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Biology

Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in Caenorhabditis elegans

Published: July 5, 2019 doi: 10.3791/59978
* These authors contributed equally

Summary

Questo studio descrive le misurazioni quantitative delle dimensioni sinaptiche e della localizzazione, della morfologia muscolare e della forma mitocondriale in C. elegans utilizzando strumenti di elaborazione delle immagini liberamente disponibili. Questo approccio consente a studi futuri in C. elegans di confrontare quantitativamente l'estensione dei cambiamenti strutturali dei tessuti e degli organelli a seguito di mutazioni genetiche.

Abstract

La definizione dei meccanismi cellulari alla base della malattia è essenziale per lo sviluppo di nuove terapie. Una strategia frequentemente utilizzata per svelare questi meccanismi consiste nell'introdurre mutazioni nei geni candidati e descrivere qualitativamente i cambiamenti nella morfologia dei tessuti e degli organelli cellulari. Tuttavia, le descrizioni qualitative potrebbero non cogliere le sottili differenze fenotipiche, potrebbero travisare le variazioni fenotipiche tra gli individui in una popolazione e sono spesso valutate soggettivamente. Qui, gli approcci quantitativi sono descritti per studiare la morfologia dei tessuti e degli organelli nel nematode Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia confocale a scansione laser combinata con un software di elaborazione bio-immagine disponibile in commercio. È stata eseguita un'analisi quantitativa dei fenotipi che influenzano l'integrità delle sinapsi (livelli di dimensioni e fluorescenza integrata), lo sviluppo muscolare (dimensioni delle cellule muscolari e la lunghezza del filamento della miosina) e la morfologia mitocondriale (circolarità e dimensione) per comprendere gli effetti delle mutazioni genetiche su queste strutture cellulari. Questi approcci quantitativi non si limitano alle applicazioni qui descritte, in quanto potrebbero essere facilmente utilizzati per valutare quantitativamente la morfologia di altri tessuti e organelli nel nematode, così come in altri organismi modello.

Introduction

Il nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) è sempre più utilizzato come sistema modello per scoprire i processi biologici e molecolari coinvolti nella malattia umana. Un nematode adulto ha una lunghezza del corpo di poco superiore a 1 mm e può produrre una grande covata fino a 300 uova1. Dopo la schiusa, C. elegans richiedono solo 3-4 giorni per raggiungere l'età adulta, e vivere per circa 2 o 3 settimane2. Grazie alla sua facilità di coltura, C. elegans è attualmente uno dei modelli animali in vivo più ricercati per condurre uno screening rapido e conveniente dei farmaci per identificare le terapie per le malattie umane. Inoltre, la sua conservazione genetica, paradigmi comportamentali ben definiti, corpo trasparente per la fluorescenza o microscopia luminosa, e la facilità di manipolazione genetica rendono lo studio delle conseguenze cellulari e molecolari delle mutazioni genetiche facilmente raggiungibili 3. Il genoma di C. elegans condivide circa il 60-80% dell'ortologica con i geni umani, e circa il 40% di questi geni sono noti per essere correlati alla malattia. Alcune delle malattie umane che sono state modellate e studiate in C. elegans includono disturbi neurodegenerativi (malattia di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth), malattie associate ai muscoli ( Distrofia muscolare di Duchenne) e malattie metaboliche (iperglicemia)2,4. Nella maggior parte dei disturbi umani, si verificano la localizzazione cellulare e di organello indotta dalla malattia e cambiamenti morfologici, che possono essere facilmente valutati nel modello nematode.

I marcatori fluorescenti sono stati ampiamente utilizzati per etichettare tessuti e organelli per la visualizzazione dinamica al microscopio. Tuttavia, in C. elegans, i metodi convenzionali che valutano le irregolarità morfologiche dovute a mutazioni genetiche si sono in gran parte affidati a descrizioni visive. Mentre le valutazioni qualitative possono coprire più ampie gamme di descrizioni fenotipiche (morfologia sinaptica, gAPPamento GFP, forma assonale specifica, spessore della fibra muscolare, ecc.) e forniscono una visione a ciglio dell'uccello dei cambiamenti morfologici, sono meno adatti per confrontando piccole variazioni tra gruppi diversi. Inoltre, le valutazioni qualitative si basano su valutazioni visive soggettive, che possono portare a sovra o sottosoprastime di anomalie morfologiche. Infine, le osservazioni qualitative possono anche variare notevolmente da individuo a individuo, creando difficoltà con la replica dei dati.

Negli ultimi anni, sono stati sviluppati una serie di algoritmi computazionali facili da usare e facilmente reperibili che possono analizzare quantitativamente le immagini. Tuttavia, l'utilizzo di tale software di analisi delle immagini per alcuni studi morfologici, soprattutto in relazione ai muscoli della parete del corpo e ai mitocondri, nella ricerca di C. elegans è rimasto indietro. Per migliorare l'analisi strutturale sottostante in C. elegans, alcuni dei software di analisi delle immagini open source prontamente disponibili sono stati sperimentati per confrontare quantitativamente gli effetti delle mutazioni genetiche sui mitocondri muscolari, sul muscolo della parete del corpo e sulla sinaptica morfologia. Queste procedure sperimentali delineano in dettaglio come questi programmi (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) possono essere utilizzati per valutare i cambiamenti nella dimensione sinaptica e nella localizzazione delle proteine sinaptiche, dell'area muscolare della parete del corpo e della lunghezza della fibra e delle dimensioni mitocondriali e circolarità a seguito di mutazioni genetiche nel nematode.

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Protocol

1. Crescita e manutenzione dei ceppi C. elegans

  1. Seme Nematode Growth Medium (NGM, vedi Tabella dei materiali) piastre di agar con 300 -L della crescita lenta E. coli ceppo OP50 in un armadio di flusso laminare.
  2. Lasciare asciugare le piastre di agar NGM nell'armadio di flusso laminare.
    NOTA: In assenza di armadietto a flusso laminare, le piastre possono essere lasciate asciugare sul banco, ma sono più soggette a contaminazione.
  3. Trasferire almeno 20 animali a ciascuna delle due piastre di agar NGM di semi OP50 per avere scorte di lavoro. Ci sono due modi principali per trasferire gli animali.
    1. Raccolta: Sollevare delicatamente gli animali utilizzando un plettro sterilizzato a caldo. Questo metodo è efficace per la selezione di singoli o più animali da una piastra di agar. Avere un piccolo graffio di batteri sulla punta durante la raccolta aiuta il trasferimento.
      NOTA: Un plettro è fatto di un piccolo pezzo di filo di platino lungo circa 4 cm che è incorporato in una pipetta di vetro, con la punta di filo appiattita per essere 'lancia-come'. Sterilizzare il calore del prelievo tra la raccolta per evitare la contaminazione incrociata.
    2. Chunking: Utilizzando una spatola sterilizzata, tagliare un piccolo quadrato di agar contenente gli animali da una piastra e trasferito a testa in giù per un nuovo piatto.
      NOTE: Questo metodo è generalmente utile per trasferire un gran numero di vermi e per rimuovere la contaminazione dalle piastre attraverso più cicli di pezzi di agar non contaminato. Evitare la contaminazione incrociata infiammando la spatola per alcuni secondi e immergendo la spatola nel 100% di etanolo tra un trasferimento e l'altro. Il trasferimento da piastre affamate non è raccomandato in quanto la fame e il sovraffollamento possono influenzare la salute e la morfologia delle strutture cellulari e subcellulari.
  4. Mantenere i vermi a temperatura di crescita standard (20 gradi centigradi). Per garantire la fornitura continua di vermi ben nutriti, trasferire i vermi su nuove piastre di semi OP50 ogni 2 o 3 giorni.

