Summary
Beskrivna är protokoll för mycket effektiv genom redigering av murina hematopoietiska Stem och stamceller (HSPC) av CRISPR/Cas9 systemet för att snabbt utveckla musmodell system med hematopoietiska systemspecifika genmodifieringar.
Abstract
Manipulera gener i hematopoietiska stamceller med hjälp av konventionella transgenetik metoder kan vara tidskrävande, dyrt och utmanande. Dra nytta av framsteg i genom redigering teknik och lentivirus-medierade transgenens leveranssystem, en effektiv och ekonomisk metod beskrivs här som etablerar möss där gener manipuleras specifikt i hematopoietiska stamceller. Lentivirus används för att transduce Cas9-uttrycker härstamning-negativa benmärgsceller med en guide RNA (gRNA) inriktning på specifika gener och en röd fluorescens reporter gen (RFP), då dessa celler transplanteras till lethally-bestrålade C57BL/6 möss. Möss som transplanteras med lentivirus som uttrycker icke-riktad gRNA används som kontroller. Engrafering av sensorik hematopoietiska stamceller utvärderas genom flödescytometrisk analys av RFP-positiva leukocyter av perifert blod. Med denna metod, ~ 90% transduktion av myeloida celler och ~ 70% av lymfoida celler vid 4 veckor efter transplantation kan uppnås. Genomiskt DNA isoleras från RFP-positiva blodceller, och delar av det riktade DNA-området förstärks av PCR för att validera genomedigering. Detta protokoll ger en hög genomströmning utvärdering av hematopoies-reglerande gener och kan utvidgas till en mängd olika modeller mus sjukdom med hematopoietisk cell inblandning.
Introduction
Många studier i hematologi och immunologi förlitar sig på tillgången på genetiskt modifierade möss, inklusive konventionella och villkorliga transgena/knock-out möss som utnyttjar hematopoietiska systemspecifika CRE förare såsom Mx1-CRE, VAV-CRE, och andra 1,2,3,4,5. Dessa strategier kräver inrättandet av nya mus stammar, vilket kan vara tidskrävande och ekonomiskt belastande. Medan revolutionära framsteg i genom redigering teknik har möjliggjort generering av nya möss stammar i så få som 3-4 månader med lämplig teknisk expertis6,7,8,9 , mycket mer tid krävs för att förstärka musen kolonin innan experiment eftersträvas. Dessutom är dessa förfaranden kostsamma. Till exempel listar Jackson Laboratory det nuvarande priset på Knock-out möss generation tjänster på $16 845 per stam (från och med december 2018). Således är metoder som är mer ekonomiska och effektiva än konventionella murina transgena metoder mer fördelaktiga.
Kluster med jämna mellanrum korta palindrom repetitioner/CRISPR Associated protein 9 (CRISPR/Cas9) teknik har lett till utveckling av nya verktyg för snabb och effektiv RNA-baserad, sekvens-specifik genomredigering. Ursprungligen upptäcktes som en bakteriell adaptiv immunmekanism för att förstöra invaderande patogen DNA, den CRISPR/Cas9 systemet har använts som ett verktyg för att öka effektiviteten av genomredigering i eukaryota celler och djurmodeller. Ett antal metoder har använts för att överföra CRISPR/Cas9 maskiner till hematopoietiska stamceller (dvs., elektroporation, nukleofektion, lipofektion, viral leverans, och andra).
Här är ett lentivirus system används för att transduce celler på grund av dess förmåga att effektivt infektera Cas9-uttrycker murina hematopoietiska stamceller och paketera tillsammans guide RNA uttryck konstruera, initiativtagare, regulatoriska sekvenser, och gener som kodar fluorescerande reporter proteiner (dvs., GFP, RFP). Med denna metod har ex vivo genredigering av mus hematopoietiska stamceller uppnåtts, följt av framgångsrik beredning av benmärg i dödligt bestrålade möss10. Den lentivirus Vector används för denna studie uttrycker Cas9 och GFP reporter gener från den gemensamma kärnan EF1a promotorn med en intern ribosomal inträde webbplats uppströms från reportern genen. Guide-RNA-sekvensen uttrycks från en separat U6-promotor. Detta system används sedan för att skapa införande och radering mutationer i kandidat klon hematopoies föraren gener Tet2 och Dnmt3a10. Dock är transduktionseffektiviteten med denna metod relativt låg (~ 5%-10%) på grund av den stora storleken på Vector insatsen (13 KBP) som begränsar transduktionseffektiviteten och reducerar virusets titer under produktionen.
