Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitative tilnærminger for Studying Cellular strukturer og organelle morfologi i Caenorhabditis elegans

Published: July 5, 2019 doi: 10.3791/59978
* These authors contributed equally

Summary

Denne studien skisserer kvantitative målinger av Synaptic størrelse og lokalisering, muskel morfologi, og mitokondrie form i C. elegans bruke fritt tilgjengelige bildebehandlingsverktøy. Denne tilnærmingen gjør at fremtidige studier i C. elegans til kvantitativt sammenligne omfanget av vev og organelle strukturelle endringer som følge av genetiske mutasjoner.

Abstract

Definere cellulære mekanismer underliggende sykdom er avgjørende for utviklingen av romanen legemiddel selskap. En strategi ofte brukt til å løse disse mekanismene er å innføre mutasjoner i kandidat gener og kvalitativt beskrive endringer i morfologi av vev og cellulære organeller. Kvalitative beskrivelser kan imidlertid ikke fange subtile fenotypiske forskjeller, kan uriktige opplysninger fenotypiske variasjoner på tvers av individer i en befolkning, og er ofte vurdert subjektivt. Her er kvantitative tilnærminger beskrevet for å studere morfologi av vev og organeller i nematode Caenorhabditis elegans ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi mikroskopi kombinert med kommersielt tilgjengelig bio-image prosessering programvare. En kvantitativ analyse av fenotyper som påvirker synapse integritet (størrelse og integrerte fluorescens nivåer), muskelutvikling (muskel Cellestørrelse og myosin filament lengde), og mitokondrie morfologi (sirkularitet og størrelse) ble utført for å forstå virkningene av genetiske mutasjoner på disse cellulære strukturer. Disse kvantitative tilnærmingene er ikke begrenset til programmene som er beskrevet her, da de lett kunne brukes til å kvantitativt vurdere morfologi av andre vev og organeller i nematode, så vel som i andre modell organismer.

Introduction

Den nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) blir i økende grad benyttet som et modell system for å avdekke de biologiske og molekylære prosessene som er involvert i menneskelig sykdom. En voksen nematode har en kropp lengde på litt over 1 mm, og kan produsere et stort kull på opptil 300 egg1. Etter klekking, C. elegans bare kreve 3-4 dager å nå voksen alder, og leve for rundt 2 til 3 uker2. På grunn av sin enkle dyrking, er C. elegans for tiden en av de mest ettertraktede in vivo dyremodeller for å gjennomføre kostnadseffektiv, rask narkotika screening for å identifisere legemiddel legemidler for menneskelige sykdommer. I tillegg sin genetiske bevaring, veldefinert atferds paradigmer, transparent kropp for fluorescens eller lys mikroskopi, og enkel genetisk manipulasjon gjør studiet av cellulære og molekylære konsekvenser av genetiske mutasjoner lett achieveable 3. The C. elegans Genova aksjer ca 60-80% orthology med menneskelige gener, og ca 40% av disse genene er kjent for å være sykdom-relatert. Noen av menneskelige sykdommer som har blitt modellert og studert i C. elegans inkluderer nevrodegenerative lidelser (Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, Charcot-Marie-Tooth sykdom), muskel-assosiert sykdommer ( Duchenne muskuløse dystrofi), og metabolske sykdommer (hyperglykemi)2,4. I de fleste menneskelige lidelser, sykdom-indusert cellulære og organelle lokalisering og morfologiske endringer oppstår, som lett kan evalueres i nematode modellen.

Fluorescerende markører har blitt mye brukt til å merke vev og organeller for dynamisk visualisering under mikroskopet. Men i C. elegans, konvensjonelle metoder som vurderer morfologiske uregelmessigheter på grunn av genetiske mutasjoner har i stor grad avhengig av visuelle beskrivelser. Mens kvalitative vurderinger kan dekke bredere spekter av fenotypiske beskrivelser (Synaptic morfologi, GFP klumper, spesifikk axonal form, muskel fiber tykkelse, etc.) og gir et fugleperspektiv av morfologiske endringer, de er mindre godt egnet for sammenligne små variasjoner på tvers av ulike grupper. Videre er kvalitative vurderinger basert på visuell, subjektiv evaluering, som kan føre til over-eller under estimater av morfologiske misdannelser. Til slutt kan kvalitative observasjoner også variere mye mellom individer, skape vanskeligheter med datareplikering.