2. Sincronizzazione dell'età di C. elegans

  1. Mantenere i vermi su 3-4 piatti NGM fino a quando la popolazione è affollata ma non affamato.
  2. Lavare delicatamente i vermi dalla piastra NGM con soluzione M9. Le uova rimarranno sul piatto poiché si attaccano all'E. coli OP50. Ripetere con quattro passaggi di lavaggio aggiuntivi per rimuovere tutti gli animali nati.
  3. Lasciare che i vermi si schiudano per 40 min.
  4. Aggiungere 1-2 mL di soluzione M9 alla piastra e ruotare delicatamente per allentare i vermi appena schiusi.
  5. Raccogli la soluzione M9 con i vermi nati di recente e trasferisci la soluzione con i vermi in una piastra NGM fresca.
  6. Lasciare evaporare la soluzione M9 esponendo la piastra NGM all'aria. Fate questo adiacente a una fiamma aperta per evitare la contaminazione della piastra NGM.
  7. Far crescere i vermi per 27 h a 20 gradi centigradi per consentire lo sviluppo nella terza fase larvale (L3). Per gli animali adulti di 3 giorni sincronizzati, i vermi vengono raccolti allo stadio larvale 4 e coltivati per altri 3 giorni per raggiungere la fase adulta di 3 giorni.

3. Preparazione dei vetrini per l'imaging

  1. Preparare il 3-4% di brodo w/v agarose in una bottiglia a microonde (3-4 g in 100 mL di acqua ultrapura).
    NOTA: L'agar può essere utilizzato al posto dell'agarose alla stessa concentrazione.
  2. Sciogliere l'agarose con attenzione in un forno a microonde, facendo attenzione a non ebollizione, fino a quando tutte le agarose si dissolvono (soluzione chiara). Mantenere la soluzione a 70 gradi centigradi per evitare la solidificazione.
    NOTA: lo stock di agarose può essere utilizzato più volte. Riscaldare prima dell'uso se l'agarose si è solidificato.
  3. Utilizzando una pipetta Pasteur, mettere una goccia di agarose fuso su un vetrino del microscopio.
    NOTA: Evitare di avere bolle d'aria nella goccia di agar come questi interrompere l'integrità del pad.
  4. Premere immediatamente verso il basso la goccia di agarose con un altro vetrino al microscopio, appiattindo delicatamente l'agarose in un pad tra i due vetrini.
    NOTA: Eventuali bolle rimanenti devono essere rimosse in questa fase. In caso contrario, i nuovi vetrini dovrebbero essere fatti come gli animali possono facilmente rimanere bloccati nelle bolle. Evitare l'overflow di agar di lato quando si preme sulla diapositiva.
  5. Lasciare asciugare l'agarose per 1 min.
  6. Separare con cura le due diapositive per evitare danni all'agarose, lasciando il pad solidificato su una delle diapositive.
    NOTA: I vetrini con pastiglie agarose devono essere sempre preparati freschi appena prima dell'esperimento in quanto possono asciugarsi. Assicurarsi che il cuscinetto di agarose abbia uno spessore costante. Non ci dovrebbero essere bolle d'aria o crepe nel pad in quanto questo può interferire con l'imaging.
  7. Aggiungere una piccola goccia (5-10 l) di 0,05% di cloridrato tetramisole (anestetico) al centro del cuscinetto di agarose.
  8. Utilizzando il piccone sterilizzato termicamente, trasferire rapidamente circa 10 – 15 animali dalla piastra di riserva alla goccia anestetica prima che la soluzione si asciughi. Evitare di trasferire troppi batteri OP50 in quanto questo rende la soluzione torbida, che può interferire con l'imaging.
    NOTA: Se la soluzione anestetica si asciuga durante la raccolta, è sufficiente pipettare una seconda goccia di 0,05% di cloruro di tetramisole sugli animali. Gli animali tendono a sdraiarsi sul loro lato laterale nella soluzione anestetica.
  9. Applicare un coverslip posizionandolo appena sopra il pad agarose e facendolo cadere delicatamente verso il basso. Questo impedirà la formazione di bolle. Non applicare pressione sul coperchio in quanto ciò potrebbe schiacciare gli animali.
  10. Etichettare le diapositive con il nome della deformazione.

4. Valutazione della morfologia sinaptica

NOTA: gli effetti della sovraespressione MEC-17 sull'integrità delle sinapsi nei neuroni del recettore tattile del microtubulo laterale posteriore (PLM) sono stati studiati quantificando le dimensioni sinaptiche e la localizzazione utilizzando la microscopia confocale a scansione lineare. I neuroni PLM (comprese le regioni sinaptiche) sono stati visualizzati utilizzando il transgene uIs115(Pmec-17::tagRFP) (strain: TU40655) e la regione sinaptica è stata specificatamente etichettata con jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) (strain: NM6644) (strain: NM6644) 6) . Questo studio è stato eseguito su animali sincronizzati L3 non transgenici e transgenici del ceppo di sovraespressione MEC-17 extracromosomal BXN507 [cjnEx036(Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37; uIs115]7. Un elenco completo dei ceppi utilizzati in questo studio è incluso nella Tabella 1.

  1. Imaging confocale delle sinapsi del neurone del recettore tattile
    1. Per immaginare le regioni sinaptiche, utilizzare un microscopio confocale a scansione di linee accoppiato a un laser a diodo semiconduttore pompato otticamente da 488 nm e 552 nm e dotato di software di acquisizione immagini.
    2. Individuare i vermi utilizzando l'ingrandimento più basso.
    3. Quando gli animali sono posizionati con successo, passare a un ingrandimento 40X e applicare un mezzo di immersione (in questo studio: è stato utilizzato un obiettivo multi-immersivo 40X/1.10 HC PL APO CS2 con immersione in acqua).
    4. Visualizza la regione sinaptica entusiasmando i fluorofori con un laser da 488 nm (potenza del 2%) per il fluoroforo GFP e 552 nm (1% di potenza) per il tagRFP fluorophore.
    5. Determinare il fotogramma x e y ottimale per catturare l'intera area sinaptica. Assicuratevi di considerare la dimensione ottimale in pixel quando selezionate il fotogramma. In questo studio, è stata ottenuta una dimensione costante dei pixel di 56 nm.
    6. Acquisire immagini utilizzando un rilevatore di foto ibrido e impostare i vantaggi per prevenire la sovraesposizione dei fluorofori (100% per 488 nm eccitazione e 15% per 552 nm eccitazione).
    7. Raccogliere le immagini z-stack per coprire l'intera sinapsi, utilizzando la dimensione ottimale z-step a seconda dell'obiettivo specifico utilizzato. In questo studio è stata utilizzata una dimensione ottimale di z-step di 0,211 nm.
      NOTA: Assicurarsi che tutte le immagini siano prese in condizioni rigorose per consentire la quantificazione e il confronto integrati della fluorescenza. Questo può essere fatto mantenendo i parametri di microscopia identici in tutte le immagini catturate (ad esempio, le impostazioni del laser e del rilevatore, le dimensioni dei pixel, la velocità di scansione e la dimensione ottimale dello z-step). Le impostazioni ottimali dipendono dall'obiettivo e possono essere calcolate utilizzando programmi di bioinformatica accessibili, come il calcolatore Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator). Etichettare le immagini in modo sistematico, questo sarà utile quando si utilizza un software bioinformatica che organizzerà ed elaborai i file in base al nome del file.
  2. Quantificazione della regione sinaptica
    1. Per analizzare la regione sinaptica, esportare le immagini come file TIFF. È possibile utilizzare un software di elaborazione di imaging basato su Java come ImageJ (in questo studio è stata utilizzata la macro di conversione dell'immagine MRI in ImageJ).
    2. Le dimensioni e i livelli integrati di intensità di fluorescenza delle sinapsi sono stati misurati dall'intensità di somma degli z-stack ottenuti con CellProfiler-3.1.5. Caricare le immagini nel software CellProfiler3.1.5. Se necessario, le immagini possono essere filtrate in base ai nomi dei file di immagine.
    3. Impostare il modulo Nome e tipo. Facoltativamente, estrarre i metadati dall'etichetta dell'immagine per organizzare di conseguenza i dati calcolati.
    4. Determinare l'area sinaptica a mano definizione di questa regione utilizzando il tag diffusoRF espresso dal transgene uIs115(Pmec-17::tagRFP). Questa operazione può essere eseguita aggiungendo il modulo relativo alla pipeline CellProfiler-3.1.5.This can be done by adding the regarding module to the CellProfiler-3.1.5 pipeline.
    5. Per misurare le dimensioni e la fluorescenza della sinapsi definita dalla mano, aggiungere il modulo Misura dimensione e forma oggetto e Intensità oggetto misura alla pipeline.
    6. Calcolare l'intensità di fluorescenza integrata relativa aggiungendo il modulo Calcola calcola calcola. Dividere le unità di intensità integrate ottenute da jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP) per le unità integrate ottenute per uIs115(Pmec-17::tagRFP).
    7. Esportare misurazioni e calcoli.

