Summary
Beschreven zijn protocollen voor de zeer efficiënte genoom bewerking van muriene hematopoietische stam en voorlopercellen (HSPC) door het CRISPR/Cas9-systeem om snel muismodel systemen te ontwikkelen met hematopoietische systeemspecifieke genmodificaties.
Abstract
Het manipuleren van genen in hematopoietische stamcellen met conventionele Transgenese benaderingen kan tijdrovend, duur en uitdagend zijn. Met het voordeel van de vooruitgang in de genoom Editing technologie en lentivirusgemedieerde transgen toedieningssystemen, wordt hier een efficiënte en economische methode beschreven die muizen vastlegt waarin genen specifiek worden gemanipuleerd in hematopoietische stamcellen. Lentivirussen worden gebruikt om Cas9-uitverkorende Lineage-negatieve beenmergcellen te leiden met een RNA-gelei (gRNA) gericht op specifieke genen en een rood fluorescentie reporter-gen (RFP), waarna deze cellen worden getransplanteerd in dodelijk bestraalde C57BL/6 muizen. Muizen die worden getransplanteerd met lentivirus die niet-gerichte gRNA uitdrukken, worden gebruikt als besturingselementen. Engraftment van getransduceerde hematopoietische stamcellen wordt geëvalueerd door flowcytometrische analyse van RFP-positieve leukocyten van perifeer bloed. Met behulp van deze methode, ~ 90% transductie van myeloïde cellen en ~ 70% van lymfoïde cellen na 4 weken na transplantatie kan worden bereikt. Genomisch DNA is geïsoleerd van RFP-positieve bloedcellen, en delen van het doelwit van het DNA van de site worden versterkt door PCR om de genoom bewerking te valideren. Dit protocol biedt een evaluatie van de hoge doorvoer van Hematopoiesis-regelgevende genen en kan worden uitgebreid naar een verscheidenheid van muis ziekte modellen met hematopoietische celbetrokkenheid.
Introduction
Veel studies in hematologie en immunologie vertrouwen op de beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muizen, met inbegrip van conventionele en voorwaardelijke transgene/knock-out muizen die gebruik maken van hematopoietische systeemspecifieke CRE drivers zoals Mxcre, vav-CRE, en anderen 1,2,3,4,5. Deze strategieën vereisen de oprichting van nieuwe muis stammen, die tijdrovend en financieel belastend kunnen zijn. Terwijl revolutionaire ontwikkelingen in de genoom Editing technologie het genereren van nieuwe muis stammen in slechts 3-4 maanden mogelijk hebben gemaakt met de juiste technische expertise6,7,8,9 , veel meer tijd is nodig om de muis kolonie te versterken voordat experimenten worden nagestreefd. Bovendien zijn deze procedures kostbaar. Bijvoorbeeld, Jackson laboratorium vermeldt de huidige prijs van knock-out mice generatie diensten op $16.845 per stam (vanaf december 2018). Daarom zijn methodes die zuiniger en efficiënter zijn dan conventionele Murine transgene benaderingen voordeliger.
Geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR geassocieerde proteïne 9 (CRISPR/Cas9) technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van nieuwe tools voor snelle en efficiënte RNA-gebaseerde, sequentie-specifieke genoom bewerking. Oorspronkelijk ontdekt als een bacteriële adaptieve immuun mechanisme om het binnenvallende pathogeen DNA te vernietigen, is het CRISPR/Cas9 systeem gebruikt als een instrument om de effectiviteit van genoom bewerking in eukaryote cellen en diermodellen te verhogen. Er zijn een aantal benaderingen toegepast om CRISPR/Cas9-machines te verzenden naar hematopoietische stamcellen (d.w.z. elektroporatie, nucleofectie, lipofectie, virale levering en andere).
Hier wordt een lentivirussysteem gebruikt om cellen te leiden als gevolg van zijn vermogen om de Cas9-uitzinnige muriene hematopoietische stamcellen effectief te infecteren en samen de RNA-expressie constructie, promoters, regelgevings sequenties en genen die coderen fluorescerende reporter eiwitten (d.w.z. GFP, RFP). Met behulp van deze methode is ex vivo genbewerking van hematopoietische stamcellen van de muis bereikt, gevolgd door een succesvolle reconstitutie van het beenmerg in dodelijk bestraalde muizen10. De lentivirus vector die voor deze studie wordt gebruikt, toont de Cas9 en GFP reporter genen van de common core EF1a Promoter met een interne ribosomale intrede site stroomopwaarts van het reporter gen. De gids RNA-sequentie wordt uitgedrukt uit een afzonderlijke U6-promotor. Dit systeem wordt vervolgens gebruikt voor het maken van inbrengen en verwijderen mutaties in de kandidaat klonale Hematopoiesis bestuurder genen Tet2 en Dnmt3a10. Echter, de transductie-efficiëntie door deze methode is relatief laag (~ 5%-10%) door het grote formaat van de vector insert (13 KBP) die de transductie-efficiëntie beperkt en de virus titer vermindert tijdens de productie.
