Summary
Burada kemik değiştirme malzemelerini kemik rejenerasyon kapasiteleri açısından değerlendirmek amacıyla tavşanlarda cerrahi bir protokol sunacağız. Tavşan kafataslarına sabitlenmiş PEEK silindirleri kullanılarak, osteokondasyon, osteoindüksiyon, osteonezogenez ve vaskülogenez indüklenen malzemeler canlı veya ötenazi yapılan hayvanlarda değerlendirilebilir.
Abstract
Tavşan kalvarial modelinin temel prensibi kafatasının kortikal kısmının üstüne dikey olarak yeni kemik dokusu yetiştirmektir. Bu model, kemik büyümesi ve nevasaskülarizasyon desteği açısından oral ve kraniyofasiyal kemik rejenerasyonu için kemik ikame malzemelerinin değerlendirilmesini sağlar. Hayvanlar anestezi ve havalandırıldıktan sonra (endotrakeal entübasyon), polyether eter ketondan (PEEK) yapılmış dört silindir, ortanca ve koronal dikişlerin her iki tarafında, kafatası üzerine vidalanır. Beş intramedüller delik kemik alanı içinde her silindir ile sınırlı, kemik iliği hücrelerinin akını sağlayan delinmiş. Malzeme örnekleri daha sonra kapatılan silindirlerin içine yerleştirilir. Son olarak, cerrahi site dikişli ve hayvanlar uyanır. Canlı hayvanlarda kemik büyümesi mikrotomografi kullanılarak değerlendirilebilir. Hayvanlar ötenazi yedikten sonra mikrotomografi, immün histoloji ve immünoresans kullanılarak kemik büyümesi ve nevasaskülarizasyon değerlendirilebilir. Bir malzemenin değerlendirilmesi maksimum standardizasyon ve kalibrasyon gerektirdiğinden, kalvarial model ideal görünür. Erişim çok kolaydır, kalibrasyon ve standardizasyon tanımlanan silindirlerin kullanımı ile kolaylaşmaktadır ve dört örnek aynı anda değerlendirilebilir. Ayrıca canlı tomografi kullanılabilir ve sonuçta ötanazi yapılacak hayvanlarda büyük bir azalma beklenilebilir.
Introduction
Kalvariyal kemik büyütme modeli 90'lı yıllarda oral ve kraniyofasiyal cerrahi alanda güdümlü kemik rejenerasyonu (GBR) kavramını optimize etmek amacıyla geliştirilmiştir. Bu modelin temel prensibi kafatasının kortikal kısmının üstüne dikey olarak yeni kemik dokusu büyümektir. Bunu yapmak için, bir reaktör (örneğin, titanyum -kubbe, -silindir veya -kafes) bir greft tarafından yürütülen kemik rejenerasyonkorumak için kafatası üzerine sabitlenir (örneğin, hidrojel, kemik yerine, vb). Bu model yardımıyla, titanyum veya seramik kafesler1,2,3,4,5,6, GBR membranlar7,8,9 ,10, osteojenik faktörler11,12,13,14,15,16,17, yeni kemik yerine12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24.000 , 25.000 , 26.000 , 27.000 , 28.000 , Kemik rejenerasyon sürecinde 29 veya nevasaskülarizasyon mekanizması30 olarak değerlendirildi.
Çevirisel açıdan bakıldığında, kalvarial model çene31bir sınıf IV defektkarşılaştırılabilir bir duvar kusur temsil eder. Amaç kortikal bir alanın üzerinde yeni kemik büyümek için, endojen kemik duvarlarından herhangi bir lateral destek olmadan. Model böylece son derece sıkı ve kemiğin kortikal kısmı üzerinde dikey osteoiletim gerçek potansiyelini değerlendirir. Burada açıklanan model öncelikle kemik yerine osteokondityon değerlendirilmesi adanmış ise, osteogenezis ve / veya osteoindüksiyon da değerlendirilebilir, yanı sıra vaskülogenez1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.
Esasen etik, pratik ve ekonomik nedenlerle, kemik metabolizması ve yapısı nın insana göre oldukça alakalı olduğu tavşanda kalvarial model geliştirilmiştir32. Yukarıda belirtilen 30 referanstan %80'i tavşan kalvarial modeli1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, böylece bu hayvan modelinin alaka gösteren. 2008'de Busenlechner grubu, aynı anda20 kemik ikame sinin karşılaştırılmasına izin vermek için kalvarial modeli domuza aktardı (tavşanla iki kemik ikamesiyle karşılaştırıldığında). Öte yandan grubumuz tavşan kalvarial modelini koyunlara aktardı. Kısacası, titanyum kubbeler koyun kafatasları üzerine yeni bir 3D baskılı kemik yerine osteoiletim karakterize yerleştirildi. Bu çalışmalar bize geliştirmek ve calvarial model ve analizi16,21master izin verdi.
