Summary
Beskrevet er protokoller for svært effektiv Genova redigering av murine blodkreft stem og stamceller (HSPC) av CRISPR/Cas9 system for å raskt utvikle musemodell systemer med blodkreft system-spesifikke gen modifikasjoner.
Abstract
Manipulere gener i blodkreft stamceller ved hjelp av konvensjonelle transgenesis tilnærminger kan være tidkrevende, dyrt og utfordrende. Drar nytte av fremskritt i Genova redigering teknologi og lentivirus-mediert transgene levering systemer, en effektiv og økonomisk metode er beskrevet her som etablerer mus der gener er manipulert spesielt i blodkreft stamceller. Lentiviruses brukes til å overfører Cas9-uttrykker avstamning-negative benmargceller med en guide RNA (gRNA) rettet mot spesifikke gener og et rødt fluorescens reporter gen (RFP), da disse cellene er transplantert inn drepende-bestrålt C57BL/6 mus. Mus transplantert med lentivirus uttrykker ikke-mål gRNA brukes som kontroller. Engraftment av transduced blodkreft stamceller er evaluert av flyt analytiske analyse av RFP-positive leukocytter av perifert blod. Ved hjelp av denne metoden, ~ 90% Transduction av myelogen celler og ~ 70% av lymfoide celler på 4 uker etter transplantasjon kan oppnås. Genomisk DNA er isolert fra RFP-positive blodlegemer, og deler av målrettede området DNA forsterkes av PCR å validere Genova redigering. Denne protokollen gir en høy-gjennomstrømming evaluering av hematopoiesen-regulatoriske gener og kan utvides til en rekke mus sykdom modeller med blodkreft celle engasjement.
Introduction
Mange studier i hematologi og immunologi stole på tilgjengeligheten av genmodifiserte mus, inkludert konvensjonelle og betingede transgene/Knock-Out mus som utnytter blodkreft system-spesifikke grobunn drivere som Mx1-grobunn, VAV-grobunn, og andre 1,2,3,4,5. Disse strategiene krever etablering av nye mus stammer, som kan være tidkrevende og økonomisk belaste. Mens revolusjonerende fremskritt i Genova redigering teknologi har aktivert generering av nye mus stammer i så få som 3-4 måneder med riktig teknisk ekspertise6,7,8,9 , mye mer tid er nødvendig for å forsterke musen kolonien før eksperimenter er forfulgt. I tillegg er disse prosedyrene kostbare. For eksempel, Jackson Laboratory lister gjeldende pris på Knock-Out mus generasjon tjenester på $16 845 per stamme (pr. desember 2018). Derfor er metoder som er mer økonomiske og effektive enn konvensjonelle murine transgene tilnærminger, mer fordelaktige.
Gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic gjentar/CRISPR assosiert protein 9 (CRISPR/Cas9) teknologi har ført til utvikling av nye verktøy for rask og effektiv RNA-baserte, sekvens-spesifikke Genova redigering. Opprinnelig oppdaget som en bakteriell adaptive uimottakelig mekanisme for å ødelegge invaderende patogen DNA, har CRISPR/Cas9 systemet blitt brukt som et verktøy for å øke effektiviteten av Genova redigering i eukaryote celler og dyremodeller. En rekke tilnærminger har vært ansatt for å overføre CRISPR/Cas9 maskiner i blodkreft stamceller (dvs. electroporation, nucleofection, lipofection, viral levering, og andre).