In andere studies, het is aangetoond dat grotere virale RNA grootte negatief beïnvloedt zowel de virus productie en transductie efficiëntie. Bijvoorbeeld, een toename van 1 KB in wisselplaatgrootte wordt gerapporteerd aan de virus productie te verlagen door ~ 50%, en transductie-efficiëntie zal afnemen tot meer dan 50% in de muis hematopoietische stamcellen11. Het is dus voordelig om de grootte van de virale insert zoveel mogelijk te verminderen om de efficiëntie van het systeem te verbeteren.
Deze tekortkoming kan worden overwonnen door het gebruik van Cas9 transgene muizen, waarbij het Cas9-eiwit wordt uitgedrukt in een constitutieve of niet-industriële manier12. De constitutieve CRISPR/Cas9 knock-in muizen drukt Cas9 endonuclease en EGFP uit van de CAG-promotor op de Rosa26 locus op een alomtegenwoordige manier. Zo kan een constructie met sgRNA onder controle van de promotor en RFP reporter gene onder de controle van de core EF1a promotor worden geleverd met behulp van de lentivirus vector om genoom bewerking te bereiken. Met dit systeem, de genen van hematopoietische stamcellen zijn met succes bewerkt, tonen een ~ 90% transductie efficiëntie. Dit protocol biedt dus een snelle en effectieve methode om muizen te creëren waarin gerichte genmutaties in het hematopoietische systeem worden geïntroduceerd. Terwijl ons lab is voornamelijk met behulp van dit soort technologie te bestuderen van de rol van van klonen Hematopoiesis bij cardiovasculaire ziekteprocessen13,14,15, het is ook van toepassing op studies van hematologische maligniteiten16. Bovendien kan dit protocol worden uitgebreid tot de analyse van de invloed van DNA-mutaties in HSPC op andere ziekte-of ontwikkelingsprocessen in het hematopoietische systeem.
Om een robuust lentivirus vector systeem te vestigen, zijn hoge titer virale voorraden en geoptimaliseerde omstandigheden voor de transductie en transplantatie van hematopoietische cellen vereist. In het protocol worden instructies gegeven over de bereiding van een hoog titer-virale bestanddeel in rubriek 1, waarbij de cultuuromstandigheden van de erytrocyten hematopoietische stamcellen in rubriek 2, de methoden voor beenmergtransplantatie in rubriek 3, worden geëvalueerd en engraftment in rubriek 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot dierproef personen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Virginia.
1. opwekking en zuivering van lentivirusdeeltjes
Opmerking: Lentivirusdeeltjes met de geoptimaliseerde handleiding RNA kunnen worden geproduceerd door de gedetailleerde protocollen die door Addgene: < https://media.addgene.org/cms/files/Zhang_lab_LentiCRISPR_library_protocol.pdf) >. De geoptimaliseerde methoden voor de bereiding en opslag van hoogtiter lentivirus worden elders besproken17,18. In het kort, linvirussen worden geproduceerd door co-transfectie van een lentivirus vector plasmide, psPAX2, en pMD2. G in HEK 293T cellen. Cultuur supernatant wordt verzameld op 48 h post-transfectie en geconcentreerd door ultracentrifugatie. Lentivirale titer wordt bepaald door een in de handel verkrijgbare test op basis van qPCR. Deze procedure moet worden uitgevoerd in een bioveiligheid-klasse II-kast.
- Bereid een 1:200-oplossing van collageen (0,0005%) in 1x PBS.
- Jas een 6 goed bord met collageen oplossing en incuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor ~ 30 min.
- Zaad 293T cellen met een dichtheid van 1 x 106 cellen per put en incuberen bij 37 °c, 5% Co2 voor ~ 2 h.
- Om het mengsel van drie transfectie plasmiden voor een put voor te bereiden, combineer 0,9 μg lentivirusvector, 0,6 μg psPAX2 en 0,3 μg pMD2. G, dan een totaal volume van 10 μL te bereiken door toevoeging van gedeïoniseerd water. Pas de bedragen dienovereenkomstig aan, afhankelijk van het aantal putten. De hoeveelheid en de ratio van elk plasmide moet mogelijk verder worden geoptimaliseerd om aan de behoeften van de onderzoekers te voldoen.
- Voeg voorzichtig 50 μL van 1x PBS en 5 μL van de verdunde PEI MAX (1,0 mg/mL) toe aan het plasmide mengsel en incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) (tabel 1).
- Voeg 1 mL DMEM toe aan het mengsel.
- Aspirate media uit de 6 goed plaat, voeg 1 mL plasmide mengsel, en incuberen bij 37 ° c, 5% CO2 voor ~ 3 h.
- Vervang de media door 2 ml verse DMEM en Incubeer bij 37 °c, 5% Co2 voor 24 uur.
- Voeg 1 mL verse DMEM toe en incuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor een extra 24 uur (totale incubatietijd is 48 uur).