5. Quantificare la struttura muscolare della parete corporea

  1. Immagine della fluorescenza della struttura muscolare della parete corporea
    1. Ottenere un ceppo (ad esempio, RW1596) portando il transgene stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 - rol-6 (su1006))8, che etichetta le fibre di miosina con GFP.
      NOTA: L'introduzione del transgene negli animali può essere ottenuta incrociando uno sforzo di interesse con animali che già esprimono il transgene, o microiniettando il DNA nel braccio distale della gonade. Il fenotipo "rotolamento" indotto dalla mutazione rol-6 in questo transgene facilita la visualizzazione dei muscoli. I muscoli della parete del corpo corrono lungo i lati dorsale e ventrale che sono normalmente preclusi dalla vista negli animali selvatici perché in genere si trovano su uno dei loro lati laterali. L'allele rol-6(su1006) induce torsione degli animali, esponendo così alcune cellule muscolari per l'imaging.
    2. Immagine degli animali utilizzando un microscopio a fluorescenza accoppiato con una fotocamera dispositivo accoppiato caricato ad alta risoluzione (CCD), obiettivo 40X o superiore, filtro GFP e software di acquisizione.
    3. Regolare il tempo di esposizione e l'intensità dell'illuminazione per evitare immagini sovrasaturate.
    4. Cattura e salva le immagini dei muscoli (400X ingrandimento) da una sezione dell'animale contenente almeno una cella muscolare oblique visibile completa. Evitare le regioni con una singola cella muscolare che è incompleta o sezioni che sono fuori fuoco. Escludere anche le immagini dalle regioni anteriori e posteriori estreme e le regioni adiacenti alla vulva.
      NOTA: Se l'animale non ha una singola cellula muscolare completa visibile, far scorrere delicatamente il coperchio per trasformare l'animale in modo da esporre una cellula completa.
  2. Misurazione dell'area delle cellule muscolari
    1. Aprire l'immagine nel software Fiji9 (versione 2.0.0 è stata utilizzata in questo studio).
    2. Utilizzare la selezione del poligono per tracciare con attenzione intorno a una singola cellula muscolare oblique. Regolare la linea del poligono alla fine trascinando il punto di ancoraggio per migliorare il ricalco.
    3. Vai alla scheda Analizza nella parte superiore del software e fai clic su Misura per calcolare l'area della selezione. Verrà visualizzata una tabella dei risultati separata contenente l'area e altre misure. Se la misura dell'area non è presente nella tabella dei risultati, passare a Imposta misurazioni nella scheda Analizza e verificare che la casella dell'area sia selezionata. Allo stesso modo, deselezionare altre misure che non sono necessarie.
    4. Per le celle muscolari con una regione degenerata/mancante, tracciate la regione mancante con lo strumento di selezione poligono e fate di nuovo clic su Misura. Se ci sono più spazi all'interno della cella, tracciare ogni spazio separatamente.
    5. Calcolare il rapporto tra l'area del gap e l'intera singola cellula muscolare. Un rapporto elevato indica una maggiore estensione della degenerazione muscolare a causa di grandi lacune all'interno della cellula. Se non ci sono regioni mancanti, come si vede comunemente negli animali selvatici, il rapporto verrebbe calcolato come zero.
      NOTA: Come controllo, il punteggio anche per i difetti della struttura muscolare visivamente e confrontare i risultati con la misurazione quantitativa. Ciò è particolarmente utile se il ceppo viene studiato per la prima volta in laboratorio. Per il punteggio fenotipico, valutare gli animali come difettosi o non difettosi in base all'integrità dei filamenti. Ad esempio, gli animali con perdita di striature di filamento distinte, gFP agglomerati o lacune all'interno delle cellule muscolari a causa di ripartizione strutturale, verrebbero valutati come difettosi.
  3. Segmentazione e quantificazione della lunghezza della fibra di miosina
    1. Se necessario, convertire prima i file in . tif utilizzando Fiji o un altro pacchetto software. Salvare i file TIFF nella posizione desiderata.
    2. Aperto ilastik10 (software libero, versione 1.3.2 può essere scaricato da https://www.ilastik.org/).
    3. Una volta in ilastik, scegliere Classificazione pixel in Crea nuovo progetto. Il software richiederà il salvataggio del progetto. Rinominare il progetto e salvarlo nella posizione desiderata.
      NOTA: un nuovo progetto deve essere creato una sola volta. La segmentazione successiva può essere effettuata utilizzando lo stesso progetto. Per utilizzare le stesse impostazioni di progetto, passare alla scheda Progetto nella parte superiore e fare clic su Apri progetto per accedere al file di progetto.
    4. Nel pannello di sinistra devono essere presenti 5 schede (Dati di input, Selezione funzionalità, Formazione, Esportazione previsione ed Elaborazione batch). Nella scheda Dati di input fare clic su Aggiungi nuovo e quindi su Aggiungi immagini separate. Dirigere la finestra pop-up alla cartella contenente i file TIFF e selezionare l'immagine da aprire.
    5. Nella scheda successiva (Selezionefunzionalità), fare clic su Seleziona funzioni per selezionare tutte le funzioni dei pixel, indicate da caselle verdi selezionate. La selezione di pixel in questo passaggio viene utilizzata per distinguere le diverse classi di pixel nel passaggio successivo.
      NOTA: la selezione delle funzioni Pixel dipende dalla risoluzione dell'immagine. Quindi, gli sviluppatori suggeriscono di selezionare tutte o quante più funzioni possibili, se la potenza di elaborazione e il tempo lo consentono.
    6. Il pannello Allenamento seguente consente la classificazione di diverse classi di oggetti in base ai pixel. In questo caso, le due classi sono i singoli filamenti di miosina che esprimono GFP e lo sfondo indesiderato o i bordi sfocati. Fare clic su Aggiungi etichetta per avere la prima etichetta. Eseguire lo scarto su un certo numero di filamenti per iniziare la formazione del classificatore.
      NOTA: facendo doppio clic sull'etichetta è possibile modificare il nome (ad esempio, rinominando 'etichetta 1' in 'filamento'). Facendo doppio clic sulla casella colorata è possibile modificare i colori per il disegno e la visualizzazione delle probabilità. La dimensione predefinita del pennello è 1, anche se la dimensione può essere aumentata a 61. Se è stato disegnato il pixel errato, è sufficiente utilizzare lo strumento gomma per rimuovere il disegno. I controlli da tastiera (-) e (MAIUSC) possono essere utilizzati rispettivamente per ingrandire e ridurre l'immagine. I tasti freccia vengono utilizzati per spostarsi all'interno dell'immagine.
    7. Aggiungere una seconda etichetta e rinominarla in Sfondo. Scarabocchiare su sfondi indesiderati e spazi tra i filamenti.
    8. Fare clic su Live Update e assicurarsi che la classificazione è stata fatta dal software correttamente. Aggiungere altri scarabocchi e ottimizzare la formazione, se necessario.
      NOTA: È importante tenere d'occhio le fibre unite e i bordi sfocati (come la linea del corpo) in questo passaggio. Migliorare la previsione qui il più possibile per aumentare la precisione delle misurazioni. La precisione della stima dipende anche dalla risoluzione dell'immagine, poiché i pixel nelle immagini di bassa qualità sono più difficili da prendere in giro. È inoltre facoltativo, ma consigliato per eseguire il metodo di filtro nella funzione Suggerisci funzionalità accanto al controllo Live Update.
    9. Una volta che il classificatore di training è stato eseguito in modo adeguato, passare al pannello Esportazione previsione. Fare clic su Scegli impostazioni immagine di esportazione con probabilità come origine.
    10. Utilizzare le seguenti impostazioni. Sottoregione di ritaglio x e y selezionato e c deselezionato. I valori di inizio e fine per c devono essere rispettivamente 0 e 1. Selezionare e convertire il tipo di dati in Trasformazioni in un signed a 8 bit, selezionare nuovamente [min, max] e utilizzare i valori predefiniti. Modificare il formato del video del file di output in PNG e rinominare il file e la directory come desiderato.
    11. Chiudere la finestra delle impostazioni di esportazione ed esportare l'immagine specifica appena segmentata.
    12. Aprire l'immagine PNG salvata nel software Fiji. L'immagine dovrebbe apparire in bianco e nero.
    13. Regolare la soglia dell'immagine utilizzando le impostazioni predefinite.
    14. Applicare il plug-in di scheletro (Scheletra 2D/3D e quindi Analizza scheletro). Verrà visualizzata una tabella separata dei risultati, che include la lunghezza del ramo. La lunghezza del ramo rappresenta la lunghezza della fibra. Altri dati nei risultati potrebbero anche essere utili, come la distanza euclidea.
      NOTA: Omettere le fibre con lunghezze pari a 0 m o superiori a 250 m, in quanto queste dimensioni non sono fisiologicamente possibili.