Son üç çalışmada16,20,21, birlikte birkaç diğer araştırmalar 12 ,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, bir tarama ve karakterizasyon olarak kalvarial modelin büyük potansiyelini doğruladı Modeli. Ancak, elde edilen sonuçlar oldukça tatmin edici olmasına rağmen, onlar da bazı sınırlamalar dikkat çekti: (1) Titanyum kubbelerin kullanımı, hangi X-ışını difüzyon engelledi ve sırayla canlı mikro-CT kullanımı. Bunlar histolojik işlemeden önce kaldırılamadı ve araştırmacılar örnekleri poli (metil metakrilat) reçine (PMMA) gömmeye zorladı. Bu nedenle ortaya çıkan analizler büyük ölçüde topografya ile sınırlıydı. (2) Özellikle hayvanların maliyeti nedeniyle yüksek mali maliyetler ve hayvanların lojistik, bakım ve cerrahi ile ilgili maliyetler. (3) Büyük hayvanlar için etik onay alma güçlüğü.
Polo, ve ark.26 tarafından yeni bir çalışma büyük ölçüde tavşan modeli geliştirilmiş. Titanyum kubbeler, sabit bir malzeme hacmi ile doldurulabilen tıkalı silindirlerle değiştirildi. Bu silindirlerden dördü tavşan kafataslarına yerleştirildi. Tamamlandığında, biyopsiler metal siz böylece silindirler kaldırılabilir, örnek işleme ile ilgili çok daha fazla esneklik getirerek. Tavşan kalvarial modeli daha düşük maliyetler, kolay hayvan taşıma ve numune işleme kolaylaştırılması ile eşzamanlı test için cazip hale geldi. Bu son gelişmelerden yararlanarak, titanyumu PEEK ile değiştirerek silindir üreterek x-ışını difüzyonuna ve canlı hayvanlarda mikrotomografi kullanımına izin vererek modeli daha da geliştirdik.
Bu yazıda anestezi ve cerrahi süreçleri açıklayacağız ve kemik mekanizmalarını değerlendirmek için bu protokol, yani (immüno-) histoloji, histomorfometri, canlı ve ex vivo mikrotomografi kullanılarak elde edilebilecek çıktıörneklerini göstereceğiz. yenilenme ve kemik yerine malzemeler tarafından desteklenen yeni kemik sentezi ölçmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İsviçre yasal gereklilikleri doğrultusunda, protokol bir akademik komite tarafından onaylanmış ve kanton ve federal veteriner kurumları tarafından denetlenmiştir (ge/16/16 ve GE/100/18 yetkileri).
1. Özel cihazlar ve hayvanlar
-
Silindir
- PEEK'in yatay sabitleme sekmelerine sahip makine silindirlerinin iç çapı 5 mm, dış çapı8 mm ve yüksekliği 5 mm olması (Şekil 1).
- Makine PEEK kapakları silindirin üst üzerine tam olarak klip sağlayan bir tasarım (kalınlık 1 mm).
- Ameliyattan önce otoklavlayarak PEEK silindirlerini ve kapaklarını sterilize edin.
-
Vida
- Silindirleri (1,2 mm çapında, 4 mm uzunluğunda) onarmak için kendi kendini delenmikro vidaları (ticari saf titanyumdan (grade 5)) kullanın. Ameliyattan önce otoklavlama ile sterilize edin.
-
Hayvan
- Satın üç aylık Yeni Zelanda beyaz tavşan (erkek veya kadın), ağırlığında ~ 2.5 kg her.
NOT: Cenevre Üniversitesi'nde çiftleşme yaparak tavşan elde ettik.
- Satın üç aylık Yeni Zelanda beyaz tavşan (erkek veya kadın), ağırlığında ~ 2.5 kg her.
2. Cerrahi
- Cerrahi tepsi
- Neşter, makas, iki adet kefen, periosteal asansör, şırınga (1, 2, 5, 50 mL), cerrahi motor, yuvarlak cerrahi burs (0,8 mm çap), iğneler, steril salin, dört silindir, sekiz vida ve tornavida hazır tutun.
- Preklinik tedavi
- Ameliyattan bir hafta önce hayvanlara alışın.
- Ameliyattan 3 gün öncesine kadar ameliyattan 2 saat önce başlayan günlük profilaktik antibiyotik (ağızdan 5-10 mg/kg (PO)) başlangıç sağlayın.
- Anestezi ve entübasyon
- Hayvanları kas içi (IM) ketamin (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0.5 mL/kg) + xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0.15 mL/kg) enjeksiyonu ile yatıştırın. Hayvanların uyuması için ~20 dk bekleyin
derinden (tam kas atonus).
NOT: Bu premedication basit, hızlı ve ağrısız entübasyon süreci sağlayacaktır. Derin analjezi ve anestezi adım 2.3.8'de açıklandığı gibi indüklenir. - Kulaktan marjinal ven içine bir intravenöz (IV) kanül yerleştirin ve entübasyon tamamlanana kadar kapalı tutun.
NOT: Bu IV serisi, sırasıyla derin analjezi ve anestezi için fentanil ve propofol perfüzyon alacaktır (bkz. adım 2.3.8). - Entübasyon yapılana kadar saf oksijen %5 sevofluran sağlayarak anesteziyi koruyun.
NOT: Bu adım sadece hayvan uyanış belirtileri (göz hareketleri, kas kasılmaları) gösterirse gereklidir. - % 10 lidokain püskürtme tarafından yerel olarak trakea anestezi. Eğilimli pozisyonda tavşan yerleştirin ve dikey uzantısı başını korumak.
- Küçük çaplı ilk endotrakeal tüpü (2,5 mm) tavşan trakeasına kaydırın ta ki tüpte hava akımı duyulana kadar. Bu gırtlak açacak ve kesin tüp ekleme kolaylaştırmak.