- Breng de kweek supernatant over naar een buis van 50 mL en centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 15 minuten om vrije zwevende cellen te verwijderen.
- Filtreer de supernatant door een 0,45 μm filter.
- Breng het filtraat over in polypropyleen centrifugebuizen.
- Ultracentrifuge bij 4 °C en 72.100 x g bij rMax voor 3 uur.
- Zuig de supernatant voorzichtig op en laat de witte pellet achter.
- Respendeer de pellet met 100 μL serumvrij hematopoietische celuitbreidingsmedium zonder beluchting.
- Houd een aliquot van 10 μL om de virale titer te meten en bewaar alle overgebleven aliquots bij-80 °C tot dat nodig is.
- Titeer het virus met een qPCR-gebaseerde test volgens de instructies van de fabrikant met behulp van de 10 μL virale aliquot.
2. isolatie en transductie van Lineage-negatieve cellen uit het beenmerg van de muis (Figuur 1a)
Opmerking: om voldoende cellen te isoleren, worden paren van tibias, femurs en humeri van elke muis geoogst. Bekken-en spinale botten kunnen ook worden geoogst als een bron van Lineage-negatieve cellen.
- Isolatie van beenmergcellen
- Euthanize 8-10 week oude mannelijke crispr/Cas9 knock-in muizen door 5% Isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie, desinfecteren hun huid met 70% ethanol.
- Met behulp van ontleden schaar, maak een dwarse incisie in de huid net onder de ribbenkast en schil de huid in beide richtingen in een distale richting om de benen en armen bloot te leggen.
- Scheid de onderste ledematen voorzichtig van het heupbeen door het heupgewricht te ontlokaliseren. Snijd langs de dijbeen kop om het dijbeen volledig uit de heup te verwijderen. Ontwer de knie en snijd op het gewricht om het dijbeen en de Tibia te scheiden, terwijl het bot Epifyse intact blijft. Ontwer het enkelgewricht en Pel de voet en extra spieren weg.
- Met behulp van ontleden schaar, over de schouder te snijden om de bovenste ledematen los te maken. Ontwer de schouder en snijd vervolgens op het ellebooggewricht om het opperarmbeen-bot te oogsten.
- Gebruik cellulose-Fiber doekjes om de spieren van de femurs, tibias en humeri voorzichtig te verwijderen. Neem extra voorzorgsmaatregelen om ervoor te zorgen dat de botten niet breken tijdens dit proces.
- Plaats de geïsoleerde botten in een conische buis van 50 mL die RPMI bevat en plaats op ijs.
Opmerking: de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheid-klasse II-kast. - Breng de botten over in een steriel, 100 mm kweekbakje.
- Pak het bot met stompe Tang en gebruik de ontleed schaar en snijd beide epifyses zorgvuldig.
Opmerking: een ontoereikende snede zal leiden tot een onvolledige spoeling van beenmerg, terwijl overmatig agressief snijden zal resulteren in celverlies. - Vul een injectiespuit van 10 mL met ijskoude RPMI en gebruik een naald van 22 G om het beenmerg van de as in een nieuw kweekbakje van 100 mm te spoelen.
Opmerking: botten worden wit en doorschijnend als de botschacht goed is gespoeld. Zo niet, dan wordt het uiteinde van het bot opnieuw afgesneden en weer verzonken. - Nadat al het beenmerg is verzameld, maak een eencellige suspensie door het beenmerg meerdere malen door te geven door middel van een 10 mL spuit met een 18 G naald. Herhaal 10x om een eencellige suspensie te garanderen.
- Filter celsuspensie door een 70 μm celzeef in een conische buis van 50 mL.
- Centrifugeer bij 310 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c.
- Zuig de supernatant op en hervat de celpellets in een geschikt volume van geoptimaliseerde scheidings buffer voor het volgende celscheidings proces.
- Isolatie en lentivirustransductie van Lineage-negatieve cellen
Opmerking: muis Lineage-negatieve cellen worden geïsoleerd uit het beenmerg van Cas9 transgene muizen3, of andere stammen van muizen, met behulp van een lineage depletie-Kit volgens de instructies van de fabrikant. Typisch, lineage-negatieve cellen rekening voor 2%-5% van de gehele beenmerg nucleated cellen, en de zuiverheid is meestal groter dan 90% na isolatie. De geïsoleerde Lineage-negatieve cellen zijn gekweekt in serum-vrij hematopoietische celuitbreidingsmedium aangevuld met 20 ng/mL recombinant Murine TPO en 50 ng/mL recombinant Murine SCF, vervolgens getransduceerde met de lentivirus vector voor 16 h bij een veelheid van infectie (MOI) = 100.- Om Lineage-negatieve cellen te isoleren, gebruikt u de Lineage Cell depletie Kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Na isolatie respendeert de Lineage-negatieve cellen in 1 mL serumvrij hematopoietische celuitbreidingsmedium.