6. Quantificare la morfologia mitocondriale

NOTA: Per la quantificazione della morfologia mitocondriale, questo studio ha utilizzato il ceppo BXN0387 contenente il numero uIs115(Pmec-17::tagRFP)5 transgene per visualizzare i neuroni PLM e jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP)11 per visualizzare i mitocondri specificamente all'interno dei neuroni PLM. Questo studio è stato eseguito in vermi adulti sincronizzati di 3 giorni, ma è stato eseguito con successo in altre età, così come in altri tessuti7.

  1. Immagine di fluorescenza dei mitocondri all'interno dei neuroni PLM
    1. Per misurare i cambiamenti di dimensione e forma dei mitocondri all'interno dei neuroni PLM, visualizzare sia il neurone di sfondo che i mitocondri usando transgeniflui fluorescenti.
    2. Per immaginare il neurone PLM, utilizzare un microscopio confocale accoppiato a un laser a diodo a semiconduttori pompato otticamente da 488 nm e 552 nm e dotato di software di acquisizione immagini.
    3. Immagine del verme come da passi 4.1.1-4.1.4 sopra, garantendo condizioni di esposizione non saturanti.
    4. Per visualizzare l'intero neurone, potrebbe essere necessaria un'immagine piastrellata. Per raggiungere questo obiettivo, utilizzare il software con un'opzione di scansione piastrelle per individuare e rilasciare un marcatore in un angolo del neurone e quindi individuare l'estremità opposta e rilasciare l'altro marcatore. Il software calcolerà il numero ottimale di piastrelle necessarie per catturare l'area richiesta.
      NOTA: Per ridurre il tempo di scansione, è spesso più facile individuare i neuroni che seguono un singolo piano, con conseguente minor numero di tessere.
    5. Per accoppiare la scansione del riquadro con uno stack z, impostare i limiti inferiore e superiore prima di avviare la scansione del riquadro e assicurarsi che sia impostata la dimensione ottimale della sezione.
    6. Assicurati che la risoluzione sia ottimizzata, poiché la segmentazione sarà più raffinata con risoluzioni più elevate (in questo caso è stata utilizzata una risoluzione di 3224 x 3224 pixel).
      NOTA: Mentre il transgene uIs115(Pmec-17::tagRFP) viene utilizzato per contrassegnare il PLM e posizionare con successo la fotocamera, non è necessariamente necessario immagine a causa della leggera fluorescenza di fondo osservata dal jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP) transgene all'interno dell'assone PLM stesso. Pertanto, il tempo di scansione e imaging può essere ridotto rimuovendo il filtro 552 nm dall'esperimento.
  2. Segmentazione degli oggetti tramite SQUASSH
    1. Convertire i file di immagine in immagini .tiff e generare proiezioni di intensità massima dagli stack z utilizzando il software di imaging Fiji. Ritagliare le immagini alle dimensioni minime pur contenendo il neurone completo per ridurre il carico computazionale e ridurre il rumore di fondo.
      NOTA: Per i risultati rappresentativi, sono stati considerati solo i mitocondri all'interno dei lunghi processi assonali, quindi il corpo cellulare e qualsiasi mitocondri all'interno sono stati esclusi da ogni immagine.
    2. Utilizzando la macro Mosaic Suite SQUASSH per ImageJ, eseguite la segmentazione12 di Split Bregman sulle proiezioni massime. Una guida dettagliata per l'installazione e l'applicazione di questa macro è disponibile sul sito Web Mosaic (http://mosaic.mpi-cbg.de/) e descritta da Rizk et al. 201413. Il processo di segmentazione dell'immagine è descritto in breve.
      NOTA: Questa segmentazione identifica gli oggetti (in questo caso il mitocondrio individuale) sopra una soglia di intensità di fluorescenza, consentendo una misurazione accurata delle dimensioni e della forma di ogni singolo oggetto.
    3. Rimuovere il disturbo di fondo da un'immagine utilizzando il metodo a sfera a rotazione, in cui una finestra definita dall'utente si sposta attraverso l'immagine, imputando la stima dell'intensità di sfondo locale dall'intensità più frequente in ogni finestra. In questo modo vengono corrette le intensità di fondo non uniformi.
    4. Utilizzare il rilevamento degli oggetti per trovare approssimativamente le aree dell'immagine che contengono oggetti (mitocondri) di interesse, in base all'intensità di fluorescenza e al numero di pixel. I parametri che regolano questo passaggio sono la regolarizzazione e l'intensità minima dell'oggetto.
      NOTA: la regolarizzazione viene utilizzata per evitare la segmentazione di piccole intensità, picchi indotti dal rumore e la soglia minima di intensità dell'oggetto aiuta a definire gli organelli subcellulari dalla fluorescenza dei tessuti di fondo. Questi sono i due parametri principali che vengono manipolati per trovare una segmentazione ottimale dei mitocondri, e il processo di ottimizzazione tende ad essere tentativi ed errori di diversi parametri per un'immagine di prova, seguita da ispezione manuale.
    5. Utilizzare il software per stimare l'intensità di fondo locale intorno a ogni oggetto per facilitare il calcolo della segmentazione ottimale.
    6. Misurare i singoli oggetti per dimensioni, perimetro, lunghezza tramite numero di pixel, nonché l'intensità del segnale e la posizione x/ y sull'immagine. Per calcolare le misure in formato nm, calcolare le dimensioni in pixel dell'immagine originale.
      NOTA: per ogni esperimento, è necessario prima calcolare i parametri ottimali. Per garantire l'accuratezza della segmentazione, è consigliabile eseguire un'analisi SQUASSH su un'immagine di prova e ispezionare manualmente l'accuratezza della segmentazione. La macro fornisce file di output che mostrano i singoli oggetti identificati sull'immagine originale e l'ispezione di questi parametri strettamente e la regolazione dei parametri per soddisfare garantirà una segmentazione accurata. I parametri definiti devono quindi essere utilizzati per l'intero esperimento per la comparabilità. I parametri utilizzati per i risultati rappresentativi sono inclusi nella tabella 2.