- Tüpün trakeaya konumunu düzeltmek için tüpe bir kılavuz (entübasyon kateteri) yerleştirin. Küçük çaplı tüpü çıkarın ve kılavuzdaki kesin endotrakeal tüpü (4,9 mm) kaydırın.
- Kılavuzu çıkarın ve cihazı nefes borusuna kapatmak ve engellemek için endotrakeal tüpün ucundaki balonu şişirin. Tüp yerinde kalacak ama alnına bağlı bir dantel kullanılarak güvenli olabilir. Hemen havalandırın (7 mL/kg, 40/dk frekans) saf oksijen % 3 sevofluran ile hayvan.
- Analjeziye neden olmak için sürekli perfüzyon (kulak ven) fentanil (0.01 mg/mL, 2-4 mL/sa), 2-4 mg/kg (%2) propofol (20 mg/mL, 4-8 mL/h) anestezi yi teşvik etmek için ve iso-hacimsel koşulları korumak için Ringer asetat4 mL/kg/h.
- Rektal sıcaklık sondası yerleştirin. Ayrıca tüm süreç boyunca kalp fonksiyonu, sıcaklık ve oksijen doygunluğu izleyin.
- Otonom solunumu izleyerek anestezinin derinliğini kontrol edin; hayvan otonom solunum belirtileri gösterirse, propofol ve fentanil küçük bir bolus dağıtmak.
- Hayvanları kas içi (IM) ketamin (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0.5 mL/kg) + xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0.15 mL/kg) enjeksiyonu ile yatıştırın. Hayvanların uyuması için ~20 dk bekleyin
- Site hazırlama
- Tavşanı ameliyat masasının üzerine bir şilte pedi (yanıklardan kaçınmak için) ile kaplı ısıtmalı bir ped (39 °C) üzerine yerleştirin. Kafa derisini tıraş et.
- Tahriş ve kuruluk önlemek için gözlere bir yağlama jeli uygulayın. Povison iyot (%10) ile cildi ovarak bölgeyi dezenfekte edin. Sonra steril bir cerrahi perde ile tavşan perde ve kafatası için bir erişim alanı kesip.
- Cerrahi bölgeyi povison iyot ile dezenfekte etmek (%10) Ikinci kez. Tahriş ve kuruluk önlemek için gözlere bir yağlama jeli uygulayın.
- Tam cerrahi tepsiyi yerleştirmek için üzerine dökümlü bir masa (steril perde) hazırlayın.
- Cerrahi alan açılışı
- Kafatasında deri altı (SC) lidokain %2 (1 mL) enjeksiyonu ile lokal anestezi yapın.
- Kalvarial sagital çizgi boyunca deri (neşter ile) ile eğim, dış oksipital protuberance (~ 4 cm uzunluğunda) yörüngeleri. Periyosteum undan emin olun.
- Kesiğin her iki tarafındaki perioyotimu (periosteal asansörlü) yavaşça yükseltin. Siteyi steril salinle durula.
- Silindir yerleşimi
- Kafatası üzerinde ortanca ve koronal dikişler bulun (Şekil 2A,B). Bu anatomik çizgilerin bir haç oluşturduğunu unutmayın. Silindirler haç tarafından tanımlanan kadranda her birine yerleştirilir ve silindirin kenarının dikişin üzerinde olmamasını sağlar (Şekil 2C).
- Sol üst kadranda (sol frontal kemik) ilk silindiri yerleştirin ve cihazı düz döşemeye çalışın. Güçlü el basıncı ile pozisyonda sabitve direnç hissedilene kadar bir mikro vida vida. Vida kafasının silindir sekmesinin yüzeyi ile floş olduğundan emin olun.
- Silindiri kafatasına sıkıca sabitlemek için diğer sekmede aynı işlemi tekrarlayın. Silindirin kemiğe hermetik olarak sabitolduğundan emin olun.
- Sağ üst çeyrek (sağ frontal kemik), sol alt çeyrek (sol parietal kemik) ve sağ alt çeyrek (sağ parietal kemik) üzerinde prosedürü tekrarlayın.
- Silindirler ile sınırlanan alan içinde 5 intramedüller deliğin kemik delme (Şekil 1)
- Silindirle sınırlanan alanın merkezinde, kemik üzerinde yuvarlak bir bur ile tuzlu sulama (0,8 mm çapında, ~1 mm derinlik) altında bir intramedullary delik matkap. Kanamanın göründüğünden emin olun.
- Silindirin iç kenarlarında, iki sekme vidadan geçen eksen boyunca iki intramedüller delik daha açın. Dik balta boyunca, silindirin iç kenarlarında iki intramedüller delik daha delin. Kanamanın göründüğünden emin olun.
- Diğer üç silindir içinde işlemi tekrarlayın.
- Silindirlerin malzeme örnekleri ile doldurulması ve kapama (Şekil 3)
- İstenilen kemik ikame malzemesini üreticitalimatlarına veya malzeme özelliklerine göre hazırlayın.
- İlk silindiri malzeme örneğiyle doldurun ve kapağı takarak silindiri kapatın. Diğer 3 silindirde işlemi tekrarlayın.
- Cerrahi saha kapatma
- Silindirlerin üzerindeki deriyi aralıklı resüsite edilemeyen bir dikişle kapatın.