Her er en lentivirus system ansatt for å overfører celler på grunn av sin evne til å effektivt infisere Cas9-uttrykker murine blodkreft stamceller og pakke sammen guiden RNA uttrykket konstruere, arrangører, regulatoriske sekvenser, og gener som koder fluorescerende reporter proteiner (dvs. GFP, RFP). Ved hjelp av denne metoden, ex vivo genredigering av mus blodkreft stamceller har blitt oppnådd, etterfulgt av vellykket rekonstituering av benmarg i drepende bestrålt mus10. Den lentivirus vektoren ansatt for denne studien uttrykker Cas9 og GFP reporter gener fra felles kjernen EF1a promoter med en intern ribosomal oppføring side oppstrøms fra reporteren genet. Guiden RNA sekvensen uttrykkes fra en egen U6 promoter. Dette systemet brukes deretter til å lage innsetting og sletting mutasjoner i kandidaten klonal hematopoiesen driver gener Tet2 og Dnmt3a10. Men Transduction effektiviteten ved denne metoden er relativt lav (~ 5%-10%) på grunn av den store størrelsen på vektoren sette inn (13 KBP) som begrenser Transduction effektivitet og reduserer virus titer under produksjon.
I andre studier har det vist seg at større viral RNA-størrelse negativt påvirker både virus produksjon og Transduction effektivitet. For eksempel, en 1 kb økning i sett inn størrelse rapporteres å redusere virus produksjonen med ~ 50%, og Transduction effektivitet reduseres til mer enn 50% i mus blodkreft stamceller11. Dermed er det en fordel å redusere størrelsen på viral sette inn så mye som mulig for å forbedre effektiviteten av systemet.
Dette brist kan overvinnes ved å ansette Cas9 transgene mus, der Cas9 proteinet er uttrykt i enten en konstituerende eller induserbart måte12. De konstituerende CRISPR/Cas9 knock-in mus uttrykker Cas9 endonuclease og EGFP fra CAG arrangøren på Rosa26 geometriske i en allestedsnærværende måte. Dermed en konstruere med sgRNA under kontroll av U6 promoter og RFP reporter genet under kontroll av kjernen EF1a arrangøren kan leveres ved hjelp av lentivirus vektor å oppnå Genova redigering. Med dette systemet, har gener av blodkreft stamceller blitt redigert, viser en ~ 90% Transduction effektivitet. Dermed gir denne protokollen en rask og effektiv metode for å lage mus der målrettede genmutasjoner er innført i blodkreft systemet. Mens vår Lab er overveiende bruker denne type teknologi for å studere rollen til klonal hematopoiesen i kardiovaskulær sykdom prosesser13,14,15, det er også aktuelt for studier av hematologiske kreft16. Videre kan denne protokollen utvides til analyse av hvordan DNA mutasjoner i HSPC påvirke andre sykdom eller utviklingsmessige prosesser i blodkreft systemet.
Å etablere en robust lentivirus vektor system, høy titer viral aksjer og optimaliserte betingelser for Transduction og transplantasjon av blodkreft celler er nødvendig. I protokollen, instruksjonene er gitt på utarbeidelse av en høy titer viral lager i § 1, optimalisere kultur forholdene i murine blodkreft stamceller i § 2, metoder for benmarg transplantasjon i § 3, og vurdere engraftment i avsnitt 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer innvolvere dyr emner ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) for universitetet av Virginia.
1. generering og rensing av lentivirus partikler
Merk: lentivirus partikler som inneholder den optimaliserte guide RNA kan produseres av de detaljerte protokollene som leveres av Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. Optimaliserte metoder for høy-titer lentivirus forberedelse og lagring er diskutert andre steder17,18. Kort sagt, lentiviruses er produsert av co-transfeksjoner av en lentivirus vektor plasmider, psPAX2, og pMD2. G inn HEK 293T celler. Kultur supernatanten samles på 48 h post-transfeksjoner og konsentrert av ultracentrifugation. Lentiviral titer bestemmes av en kommersielt tilgjengelig qPCR-basert analyse. Denne prosedyren bør utføres i en biosafety klasse II kabinett.
- Forbered en 1:200 løsning av kollagen (0,0005%) i 1x PBS.
- Coat en 6 brønn plate med kollagen løsning og ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for ~ 30 min.