    7. Aprire il software di analisi Fiji o ImageJ, passare al contenitore macro Mosaic e aprire il menu SQUASSH.
      1. Aprire il sottomenu Sottrazione in background e verificare che l'opzione Rimuovi sfondo sia selezionata. Il valore predefinito per le dimensioni della finestra è 10.
      2. Impostare i valori di Regolarizzazione e Intensità minima oggetto, canale 1 per identificare e segmentare al meglio gli oggetti (vedere il passaggio 6.2.4). I valori del canale 2 non sono necessari per gli oggetti contrassegnati con un singolo transgene.
      3. Fare clic sul PSF stimare dalle proprietà oggettive per stimare la funzione di diffusione dei punti in base alle caratteristiche del microscopio. Ciò consente di segmentare gli oggetti vicini tenendo conto dell'influenza di ogni pixel sul pixel adiacente.
        NOTA: la segmentazione dei subpixel non è stata utilizzata in questo esperimento a causa del suo aumento del carico sulla potenza di elaborazione del computer. Anche le maschere cellulari non sono state utilizzate in quanto l'assone è facilmente definito. Queste impostazioni sono utili per i tessuti più complessi e per definire gli oggetti su una cella per cella.
      4. Per le opzioni di visualizzazione, verificare che le caratteristiche Dettagli oggetto e Salva oggetto e immagine siano selezionate. Per utilizzarli in seguito nella grafica e nel software statistico, assicurarsi che venga immesso il numero corretto di condizioni.
    8. Individuare la cartella con le immagini .tiff ed eseguire la macro. Questo processo può essere eseguito su una singola immagine o su un batch di immagini per genotipo che si trova all'interno di una cartella. I file di output si troveranno nella cartella insieme alle immagini originali.
  3. Analisi e misurazioni della forma
    1. Utilizzare l'output di SQUASSH per fornire un file CSV di dati oggetto dettagliato, che fornisce ogni singolo oggetto per riga, incluse le relative misure come descritto in precedenza.
      NOTA: mentre questo processo macro automatizza le misurazioni degli oggetti, è sempre importante controllare manualmente le immagini di output dopo la segmentazione SQUASSH per assicurarsi che la macro abbia identificato correttamente i mitocondri.
    2. Per analizzare la forma di ogni mitocondri, utilizzare una misura bidimensionale per la sfericità, la circolarità, per stimare la deviazione dell'oggetto da un cerchio perfetto.
      NOTA: La circolarità è una funzione dell'area e del perimetro(Circolalità) x (Area/Perimetro 2) dove 1 è un cerchio perfetto e 0 - una linea retta. Questo può essere ottenuto utilizzando una formula in grafica e software statistico.
    3. Per determinare la varianza in termini di dimensioni e forma attraverso il pool di mitocondri, calcolare gli istogrammi e una distribuzione gaussiana adattata utilizzando grafica e software statistico, con bidoni di 0,2 m per le dimensioni mitocondriali e 0,05 per la circolarità mitocondriale.

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Representative Results

C. elegans è un organismo modello ideale per studiare la morfologia di diversi tessuti e organelli grazie alla sua semplicità, al lignaggio cellulare noto, alla trasparenza e agli strumenti disponibili. Qui, forniamo approcci quantitativi per studiare organelli (ad esempio, mitocondri) e tessuti, tra cui sinapsi e muscoli utilizzando l'imaging a fluorescenza dal vivo e il software di elaborazione bio-immagine gratuito.

È necessaria una rigorosa regolazione dell'espressione MEC-17 per il normale sviluppo delle sinapsi

Per comprendere meglio la funzione dell'acetil-transferase alfa-tubulina MEC-1714,15,16 nel sistema nervoso, abbiamo studiato la morfologia sinaptica nei neuroni del recettore del tatto in C. elegans sovraesprimendo la proteina17. Queste strutture cellulari sono essenziali per la funzione del neurone in quanto consentono segnali da passare ai neuroni vicini. Le immagini della sinapsi PLM sono state raccolte utilizzando un microscopio confocale a scansione laser e l'analisi della morfologia quantitativa è stata eseguita utilizzando un software di elaborazione bio-immagine accessibile (Figura 1A,B). La sovraespressione del MEC-17 si traduce in riduzioni significative nel settore degli accumuli pre-sinaptici nel PLM e in una ridotta intensità di fluorescenza integrata relativa del marcatore SBN-1::GFP (Figura1C,D). Insieme, questi risultati suggeriscono che la sovraespressione di MEC-17 interrompe lo sviluppo normale delle sinapsi nei neuroni del recettore del tocco PLM.

Le dimensioni del sito presilnaptico e la relativa fluorescenza integrata sono state studiate utilizzando il software di elaborazione bio-immagine gratuito CellProfiler3.1.5. A causa della loro struttura complessa, le sinapsi sono state definite a mano utilizzando la proteina tagRFP diffusa espressa dal transgene uIs115(Pmec-17::tagRFP). L'area della sinapsi definita è stata calcolata in base al numero di pixel all'interno dell'area definita. Rispetto al controllo di tipo selvaggio, gli animali che esprimono in modo eccessivo il MEC-17 hanno ridotto significativamente le regioni pre-sinaptiche (P - 0,0025; n - 10) (Figura 1C). Inoltre, per studiare l'integrità sinaptica, sono stati confrontati i relativi livelli di intensità di fluorescenza integrata. Ciò è stato calcolato misurando i livelli integrati di intensità di fluorescenza all'interno della sinapsi definita sia per la BNSN-1::GFP che per il tagRF diffusi. Successivamente, sono stati confrontati i valori di fluorescenza della BNS-1::GFP relativi ai valori tagRFP, per i quali è stata osservata una diminuzione significativa (P - 0,0479; n - 10) con la sovraespressione del MEC-17 (Figura1D). Insieme, questi risultati suggeriscono che la corretta regolamentazione del MEC-17 è importante per lo sviluppo delle sinapsi.