- Zaai de cellen in een 6-put plaat met een dichtheid van 1,5 x 106 cellen/ml (5 x 105 Lineage-negatieve cellen/muis.)
- Voeg recombinant Murine TPO en SCF toe aan putjes in de uiteindelijke concentraties van respectievelijk 20 ng/mL en 50 ng/mL.
- Pre-Incubate cellen bij 37 °C in 5% CO2 voor ~ 2 h.
- Voeg lentivirus toe aan MOI = 100, 4 μg/mL poly Brene, en penicillaire/streptomycine in de putjes en inincuberen bij 37 °C, 5% CO2 voor 16-20 u (Figuur 1b).
- Verzamel de volgende dag de lentivirus getransduceerde cellen in een conische buis van 15 mL en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 g.
- Zuig de supernatant voorzichtig op en breng de pellet in 200 μL RPMI per muis. Houd de cellen op RT tot transplantatie in muizen (rubriek 3).
3. transplantatie van getransduceerde cellen in dodelijk bestraalde muizen
- Plaats de ontvangende muizen op de dag van beenmergtransplantatie in een cirkel kooi met acht segmenten en stel ze bloot aan twee doses van hele lichaams bestraling (550 rad/dosis, totale dosis = 1100 RAD), met ongeveer 4 uur tussen elke bestraling.
- Injecteer na de tweede bestraling, met behulp van een insulinespuit (figuur 1c), de getransiteerde Lineage-negatieve cellen naar elke ontvanger van de verdoofd Mouse via de retroorbitale ader plexus (in totaal 200 μL).
- Na bestraling moeten muizen in gesteriliseerde kooien worden ondergebracht en voorzien van een zachte voeding en drinkwater, aangevuld met antibiotica voor 14 d.
- Bij 3-4 weken na beenmergtransplantatie, analyseren van perifeer bloed om te controleren op de engraftment van getransduceerde donor cellen (rubriek 4).
4. evaluatie van het chimerisme van perifeer bloed
- Anesthetiseer muizen met 5% Isofluraan en verkrijgen een bloedmonster uit een retro-orbitale ader met behulp van capillaire buizen, en verzamelen het in K2EDTA-buizen (het volume in één capillaire buis volstaat voor de volgende bepaling).
- Breng 20 μL bloed uit de K2EDTA buisjes in de ronde onderste polystyreen buisjes van 5 mL en zet op ijs.
- Voeg 1,5 mL RBC lysisbuffer toe aan lyse rode bloedcellen. Inbroed voor 5 min op ijs.
- Om de lysisbuffer te neutraliseren, moet u samples met FACS buffer (1,5 mL/sample) wassen.
- Centrifugeer op 609 x g bij rMax gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg.
- Incuberen de cellen met een cocktail van monoklonale antilichamen (verdund in 100 μL FACS buffer/sample) bij RT gedurende 20 minuten in het donker. Een volledige lijst van antilichamen wordt gegeven in de sectie materialen hierboven.
- Was de cellen eenmaal met FACS buffer (2 mL/sample). Centrifugeer op 609 x g bij rMax (1.800 rpm) gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant volledig weg.
- Fixeer de cellen met Paraformaldehyde bevattende fixatie buffer (100 μL/buis) gedurende 10 min bij 4 °C.
- Was de cellen eenmaal met een FACS buffer (3 mL/sample). Centrifugeer op 609 x g bij rMax (1.800 rpm) gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant volledig weg.
- Suspendeer de pellet in 400 μL FACS buffer.
- Houd de monsters bij 4 °C tot analyse doorstroming cytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het hierboven beschreven protocol zijn ongeveer 0,8-1,0 x 108 beenmergcellen per muis verkregen. Het aantal Lineage-negatieve cellen die we verkrijgen is ongeveer 3 x 106 cellen per muis. Typisch, de opbrengst van beenmerg Lineage-negatieve cellen is 4%-5% van die van totale beenmerg kern cellen.
Het chimerisme van getransduceerde cellen (RFP-positief) wordt geëvalueerd door Flowcytometrie van het perifere bloed (Figuur 2a,B). Bloed wordt geïsoleerd uit de retro-orbitale ader en geschikte markers worden gebruikt om de identiteit van elke hematopoietische celpopulatie te bepalen (d.w.z. neutrofielen, monocyten, T-cellen, enz.) (Figuur 3a,B). Genomisch DNA kan worden geïsoleerd uit RFP-positieve bloedcellen, en secties van het doelwit van de site DNA kunnen worden versterkt door PCR en subgekloond in TA klonen vectoren voor sequentieanalyse. Deze plasmiden worden in E. coli opgenomen en de sequenties van de doellocatie worden bepaald door de Sanger-sequencing (Figuur 4). Als alternatief kunnen sequenties van de doelsite worden bepaald door andere methoden, zoals Sanger-sequencing van het gepoolde genoom gevolgd door het volgen van indels door ontleding (TIDE) analyse10. Voor de controle voorwaarde worden muizen meestal getransplanteerd met cellen die zijn getransducteerd met een lentivirus die niet-gerichte gelei-RNA uitdrukt.