- Seed 293T celler i en tetthet på 1 x 106 celler per brønn og ruge ved 37 ° c, 5% co2 for ~ 2 h.
- For å klargjøre blandingen av tre transfeksjoner plasmider for en brønn, kombinerer du 0,9 μg av lentivirus vektor, 0,6 mikrogram psPAX2 og 0,3 μg av pMD2. G, for så å oppnå et samlet volum på 10 μL ved å tilsette deionisert vann. Juster beløpene tilsvarende avhengig av antall brønner. Mengden og forholdet mellom hver plasmider må være ytterligere optimalisert for å passe behovene til forskerne.
- Tilsett forsiktig 50 μL av 1x PBS og 5 μL av den fortynnede PEI MAX (1,0 mg/mL) til plasmider blanding og ruge i 15 minutter ved romtemperatur (RT) (tabell 1).
- Tilsett 1 mL DMEM til blandingen.
- Aspirer medier fra 6 brønn plate, tilsett 1 mL plasmider blanding, og ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for ~ 3 h.
- Bytt ut mediet med 2 mL fersk DMEM og ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for 24 timer.
- Tilsett 1 mL fersk DMEM og ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for ytterligere 24 timer (total inkubasjonstid er 48 h).
- Overfør kulturen supernatanten til en 50 mL rør og sentrifuger ved 3 000 x g i 15 min for å fjerne eventuelle fri-flytende celler.
- Filtrer supernatanten gjennom et 0,45 μm-filter.
- Overfør Filtrer til sentrifuge rørene i polypropylen.
- Ultracentrifuge ved 4 ° c og 72 100 x g ved rMax for 3 t.
- Forsiktig aspirer supernatanten, etterlot seg bak den hvite pellet.
- Resuspend pellet med 100 μL av serum-fri blodkreft celle ekspansjon medium uten lufting.
- Hold en 10 μL alikvot for å måle viral titer og Oppbevar alle gjenværende alikvoter ved-80 ° c til nødvendig.
- Titrere viruset med en qPCR-basert analyse i henhold til produsentens anvisninger ved bruk av 10 μL viral alikvot.
2. isolering og Transduction av avstamning-negative celler fra mus benmarg (figur 1a)
Merk: Hvis du for eksempel vil isolere nok celler, høstes par med tibias, femurs og humeri fra hver mus. Bekken og spinal bein kan også høstes som en kilde til avstamning-negative celler.
- Isolering av benmargceller
- Euthanize 8-10 uke gammel mannlig CRISPR/Cas9 knock-in mus med 5% isoflurane etterfulgt av cervical forvridning, deretter desinfisere huden med 70% etanol.
- Ved hjelp av dissekere saks, lage en tverrgående snitt i huden rett under brystkasse og skrelle huden distally i begge retninger for å avdekke ben og armer.
- Forsiktig skille de nedre lemmer fra hoftebenet ved dislocating hofteleddet. Skjær langs femur hodet for å fjerne femur helt fra hoften. Dislocate kneet og kutt i leddet for å skille femur og Tibia, samtidig som benet epiphysis intakt. Dislocate ankelen felles og skrelle bort foten og ekstra muskler.
- Ved hjelp av dissekere saks, kuttet over skulderen for å løsne de øvre lemmer. Dislocate skulderen, deretter kuttet i albueleddet å høste humerus benet.
- Bruk cellulose-fiber kluter å forsiktig fjerne musklene fra femurs, tibias, og humeri. Ta ekstra forholdsregler for å sikre at beina ikke brytes under denne prosessen.
- Plasser de isolerte beina i et 50 mL konisk rør som inneholder RPMI, og plasser på is.
Merk: følgende trinn bør utføres i et kabinett i biosafety klasse II. - Overfør beina til en steril, 100 mm kultur rett.
- Ta tak i benet med stump tang, og bruke dissekere saks, forsiktig kuttet begge epifyser.