I andra studier, det har visats att större viral RNA-storlek negativt påverkar både virus produktion och signaltransduktion effektivitet. Till exempel, en 1 KB ökning av skär storlek rapporteras att minska virus produktionen av ~ 50%, och transduktion effektivitet kommer att minska till mer än 50% i mus hematopoietiska stamceller11. Därför är det fördelaktigt att minska storleken på virus insatsen så mycket som möjligt för att förbättra systemets effektivitet.
Denna brist kan övervinnas genom att anställa Cas9 transgena möss, där Cas9 proteinet uttrycks i antingen ett konstitutivt eller inducerbart sätt12. De konstitutiva CRISPR/Cas9-Knock-in-möss uttrycker Cas9 endonukleas och EGFP från CAG-promotorn på Rosa26 Locus på ett allestädande sätt. Således, en konstruktion med sgRNA under kontroll av U6 promotorn och RFP reporter genen under kontroll av Core EF1a promotorn kan levereras med hjälp av lentivirus vektorn för att uppnå genomredigering. Med detta system har gener av hematopoietiska stamceller framgångsrikt redigerats, visar en ~ 90% signaltransduktion effektivitet. Detta protokoll ger således en snabb och effektiv metod för att skapa möss där riktade genmutationer introduceras i det hematopoietiska systemet. Medan vårt labb huvudsakligen använder denna typ av teknik för att studera den roll som klonala hematopoies i hjärt-kärlsjukdomar processer13,54,15, det är också tillämplig på studier av hematologiska malignitet16. Dessutom kan detta protokoll utvidgas till analysen av hur DNA-mutationer i HSPC påverkar andra sjukdoms-eller utvecklingsprocesser i det hematopoietiska systemet.
För att etablera ett robust lentivirus Vector system, hög titer viral lager och optimerade villkor för transduktion och transplantation av hematopoietiska celler krävs. I protokollet ges instruktioner om beredning av en hög titervirusstock i avsnitt 1, optimering av odlingsförhållandena för murina hematopoietiska stamceller i avsnitt 2, metoder för benmärgstransplantation i avsnitt 3 och bedömning av inympelse i avsnitt 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som involverar djur försökspersoner har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Virginia.
1. generering och rening av lentivirus partiklar
Anmärkning: lentivirus partiklar som innehåller den optimerade guide RNA kan produceras av detaljerade protokoll från Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. Optimerade metoder för hög titer lentivirus beredning och lagring diskuteras på andra håll17,18. I korthet, lentivirus produceras av co-transfektion av en lentivirus Vector plasmid, psPAX2, och pMD2. G i HEK 293T celler. Kultur supernatanten samlas på 48 h post-transfektion och koncentreras av ultracentrifugation. Lentiviral titer bestäms av en kommersiellt tillgänglig qPCR-baserad analys. Detta förfarande bör utföras i ett biosäkerhets klass II-skåp.
- Bered en 1:200 lösning av kollagen (0,0005%) i 1x PBS.
- Coat en 6 brunn tallrik med kollagen lösning och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för ~ 30 min.
- Seed 293T celler med en densitet av 1 x 106 celler per brunn och inkubera vid 37 ° c, 5% Co2 för ~ 2 h.
- För att förbereda blandningen av tre transfektion plasmider för en brunn, kombinera 0,9 μg av lentivirus vektor, 0,6 μg psPAX2, och 0,3 μg pMD2. G, sedan uppnå en total volym av 10 μL genom att tillsätta avjoniserat vatten. Justera beloppen beroende på antalet brunnar. Mängden och kvoten av varje plasmid kan behöva optimeras ytterligare för att passa forskarnas behov.
- Tillsätt försiktigt 50 μL 1x PBS och 5 μL av den utspädda PEI-MAX (1,0 mg/mL) till plasmid-blandningen och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur (RT) (tabell 1).
- Tillsätt 1 mL DMEM till blandningen.
- Aspirera media från 6 väl plattan, tillsätt 1 mL plasmid blandning, och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för ~ 3 h.
- Byt ut mediet med 2 mL färsk DMEM och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för 24 h.