Figuur 1: Schematische illustratie van dit protocol. a ) isolatie van Lineage-negatieve beenmergcellen van Cas9-uitdrukkelijke muizen (punt 2,1). B) linvirustransductie van Lineage-negatieve cellen (punt 2,2). C) retro-orbitale injectie van getransduceerde cellen in dodelijk bestraald wild type muizen (rubriek 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: efficiënte linvirale transductie van muis beenmerg Lineage-negatieve cellen in vitro. (A) flow cytometrie analyse onthult succesvolle transductie van Lineage-negatieve cellen. Analyse werd uitgevoerd na 7 dagen in vitro cultuur. (B) gemiddeld werd 75,7% van de cellen in deze test (n = 3) op een getransduceerde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3:reconstitutie van dodelijk-bestraald muis beenmerg door getransduceerde Lineage-negatieve cellen. A) Flowcytometrie analyse van het perifere bloed van de muis na reconstitutie door hematopoietische stamcellen die (onder) waren of niet (boven) zijn weergegeven met lentivirus die RFP uitsprak. Neutrofielen worden gedefinieerd als Ly6G+ en Ly6CHi monocyten als Ly6G- en Ly6C+, en B-cellen als CD45R+. B) in deze assays zijn gemiddeld 94,8%, 93,5% en 82,7% van de cellen RFP+ in de neutrofiele, Ly6CHi monocyte en B celpopulaties, respectievelijk (n = 8). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4:evaluatie van het bewerken van genen in getransduceerde bloedcellen. (A) voorbeeld van genbewerking met de sequentie resultaten van gemuleerde Dnmt3a Locus in RPF-positieve bloedcellen. Verwijderingen worden weergegeven als rode streepjes en inserties worden aangeduid met rode letters. B) samenvatting van de geconstateerde mutaties. C) 69% (11/16 klonen) vertoonde out-of-frame/premature stop mutaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Plasmide | Grootte (BP) | Bedrag per put (μg) | Verhouding |
| pLKO 5.0 | 7700 | 0,9 | 2 |
| psPAX2 | 10668 | 0,6 | 1 |
| pMD2. G | 5822 | 0,3 | 1 |
| PEI-Max (voorraad: 100 mg/mL) | 5 μL/goed | ||
Tabel 1: hoeveelheden plasmide en PEI-Max gebruikt voor Transfectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het voordeel van dit protocol is de creatie van diermodellen die specifieke mutaties in hematopoietische cellen in een snelle en zeer kosteneffectieve manier verteren in vergelijking met conventionele muis transgene benaderingen. Bleek dat deze methodologie maakt het genereren van muizen met hematopoietische cel gen-manipulaties binnen 1 maand. Er zijn verschillende kritieke stappen in dit protocol die verder moeten worden overwogen.
Screening van de gRNA-sequentie
Het wordt aanbevolen om de gRNAs in vitro te testen om de bewerkings efficiëntie te beoordelen voorafgaand aan de uitvoering in vivo experimenten. De efficiëntie van gRNAs wordt getest met behulp van een cel-vrij in vitro transcriptie en screeningsysteem. De getranscribeerde grna wordt gevalideerd door het meten van de efficiëntie bij het klieft van het template DNA in de aanwezigheid van recombinant Cas9 eiwit, met behulp van agarose gel elektroforese. Voor dit doel zijn er commercieel verkrijgbare kits beschikbaar.
Hier worden Indel-mutaties gekenmerkt door het TA-klonen van PCR-producten versterkt uit bewerkte regio, het transformeren van bacteriële cellen met die plasmiden en het oppakken van individuele kolonies voor Sanger-sequencing. Deze methode is echter omslachtige en tijdrovend. Als alternatief kunnen de volgende generatie sequencing (NGS) of gegroepeerde DNA-sequencing gevolgd door getij analyse19worden uitgevoerd. Het getij algoritme is gemaakt om Sanger sequentie traceringen gegenereerd uit complexe samples te analyseren. Het is aangetoond dat Indel schattingen met getij doorgaans consistent zijn met die van niet-gerichte NGS20. De analytische software is online beschikbaar op < http://Tide.NKI.nl >.
Genereren van hoogtiter lentivirusdeeltjes
Het virale vesiculaire stomatitis-virus G-eiwit, dat essentieel is voor celinfectie, is zeer pH-gevoelig. Het is dus belangrijk om het cultuurmedium binnen een aanvaardbaar pH-bereik te houden en het mag geen gelig uiterlijk ontwikkelen. Collageen-gecoate gerechten voor het genereren van virussen worden gebruikt omdat het de hechting van HEK293T cellen versnelt en de prestaties van transfectie binnen een paar uur toestaat, in plaats van 's nachts te wachten. Afhankelijk van het experimentele schema kan er echter ook een nachtelijke incubatie worden overwogen.