La misurazione quantitativa dell'area cellulare muscolare della parete corporea e della lunghezza delle fibre rivela difetti significativi a seguito di mutazioni nei geni correlati alla CMT2

La mutazione nei geni MFN2, DNM2 e KIF5A ha dimostrato di causare Charcot-Marie-Tooth di tipo 2 (CMT2), una forma assonale della neuropatia periferica ereditata più comune18,19. CMT2 è comunemente associata a debolezza muscolare distale lentamente progressiva e atrofia, danno sensoriale distale, deformità del piede e andatura secondaria della steppage. Di conseguenza, i pazienti spesso soffrono di disabilità di mobilità per tutta la vita debilitanti. Attualmente non esiste una cura per la malattia, in parte a causa dell'eterogeneità genetica e clinica associata alla CMT219, così come la mancanza di modelli animali per studiare la fisiofisiologia della malattia. Quindi, l'utilizzo di modelli animali per comprendere i difetti cellulari sottostanti può fornire risposte ai meccanismi sconosciuti della malattia di CMT2.

Finora, gli studi pubblicati che valutano i difetti muscolari della parete del corpo in C. elegans hanno fatto affidamento sul punteggio visivo piuttosto che sulle misurazioni quantitative20. Al fine di evitare pregiudizi soggettivi che possono verificarsi durante la valutazione qualitativa, le misurazioni quantitative dell'area muscolare della parete del corpo e della lunghezza della fibra di miosina sono state sperimentate utilizzando programmi di elaborazione delle immagini disponibili. Abbiamo usato questi metodi per valutare la morfologia muscolare negli animali che trasportano mutazioni nei geni fzo-1/MFN2, dyn-1/DNM2 e unc-116/KIF5A nei geni Adulti C. elegansdi 3 giorni . Per entrambe le misurazioni, sono state applicate una serie di condizioni, in modo che almeno una singola cellula muscolare oblique completa fosse in vista, le cellule muscolari che erano fuzzy o fuori fuoco sono state escluse, e le regioni estreme e posteriori anteriori, così come le regioni adiacenti a le vulva sono state omesse. Oltre alle mutazioni nei geni associati a CMT2, gli animali trasportavano anche il transgene stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 - rol-6(su1006)) che etichetta una sottounità a catena pesante C. elegans myosin con GFP (Figura 2A-E). Il semplice strumento poligono nel software Fiji9 (versione 2.0.0) è stato utilizzato per misurare l'area di una singola cellula muscolare. Se un animale ha sperimentato la ripartizione della struttura muscolare della parete del corpo, lasciando dietro di sé spazi vuoti all'interno delle cellule muscolari, è stato calcolato il rapporto tra l'area di gap e l'area totale delle singole cellule muscolari, e confrontato con il controllo di tipo selvaggio (Figura 3A). Per ottenere le misurazioni della lunghezza della fibra di miosina, ogni immagine è stata prima segmentata utilizzando il software ilastik10 (versione 1.3.0) (Figura 3B). La segmentazione è un processo che permette alle singole fibre muscolari di essere classificate e separate da sezioni indesiderate come lo sfondo. Dopo la segmentazione, l'immagine è stata esportata come immagine binaria a 8 bit non assegnata. Fiji (versione 2.0.0) è stato successivamente utilizzato per Scheletrizzare l'immagine binaria per filtrare i pixel del bordo, lasciando dietro di sé frammenti che rappresentano le fibre originali. Le lunghezze dei rami degli scheletri, o singoli filamenti di miosina, sono stati poi analizzati nelle Fiji. Sono state escluse le misure di lunghezza di 0 o più di 250 m, che è la lunghezza massima ragionevole per un filamento anche con stretching muscolare. Complessivamente, sono state misurate tra 2000 e 3000 lunghezze di fibra di miosina. Un riepilogo del flusso di lavoro di segmentazione è illustrato nella figura 3B. I risultati dell'analisi quantitativa sono stati ulteriormente confrontati con il punteggio visivo dei difetti muscolari della parete del corpo, dove gli animali di 3 giorni sono stati classificati come difettosi o non difettosi in base all'integrità della struttura muscolare.

Sono stati osservati difetti nella morfologia muscolare della parete del corpo tra 2,5 e 3,5 volte più alti in fzo-1 (cjn020), dyn-1(ky51) e unc-116(e2310) rispetto agli animali selvatici durante la valutazione visiva (Figura 4A). La maggior parte degli animali con mutazioni in fzo-1 e unc-116 ha subito una cospicua perdita di striature muscolari, grandi GFP a causa dell'accumulo di detriti cellulari e degenerazione della fibra muscolare che ha lasciato spazio all'interno delle cellule muscolari ( Figura 2C,E). Al contrario, mentre più del 60% dei mutanti dyn-1 sono stati segnati visivamente difettosi, l'entità dei difetti era minima rispetto agli altri due mutanti genetici. C'è stata solo una leggera perdita di striature, nessuna aggregazione GFP e solo una degenerazione muscolare minore rispetto agli altri due mutanti (Figura 2D e Figura 4A). Come per altri punti fenotipici, l'entità dei difetti non poteva essere considerata e una tendenza alla distorsione potrebbe causare la registrazione di una percentuale più elevata di difetti. Pertanto, le misurazioni quantitative dell'area delle cellule muscolari e della lunghezza della fibra fornirebbero una rappresentazione più accurata dell'estensione dei difetti muscolari rispetto alla sola valutazione visiva. In linea con le grandi lacune osservate con il punteggio visivo, il rapporto tra l'area di gap e l'area totale delle singole cellule è stato indicato essere da 5 a 6 volte superiore negli animali mutanti fzo-1 e unc-116 rispetto al gruppo wild-type, che ha sperimentato solo trascurabile ripartizione della struttura muscolare (Figura 4B). La mancanza di collasso strutturale nei mutanti dyn-1 ha provocato un aumento non significativo, di 3 volte, del rapporto tra le celle muscolari e l'area delle cellule muscolari (Figura 4B). Ciò indica anche che la distorsione degli sperimentatori potrebbe essere un fattore che contribuisce all'alta percentuale di difetti assegnati dalla valutazione qualitativa. Tuttavia, le piccole lacune diminuirono la lunghezza media delle fibre da 24 m in wild-type a 22 m nei mutanti dyn-1 (Figura 4C). La lunghezza media delle fibre era drammaticamente più corta nei mutanti fzo-1 e unc-116, in correlazione con la presenza di gap maggiori all'interno delle cellule muscolari degeneranti in questi animali (Figura 2C,E e Figura 4C ). Questi risultati sono coerenti con i nostri recenti risultati che studiano gli effetti della mutazione dei geni asscoiati di CMT2 in C. elegans20. Inoltre, evidenziano la valutazione più precisa della morfologia muscolare utilizzando questi metodi quantitativi rispetto al solo punteggio visivo, e forniscono la prova che fzo-1 e unc-116 sono necessari per la normale morfologia muscolare.

Misurazioni quantitative della morfologia mitocondriale utilizzando la segmentazione degli oggetti SQUASSH

Per capire come l'assenza di fissione mitocondriale influenzi la morfologia mitocondriale nei neuroni C. elegans, abbiamo eseguito analisi quantitative nei neuroni meccanosensoriali PLM. DRP-1, l'ortologo C. elegans della proteina 1 (DRP1) correlata al mammifero Dynamin controlla la fissione mitocondriale, dove al momento dell'attivazione viene reclutata dal citosol per formare una spirale intorno ai mitocondri, restringendo e infine recidendo sia le membrane mitocondriali interne ed esterne21,22. Abbiamo etichettato fluorescentmente i mitocondri con un transgene specifico del tessuto nei neuroni PLM, che hanno un lungo processo assonale che può essere facilmente visualizzato utilizzando la microscopia a epifluorescenza. Si ipotizza una perdita di fissione per interrompere la dinamica mitocondriale complessiva, e quindi diminuire la creazione di mitocondri più recenti e più piccoli attraverso un processo noto come germogliamento23.