- Tillsätt 1 mL färsk DMEM och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för ytterligare 24 h (total inkubationstid är 48 h).
- Överför kultur supernatanten till en 50 mL tub och centrifugera vid 3 000 x g i 15 minuter för att ta bort alla fritt flytande celler.
- Filtrera supernatanten genom ett 0,45 μm filter.
- Överför filtratet till polypropylen centrifugrör.
- Ultracentrifuge vid 4 ° c och 72 100 x g vid rMax för 3 h.
- Försiktigt Aspirera supernatanten, lämnar bakom den vita pelleten.
- Omsuspendera pelleten med 100 μL serumfritt hematopoietiskt cell expansions medium utan luftning.
- Håll 10 μL alikvot för att mäta viral titern och förvara alla återstående portioner vid-80 ° c tills det behövs.
- Titrera viruset med en qPCR-baserad analys enligt tillverkarens anvisningar med hjälp av den 10 μL viral alikvot.
2. isolering och transduktion av härstamning-negativa celler från mus benmärg (figur 1a)
Anmärkningar: typiskt, för att isolera tillräckligt med celler, är par av Tibias, femurer och överarmsben skördas från varje mus. Bäcken och ryggrads ben kan också skördas som en källa till härstamning-negativa celler.
- Isolering av benmärgsceller
- Euthanize 8-10 vecka gamla manliga CRISPR/Cas9 Knock-in möss med 5% isofluran följt av cervikal dislokation, sedan desinficera huden med 70% etanol.
- Använd dissekera sax, gör ett tvärgående snitt i huden strax under bröstkorgen och skala huden distalt i båda riktningarna för att exponera ben och armar.
- Noggrant separera de nedre extremiteterna från höftbenet genom att dislokalisera höftleden. Skär längs lårbenet huvudet för att ta bort lårbenet helt från höften. Dislocate knäet och skär på leden för att separera lårbenet och Tibia, samtidigt som ben epifysen intakt. Dislocate fotleden och skala bort foten och extra muskler.
- Med dissekera sax, skära över axeln för att lossa de övre extremiteterna. Dislocate axeln, sedan skära på armbågsleden för att skörda humerus benet.
- Använd cellulosa-fibervåtservetter för att försiktigt ta bort muskler från femurer, Tibias, och humeri. Vidta extra försiktighetsåtgärder för att säkerställa att benen inte bryts under denna process.
- Placera de isolerade benen i ett 50 mL koniskt rör som innehåller RPMI, och placera på is.
Anmärkning: följande steg bör utföras i ett biosäkerhets klass II-skåp. - Överför benen till en steril, 100 mm kultur rätt.
- Greppa benet med trubbiga tång, och med hjälp av dissekera sax, försiktigt skära båda epifyser.
Anmärkning: en otillräcklig skärning kommer att leda till en ofullständig spolning av benmärg, medan alltför aggressiv skärning kommer att resultera i cellförlust. - Fyll en 10 mL spruta med iskall RPMI, och Använd en 22 G nål, spola benmärgen från skaftet till en ny 100 mm kultur rätt.
Anmärkning: ben kommer att bli vit och genomskinlig om ben skaftet har varit väl spolas. Om inte, klipp av benändarna och spola igen. - Efter all benmärg har samlats, gör en encellig suspension genom att passera benmärgen flera gånger genom en 10 mL spruta med en 18 G nål. Upprepa 10X för att säkerställa en encellig suspension.
- Filtrera cellsuspensionen genom en 70 μm cell SIL i ett 50 mL koniskt rör.
- Centrifugera vid 310 x g i 10 min vid 4 ° c.
- Aspirera på supernatanten och Omsuspendera cell pellets i en lämplig volym av optimerad separations buffert för följande cell separationsprocess.
- Isolering och lentivirus transduktion av härstamning-negativa celler
Obs: Mouse Lineage-negativa celler isoleras från benmärgen hos Cas9 transgena möss3, eller andra stammar av möss, med hjälp av en härstamning utfiskningssats enligt tillverkarens anvisningar. Typiskt, härstamning-negativa celler står för 2%-5% av hela benmärgen kärn celler, och renheten är oftast större än 90% efter isolering. De isolerade härstamning-negativa cellerna odlas i serumfritt hematopoietiska cell expansion medium kompletteras med 20 ng/ml rekombinant murint TPO och 50 ng/ml rekombinant murin SCF, sedan sensorik med lentivirus vektorn för 16 h vid en multiplicity av infektion (MOI) = 100.- Om du vill isolera härstamning-negativa celler använder du Lineage cell utarmningssats enligt tillverkarens anvisningar.