Zuivering van lentivirusdeeltjes
Om een efficiënte transductie van hematopoietische stamcellen te bereiken, is het noodzakelijk om hoogtiter lentivirus te genereren. Optimalisatie van de centrifugeersnelheid is een belangrijk kenmerk. Terwijl de concentratie van lentivirus wordt meestal uitgevoerd op 90.000 x g, verschillende rapporten hebben aangetoond dat virus herstel toeneemt als het materiaal wordt gecentrifugeerd bij de lagere snelheid van 20.000 x g18. De productie van een hoogtiter lentivirus voorbereiding zonder ultracentrifugatie is ook voorgesteld17. Opgemerkt moet worden dat het belangrijk is om de virus centrifugeren pellet op te schorten en tegelijkertijd een krachtige Pipetteer tijd te vermijden om de beluchting te minimaliseren en de virus integriteit te behouden. Hoogtiter lentivirus deeltjes zijn nodig voor een efficiënte transductie van hematopoietische stamcellen11. Pilot experimenten onthulde dat een MOI van 100 optimaal is met betrekking tot de transductie-efficiëntie en de levensvatbaarheid van de cel. Het wordt aanbevolen om lentivirus bestanden te evalueren op basis van de levensvatbaarheid van de cellen en de transductie-efficiëntie.
Opslag van lentivirusdeeltjes
De lentivirus titer is zeer gevoelig voor temperatuur en de titer kan drastisch worden verminderd door ongeschikte opslagcondities en herhaalde vries dooi cycli. Het is gebleken dat de transductie-efficiëntie van lentivirus snel afneemt wanneer het wordt bewaard bij 4 °C [t (1/2) = 1,3 dagen] of onderworpen aan meervoudige vries-dooi cycli [t (1/2) = 1,1 rondes]. Het wordt aanbevolen om de virus preparaten in te vriezen in vloeibare stikstof of gemalen droogijs kort nadat de virus pellet is geschorst. De virale voorraden moeten worden gehandhaafd op-80 °C en ontdooid op het ijs tot RT net vóór de equilibratie en gebruik11.
Er moeten verschillende mogelijke beperkingen worden vastgesteld. Ten eerste wordt de introductie van off-target Indel-mutaties door CRISPR/Cas9 al heel lang gewaardeerd. Het is ook aangetoond dat CRISPR/Cas9 in vivo21kan leiden tot afwijkend mutaties. In de praktijk, off-target Indel mutaties kunnen worden vermeden door het gebruik van gRNA sequenties die nauw zijn afgestemd op doel genoom sites en hebben meer dan vier mismatches aan voorspelde secundaire sites. Een dergelijk ontwerp kan worden gedaan met bestaande in silico tools22. Andere rekenkundige tools om gRNA te voorspellen met geminimaliseerde off-target acties zijn beschikbaar (< http://portals.broadinstitute.org/gpp/Public/Analysis-Tools/sgrna-Design > of < http://www.Benchling.com >). Het kan ook nuttig zijn om een diermodel te analyseren met behulp van twee of meer verschillende Grna's om het fenotype te bevestigen en de kans te minimaliseren dat het waargenomen fenotype wordt gemedieerd door een niet-doel effect van een specifieke gRNA.
Naast conventionele Indel-mutaties die door CRISPR/Cas9 zijn gecreëerd, zijn grotere verwijderingen die verder reiken dan kilobasissen gerapporteerd. Dit kan worden gevonden studies; echter, die grotere verwijderingen worden gerapporteerd aan veel lagere frequentie in vergelijking met indels23. Een ander potentieel probleem is de genetische compensatie. Er is gemeld dat Mutant RNA met een voortijdige beëindiging codon (PTC) kan resulteren in de opregulatie van verwante genen met sequentie gelijkenis met Compass complex-gemedieerde activering van transcriptie24,25. Dit voorval is gesuggereerd als een mechanisme dat kan leiden tot fenotypische verschillen tussen knock-out en knockdown benaderingen van genablatie. Omdat CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerking sterk afhankelijk is van stochastische introductie van frame-Shift mutaties die leiden tot de generatie van PTC, kan genetische compensatie het fenotype wijzigen. Om genetische compensatie te voorkomen, kunnen experimenten worden overwogen waarbij de regelgevings sequenties van een gen worden getarget door CRISPR/Cas9 of door de introductie van epigenetische modificatoren die Cas9 gebruiken als een RNA-geleide DNA-herkennings platform.
Ten slotte moet worden erkend dat hematopoiese uit cellen die in dodelijk bestraalde muizen worden geënt, kunnen afwijken van de inheemse voorwaarden van hematopoiese. Bovendien kan bestraling systemische effecten hebben op het organisme die de interpretatie van experimenten die de gevolgen van genmutaties in hematopoietische cellen onderzoeken, kunnen verwoorden.