Merk: en utilstrekkelig skjæring vil føre til en ufullstendig flush av benmargen, mens altfor aggressive skjæring vil føre til celle tap. - Fyll en 10 mL sprøyte med iskald RPMI, og bruk en 22 G nål, skyll benmargen fra skaftet inn i en ny 100 mm kultur rett.
Merk: beina blir hvite og gjennomsiktige hvis Ben akselen har blitt godt spyles. Hvis ikke, re-kutt benet ender og flush igjen. - Etter at alle benmargen er samlet inn, gjør en enkelt celle suspensjon ved å passere benmargen flere ganger gjennom en 10 mL sprøyte med en 18 G nål. Gjenta 10x for å sikre en enkelt celle suspensjon.
- Filter celle suspensjon gjennom en 70 μm celle sil i en 50 mL konisk rør.
- Sentrifuger på 310 x g i 10 min ved 4 ° c.
- Aspirer den supernatanten og resuspend celle pellets i et passende volum av optimalisert separasjon buffer for følgende celle separasjon prosessen.
- Isolering og lentivirus Transduction av avstamning-negative celler
Merk: mus avstamning-negative celler er isolert fra benmargen på Cas9 transgene mus3, eller andre mus stammer, ved hjelp av et linje utladet sett i henhold til produsentens anvisninger. Vanligvis, avstamning-negative celler utgjør 2%-5% av hele benmarg kjerne celler, og renheten er vanligvis større enn 90% etter isolasjon. Den isolerte avstamning-negative celler er kultivert i serum-fri blodkreft celle ekspansjon medium supplert med 20 ng/mL rekombinant murine TPO og 50 ng/mL rekombinant murine SCF, deretter transduced med lentivirus vektor for 16 h på et mangfold av infeksjon (MOI) = 100.- For å isolere avstamning-negative celler, bruk slekts celle nedbrytingen Kit i henhold til produsentens instruksjoner.
- Etter isolasjon resuspend avstamning-negative celler i 1 mL serum-fri blodkreft celle ekspansjon medium.
- Seed cellene i en 6 brønn plate i en tetthet på 1,5 x 106 celler/ml (5 x 105 Lineage-negative celler/mus.)
- Tilsett rekombinant murine TPO og SCF i brønner ved slutt konsentrasjoner på henholdsvis 20 ng/mL og 50 ng/mL.
- Pre-ruge celler ved 37 ° c i 5% CO2 for ~ 2 h.
- Legg til lentivirus ved MOI = 100, 4 μg/mL polybrene, og penicillin/Streptomycin til brønnene og ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for 16-20 h (figur 1B).
- På neste dag, samle lentivirus transduced cellene til en 15 mL konisk rør og sentrifuger på 300 g i 10 min.
- Aspirer forsiktig supernatanten og resuspend pellet i 200 μL av RPMI per mus. Hold cellene på RT inntil transplantasjon til mus (del 3).
3. transplantasjon av transduced celler til drepende bestrålt mus
- På dagen av benmarg transplantasjon, sted mottaker mus i en åtte-Slice Pie bur og utsette dem til to doser av hele kroppen bestråling (550 rad/dose, total dose = 1100 rad), med ca 4 h mellom hver bestråling økt.
- Etter den andre bestråling økten, injisere transduced avstamning-negative celler til hver anesthetized mottaker musen via retro-orbital vene plexus (200 μL totalt) ved hjelp av en insulinsprøyte (figur 1C).
- Etter bestråling, bør mus være plassert i sterilisert bur og utstyrt med en myk diett og drikkevann supplert med antibiotika for 14 d.
- På 3-4 uker etter benmarg transplantasjon, analysere perifert blod for å se etter engraftment av transduced donor celler (§ 4).
4. evaluering av chimerism av perifert blod
- Bedøve mus med 5% isoflurane og få en blodprøve fra en retro-orbital vene ved hjelp av kapillærrør, og samle den inn K2EDTA rør (volumet i en kapillærrøret er tilstrekkelig for følgende analysen).