- Efter isolering Omsuspendera de härstamning-negativa cellerna i 1 mL av serumfritt hematopoietiska cell expansion medium.
- Frö cellerna till en 6 brunn tallrik med en densitet av 1,5 x 106 celler/ml (5 x 105 härstamning-negativa celler/mus.)
- Tillsätt rekombinant murin TPO och SCF i brunnar vid slutliga koncentrationer på 20 ng/mL respektive 50 ng/mL.
- Pre-Inkubera celler vid 37 ° c i 5% CO2 för ~ 2 h.
- Tillsätt lentivirus vid MOI = 100, 4 μg/mL polybrene och penicillin/streptomycin till brunnarna och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för 16-20 h (figur 1b).
- På dagen efter, samla in lentivirus sensorik celler i en 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 300 g i 10 min.
- Sug försiktigt upp supernatanten och Omsuspendera pelleten i 200 μL RPMI per mus. Förvara cellerna vid RT tills transplantation till möss (avsnitt 3).
3. transplantation av omvandlades celler till dödligt bestrålade möss
- På dagen för benmärgstransplantation, placera mottagar möss i en åtta-slice paj bur och utsätta dem för två doser av hela kroppen bestrålning (550 rad/dos, total dos = 1100 rad), med cirka 4 h mellan varje bestrålning session.
- Efter den andra bestrålnings sessionen, injicera sensorik härstamning-negativa celler till varje sövda mottagare mus via retro-orbital Vein plexus (200 μl totalt) med hjälp av en insulinspruta (figur 1c).
- Efter bestrålning bör möss inhysas i steriliserade burar och förses med en mjuk diet och dricksvatten kompletterat med antibiotika för 14 d.
- Vid 3-4 veckor efter benmärgstransplantation, analysera perifert blod för att kontrollera om transplantationen av sensorik givar celler (avsnitt 4).
4. utvärdering av chimärism av perifert blod
- Anesthetize möss med 5% isofluran och få ett blodprov från en retro-orbital ven med hjälp av kapillärrör, och samla in den i K2EDTA rör (volymen i ett kapillärrör är tillräcklig för följande analys).
- Överför 20 μL blod från K2EDTA rören till 5 mL runda botten polystyrenprovrör, och sätta på is.
- Tillsätt 1,5 mL RBC-lysbuffert för att lysera röda blodkroppar. Inkubera i 5 minuter på isen.
- För att neutralisera lyseringsbufferten, tvätta prover med FACS-buffert (1,5 mL/prov).
- Centrifugera vid 609 x g vid rMax i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten.
- Inkubera cellerna med en cocktail av monoklonala antikroppar (utspädd i 100 μL FACS buffert/prov) vid RT för 20 min i mörker. En fullständig lista över antikroppar finns i material avsnittet ovan.
- Tvätta cellerna en gång med FACS-buffert (2 mL/prov). Centrifugera vid 609 x g vid rMax (1 800 RPM) i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten helt.
- Fixera cellerna med PARAFORMALDEHYD som innehåller fixeringsbuffert (100 μL/tub) i 10 min vid 4 ° c.
- Tvätta celler en gång med FACS-buffert (3 mL/prov). Centrifugera vid 609 x g vid rMax (1 800 RPM) i 5 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten helt.
- Suspendera pelleten i 400 μL FACS-buffert.
- Förvara proverna vid 4 ° c tills analysen är flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av det ovan beskrivna protokollet, cirka 0,8-1,0 x 108 benmärgsceller per mus har erhållits. Antalet härstamning-negativa celler vi får är cirka 3 x 106 celler per mus. Typiskt, avkastningen av benmärgen härstamning-negativa celler är 4%-5% av den totala benmärgs kärn celler.