Onderzoekers hebben gebruik gemaakt van katalytisch inactieve Cas9 (dCas9) eiwitten als een "RNA-geleide DNA-herkennings platform" en gebruikten dCas9 fusie-eiwitten om Effector domeinen te lokaliseren naar specifieke DNA-sequenties om ofwel te onderdrukken (CRISPRi) of activeren (CRISPRa) transcriptie off-target genen26,27. Hoewel dit protocol katalytisch actieve Cas9 transgene muizen gebruikt om dsDNA-decolleté in genomische DNA-sequentie te introduceren, is epigenetische modificatie om specifieke genen te onderdrukken of te activeren van toepassing door dCas9 te gebruiken met chromatine-Verander domeinen, zoals dCas9-KRAB of dCas9-VP64, respectievelijk. Als alternatief kan dCas9 worden gebruikt als een transcriptionele onderdrukker als eigen, door het blokkeren van transcriptionele machines om toegang te krijgen tot de gensite27. Meer recentelijk, Zhou et al. opgericht dCas9-SunTag-p65-HSF1 (SPH) transgene muizen die een gemodificeerde versie van een epigenetische Activator met dCas9 uitdrukken en toonde aan dat dit CRISPRa-systeem functioneel is in vivo28.
Ons lab gebruikt voornamelijk deze technologie om de rol van van klonen Hematopoiesis in cardiovasculaire ziekteprocessen te bestuderen. In prolifererend weefsel kan somatische mutaties in genen van kanker bestuurders een cellulaire groei voordeel opleveren en leiden tot afwijkende klonale uitbreidingen. In het hematopoietische systeem, dit proces staat bekend als "clonal Hematopoiesis", en het resulteert in situaties waarin een aanzienlijke Fractie van de leukocyten van een individu worden vervangen door Mutant klonen. Er is een groeiende waardering dat afwijkende klonale expansies hart-en vaatziekten versnellen, zoals atherosclerose en hartfalen, en bijdragen tot morbiditeit en all-cause sterfte15,29.
Onlangs is een causaal verband tussen verschillende van deze somatische mutaties en hart-en vaatziekten gedocumenteerd, en aspecten van de onderliggende mechanismen zijn opgehelderd10,13,14. Echter, deze somatische mutaties vertegenwoordigen waarschijnlijk de "Tip van de ijsberg", zoals epidemiologische studies hebben aangetoond dat veel aanvullende kandidaatgenen worden geassocieerd met klonale hematopoiese en, potentieel, verhoogde sterfte van cardiovasculaire aandoeningen. Dus, een systematische, hogere doorvoer evaluatie van van klonen Hematopoiesis bestuurder genen is vereist. Huidige studies van de causale verbinding van van klonen Hematopoiesis en hart-en vaatziekten zijn gebaseerd op de analyse van muizen met hematopoietische systeemspecifieke voorwaardelijke transgene (mxcre, vav-CRE, enz.) of muizen na beenmergtransplantatie. Deze strategieën moeten echter nieuwe muis kolonies vestigen en kunnen een financiële en fysieke last voor onderzoekers worden. Dus, een goedkopere en snellere methode dan de conventionele Murine transgene/knock-out benadering die in het verleden wordt gebruikt, is gerechtvaardigd. Lentivirale vectoren om hspc-en crispr-technologieën te bezorgd om mutaties te engineeren, zoals beschreven in dit manuscript, vergemakkelijken de studie van van klonen Hematopoiesis en hart-en vaatziekten.
Naast het genereren van conventionele knock-out Locus, deze methode is van toepassing op de productie van afgeknotte gemuleerde eiwitten. Bijvoorbeeld, onderzoekers hebben met succes gegenereerd een hematopoietische-Ppm1d truncation, die vaak wordt gezien bij patiënten met van klonen Hematopoiesis, door het introduceren van frame Shift mutaties met een grna gericht Exon 6 van de Ppm1d gen30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
S. S. werd gesteund door een Amerikaanse hart vereniging Postdoctoral Fellowship 17POST33670076. K. W. werd ondersteund door NIH subsidies R01 HL138014, R01 HL141256, en R01 HL139819.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | Medium |
| Sulfamethoxazole and Trimethoprim injection | TEVA | 0703-9526-01 | |
| 1/2 cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE | EXELINT | 26028 | general supply |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216-- | Cell line |
| APC-anti-mouse Ly6C (Clone AL-21) | BD Biosciences | 560599 | Antibodies |
| APC-Cy7-anti-mouse CD45R (RA3-6B2) | BD Biosciences | 552094 | Antibodies |
| BD Luer-Lok disposable syringes, 10 ml | BD | 309604 | general supply |
| BD Microtainer blood collection tubes, K2EDTA added | BD Bioscience | 365974 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 18 G | BD | 305195 | general supply |
| BD Precisionglide needle, 22 G | BD | 305155 | general supply |
| BV510-anti-mouse CD8a (Clone 53-6.7) | Biolegend | 100752 | Antibodies |
| BV711-anti-mouse CD3e (Clone 145-2C11) | Biolegend | 100349 | Antibodies |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | 9007-34-5 | general supply |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate, 6 well | Millipore Sigma | CLS3471 | general supply |
| CRISPR/Cas9 knock-in mice | The Jackson Laboratory | 028555 | mouse |
| DietGel 76A | Clear H2O | 70-01-5022 | general supply |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose | Sigma Aldrich | D6429 | Medium |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | Thermo fisher Scientific | 00-4333-57 | Solution |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Life Sciences | 353003 | general supply |