- Yaranın üzerine püskürtülebilir bir pansuman uygulayın.
3. Cerrahi sonrası tedavi
- Analjezi ve anesteziyi durdurun (propofol ve fentanil perfüzyon durması) tedarik edin ve otonom solunumun iyileşmesini kontrol edin.
- Hayvan otonom solunum iyileştiğinde havalandırmayı durdurun. Tam uyanış önce saf oksijen altında hayvan korumak.
- Buprenorfin hidroklorür SC enjekte edin (0.02 mg/kg, 0.03 mg/mL, 0.67 mL/kg) ve enjeksiyonu cerrahi sonrası analjezi olarak 3 gün boyunca her 6 saat tekrarlayın.
- Su ve tam besleme ile her zamanki konut içine hayvan aktarın.
- Yara iyileşmesi yaklaşık 10 gün sonra dikişleri çıkarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan model kemik yerine osteoiletim in değerlendirilmesi adamıştır. Osteogenezis ve-veya osteoindüksiyon kemik yerine ya (pre-)hücresel veya biyoaktif moleküller ile yüklü de değerlendirilebilir, yanı sıra vaskülogenez1,2,3,4, 5.000 , 6.000 , 7.000 , 8.000 , 9.000 , 10.000 , 11.11.20 , 12.000.0 , 13.000 , 14.000 , 15.000 , 16.02.20 , 17.000 , 18.000 , 19.09.20 , 20.000 , 21.000 , 22.000 , 23.000 , 24.000 , 25.000 , 26.000 , 27.000 , 28.000 , 29.000 , 30- Ameliyattan 3 günden 3 aya kadar analiz edilecek mekanizma ve çıktılara bağlı olarak kinetik bir çalışma yapılabilir. Erken ve orta zaman açıklamaları sağlayan klasik bir zaman çizelgesi: 2, 4, 6, 8 ve 12 hafta. Önemli sonuçlar elde etmek için zaman başına en az 6 örnek alınmasının zorunlu olduğunu unutmayın. Test edilecek her numunenin her pozisyonda en az bir kez zaman noktası başına kafatasıüzerine yerleştirilmesi gerekir (rasgele ayırma). Son olarak, sahte örnekler (örneğin, pıhtılaşmış kan ile dolu silindirler) protokol34dahil edilmelidir.
Ameliyat tamamlandıktan sonra canlı hayvanlarda kemik tomografisi kullanılarak farklı zaman noktalarında kemik büyümesi izlenebilir. Bir örnek Şekil 4A,B'degösterilmiştir. Ek analizhayvanların kurban edilmesi gerektiğini (150 mg/kg pentobarbital (100 mg/mL) öldürücü intravenöz enjeksiyonu. Ötenaziden sonra numuneler kesiştirilir ve silindirler özenle çıkarılır (Şekil 5). Biyopsiler fosfat tamponlu tuzlu ve %4 formaldehit çözeltisi ile sabitlenir. Kemik büyümesi daha sonra mikrotomografi kullanılarak değerlendirilebilir (Şekil 4 C,D). Örnekler de işlenebilir (bağışıklık-) histolojik boyama. Histomorfometrik analiz ve spesifik boyamalar daha spesifik olarak analizi tamamlamak mümkündür (Şekil 6).
Şekil 1: PEEK silindirlerinin özellikleri. Vidalama için yanal stabilizasyon sekmelerinde iki delik (0.8 mm çapında) delinmiş. Silindirle sınırlandırılmış alan içindeki kafatasına delinecek 5 intramedüller deliğin (0,8 mm çapında) konumları kırmızı daireler kullanılarak işaretlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tavşan kafatasının temsili görüntüsü ve silindirlerin yerleştirilmesi. Sol-sağ parietal ve frontal kemikleri delineating tavşan kafatası üzerinde medyan vekoronal dikişgösteren resimler (A ,B). Silindirlerin dikişlerin her iki tarafına yerleştirilmesi(C). Ölçek çubukları = 5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Silindirlerin temsili görüntüsü sabit, doldurulmuş ve kaplanmış. Titanyum vidalı bir tavşanın kafatasına sabitlenmiş dört silindiri gösteren resim. Her silindirle sınırlandırılmış alanda, kemik hücresi göçüne izin vermek için sulama altında 5 intramedüller delik (0,8 mm çapında, ~1 mm derinlik) delinmiş. Silindirler kapamadan önce farklı kemik ikame numuneleri (kalibre edilmiş hacimler) ile doldurulmuştu (sadece bir kapalı silindir gösterilir). Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Mikrotomografik (mikro-BT) analizinden temsili görüntüler. Kemik yerine geçen kemik büyümesini değerlendirmek için nihai hedef olan 4 silindir, titanyum vidalı bir tavşan kafatasına sabitlenmiş ve kemik ikame malzemelerle doldurulmuştur. (A) Canlı görüntüleme: 12 haftada bir silindirin iki boyutlu enine taraması (14 dk, 99 kV/88 μA, 20 m çözünürlüğe sahip). (B) canlı mikro-CT analizinden 4 hafta (kırmızı daireler: silindirlerde kemik yerine; kırmızı ok: silindirin pıhtılaşmış kanla dolu olduğu kontrol) üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon. (C,D) Ötenaziden