Chimerism av sensorik celler (RFP-positiva) utvärderas genom flödescytometri av perifert blod (figur 2A,B). Blod är isolerad från retro-orbital ven och lämpliga markörer används för att bestämma identiteten för varje hematopoietisk cellpopulation (dvs., neutrofiler, monocyter, T-celler, etc.) (Figur 3a,B). Genomiskt DNA kan isoleras från RFP-positiva blodceller, och delar av det riktade området DNA kan förstärkas med PCR och subklonas till TA kloning vektorer för sekvensanalys. Dessa plasmider är omvandlas till E. coli och målplatsens sekvenser bestäms av sanger sekvensering (figur 4). Alternativt kan mål platsekvenser bestämmas med andra metoder, såsom Sanger sekvensering av poolade genomet följt av spårning av indels genom nedbrytning (tidvatten) analys10. För kontrollvillkoret, möss är vanligtvis transplanteras med celler som är sensorik med ett lentivirus uttrycker icke-targeting guide RNA.
Figur 1: Schematisk illustration av detta protokoll. (a) isolering av härstamning-negativa benmärgsceller från Cas9-uttrycker möss (avsnitt 2,1). B) lentivirutransduktion av härstamning-negativa celler (avsnitt 2,2). C) retro-orbital injektion av omvandlades celler till dödligt bestrålade vild typ möss (avsnitt 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: effektiv lentiviral transduktion av mus benmärgs härstamning-negativa celler in vitro. (A) flödescytometri analys visar framgångsrik transduktion av härstamning-negativa celler. Analys utfördes efter 7 dagars in vitro-kultur. (B) i genomsnitt omvandlades 75,7% av cellerna i denna analys (n = 3). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:beredning av lethally-bestrålad mus benmärg genom sensorik härstamning-negativa celler. (A) flödescytometri analys av mus perifera blod efter beredning av hematopoietiska stamceller som var (botten) eller inte var (överst) sensorik med lentivirus uttrycker RFP. Neutrofiler definieras som Ly6G+ och Ly6CHi monocyter som Ly6G-och Ly6C+, och B- celler som CD45R+. (B) i dessa analyser är i genomsnitt 94,8%, 93,5% och 82,7% av cellerna RFP+ i neutrofila, Ly6CHi monocyte respektive B-cellpopulationer (n = 8). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:utvärdering av genredigering i sensorik blodceller. (A) exempel på genredigering som visar sekvenserings resultat av muterade Dnmt3a Locus i RPF-positiva blodkroppar. Borttagningar visas som röda streck och infogningar betecknas med röda bokstäver. B) Sammanfattning av de mutationer som upptäcktes. (C) 69% (11/16 kloner) visade ut-av-Frame/för tidiga stopp mutationer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Plasmiden | Storlek (BP) | Belopp per brunn (μg) | Förhållandet |
| pLKO 5.0 | 7700 | 0,9 | 2 |
| psPAX2 | 10668 | 0,6 | 1 |
| pMD2. G | 5822 | 0,3 | 1 |
| PEI-Max (lager: 100 mg/mL) | 5 μL/brunn | ||
Tabell 1: mängder av plasmid och PEI-Max som används för transfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fördelen med detta protokoll är skapandet av djurmodeller härda specifika mutationer i hematopoietiska celler på ett snabbt och mycket kostnadseffektivt sätt jämfört med konventionella mus transgena metoder. Det konstaterades att denna metod möjliggör generering av möss med hematopoietiska cell gen-manipulationer inom 1 månad. Det finns flera kritiska steg i detta protokoll som kräver ytterligare övervägande.
Screening av gRNA-sekvens
Det rekommenderas att du testar gRNAs in vitro för att utvärdera redigerings effektiviteten innan du genomför in vivo-experiment. Effektiviteten hos gRNAs testas med hjälp av en cell fri in vitro-transkription och screening system. Den transkriberade gRNA valideras genom att mäta dess effektivitet på klyva mallen DNA i närvaro av rekombinant Cas9 protein, med hjälp av agaros gel elektrofores. Kommersiellt tillgängliga kit finns för detta ändamål.
Här kännetecknas indel mutationer av ta kloning av PCR-produkter förstärks från redigerade regionen, omvandla bakterieceller med dessa plasmider, och plocka upp enskilda kolonier för Sanger sekvensering. Men denna metod är mödosam och tidskrävande. Alternativt kan nästa generations sekvensering (NGS) eller poolad DNA-sekvensering följt av tidvatten analys utföras19. TIDNINGSALGORITMEN skapades för att analysera Sanger sekvens spår som genererats från komplexa prover. Det har visats att indel uppskattningar med tidvatten är vanligtvis överensstämmer med de off-riktade NGS20. Den analytiska programvaran är tillgänglig online på < http://Tide.NKI.nl >.