Abbiamo eseguito la segmentazione SQUASSH per confrontare la morfologia mitocondriale in animali mutanti di tipo selvatico e drp-1. Abbiamo analizzato i mitocondri da 6 neuroni PLM per genotipo, risultando in un valore n di maggiore di 200 mitocondri per ciascuno. Le immagini schematiche e rappresentative sono illustrate nella figura 5A,B. Abbiamo scoperto che i mutanti privi di DRP-1 avevano mitocondri più grandi e allungati (Figura 5B-F). I mitocondri, sullo sfondo dei muti drp-1, erano più grandi del 32% rispetto a quelli di tipo selvaggio (P - 0,0006, Figura 5C) e il 14% più allungati (più lontano da un cerchio perfetto) (P < 0.0001, Figura 5D). Per una valutazione più dettagliata della varianza per dimensioni e forma, abbiamo tracciato gli istogrammi per ogni misura, adattando i dati alle distribuzioni gaussiane (Figura 5E,F). Abbiamo scoperto che sia per le dimensioni che per la circolarità, i mutanti privi della proteina fissile avevano una varianza maggiore (p < 0.0001 per entrambi), evidenziata dalla presenza di reti mitocondri/mitocondri "figura 5Bii per esempi" ). Nel complesso, abbiamo trovato prove che suggeriscono che la mutazione di drp-1 causa una mancanza di fissione all'interno dei neuroni PLM, con conseguente mitocondri più grandi e più allungati. Abbiamo anche dimostrato che la rottura della fissione mitocondriale causa un aumento della varianza della morfologia mitocondriale.

Figure 1
Figura 1: Quantificazione dell'integrità delle sinapsi nei neuroni PLM. (A) Le immagini sono proiezioni z massime della regione sinaptica PLM in un animale non transgenico. Il pannello di sinistra mostra il neurone PLM etichettato con tagRFP, il secondo pannello mostra l'area pre-sinaptica etichettata con SNB-1::GFP, la terza immagine è una sovrapposizione con co-localizzazione rappresentata in giallo e il quarto pannello è uno schema della sovrapposizione dell'immagine. (B) Immagini confocali di proiezione z massima della regione sinaptica in animali sovraespereti MEC-17. Le immagini sono visualizzate in base al pannello A. (C) Quantificazione delle dimensioni della regione presinaptica in animali non transgenici rispetto agli animali transgenici che sovraesprimono MEC-17. (D) Quantificazione dei livelli di fluorescenza integrati relativi della BNSC-1::GFP negli animali non transgenici rispetto agli animali transgenici che sovraesprimono meC-17. Per (C) e (D), le singole sinapsi analizzate sono rappresentate da cerchi; n n 10; (a.s.) in nero. Valori P : < 0,05, < 0,01 da test tnon accoppiati; barre della scala rappresentano 2 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Visualizzazione dei muscoli della parete del corpo C. elegans . (A) Un animale che esprime il transgene stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 - rol-6(su1006)), che etichetta la catena pesante di miosina con GFP nei muscoli della parete del corpo. L'array induce anche un fenotipo rotolante nell'animale che facilita la visualizzazione delle cellule muscolari disposte lungo i lati dorsali e ventrali del corpo. Rappresentante ingrandito vista delle fibre di miosina in (B) wild-type, (C) fzo-1(cjn020), (D) dyn-1(ky51) e (E) unc-116(e2310) animali. Tutti gli animali sono stati immagini nella fase adulta di 3 giorni. La barra della scala rappresenta 60 m di a3, e 30 m di Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Misurazione dell'area muscolare della parete del corpo e della lunghezza della fibra utilizzando gli algoritmi computazionalidisponibili. (A) Immagine di esempio che dimostra come lo spazio di spazio interno all'interno di una singola cella muscolare (inchiusa in rosso) e l'area dell'intera cella (inchiusa in giallo) vengono disegnati e calcolati in Fiji per ottenere il rapporto dell'area muscolare. (B) Struttura del protocollo di segmentazione su una singola immagine di esempio utilizzando una combinazione di Figi e ilastik. La barra della scala rappresenta 30 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Qualifica e quantificazione dei difetti muscolari della parete del corpo. (A) Valutazione visiva dei difetti muscolari della parete corporea. (B) Confronto tra l'area vuota e il rapporto totale delle cellule muscolari tra WT e mutanti indicati. (C) Misurazione della lunghezza della fibra di miosina. Per (B) e (C), solo le immagini con almeno una cellula muscolare oblique visibile completa sono state incluse per l'analisi. Sono state escluse anche le fibre con lunghezza superiore a 0 m o superiori a 250 m. Le barre rappresentano la percentuale di animali difettosi in (A) e la media S.E.M. in (B) e (C); n valori elencati in ogni barra. Sono stati eseguiti test chi-quadrati con falso tasso di scoperta per confrontare i difetti visivi in (A), mentre ANOVA unidirezionale con i test post hoc di Dunnett per il confronto multiplo è stato utilizzato per analizzare le misurazioni quantitative in (B) e (C). -P < 0,05, SR < 0,0001, ns - non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: morfologia mitocondriale all'interno degli assoni dei neuroni PLM. (A) Schematico di un neurone meccanosensoriale del microtubulo laterale posteriore (PLM) nella coda di C. elegans. La casella rossa indica la posizione approssimativa delle sezioni evidenziate in (B),che mostrano immagini rappresentative di GFP etichettati mitocondri (Pmec-4::MLS::GFP) all'interno dell'assone PLM. I puncta verdi brillanti indicano mitocondri. Rispetto ai mutanti WT (i), drp-1(tm1108) mostrano mitocondri più grandi e allungati. Le immagini sono rappresentative di n - 6 assoni PLM da 6 vermi per genotipo; barre della scala: 15 m. (C) Dimensione media (M2) della mitocondria individuale quantificata dalla segmentazione degli oggetti SQUASSH nei vermi adulti di 3 giorni (3DOA). (D) Circolarità media del mitocondrio individuale all'interno dell'assone PLM, come quantificato dalle misurazioni degli oggetti SQUASSH in 3DOA. (E) Istogramma e distribuzione gaussiana che mostra la varianza delle dimensioni mitocondriali. Il test F (P < 0.0001) mostra che le varianze sono significativamente diverse tra l'istogramma drp-1 e WT. (F) e la distribuzione gaussiana che mostra la varianza della circolarità mitocondriale. I dati sono rappresentati come media "/- SEM. n - 204 mitocondri per l'analisi quantitativa da n s 6 vermi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome deformazione genotipo fonte referenza #
BXN038 (in n. B) uIs115(Pmec-17::tagRFP); jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP) Laboratorio Neumann 7 (in questo stato
BXN366 fzo-1(cjn020); myo-3(st386); zdIs5(Pmec-4::GFP); stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 : rol-6 (su1006)) Laboratorio Neumann 20 anni
BXN419 (in n) drp-1(tm1108); jsIs609(Pmec-4::MLS::GFP); uIs115(Pmec-17::tagRFP) Laboratorio Neumann 7 (in questo stato
BXN507 (in n) cjnEx036(Pmec-4::mec-17, Pmyo-2::mCherry); jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP); lin-15B&lin-15A(n765); uIs115(Pmec-17::tagRFP) Laboratorio Neumann 17 mi lato
BXN675 (in inglese) unc-116(e2310); myo-3(st386); stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 : rol-6 (su1006)) Laboratorio Neumann 20 anni
BXN685 (in inglese) dyn-1(ky51); myo-3(st386); stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 : rol-6 (su1006)) Laboratorio Neumann 20 anni
NM664 jsIs37(Pmec-7::snb-1::GFP); lin-15B&lin-15A(n765) Caenorhabditides Centro di Genetica 6 È possibile:
RW1596 myo-3(st386); stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 : rol-6 (su1006)) Caenorhabditides Centro di Genetica 8 (IN vio
TU4065 uIs115(Pmec-17::tagRFP) Martin Chalfie 5 Del numero 3(

Tabella 1. Elenco dei ceppi di C. elegans utilizzati in questo studio.

