur före och efter sutur avlägsnande. Även om huden från skallen är tjock, riklig och lös, inducerar cylindrarnas fixering stora spänningar. Om suturer tas bort för tidigt, såret kan öppna igen och kommer att kräva en mer vecka av suturering och en ny antibiotikabehandling. Vid sårläkning från sår linjen, måste kirurgen överväga om suturering är möjligt eller inte. Om inte, måste prov avstötning övervägas.
Utöver de kritiska stegen som beskrivs i avsnittet protokoll kan informationen nedan vara till hjälp vid korrekt implementering av detta protokoll. Ur teknisk synvinkel, som kaniner som används är unga och små, är det viktigt att använda en två-stegs intubation, som beskrivs i protokollet. Den andra (och sista) röret är för stort för att användas i första intubation, och det finns en verklig risk för "fel sätt" som kan vara skadliga eller till och med dödliga.
Beroende på material testade, kan det vara intressant att ta lite färskt blodprov från örat IV linje som redan är placerad. Detta kan ge en bra metod för att pre-ingjuta benet substitut material med naturliga celler och tillväxtfaktorer. Färskt koagulerat blod kan också ge en idealisk simulerad prov.
Hur intramedullära hål borras bör vara till stor hjälp för framtida histologisk bearbetning och histomorphometrical analys. I själva verket, så länge hålen är (i) på samma plats, (II) biopsier är lika orienterade och (III) skärprocessen är standardiserad (dvs. samma tjocklek, samma snitt nivå), de fält som utvärderas är likvärdiga och deras jämförelse är mycket Relevanta. Som en fråga om standardisering, kan det vara av verkligt intresse att kalibrera volymen-kvantitet av material för att fylla cylindern, och att förbereda den i förväg, på ett sterilt sätt.
Ur vetenskaplig synvinkel, beroende på de produkter eller hypotes testas, kan det vara viktigt att undvika att placera cylindrarna på ben suturer. Vissa specifika stamceller finns i dessa strukturer35, skiljer sig från de mesenkymala ben stamceller som är inblandade i mekanismerna för intramembranös förbening, dvs, den benregenereringsprocess som påträffas i det Orofaciala området. Därför kan en verklig bias förekomma i händelse av felutveckling.
En av de stora fördelarna med calvarial modellen är användningen av levande mikrotomografi genom vilken bentillväxt kan följas på ett enda djur som en longitudinell studie. Denna strategi kan till stor del minska antalet euthanized djur och därför respektera "3R-regeln"36. Beroende på mikrotomografen enhet som används (upplösning, utrymme tillgängligt för djuret), variationer kommer att inträffa i form av strategi för anestesi (IV, gas, etc.), samt i bildupplösning och relevansen av den resulterande analysen.
Vi använder rutinmässigt en mikrotomograf tillägnad djurförsök (t. ex., Quantum GX) för rutinmässiga kontroller. Ett typiskt experiment inleds med en sedering, enligt beskrivningen i steg 2.3.1. Anestesi upprätthålls sedan med 2% isofluran i rent syre. Detta gör att djuret kan andas lugnt under en skannings tid på ca 14 min (99 kV/88 μA med en upplösning på 20 μm); Detta är tillräckligt för att kontrollera grundläggande parametrar (Inympning, cylinder fixering, semikvantitativ analys av bentillväxt, etc.). När du letar efter en exakt kvalitativ och kvantitativ analys, en mycket fininställning av skanningstiden, upplösning, anestesi och djur positionering kommer att behövas.
Existerande modellerar framkallat för assessementen av osteoconduction, osteogenesis, osteoinduktion as well as vasculogenesis, är talrika, speciellt i det orofacial sätter in. På grund av etiska och ekonomiska överväganden, vårt syfte kommer att begränsas till kanin eller mindre djur. Bortsett från skallen, de platser där materialet kan testas är mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, Diastema48 eller de incisiva uttagen (efter tandutdragning)49,50,51. Råttor, möss, marsvin och kaniner kan användas för var och en av de modeller som beskrivs nedan. Kortfattat, en kritisk defekt borras (eller ett uttag skapas genom genomträngande extraktion), fylld med materialet provet och sedan täcks av ett membran. Bortsett från det uppenbara faktum att endast två prover kan testas i var och en av dessa platser (ett prov per käken sida eller per genomträngande socket), de kirurgiska ingrepp är också till stor del svårare och invasiva. Åtkomst till webbplatsen är begränsad och om man använder råtta eller mus, svårigheten ökas ytterligare av storleken på djuren. Slutligen är den kritiska storleken på defekterna (dvs. dimensioner som inte tillåter spontan ben förnyelse) inte väldefinierade och varierar från ett djur till ett annat.