Generering av hög titer lentivirus partiklar
Viral vesikulär stomatit virus G-protein, som är viktigt för cell infektion, är mycket pH-känsligt. Därför är det viktigt att hålla odlingsmediet inom ett godtagbart pH-intervall, och det bör inte utveckla en gulaktig utseende. Kollagen-belagda rätter för virus generation är anställda eftersom det påskyndar fastsättning av HEK293T celler och tillåter utförandet av transfektion inom några timmar, snarare än att vänta över natten. Men beroende på experimentellt schema, övernattning inkubation kan också övervägas.
Rening av lentivirus partiklar
För att uppnå effektiv transduktion av hematopoietiska stamceller, är det nödvändigt att generera hög titer lentivirus. Optimering av centrifugeringshastigheten är en viktig funktion. Medan koncentrationen av lentivirus utförs vanligtvis på 90 000 x g, flera rapporter har visat att virus återhämtning ökar om materialet centrifugeras vid den lägre hastigheten på 20 000 x g18. Produktionen av hög titer lentivirus beredning utan ultracentrifugering har också föreslagits17. Det bör noteras att det är viktigt att avbryta virusets centrifugeringspellet samtidigt som man undviker kraftig pipettering för att minimera luftningen och bibehålla virus integriteten. Hög titer lentivirus partiklar krävs för effektiv transduktion av hematopoietiska stamceller11. Pilot experiment avslöjade att en MOI av 100 är optimal med avseende på transduktionseffektivitet och cellernas lönsamhet. Det rekommenderas att utvärdera lentivirus lager på grundval av cellernas lönsamhet och signaltransduktion effektivitet.
Förvaring av lentiviruspartiklar
Den lentivirus titer är mycket känslig för temperatur, och titern kan minskas drastiskt genom olämpliga lagringsförhållanden och upprepade frysa-Tina cykler. Det har visat sig att transduktionseffektiviteten hos lentivirus minskar snabbt när den förvaras vid 4 ° c [t (1/2) = 1,3 dagar] eller utsätts för flera frys-Taw cykler [t (1/2) = 1,1 rundor]. Det rekommenderas att virus preparaten fästs i flytande kväve eller krossad torris strax efter att viruset pelleten har avbrutits. Viruslagren bör bibehållas vid-80 ° c och tinas på is till RT bara tidigare jämvikt och användning11.
Flera potentiella begränsningar bör noteras. Först, införandet av off-Target indel mutationer av CRISPR/Cas9 har länge varit uppskattat. Det har också visats att CRISPR/Cas9 kan inducera mutationsmutter i vivo21. I praktiken, off-Target indel mutationer kan undvikas genom att använda gRNA sekvenser som är nära matchade till mål genomet platser och har mer än fyra felmatchningar till förväntade sekundära platser. Sådan design kan göras med befintliga i silico tools22. Andra beräkningsverktyg för att förutsäga gRNA med minimerade åtgärder utanför mål är tillgängliga (< http://Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Analysis-tools/sgrna-design > eller < http://www.Benchling.com >). Det kan också vara fördelaktigt att analysera en djurmodell med hjälp av två eller flera olika gRNAs för att bekräfta fenotypen och minimera risken för att den observerade fenotypen förmedlas med en off-Target effekt av en specifik gRNA.
Förutom konventionella indel mutationer som skapats av CRISPR/Cas9, större borttagningar som sträcker sig bortom kilobaser har rapporterats. Detta kan blanda ihop studier; emellertid, de större borttagningar rapporteras vara mycket lägre frekvens jämfört med indels23. Ett annat potentiellt problem är genetisk kompensation. Det har rapporterats att muterat RNA med en förtida uppsägning kodon (PTC) kan resultera i uppreglering av relaterade gener med sekvens likhet med Compass Complex-medierad aktivering av transkription24,25. Denna händelse har föreslagits vara en mekanism som kan leda till fenotypiska skillnader mellan Knock-out och knockdown metoder för Gene ablation. Eftersom CRISPR/Cas9-medierad genom redigering starkt förlitar sig på stokastisk införande av Frame-Shift mutationer som leder till generering av PTC, genetisk kompensation kan ändra fenotyp. För att undvika genetisk kompensation, kan experiment övervägas där en gen regulatoriska sekvenser är riktade av CRISPR/Cas9 eller genom införandet av epigenetiska modifierare använder Cas9 som en RNA-guidad DNA-erkännande plattform.