- Overføring 20 μL av blod fra K2EDTA rør inn i 5 mL rund bunn polystyren test rør, og satt på isen.
- Tilsett 1,5 mL RBC lyse buffer til lyse røde blodlegemer. Ruge i 5 minutter på isen.
- For å nøytralisere lyseringsbufferen, vask prøver med FACS buffer (1,5 mL/Sample).
- Sentrifuger ved 609 x g ved rMax i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten.
- Ruge cellene med en cocktail av monoklonale antistoffer (fortynnet i 100 μL FACS buffer/prøve) ved RT i 20 minutter i mørket. En fullstendig liste over antistoffer er gitt i Material delen ovenfor.
- Vask cellene én gang med FACS-buffer (2 mL/utvalg). Sentrifuger ved 609 x g ved rMax (1 800 RPM) i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten helt.
- Fest cellene med paraformaldehyde som inneholder fikserings buffer (100 μL/tube) i 10 min ved 4 ° c.
- Vask celler én gang med FACS-buffer (3 mL/utvalg). Sentrifuger ved 609 x g ved rMax (1 800 RPM) i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten helt.
- Suspendere pellet i 400 av FACS buffer.
- Oppbevar prøvene ved 4 ° c til analyse ved strømnings flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke ovennevnte protokollen, ca 0.8-1,0 x 108 benmargceller per mus er innhentet. Antall avstamning-negative celler vi får er ca 3 x 106 celler per mus. Vanligvis, avkastningen av benmarg avstamning-negative celler er 4%-5% av det totale benmarg kjernefysiske celler.
Chimerism av transduced celler (RFP-positive) evalueres av strømnings flowcytometri av perifert blod (figur 2a,B). Blod er isolert fra retro-orbital vene og hensiktsmessig markører brukes til å bestemme identiteten til hver blodkreft celle befolkning (dvs. nøytrofile, monocytter, T-celler, etc.) (Figur 3a,B). Genomisk DNA kan isoleres fra RFP-positive blodceller, og deler av målrettede nettstedet DNA kan forsterkes av PCR og subcloned i TA kloning vektorer for sekvens analyse. Disse plasmider er transduced inn i E. coli og målet nettstedet sekvenser bestemmes av sanger sekvensering (Figur 4). Alternativt kan målområde sekvenser bestemmes av andre metoder, for eksempel sanger sekvensering av grupperte Genova etterfulgt av sporing av indeler ved nedbryting (TIDEVANN) analyse10. For kontroll tilstanden er mus vanligvis transplantert med celler som er transduced med en lentivirus som uttrykker ikke-rettet guide RNA.