Förutom dessa generaliteter kan särskilda begränsningar uppstå beroende på den anatomiska plats som utsätts för defekten och den efterföljande analysen. Som ett exempel, i mandibular modellen, tänder rötter är närvarande inom defekten. Detta kan störa materialet och modifiera benregenereringsprocessen. Defekten kan placeras mer distalt på Ramus, men i så fall skulle benet vara mycket tunn (två corticals anbringas med en extremt tunn medullär utrymme) och den resulterande defekt volym kan vara för liten45,46, 47med tanke på dessa exempel på begränsningar och beroende på modell kan stora avvikelser förutses i fråga om material volym som skall testas, kvalitet och kvantitet av insamlade data.
Som utvärderingen av ett materiellt kräver en maximum av standardisering och kalibrering, calvarial modellerar verkar ideal. Åtkomsten är mycket enkel, kalibrering och standardisering underlättas genom användning av definierade cylindrar och 4 prover kan bedömas samtidigt. Dessutom kan levande tomografi användas och slutligen en stor minskning av djur som skall euthanized kan förutses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är skuldsatta till Geistlich AG (Wolhusen, CH) och Osteology Foundation (Lucerne, CH) (Grant n ° 18-049) för deras stöd, samt globala D (Brignais, FR) för att ge skruvarna. Ett särskilt tack går till Dr B. Schaefer från Geistlich. Vi är också tacksamma mot Eliane Dubois och Claire Herrmann för deras utmärkta histologiska bearbetning och deras dyrbara råd. Slutligen, vi erkänner varmt Xavier Belin, Sylvie Roulet och hela teamet av PR Walid Habre, "experimentell kirurgi DPT", för deras anmärkningsvärda tekniska hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Enrofloxacine Baytril 10% | Bayer | Antibiotic | |
| Fentanyl | Bischel | For analgesia | |
| Ketalar 50mg/ml | Pfizer | Ketamine for anesthesia | |
| Lidohex | Bichsel | Lubricating gel for the eyes | |
| Opsite | Smith and Nephew | 66004978 | Sprayable dressing |
| Povidone iodine 10%, Betadine | Mundipharma | anti-infective agent | |
| Propofol 2% | Braun | 3538710 | For anesthesia |
| Rapidocain 2% | sintetica | Local anesthesia | |
| Ringer-acetate | Fresenius Kabi | Volume compensation | |
| Rompun 2% | Bayer | Xylazin for anesthesia | |
| Sevoflurane 5% | Abbvie | For anesthesia | |
| Sterile saline | Sintetica | ||
| Temgesic | Reckitt Benckiser | Buprenorphine hydrochloride, analgesia | |
| Thiopental Inresa | Ospediala | For anesthesia | |
| Xylocaine 10% spray | Astra Zeneca | For intubation | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fresenius Vial pilot C | Imexmed | Infusion pump | |
| Heated pad | Harvard Apparatus | ||
| Suction dominant 50 | Medela | ||
| Suction tubing Optimus | Promedical | 80342.2 | |
| Surgical motor | Schick dental | Qube | Drilling of intramedullary holes |
| Ventilation | Maquet Servo1 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Cylinders and caps | Boutyplast | Customized | composition: PEEK (poly ether ether ketone) |
| Manual self-retaining shaft | GlobalD | ACT1K | |
| Mobile handle for self-retaining shaft | GlobalD | MTM | |
| Self- drilling screws | GlobalD | VA1.2KL4 | cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tray | |||
| Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm | Covidien | 86233 | For intubation |
| Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm | Covidien | 107-35G | For intubation |
| Ethicon prolene 4-0 | Ehticon | 8581H | Non-resorbable suture |
| Forceps | Marcel Blanc | BD027R | 145 mm |
| Intubation catheter | Cook medical | Guide for intubation | |
| Needlle holder | Marcel Blanc | BM008R | |
| Needles BD Microlance3 | Becton Dickinson | 300300/304622 | 26G; 18G |
| Periosteal | HU-Friedy | P9X | |
| Round surgical burs | Patterson | 78000 | 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes |
| Scalpel | Swann-Morton | n°10 and n°15 | |
| Scissors | Marcel Blanc | 00657 | 180 mm |
| Syringes Omnifix | Braun | 4616057V | 5ml, 10ml and 50ml |
| Venflon G22 | Braun | 42690985-01 | Vasofix safety for the ear iv line |
References
- Anderud, J., et al. Guided bone augmentation using a ceramic space-maintaining device. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology and Oral Radiology. 118 (5), 532-538 (2014).