sonra (12 hafta) fiksasyon ve mikro-BT analizinden önce silindirler çıkarıldı. (C) 2D enine talan (57 dk, 99 kV/88 μA çözünürlüğe sahip 10 μm) silindir ve silindirdeki toplam yeni kemiğin 3Boyutlu rekonstrüksiyonu (D). Kemik ikame partiküller (kırmızı), yeni kemik (yeşil) ve kemik yatağı (sarı) gösterilir. Ölçek çubukları = 2 mm Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 4 haftalık biyopsinin temsili görüntüleri. Ötanaziden sonra (4 hafta) örnekler blok-kesitli ve %4 formalin, mikro-BT analizi ve histolojik işleme de fiksasyondan önce silindirler çıkarıldı. Ölçek çubuğu = 5mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: (immün-)histolojik kesitlerin temsili resimleri. Kemik erimesi ve kemik yerine geçen nevasaskülarizasyon uyruplarını değerlendirmek için nihai hedef olan 4 silindir, titanyum vidalı bir tavşan kafatasına sabitlenmiş ve kemik ikameleriyle doldurulmuştür. Ötenaziden (12 hafta) sonra, fiksasyon ve histolojik işleme den önce silindirler çıkarıldı. (A) Masson-Goldner boyama (50x): kemik yerine yeşil yeni kemik ile çevrili leylak parçacıkları olarak görünür. (B) Yeni kemik (kırmızı) kolayca ölçülebilsin diye dilimler tarandı ve kemik ikame malzemesinin dijital olarak çıkarılması için işlendi. (C) CD31 (oklar), endotel hücrelerinin tipik bir belirteç ve nevasaskülarizasyon süreci immunostaining. (D) İmmünofloresan boyama (yeşil) yüksek nevasalarbölgesi içinde bazı yeni kılcal damarlar yüksek IFADE CD31 (ok). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan model basittir ve tüm adımlar takip edildiği ve ekipman uygun olduğu sürece oldukça kolay geliştirilmelidir. Açıklanan protokol cerrahi bir yöntem olduğundan, tüm adımlar kritik görünür ve düzgün bir şekilde izlenmelidir. Özellikle tavşan taşıma ve anestezi konusunda hayvan deneyleri için eğitilmek önemlidir. Profesyonel anestezi uzmanı ve veteriner yardımı istemekten çekinmeyin. Dikiş çıkarmadan önce ve sonra hayvanların günlük görsel olarak izlenmesi nde ısrar etmek önemlidir. Kafatasındaki deri kalın, bol ve gevşek olsa bile, silindirlerin fiksasyonu büyük gerginliklere neden olur. Dikişler çok erken çıkarılırsa, yara yeniden açılabilir ve bir hafta daha dikiş ve yeni bir antibiyotik tedavisi gerektirir. Yara hattının kopması durumunda, cerrah dikişin mümkün olup olmadığını göz önünde bulundurmak zorunda kalacaktır. Değilse, örnek reddi dikkate alınmalıdır.
Protokol bölümünde açıklanan kritik adımlara ek olarak, aşağıdaki ayrıntılar bu protokolün doğru şekilde uygulanmasında yararlı olabilir. Teknik açıdan bakıldığında, kullanılan tavşanlar genç ve küçük olduğundan, protokolde açıklandığı gibi iki aşamalı entübasyon kullanmak önemlidir. İkinci (ve son) tüp ilk entübasyonda kullanılmak üzere çok büyüktür ve zararlı ya da ölümcül olabilecek gerçek bir "yanlış yol" riski vardır.
Test edilen malzemelere bağlı olarak, zaten yerleştirilmiş kulak IV hattından bazı taze kan örneği almak ilginç olabilir. Bu doğal hücreler ve büyüme faktörleri ile kemik yerine malzeme önceden aşılamak için iyi bir yöntem sağlayabilir. Taze pıhtılaşmış kan da ideal bir sahte örnek sağlayabilir.
İntramedüller deliklerin delinme şekli gelecekteki histolojik işleme ve histomorfometrik analiz için çok yararlı olmalıdır. Sonuç olarak, delikler (i) aynı yerde olduğu sürece, (ii) biyopsiler benzer şekilde yönlendirilir ve (iii) kesme işlemi standartlaştırılmıştır (yani, aynı kalınlık, aynı kesim seviyesi), değerlendirilen alanlar eşdeğerdir ve karşılaştırmaları yüksektir Ilgili. Standardizasyon meselesi olarak, silindirdoldurmak için malzeme nin hacim-miktar kalibre etmek için gerçek ilgi olabilir, ve önceden hazırlamak için, steril bir şekilde.
Bilimsel bir bakış açısıyla, test edilen ürünlere veya hipoteze bağlı olarak, silindirlerin kemik dikişlerinin üzerine yerleştirilmesinden kaçınmak önemli olabilir. Bazı spesifik kök hücreler bu yapılarda mevcut35, intramembran ossifikasyon mekanizmaları nda yer alan mezenkimal kemik kök hücreleri farklı, yani, orofasiyal alanda karşılaşılan kemik rejenerasyon süreci. Bu nedenle, yanlış yerleştirme durumunda gerçek bir önyargı oluşabilir.