Immagini assone PLM
obiettivo 40x
Risoluzione dell'immagine (per pannello per tilescan) 3224 x 3224
Dimensioni della finestra di rimozione dello sfondo 20 anni
PSF xy 0,78 (in questo 0,00)
PSF z 0,68 (in inglese)
Regolarizzazione 0.15
Intensità di fluorescenza minima della GFP 0,4 0

Tabella 2. Parametri SQUASSH per la segmentazione dei mitocondri.

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Discussion

Le variazioni morfologiche sono state frequentemente valutate attraverso il conteggio manuale di differenze evidenti o utilizzando soglie arbitrarie per determinare i difetti rispetto a un fenotipo di tipo selvaggio. Più recentemente, tuttavia, sono stati utilizzati metodi quantitativi per studi comparativi di morfologia per misurare e descrivere con precisione i cambiamenti a livello cellulare e subcellulare in modo imparziale. La capacità di identificare differenze sottili ma biologicamente rilevanti tra i fenotipi è un potente mezzo per comprendere i meccanismi molecolari sottostanti che controllano i cambiamenti nella morfologia causati da fattori ambientali o malattie genetiche. Il continuo aumento della potenza di calcolo e della risoluzione dell'imaging microscopio, unito alla facilità di crescita e alla versatilità della genetica Di C. elegans, ha fornito la piattaforma perfetta per la combinazione di sofisticati ma liberi software di imaging con belle immagini confocali dettagliate. Qui, abbiamo dimostrato metodi per valutare e quantificare le dimensioni sinaptiche e la localizzazione delle proteine, l'area muscolare della parete del corpo e la lunghezza della fibra e la morfologia mitocondriale in una serie di background genetici.

Mentre queste analisi hanno dimostrato la capacità di quantificare sottili differenze morfologiche, ci sono limitazioni. Sebbene ognuna di queste analisi si utilizzi di software open source e prontamente disponibile, si basa su immagini nitide e di alta qualità per risolvere con precisione le strutture cellulari e gli organelli subcellulari. Questo può spesso essere un passo limitante, poiché sono necessarie apparecchiature sensibili di fascia alta, come i microscopi confocali con rilevatori avanzati, per catturare immagini con risoluzione soddisfacente. Questi non sono sempre accessibili ai laboratori, e l'analisi con la tecnologia sub-par può portare a risultati imprecisi e irripetibili. Inoltre, mentre ogni tecnica mira a ridurre la distorsione degli sperimentatori utilizzando algoritmi informatici, ci sono ancora passaggi che possono coinvolgere un elemento di errore umano. La definizione manuale della sinapsi a mano, la delineazione dell'area delle cellule muscolari, le ottimizzazioni dei parametri della segmentazione mitocondriale per occhio sono tutte aree che possono essere migliorate in questo senso. Per ridurre la possibilità di errore umano, gli studi potrebbero essere condotti in modo cieco o in alternativa software di analisi delle immagini potrebbe essere utilizzato per definire la regione di interesse stesso. L'uso di maschere cellulari, in cui l'area desiderata per l'analisi è definita dalla fluorescenza a una diversa lunghezza d'onda, può aiutare questo. Viene utilizzato per limitare l'analisi a una sezione di un'immagine che mostra fluorescenza al di sopra di una soglia prestabilita, ad esempio il nucleo di una cella o una cella trasfetata13,24. Inoltre, l'uso di immagini a singolo punto orario limita le domande che queste tecniche possono affrontare. I processi che governano la morfologia dell'orgello, la formazione delle sinapsi e la struttura muscolare sono molto probabilmente dinamici, e le differenze possono essere viste all'interno della stessa cellula a seconda dello stato di sviluppo o biologico. L'analisi di queste strutture in un punto finale specifico può quindi essere limitante e l'imaging time-lapse sarebbe utile per il monitoraggio dei cambiamenti strutturali nel tempo. Infine, mentre i cambiamenti morfologici possono essere un buon indicatore di interruzione nei processi cellulari, la correlazione non è sempre implicita. Ad esempio, recenti scoperte in diverse specie hanno dimostrato che la funzione mitocondriale e la forma possono effettivamente essere dissociate7,25. Pertanto, ulteriori analisi devono essere presi in considerazione quando si deducono cambiamenti funzionali come risultato di differenze morfologiche.

Siamo stati in grado di dimostrare l'uso di queste tecniche quantitative in un particolare insieme di tessuti e provenienze genetiche; tuttavia, il loro utilizzo può essere applicato in modo più ampio. La quantificazione della fluorescenza tramite software di imaging può essere utilizzata per analizzare una serie di diversi organelli subcellulari come nuclei ed endosomi, o diverse strutture come neuroni e cellule epiteliali, il tutto nel contesto di diversi mutanti o malattie Sfondi.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgments

Ringraziamo i membri del laboratorio Neumann per preziose discussioni e contributi. Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440). Gli autori ringraziano WormBase per la sua ricchezza di informazioni su C. eleganse riconoscono Monash Micro Imaging, Monash University, per la fornitura di strumentazione, formazione e supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca CMTAA (2015 e 2018), e NHMRC Project Grants 1101974 e 1099690 assegnato a B.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-agar Merck 1.01614.1000
Agarose Invitrogen 16500-500
Confocal microscope Leica TCS SP8 Inverted platform
Fluorescence microscope Carl Zeiss AG Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1 Thermo scientifique MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5 Zeiss 474030-9000-000 Made by SCHOTT
Glass slides Thermo scientifique MENS41104A/40
Light LED Schott KL 300 LED
Stereo Microscope Olympus SZ51
Tryptone (Peptone from casein) Merck 107213 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract Merck 103753 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat) Merck 107214 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar Sigma A1296 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol Sigma C8667-25G Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride Merck 102382 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate Merck 105886 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate Merck 105101 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate Merck 106586 Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate Merck 105886 Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette Corning CLS7095D5X-200EA
Petri dishes Corning CLS430589-500EA
Platinum wire Sigma 267201-2G
Spatula Met-app 2616
Tetramisole hydrochloride Sigma L9756-5G

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References

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Biologia Numero 149 Caenorhabditis elegans misurazioni quantitative imaging morfologia sinaptica muscolo della parete corporea lunghezza della miosina morfologia mitocondriale malattia di Charcot-Marie-Tooth
Approcci quantitativi per studiare le strutture cellulari e la morfologia delle orgine in <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Teoh, J. S., Soh, M. S., Byrne, J.More

Teoh, J. S., Soh, M. S., Byrne, J. J., Neumann, B. Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (149), e59978, doi:10.3791/59978 (2019).

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