- Lundgren, A. K., Lundgren, D., Hammerle, C. H., Nyman, S., Sennerby, L. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clinical Oral Implants Research. 11 (2), 99-106 (2000).
- Lundgren, D., Lundgren, A. K., Sennerby, L., Nyman, S. Augmentation of intramembraneous bone beyond the skeletal envelope using an occlusive titanium barrier. An experimental study in the rabbit. Clinical Oral Implants Research. 6 (2), 67-72 (1995).
- Slotte, C., Lundgren, D. Impact of cortical perforations of contiguous donor bone in a guided bone augmentation procedure: an experimental study in the rabbit skull. Clinical Implant Dentistry and Relat Research. 4 (1), 1-10 (2002).
- Tamura, T., et al. Three-dimensional evaluation for augmented bone using guided bone regeneration. Journal of Periodontal Research. 40 (3), 269-276 (2005).
- Yamada, Y., et al. Correlation in the densities of augmented and existing bone in guided bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 23 (7), 837-845 (2012).
- Chierico, A., et al. Electrically charged GTAM membranes stimulate osteogenesis in rabbit calvarial defects. Clinical Oral Implants Research. 10 (5), 415-424 (1999).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of the permeability of shields with autologous bone grafts on bone augmentation. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (6), e386-e392 (2013).
- Ito, K., Nanba, K., Murai, S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. Journal of Periodontology. 69 (11), 1229-1237 (1998).
- Lee, Y. M., et al. Enhanced bone augmentation by controlled release of recombinant human bone morphogenetic protein-2 from bioabsorbable membranes. Journal of Periodontology. 74 (6), 865-872 (2003).
- Fugl, A., et al. S-nitroso albumin enhances bone formation in a rabbit calvaria model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 43 (3), 381-386 (2014).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of self-assembling peptide hydrogel scaffold on bone regeneration with recombinant human bone morphogenetic protein-2. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (5), e283-e289 (2013).
- Ito, K., et al. Effects of ipriflavone on augmented bone using a guided bone regeneration procedure. Clinical Oral Implants Research. 18 (1), 60-68 (2007).
- Jung, R. E., Hammerle, C. H., Kokovic, V., Weber, F. E. Bone regeneration using a synthetic matrix containing a parathyroid hormone peptide combined with a grafting material. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 22 (2), 258-266 (2007).
- Minegishi, T., et al. Effects of ipriflavone on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvaria. Journal of Oral Science. 44 (1), 7-11 (2002).
- Moussa, M., et al. Medium-Term Function of a 3D Printed TCP/HA Structure as a New Osteoconductive Scaffold for Vertical Bone Augmentation: A Simulation by BMP-2 Activation. Materials. 8 (5), 2174-2190 (2015).
- Thoma, D. S., Kruse, A., Ghayor, C., Jung, R. E., Weber, F. E. Bone augmentation using a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute materials with and without recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clinical Oral Implants Research. 26 (5), 592-598 (2014).
- Busenlechner, D., et al. Resorption of deproteinized bovine bone mineral in a porcine calvaria augmentation model. Clinical Oral Implants Research. 23 (1), 95-99 (2012).
- Busenlechner, D., et al. Paste-like inorganic bone matrix: preclinical testing of a prototype preparation in the porcine calvaria. Clinical Oral Implants Research. 20 (10), 1099-1104 (2009).
- Busenlechner, D., et al. Simultaneous in vivo comparison of bone substitutes in a guided bone regeneration model. Biomaterials. 29 (22), 3195-3200 (2008).
- Carrel, J. P., et al. A 3D printed TCP/HA structure as a new osteoconductive scaffold for vertical bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 55-62 (2016).
- Murai, M., et al. Effects of different sizes of beta-tricalcium phosphate particles on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Dental Materials Journal. 25 (1), 87-96 (2006).
- Nishida, T., et al. Effects of bioactive glass on bone augmentation within a titanium cap in rabbit parietal bone. Journal of Periodontology. 77 (6), 983-989 (2006).