Slutligen bör det erkännas att hematopoies från celler inympade i lethally-bestrålad möss kan skilja sig från de inhemska villkoren för hematopoies. Vidare kan bestrålning ha systemiska effekter på organismen som kan blanda ihop tolkningen av experiment som undersöker konsekvenserna genmutationer i hematopoietiska celler.
Forskare har utnyttjat katalytiskt inaktiva Cas9 (dCas9) proteiner som en "RNA-guidad DNA-erkännande plattform" och används dCas9 fusions proteiner för att lokalisera effektor domäner till specifika DNA-sekvenser för att antingen förtränga (crispri) eller aktivera (crispra) transkription av-målgener26,27. Även om detta protokoll använder katalytiskt aktiva Cas9 transgena möss för att introducera dsDNA-klyvning i genomisk DNA-sekvens, är epigenetisk modifiering för att förtrycka eller aktivera specifika gener tillämpligt genom att fixera dCas9 med kromatin-modifieringsdomäner som dCas9-KRAB respektive dCas9-VP64. Alternativt kan dCas9 användas som en transkriptionell repressormolekyl som sin egen, genom att blockera transkriptionella maskiner tillgång till genen plats27. På senare tid, Zhou et al. etablerad dCas9-SunTag-P65-HSF1 (SPH) transgena möss som uttrycker en modifierad version av en epigenetisk aktivare smält med dCas9 och visade att detta CRISPRa systemet är funktionell in vivo28.
Vårt labb använder huvudsakligen denna teknik för att studera den roll som klonala hematopoies i hjärt-kärlsjukdomar processer. I prolifererande vävnad, somatiska mutationer i cancer driver gener kan ge en cellulär tillväxtför del och leda till avvikande klon expansioner. I det hematopoietiska systemet, denna process är känd som "klonala hematopoies", och det resulterar i situationer där en betydande del av en individs leukocyter ersätts av muterade kloner. Det finns en växande uppskattning att avvikande klon expansioner påskynda hjärt-kärlsjukdom, såsom åderförkalkning och hjärtsvikt, och bidra till sjuklighet och all-orsak dödlighet15,29.
Nyligen har ett orsakssamband mellan flera av dessa somatiska mutationer och hjärt-kärlsjukdom dokumenterats, och aspekter av de bakomliggande mekanismerna har klargjorts10,13,14. Men dessa somatiska mutationer representerar förmodligen "toppen av isberget", som epidemiologiska studier har visat att många ytterligare kandidatgener är förknippade med klonala hematopoies och potentiellt, ökad kardiovaskulär sjukdom dödlighet. Således krävs en systematisk, högre genomströmning utvärdering av klonala hematopoies driver gener. Aktuella studier av orsakssambandet av klonala hematopoies och hjärt-kärlsjukdom är baserade på analysen av möss med hematopoietiska systemspecifika villkorliga transgena (Mx1-CRE, VAV-CRE, etc.) eller möss efter benmärgstransplantation. Dessa strategier måste dock etablera nya muskolonier och kan bli en ekonomisk och fysisk börda för forskarna. Således är en billigare och snabbare metod än konventionella murina transgena/knock-out strategi som används i det förflutna är motiverad. Lentivirala vektorer att transduce HSPC och CRISPR teknik för att iscensätta mutationer, som beskrivs i detta manuskript, underlätta studiet av klonala hematopoies och hjärt-kärlsjukdom.
Förutom att generera konventionella knock-out Locus, denna metod är tillämplig på produktionen av stympade muterade proteiner. Till exempel, forskare har framgångsrikt genererat en hematopoietisk-Ppm1d trunkering, som ofta ses hos patienter med klonala hematopoies, genom att införa frameshift mutationer med en gRNA inriktning exon 6 av Ppm1d genen30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
S. S. stöddes av ett amerikanskt hjärta Association postdoktor Fellowship 17POST33670076. K. W. stöddes av NIH Grants R01 HL138014, R01 HL141256, och R01 HL139819.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim injection | TEVA | 0703-9526-01 | |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216-- | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