Figur 1: skjematisk illustrasjon av denne protokollen. (A) isolering av avstamning-negative benmargceller fra Cas9-uttrykker mus (§ 2,1). (B) lentivirus Transduction av avstamning-negative celler (seksjon 2,2). (C) retro-orbital injeksjon av transduced celler i drepende bestrålt vill type mus (del 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: effektiv lentiviral Transduction av mus benmarg avstamning-negative celler in vitro. (A) Flow flowcytometri analyse avslører vellykket Transduction av avstamning-negative celler. Analysen ble utført etter 7 dager i vitro-kulturen. (B) i gjennomsnitt ble 75,7% av cellene transduced i denne analysen (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:rekonstituering av drepende-bestrålt mus benmarg ved transduced avstamning-negative celler. (A) Flow flowcytometri analyse av musen perifere blod følgende rekonstituering av blodkreft stamceller som var (nederst) eller ikke var (øverst) transduced med LENTIVIRUS uttrykke RFP. Nøytrofile er definert som Ly6G+ og Ly6CHi monocytter som Ly6G- og Ly6C+, og B-celler som CD45R+. (B) i disse analysene, et gjennomsnitt på 94,8%, 93,5%, og 82,7% av CELLENE er RFP+ i nøytrofile, Ly6CHi monocytt, og B celle populasjoner, henholdsvis (n = 8). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:evaluering av genredigering i transduced blodceller. (A) eksempel på genredigering som viser resultater fra sekvensering av mutert Dnmt3a-geometrisk i RPF-positive blodceller. Slettinger vises som røde streker, og innsettinger er merket med røde bokstaver. (B) oppsummering av mutasjoner som ble oppdaget. (C) 69% (11/16 kloner) viste ut-av-ramme/prematur stopp mutasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Plasmider | Størrelse (BP) | Beløp per brønn (μg) | Forholdet |
| pLKO 5,0 | 7700 | 0,9 | 2 |
| psPAX2 | 10668 | 0,6 | 1 |
| pMD2. G | 5822 | 0,3 | 1 |
| PEI-Max (lager: 100 mg/mL) | 5 μL/brønn | ||
Tabell 1: mengder plasmider og PEI-Max brukt for transfeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordelen med denne protokollen er etableringen av dyremodeller harboring spesifikke mutasjoner i blodkreft celler i en rask og svært kostnadseffektiv måte sammenlignet med konvensjonelle mus transgene tilnærminger. Det ble funnet at denne metodikken gjør det mulig generering av mus med blodkreft celle gen-manipulasjoner innen 1 måned. Det er flere kritiske trinn i denne protokollen som krever ytterligere vurdering.
Screening av gRNA sekvens
Det anbefales å teste gRNAs in vitro for å vurdere redigering effektivitet før du utfører in vivo eksperimenter. Effektiviteten av gRNAs er testet ved hjelp av en celle-fri in vitro transkripsjon og screening system. Den transkribere gRNA er validert ved å måle effektiviteten ved spalte malen DNA i nærvær av rekombinant Cas9 protein, ved hjelp av agarose gel elektroforese. Kommersielt tilgjengelige sett er tilgjengelig for dette formålet.
Her er indel mutasjoner preget av TA kloning av PCR produkter forsterket fra redigert region, transformere bakterieceller med disse plasmider, og plukke opp individuelle kolonier for sanger sekvensering. Denne metoden er imidlertid arbeidskrevende og tidkrevende. Alternativt kan neste generasjons sekvensering (NGS) eller gruppert DNA-sekvensering etterfulgt av TIDEVANNS analyse utføres19. TIDE-algoritmen ble opprettet for å analysere sanger sekvens spor generert fra komplekse prøver. Det har blitt vist at indel anslag med TIDE er vanligvis i samsvar med de off-målrettede NGS20. Den analytiske programvaren er tilgjengelig på Internett på < http://tide.NKI.nl >.
Generering av høy-titer lentivirus partikler
Viral flytande stomatitt virus G-protein, som er avgjørende for celle infeksjon, er svært pH-sensitive. Dermed er det viktig å holde kulturen medium innenfor en akseptabel pH-område, og det bør ikke utvikle en gulaktig utseende. Kollagen-belagte retter for virus generasjon er ansatt fordi den akselererer vedlegget av HEK293T celler og tillater utførelsen av transfeksjoner i løpet av få timer, i stedet for å vente over natten. Imidlertid, avhenger på eksperimentelle tidsramme, overnight inkubasjons kanne likeledes være betraktet som.