- Nyan, M., et al. Feasibility of alpha tricalcium phosphate for vertical bone augmentation. Journal of Investigating and Clinical Dentistry. 5 (2), 109-116 (2012).
- Polimeni, G., et al. Histopathological observations of a polylactic acid-based device intended for guided bone/tissue regeneration. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 99-105 (2008).
- Polo, C. I., et al. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 2 associated with a variety of bone substitutes on vertical guided bone regeneration in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 84 (3), 360-370 (2013).
- Slotte, C., Lundgren, D., Burgos, P. M. Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 18 (6), 795-806 (2003).
- Tamimi, F. M., et al. Bone augmentation in rabbit calvariae: comparative study between Bio-Oss and a novel beta-TCP/DCPD granulate. Journal of Clinical Periodontology. 33 (12), 922-928 (2006).
- Torres, J., et al. Effect of solely applied platelet-rich plasma on osseous regeneration compared to Bio-Oss: a morphometric and densitometric study on rabbit calvaria. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 106-112 (2008).
- Yamada, Y., et al. Angiogenesis in newly augmented bone observed in rabbit calvarium using a titanium cap. Clinical Oral Implants Research. 19 (10), 1003-1009 (2008).
- Cordaro, L., Terheyden, H. ITI Treatment Guide. Wismeijer, D., Chen, S., Buser, D. 7, Quintessence. (2014).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
- Min, S., et al. Effects of marrow penetration on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 78 (10), 1978-1984 (2007).
- Braun, T. M. Ch. 4. Osteology guidelines for oral and maxillofacial regeneration Preclinical models for translational research. Giannobile, W. V., Nevins, M. , Quintessence publishing. 31-43 (2011).
- Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial Suture-Derived Stem Cells and Their Contribution to Cranial Bone Repair. Frontiers in Physiology. 8, 956 (2017).
- Russel, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. , Universities Federation for Animal Welfare. (1959).
- Asvanund, P., Chunhabundit, P. Alveolar bone regeneration by implantation of nacre and B-tricalcium phosphate in guinea pig. Implant Dentistry. 21 (3), 248-253 (2012).
- Gielkens, P. F., et al. Gore-Tex as barrier membranes in rat mandibular defects: an evaluation by microradiography and micro-CT. Clinical Oral Implants Research. 19 (5), 516-521 (2008).
- Lioubavina, N., Kostopoulos, L., Wenzel, A., Karring, T. Long-term stability of jaw bone tuberosities formed by "guided tissue regeneration". Clinical Oral Implants Research. 10 (6), 477-486 (1999).
- Mardas, N., Kostopoulos, L., Stavropoulos, A., Karring, T. Osteogenesis by guided tissue regeneration and demineralized bone matrix. Journal of Clinical Periodontology. 30 (3), 176-183 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Mardas, N., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone used as an adjunct to guided bone augmentation: an experimental study in the rat. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 3 (3), 156-165 (2001).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone (Bio-Oss) and bioactive glass (Biogran) arrest bone formation when used as an adjunct to guided tissue regeneration (GTR): an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 30 (7), 636-643 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Fate of bone formed by guided tissue regeneration with or without grafting of Bio-Oss or Biogran. An experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 31 (1), 30-39 (2004).
- Stavropoulos, A., Nyengaard, J. R., Kostopoulos, L., Karring, T. Implant placement in bone formed beyond the skeletal envelope by means of guided tissue regeneration: an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 32 (10), 1108-1115 (2005).
- Thomaidis, V., et al. Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size. Medical Science Monitor. 14 (4), (2008).
- Zhang, J. C., et al. The repair of critical-size defects with porous hydroxyapatite/polyamide nanocomposite: an experimental study in rabbit mandibles. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 39 (5), 469-477 (2010).
- Zhang, X., et al. Osteoconductive effectiveness of bone graft derived from antler cancellous bone: an experimental study in the rabbit mandible defect model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 41 (11), 1330-1337 (2012).
- Bronoosh, P., et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on healing of mandibular bone defects: an experimental study in rabbits. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 277-284 (2015).
- Gomes, F. V., et al. Low-level laser therapy improves peri-implant bone formation: resonance frequency, electron microscopy, and stereology findings in a rabbit model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 245-251 (2014).
- Lalani, Z., et al. Spatial and temporal localization of secretory IgA in healing tooth extraction sockets in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 62 (4), 466-472 (2004).
- Osorio, L. B., et al. Post-extraction evaluation of sockets with one plate loss--a microtomographic and histological study. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 31-38 (2014).