Kalvariyal modelin en önemli avantajlarından biri, kemik büyümesinin tek bir hayvanüzerinde uzunlamasına bir çalışma olarak takip edilebilen canlı mikrotomografi kullanımıdır. Bu strateji büyük ölçüde ötenazi hayvan sayısını azaltabilir ve bu nedenle "3R kuralı"36saygı . Kullanılan mikrotomograf cihazına (çözünürlük, hayvan için kullanılabilir alan) bağlı olarak, anestezi stratejisi (IV, gaz, vb.) ve görüntü çözünürlüğü ve ortaya çıkan analizin önemi açısından farklılıklar meydana gelecektir.
Rutin kontroller için rutin olarak hayvan deneylerine (örneğin Quantum GX) adanmış bir mikrotomograf kullanıyoruz. Tipik bir deney, adım 2.3.1'de açıklandığı gibi bir sedasyonla başlar. Anestezi daha sonra saf oksijen% 2 isofluran ile korunur. Bu, hayvanın yaklaşık 14 dk (99 kV/88 μA) 20 μm çözünürlüğe sahip tarama süresi boyunca sakin bir şekilde nefes almasını sağlar; temel parametrelerin (engreftment, silindir fiksasyonu, kemik büyümesinin yarı kantitatif analizi vb.) kontrol edilmesi için yeterlidir. Kesin bir nitel ve nicel analiz ararken, tarama süresi, çözünürlük, anestezi ve hayvan konumlandırma çok ince bir ayar gerekli olacaktır.
Osteoiletim, osteogenezis, osteoindüksiyon ve vaskülogenezin değerlendirilmesi için geliştirilen mevcut modeller, özellikle orofasiyal alanda çok sayıdadır. Etik ve ekonomik hususlar nedeniyle, amacımız tavşan veya küçük hayvanlarla sınırlı olacaktır. Kafatası dışında, malzeme nin test edilebilecek yerleri mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, diyastema48 veya kesi soketleri (diş çekiminden sonra)49,50,51. Fareler, fareler, kobaylar ve tavşanlar aşağıda açıklanan modellerin her biri için kullanılabilir. Kısaca, kritik bir kusur delinmiş (veya bir soket insizyöz ekstraksiyon tarafından oluşturulur), malzeme numunesi ile doldurulur ve daha sonra bir membran ile kaplıdır. Bu yerlerin her birinde sadece iki numunenin test edilebildiği gerçeğinin dışında (çene yan veya kesi soketi başına bir örnek) cerrahi prosedürler de büyük ölçüde daha zor ve invazivtir. Siteye erişimler sınırlıdır ve fare veya fare kullanıyorsanız, hayvanların büyüklüğü ile zorluk daha da artar. Son olarak, kusurların kritik boyutu (yani, spontan kemik yenilenmesine izin vermez boyutlar) iyi tanımlı değildir ve bir hayvandan diğerine değişir.
Bu genellemelerin yanı sıra, defekte maruz kalan anatomik konuma ve sonraki analize bağlı olarak belirli kısıtlamalar ortaya çıkabilir. Örnek olarak, mandibular modelde, diş kökleri defekt içinde mevcuttur. Bu malzeme ile müdahale ve kemik rejenerasyon sürecini değiştirebilir. Kusur ramus daha distally yerleştirilebilir, ama bu durumda, kemik çok ince olurdu (iki kortikal son derece ince medüller boşluk ile yapıştırılmış) ve ortaya çıkan kusur hacmi çok küçük olabilir45,46, 47. Bu sınırlama örnekleri göz önüne alındığında ve modele bağlı olarak, test edilecek malzeme hacmi, toplanan verilerin kalitesi ve miktarı açısından büyük sapmalar beklenebilir.
Bir malzemenin değerlendirilmesi maksimum standardizasyon ve kalibrasyon gerektirdiğinden, kalvarial model ideal görünür. Erişim çok kolaydır, kalibrasyon ve standardizasyon tanımlanmış silindirlerin kullanımı ile kolaylaşmaktadır ve 4 örnek aynı anda değerlendirilebilir. Ayrıca canlı tomografi kullanılabilir ve son olarak ötanazi yapılacak hayvanlarda büyük bir azalma beklenilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Geistlich AG (Wolhusen, CH) ve Osteoloji vakfı (Lucerne, CH) (hibe n ° 18-049) yanı sıra Global D (Brignais, FR) vida sağlamak için borçludur. Geistlich'ten Dr. B. Schaefer'a özel bir teşekkür. Ayrıca Eliane Dubois ve Claire Herrmann'a mükemmel histolojik işlemleri ve değerli tavsiyelerinden dolayı minnettarız. Son olarak, biz sıcak Xavier Belin, Sylvie Roulet ve Pr Walid Habre tüm ekibi, "deneysel cerrahi Dpt" , onların olağanüstü teknik yardım için kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Enrofloxacine Baytril 10% | Bayer | Antibiotic | |
| Fentanyl | Bischel | For analgesia | |
| Ketalar 50mg/ml | Pfizer | Ketamine for anesthesia | |
| Lidohex | Bichsel | Lubricating gel for the eyes | |
| Opsite | Smith and Nephew | 66004978 | Sprayable dressing |
| Povidone iodine 10%, Betadine | Mundipharma | anti-infective agent | |
| Propofol 2% | Braun | 3538710 | For anesthesia |
| Rapidocain 2% | sintetica | Local anesthesia | |
| Ringer-acetate | Fresenius Kabi | Volume compensation | |
| Rompun 2% | Bayer | Xylazin for anesthesia | |
| Sevoflurane 5% | Abbvie | For anesthesia | |
| Sterile saline | Sintetica | ||
| Temgesic | Reckitt Benckiser | Buprenorphine hydrochloride, analgesia | |
| Thiopental Inresa | Ospediala | For anesthesia | |
| Xylocaine 10% spray | Astra Zeneca | For intubation | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fresenius Vial pilot C | Imexmed | Infusion pump | |
| Heated pad | Harvard Apparatus | ||
| Suction dominant 50 | Medela | ||
| Suction tubing Optimus | Promedical | 80342.2 | |