Rensing av lentivirus partikler
For å oppnå effektiv Transduction av blodkreft stamceller, er det nødvendig å generere høy-titer lentivirus. Optimalisering av sentrifugering hastighet er en viktig funksjon. Mens konsentrasjonen av lentivirus er vanligvis utført på 90 000 x g, flere rapporter har vist at virus utvinning øker hvis materialet er sentrifugert på lavere hastighet på 20 000 x g18. Produksjonen av høy-titer lentivirus forberedelser uten ultracentrifugation har også blitt foreslått17. Det bør bemerkes at det er viktig å suspendere viruset sentrifugering pellet mens du unngår kraftig pipettering for å minimere lufting og opprettholde virus integritet. Høy-titer lentivirus partikler er nødvendig for effektiv Transduction av blodkreft stamceller11. Pilot eksperimenter avslørte at en MOI av 100 er optimal med hensyn til Transduction effektivitet og celle levedyktighet. Det anbefales å evaluere lentivirus bestander på grunnlag av celle levedyktighet og Transduction effektivitet.
Lagring av lentivirus partikler
Den lentivirus titer er svært følsom for temperatur, og titer kan drastisk reduseres ved upassende lagringsforhold og gjentatte fryse-tine sykluser. Det har blitt funnet at Transduction effektiviteten av lentivirus avtar raskt når den oppbevares ved 4 ° c [t (1/2) = 1,3 dager] eller utsettes for flere fryse-tine sykluser [t (1/2) = 1,1 runder]. Det anbefales at viruset forberedelsene være snap-frosset i flytende nitrogen eller knust tørr is kort tid etter at viruset pellet er suspendert. Viral bestandene bør opprettholdes ved-80 ° c og tint på isen til RT like før likevekts og bruk11.
Flere mulige begrensninger bør bemerkes. Først innføringen av off-målet indel mutasjoner av CRISPR/Cas9 har lenge vært verdsatt. Det har også vist seg at CRISPR/Cas9 kan indusere av-mål mutasjoner i vivo21. I praksis kan off-målet indel mutasjoner unngås ved hjelp av gRNA sekvenser som er nært matchet til målet Genova nettsteder og har mer enn fire uoverensstemmelser til spådd sekundære nettsteder. Slike design kan gjøres med eksisterende i silisiummangan verktøy22. Andre beregningsverktøy for å forutsi gRNA med minimerte handlinger utenfor mål er tilgjengelige (< http://Portals.broadinstitute.org/GPP/Public/Analysis-Tools/sgrna-design > eller < http://www.Benchling.com >). Det kan også være fordelaktig å analysere en dyremodell ved hjelp av to eller flere forskjellige gRNAs for å bekrefte fenotype og minimere muligheten for at den observerte fenotype er formidlet av et off-Target effekt av en bestemt gRNA.
I tillegg til konvensjonelle indel mutasjoner opprettet av CRISPR/Cas9, større slettinger som strekker seg utover kilobases har blitt rapportert. Dette kan forvirre studier; Imidlertid, dem større slettinger er rapportere å bli mange lavere hyppigheten sammenlignet med indeler23. Et annet potensielt problem er genetisk kompensasjon. Det har blitt rapportert at mutant RNA med en prematur oppsigelse Codon (PTC) kan resultere i oppregulering av beslektede gener med sekvens likhet med kompass kompleks-mediert aktivering av transkripsjon24,25. Denne hendelsen har blitt foreslått å være en mekanisme som kan føre til fenotypiske forskjeller mellom knock-out og knockdown tilnærminger av genet ablasjon. Fordi CRISPR/Cas9-mediert Genova redigering tungt avhengig av Stokastisk innføring av ramme-Shift mutasjoner som fører til generering av PTC, genetisk kompensasjon kan endre fenotype. For å unngå genetisk kompensasjon, kan eksperimenter betraktes som et gen regulatoriske sekvenser er målrettet av CRISPR/Cas9 eller ved innføring av epigenetic bestemmelsesord bruker Cas9 som en RNA-guidede DNA anerkjennelse plattform.
Til slutt bør det være erkjent at hematopoiesen fra celler engrafted til drepende-bestrålt mus kan avvike fra de innfødte forholdene i hematopoiesen. Videre kan bestråling ha systemiske effekter på organismen som kan forvirre tolkning av eksperimenter undersøke konsekvensene genet mutasjoner i blodkreft celler.