I de senere årene, en rekke brukervennlige, lett tilgjengelige beregningsorientert algoritmer som kan kvantitativt analysere bildene er utviklet. Men, utnyttelse av slike bildeanalyse programvare for noen morfologiske studier, spesielt i forhold til kroppen veggen muskler og mitokondrier, i C. elegans forskning har ligget bak. For å forbedre underliggende strukturelle analyser i C. elegans, noen av de lett tilgjengelige, åpen kildekode bildeanalyse programvare ble trialed å kvantitativt sammenligne virkningene av genetiske mutasjoner på muskel mitokondrier, kropp veggen muskel og Synaptic Morfologi. Disse eksperimentelle prosedyrer skissere i detalj hvordan disse programmene (Fiji, ilastik, CellProfiler, SQUASSH) kan brukes til å evaluere endringer i Synaptic størrelse og Synaptic protein lokalisering, kropp veggen muskelområdet og fiber lengde, og mitokondrie størrelse og sirkularitet som følge av genetiske mutasjoner i nematode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. vekst og vedlikehold av C. elegans stammer

  1. Seed nematode vekst medium (NGM, se tabell av materialer) agar plater med 300 μL av den sakte voksende E. coli stamme OP50 i et laminær Flow kabinett.
  2. La NGM agar platene i laminær Flow kabinett til tørk.
    Merk: i fravær av laminær Flow kabinett, kan platene overlates til tørk på benken, men de er mer utsatt for forurensning.
  3. Overfør minst 20 dyr til hver av to OP50-seeded NGM agar plater å ha arbeids aksjer. Det er to hovedtyper måter å overføre dyr.
    1. Plukking: Løft dyrene forsiktig ved hjelp av en varme sterilisert hakke. Denne metoden er effektiv for å velge individuelle eller flere dyr fra en agar plate. Å ha en liten skrape av bakterier på spissen når plukke hjelper overføringen.
      Merk: en hakke er laget av et lite stykke Platinum wire ca 4 cm lang som er innebygd i et glass pipette, med wire spissen flatet å være "spyd-lignende". Varm-sterilisere plukking mellom plukking for å hindre krysskontaminering.
    2. Chunking: ved hjelp av en sterilisert slikkepott, kutt en liten firkant av agar som inneholder dyrene fra en tallerken og overføres opp-ned til en ny plate.
      Merknader: denne metoden er generelt nyttig for overføring av et stort antall ormer, og for å fjerne forurensning fra plater gjennom flere runder med chunking ikke-forurenset agar. Unngå krysskontaminering av Flaming slikkepott i noen sekunder og dyppe slikkepott i 100% etanol mellom overføringer. Overføring fra sultet plater er ikke anbefalt som sult og overbefolkning kan påvirke helsen og morfologi av cellulære og subcellulære strukturer.
  4. Oppretthold ormene ved standard vekst temperatur (20 ° c). For å sikre kontinuerlig tilførsel av godt matet ormer, overføre ormer til nye OP50-seeded plater hver 2 til 3 dager.

2. alder-synkronisering C. elegans

  1. Opprettholde ormer på 3-4 NGM plater til befolkningen er overfylt, men ikke sultet.
  2. Forsiktig vaske ormer av NGM plate med M9 løsning. Eggene vil forbli på tallerkenen siden de holder seg til E. COLI OP50. Gjenta med fire ekstra vasketrinn for å fjerne alle klekket dyr.
  3. La ormer til å klekkes i 40 min.
  4. Tilsett 1-2 mL av M9 løsning på tallerkenen og forsiktig virvel å løsne nylig klekket ormer.
  5. Samle M9 løsning med nylig født ormer og overføre løsningen med ormer til en frisk NGM plate.
  6. La M9-løsningen fordampe ved å utsette NGM-platen for luft. Gjør dette ved siden av en åpen flamme for å unngå forurensning av NGM-platen.
  7. Øk ormer for 27 t ved 20 ° c for å tillate utvikling i den tredje larvestadiet (L3) scenen. For synkron 3-dagers gamle voksne dyr, er ormene plukket på larvestadiet trinn 4, og vokst for ytterligere 3 dager for å nå 3-dagers gamle voksen scenen.