| Surgical motor | Schick dental | Qube | Drilling of intramedullary holes |
| Ventilation | Maquet Servo1 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Cylinders and caps | Boutyplast | Customized | composition: PEEK (poly ether ether ketone) |
| Manual self-retaining shaft | GlobalD | ACT1K | |
| Mobile handle for self-retaining shaft | GlobalD | MTM | |
| Self- drilling screws | GlobalD | VA1.2KL4 | cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tray | |||
| Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm | Covidien | 86233 | For intubation |
| Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm | Covidien | 107-35G | For intubation |
| Ethicon prolene 4-0 | Ehticon | 8581H | Non-resorbable suture |
| Forceps | Marcel Blanc | BD027R | 145 mm |
| Intubation catheter | Cook medical | Guide for intubation | |
| Needlle holder | Marcel Blanc | BM008R | |
| Needles BD Microlance3 | Becton Dickinson | 300300/304622 | 26G; 18G |
| Periosteal | HU-Friedy | P9X | |
| Round surgical burs | Patterson | 78000 | 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes |
| Scalpel | Swann-Morton | n°10 and n°15 | |
| Scissors | Marcel Blanc | 00657 | 180 mm |
| Syringes Omnifix | Braun | 4616057V | 5ml, 10ml and 50ml |
| Venflon G22 | Braun | 42690985-01 | Vasofix safety for the ear iv line |
References
- Anderud, J., et al. Guided bone augmentation using a ceramic space-maintaining device. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology and Oral Radiology. 118 (5), 532-538 (2014).
- Lundgren, A. K., Lundgren, D., Hammerle, C. H., Nyman, S., Sennerby, L. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clinical Oral Implants Research. 11 (2), 99-106 (2000).
- Lundgren, D., Lundgren, A. K., Sennerby, L., Nyman, S. Augmentation of intramembraneous bone beyond the skeletal envelope using an occlusive titanium barrier. An experimental study in the rabbit. Clinical Oral Implants Research. 6 (2), 67-72 (1995).
- Slotte, C., Lundgren, D. Impact of cortical perforations of contiguous donor bone in a guided bone augmentation procedure: an experimental study in the rabbit skull. Clinical Implant Dentistry and Relat Research. 4 (1), 1-10 (2002).
- Tamura, T., et al. Three-dimensional evaluation for augmented bone using guided bone regeneration. Journal of Periodontal Research. 40 (3), 269-276 (2005).
- Yamada, Y., et al. Correlation in the densities of augmented and existing bone in guided bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 23 (7), 837-845 (2012).
- Chierico, A., et al. Electrically charged GTAM membranes stimulate osteogenesis in rabbit calvarial defects. Clinical Oral Implants Research. 10 (5), 415-424 (1999).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of the permeability of shields with autologous bone grafts on bone augmentation. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (6), e386-e392 (2013).
- Ito, K., Nanba, K., Murai, S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. Journal of Periodontology. 69 (11), 1229-1237 (1998).
- Lee, Y. M., et al. Enhanced bone augmentation by controlled release of recombinant human bone morphogenetic protein-2 from bioabsorbable membranes. Journal of Periodontology. 74 (6), 865-872 (2003).
- Fugl, A., et al. S-nitroso albumin enhances bone formation in a rabbit calvaria model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 43 (3), 381-386 (2014).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of self-assembling peptide hydrogel scaffold on bone regeneration with recombinant human bone morphogenetic protein-2. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (5), e283-e289 (2013).
- Ito, K., et al. Effects of ipriflavone on augmented bone using a guided bone regeneration procedure. Clinical Oral Implants Research. 18 (1), 60-68 (2007).
- Jung, R. E., Hammerle, C. H., Kokovic, V., Weber, F. E. Bone regeneration using a synthetic matrix containing a parathyroid hormone peptide combined with a grafting material. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 22 (2), 258-266 (2007).
- Minegishi, T., et al. Effects of ipriflavone on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvaria. Journal of Oral Science. 44 (1), 7-11 (2002).
- Moussa, M., et al. Medium-Term Function of a 3D Printed TCP/HA Structure as a New Osteoconductive Scaffold for Vertical Bone Augmentation: A Simulation by BMP-2 Activation. Materials. 8 (5), 2174-2190 (2015).
- Thoma, D. S., Kruse, A., Ghayor, C., Jung, R. E., Weber, F. E. Bone augmentation using a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute materials with and without recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clinical Oral Implants Research. 26 (5), 592-598 (2014).
- Busenlechner, D., et al. Resorption of deproteinized bovine bone mineral in a porcine calvaria augmentation model. Clinical Oral Implants Research. 23 (1), 95-99 (2012).