Forskere har utnyttet katalytisk inaktive Cas9 (dCas9) proteiner som en "RNA-guidede DNA anerkjennelse plattform" og brukte dCas9 Fusion proteiner å lokalisere effektor domener til bestemte DNA-sekvenser til enten undertrykke (CRISPRi) eller aktivere (CRISPRa) transkripsjon off-Target gener26,27. Selv om denne protokollen bruker katalytisk aktive Cas9 transgene mus for å innføre dsDNA kløft i genomisk DNA-sekvens, er epigenetic modifisering av undertrykke eller aktivering av spesifikke gener tilgjengelig ved å smelte dCas9 med kromatin endrings domener som dCas9-KRAB eller dCas9-VP64, henholdsvis. Alternativt kan dCas9 brukes som en transcriptional hemmende som sin egen, ved å blokkere transcriptional maskineri for å få tilgang til genet nettstedet27. Mer nylig, Zhou et al. etablerte dCas9-SunTag-P65-HSF1 (SPH) transgene mus som uttrykker en modifisert versjon av en epigenetic aktivator smeltet sammen med dCas9 og viste at dette CRISPRa systemet fungerer i vivo28.
Vår Lab hovedsakelig bruker denne teknologien til å studere rollen som klonal hematopoiesen i hjerte-og karsykdommer prosesser. I voksende vev, somatiske mutasjoner i kreft driver gener kan konferere en mobilnettet vekst fordel og føre til avvikende klonal utvidelser. I blodkreft system, denne prosessen er kjent som "klonal hematopoiesen", og det resulterer i situasjoner der en betydelig brøkdel av en persons leukocytter er erstattet av mutant kloner. Det er en økende takknemlighet som avvikende klonal utvidelser akselerere kardiovaskulær sykdom, slik som aterosklerose og hjertesvikt, og bidra til sykelighet og all årsak dødelighet15,29.
Nylig har en årsakssammenheng mellom flere av disse somatiske mutasjoner og hjerte-og karsykdommer blitt dokumentert, og aspekter av de underliggende mekanismene har blitt belyst10,13,14. Men disse somatiske mutasjoner representerer trolig "toppen av isfjellet", som Epidemiologiske studier har vist at mange flere kandidat gener er forbundet med klonal hematopoiesen og potensielt økt kardiovaskulær sykdom dødelighet. Dermed kreves en systematisk, høyere gjennomstrømnings evaluering av klonal hematopoiesen driver gener. Gjeldende studier av årsakssammenheng av klonal hematopoiesen og kardiovaskulær sykdom er basert på analyse av mus med blodkreft systemspesifikk betinget transgene (Mx1-grobunn, VAV-grobunn, etc.) eller mus etter benmarg transplantasjon. Disse strategiene, men må etablere nye muse kolonier og kan bli en finansiell og fysisk byrde for forskere. Dermed er en billigere og mer rask metode enn den konvensjonelle murine transgene/Knock-Out tilnærming ansatt i fortiden er berettiget. Lentiviral vektorer for å overfører HSPC og CRISPR teknologier til ingeniør mutasjoner, som beskrevet i dette manuskriptet, Letter studiet av klonal hematopoiesen og kardiovaskulær sykdom.
I tillegg til å generere konvensjonelle Knock-Out geometrisk, er denne metoden gjelder for produksjon av avkortet muterte proteiner. For eksempel har forskerne lykkes generert en blodkreft-Ppm1d avkorting, som ofte sett hos pasienter med klonal hematopoiesen, ved å innføre frameshift mutasjoner med en gRNA målretting ekson 6 av Ppm1d genet30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
S. S. ble støttet av en American Heart Association postdoktor Fellowship 17POST33670076. K. W. ble støttet av NIH tilskudd R01 HL138014, R01 HL141256, og R01 HL139819.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim injection | TEVA | 0703-9526-01 | |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216-- | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