| Falcon 5 mL round bottom polystyrene test tube | Life Sciences | 352054 | general supply |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 352098 | general supply |
| Falcon 6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | Life Science | 353046 | general supply |
| Fisherbrand microhematocrit capillary tubes | Thermo Fisher Scientific | 22-362566 | general supply |
| Fisherbrand sterile cell strainers, 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | general supply |
| FITC-anti-mouse CD4 (Clone RM4-5) | Invitrogen | 11-0042-85 | Antibodies |
| Fixation Buffer | BD Bioscience | 554655 | Solution |
| Guide-it Compete sgRNA Screening Systems | Clontech | 632636 | Kit |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein | 29404 | Solution |
| Lenti-X qRT-PCR Titration Kit | Takara | 631235 | Kit |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Kit |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 mm | Millipore Sigma | SLHV004SL | general supply |
| PBS pH7.4 (1X) | Gibco | 10010023 | Solution |
| PE-Cy7-anti-mouse CD115 (Clone AFS98) | eBioscience | 25-1152-82 | Antibodies |
| PEI MAX | Polysciences | 24765-1 | Solution |
| Penicillin-Streptomycin Mixture | Lonza | 17-602F | Solution |
| PerCP-Cy5.5-anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Biosciences | 560602 | Antibodies |
| pLKO5.sgRNA.EFS.tRFP | Addgene | 57823 | Plasmid |
| pMG2D | Addgene | 12259 | Plasmid |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Sigma Aldrich | TR-1003-G | Solution |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 326823 | general supply |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | Plasmid |
| RadDisk – Rodent Irradiator Disk | Braintree Scientific | IRD-P M | general supply |
| Recombinant Murine SCF | Peprotech | 250-03 | Solution |
| Recombinant Murine TPO | Peprotech | 315-14 | Solution |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 09600 | Solution |
| TOPO TA cloning kit for sequencing with One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli | Thermo fisher Scientific | K457501 | Kit |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend | 423102 | Solution |
References
- Sasaki, Y., et al. Defective immune responses in mice lacking LUBAC-mediated linear ubiquitination in B cells. EMBO Journal. 32, 2463-2476 (2013).
- Ogilvy, S., et al. Transcriptional regulation of vav, a gene expressed throughout the hematopoietic compartment. Blood. 91, 419-430 (1998).
- Meyer, S. E., et al. DNMT3A Haploinsufficiency Transforms FLT3ITD Myeloproliferative Disease into a Rapid, Spontaneous, and Fully Penetrant Acute Myeloid Leukemia. Cancer Discovery. 6, 501-515 (2016).
- Kuhn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269, 1427-1429 (1995).
- Cole, C. B., et al. PML-RARA requires DNA methyltransferase 3A to initiate acute promyelocytic leukemia. Journal of Clinical Investigation. 126, 85-98 (2016).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, 1370-1379 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knock-out mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13, 195-215 (2018).
- Sano, S., et al. CRISPR-Mediated Gene Editing to Assess the Roles of Tet2 and Dnmt3a in Clonal Hematopoiesis and Cardiovascular Disease. Circulation Research. 123, 335-341 (2018).
- Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: size matters. BMC Research Notes. 9 (312), (2016).
- Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 12514-12519 (2016).
- Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355, 842-847 (2017).
- Sano, S., et al. Tet2-Mediated Clonal Hematopoiesis Accelerates Heart Failure Through a Mechanism Involving the IL-1beta/NLRP3 Inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71, 875-886 (2018).
- Sano, S., Wang, Y., Walsh, K. Clonal Hematopoiesis and Its Impact on Cardiovascular Disease. Circulatory Journal. 71, 875-886 (2018).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Biotechnology. 32, 941-946 (2014).
- Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Scientific Reports. 5, 13875 (2015).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnology. 13, 98 (2013).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42, e168 (2014).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561, 416-419 (2018).
- Bae, S., Park, J., Kim, J. S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics. 30, 1473-1475 (2014).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36, 765-771 (2018).
- El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568, 193-197 (2019).
- Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568, 259-263 (2019).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154, 442-451 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21, 440-446 (2018).
- Fuster, J. J., Walsh, K. Somatic Mutations and Clonal Hematopoiesis: Unexpected Potential New Drivers of Age-Related Cardiovascular Disease. Circulatory Research. 122, 523-532 (2018).
- Kahn, J. D., et al. PPM1D truncating mutations confer resistance to chemotherapy and sensitivity to PPM1D inhibition in hematopoietic cells. Blood. , (2018).