- Busenlechner, D., et al. Paste-like inorganic bone matrix: preclinical testing of a prototype preparation in the porcine calvaria. Clinical Oral Implants Research. 20 (10), 1099-1104 (2009).
- Busenlechner, D., et al. Simultaneous in vivo comparison of bone substitutes in a guided bone regeneration model. Biomaterials. 29 (22), 3195-3200 (2008).
- Carrel, J. P., et al. A 3D printed TCP/HA structure as a new osteoconductive scaffold for vertical bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 55-62 (2016).
- Murai, M., et al. Effects of different sizes of beta-tricalcium phosphate particles on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Dental Materials Journal. 25 (1), 87-96 (2006).
- Nishida, T., et al. Effects of bioactive glass on bone augmentation within a titanium cap in rabbit parietal bone. Journal of Periodontology. 77 (6), 983-989 (2006).
- Nyan, M., et al. Feasibility of alpha tricalcium phosphate for vertical bone augmentation. Journal of Investigating and Clinical Dentistry. 5 (2), 109-116 (2012).
- Polimeni, G., et al. Histopathological observations of a polylactic acid-based device intended for guided bone/tissue regeneration. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 99-105 (2008).
- Polo, C. I., et al. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 2 associated with a variety of bone substitutes on vertical guided bone regeneration in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 84 (3), 360-370 (2013).
- Slotte, C., Lundgren, D., Burgos, P. M. Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 18 (6), 795-806 (2003).
- Tamimi, F. M., et al. Bone augmentation in rabbit calvariae: comparative study between Bio-Oss and a novel beta-TCP/DCPD granulate. Journal of Clinical Periodontology. 33 (12), 922-928 (2006).
- Torres, J., et al. Effect of solely applied platelet-rich plasma on osseous regeneration compared to Bio-Oss: a morphometric and densitometric study on rabbit calvaria. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 106-112 (2008).
- Yamada, Y., et al. Angiogenesis in newly augmented bone observed in rabbit calvarium using a titanium cap. Clinical Oral Implants Research. 19 (10), 1003-1009 (2008).
- Cordaro, L., Terheyden, H. ITI Treatment Guide. Wismeijer, D., Chen, S., Buser, D. 7, Quintessence. (2014).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
- Min, S., et al. Effects of marrow penetration on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 78 (10), 1978-1984 (2007).
- Braun, T. M. Ch. 4. Osteology guidelines for oral and maxillofacial regeneration Preclinical models for translational research. Giannobile, W. V., Nevins, M. , Quintessence publishing. 31-43 (2011).
- Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial Suture-Derived Stem Cells and Their Contribution to Cranial Bone Repair. Frontiers in Physiology. 8, 956 (2017).
- Russel, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. , Universities Federation for Animal Welfare. (1959).
- Asvanund, P., Chunhabundit, P. Alveolar bone regeneration by implantation of nacre and B-tricalcium phosphate in guinea pig. Implant Dentistry. 21 (3), 248-253 (2012).
- Gielkens, P. F., et al. Gore-Tex as barrier membranes in rat mandibular defects: an evaluation by microradiography and micro-CT. Clinical Oral Implants Research. 19 (5), 516-521 (2008).
- Lioubavina, N., Kostopoulos, L., Wenzel, A., Karring, T. Long-term stability of jaw bone tuberosities formed by "guided tissue regeneration". Clinical Oral Implants Research. 10 (6), 477-486 (1999).
- Mardas, N., Kostopoulos, L., Stavropoulos, A., Karring, T. Osteogenesis by guided tissue regeneration and demineralized bone matrix. Journal of Clinical Periodontology. 30 (3), 176-183 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Mardas, N., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone used as an adjunct to guided bone augmentation: an experimental study in the rat. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 3 (3), 156-165 (2001).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone (Bio-Oss) and bioactive glass (Biogran) arrest bone formation when used as an adjunct to guided tissue regeneration (GTR): an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 30 (7), 636-643 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Fate of bone formed by guided tissue regeneration with or without grafting of Bio-Oss or Biogran. An experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 31 (1), 30-39 (2004).
- Stavropoulos, A., Nyengaard, J. R., Kostopoulos, L., Karring, T. Implant placement in bone formed beyond the skeletal envelope by means of guided tissue regeneration: an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 32 (10), 1108-1115 (2005).
- Thomaidis, V., et al. Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size. Medical Science Monitor. 14 (4), (2008).
- Zhang, J. C., et al. The repair of critical-size defects with porous hydroxyapatite/polyamide nanocomposite: an experimental study in rabbit mandibles. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 39 (5), 469-477 (2010).
- Zhang, X., et al. Osteoconductive effectiveness of bone graft derived from antler cancellous bone: an experimental study in the rabbit mandible defect model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 41 (11), 1330-1337 (2012).
- Bronoosh, P., et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on healing of mandibular bone defects: an experimental study in rabbits. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 277-284 (2015).
- Gomes, F. V., et al. Low-level laser therapy improves peri-implant bone formation: resonance frequency, electron microscopy, and stereology findings in a rabbit model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 245-251 (2014).
- Lalani, Z., et al. Spatial and temporal localization of secretory IgA in healing tooth extraction sockets in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 62 (4), 466-472 (2004).
- Osorio, L. B., et al. Post-extraction evaluation of sockets with one plate loss--a microtomographic and histological study. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 31-38 (2014).