3. utarbeidelse av lysbilder for bildebehandling

  1. Forbered 3-4% w/v agarose lager i en flaske med mikrobølgeovn (3-4 g i 100 mL ultrarent vann).
    Merk: agar kan brukes i stedet for agarose ved samme konsentrasjon.
  2. Smelt agarose forsiktig i en mikrobølgeovn, ta vare ikke å over koke, før alle agarose oppløses (klar løsning). Oppbevar løsningen på 70 ° c for å hindre herding.
    Merk: Agarose lager kan brukes flere ganger. Varm før bruk hvis agarose har befestet.
  3. Med en pipette med Pasteur kan du plassere en dråpe smeltet agarose på et objektglass.
    Merk: unngå å ha luftbobler i dråpe agar som disse forstyrre integriteten til puten.
  4. Trykk umiddelbart ned agarose dråpe med et annet mikroskop lysbilde, forsiktig flatere agarose inn i en pute mellom de to lysbildene.
    Merk: eventuelle rester av bobler bør fjernes på dette stadiet. Hvis ikke, bør nye lysbilder gjøres som dyr kan lett bli sittende fast i boblene. Unngå overløp av agar til siden når du trykker på lysbildet.
  5. La agarose tørke i 1 min.
  6. Skill de to lysbildene forsiktig, slik at du unngår å skade agarose, samtidig som du går ut av puten på et av lysbildene.
    Merk: lysbilder med agarose pads bør alltid være forberedt friskt like før eksperimentet som de kan tørke ut. Kontroller at agarose puten har en jevn tykkelse. Det bør ikke være luftbobler eller sprekker i puten, da dette kan forstyrre bildebehandling.
  7. Legg til en liten dråpe (5-10 μL) på 0,05% tetramisole hydrochloride (bedøvelse) til midten av agarose puten.
  8. Ved hjelp av varme sterilisert plukke, raskt overføre rundt 10-15 dyr fra lager platen til anestesi dråpe før løsningen tørker ut. Unngå å overføre for mye OP50 bakterier da dette gjør løsningen skyet, noe som kan forstyrre bildebehandling.
    Merk: Hvis anestesi løsningen tørker ut mens du plukker, bare pipette en andre dråpe 0,05% tetramisole hydrochloride på dyrene. Dyrene har en tendens til å legge på sin lateral side i bedøvelse løsning.
  9. Påfør en dekkglass ved å plassere den like over agarose puten og forsiktig slippe den ned. Dette vil hindre dannelse av bobler. Ikke Påfør Trykk på dekkglass da dette kan knuse dyrene.
  10. Merk lysbildene med strekk navnet.

4. vurdering av Synaptic morfologi

Merk: effekten av MEC-17 overuttrykte på synapse integritet i bakre lateral mikrotubulinettverket (PLM) touch reseptor neurons ble studert ved kvantifisere av Synaptic størrelse og lokalisering ved hjelp av linjeskanning konfokalmikroskopi mikroskopi. PLM neurons (inkludert Synaptic regionene) ble visualisere ved hjelp av uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) transgene (STAMME: TU40655) og Synaptic-regionen var spesielt merket med jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP) (stamme: NM664 6i det . Denne studien ble utført i synkroniserte L3-ikke-transgene-og transgene-dyr av extrachromosomal MEC-17 overuttrykte stamme BXN507 [cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37; uIs115]7. En fullstendig liste over belastninger som brukes i denne studien er inkludert i tabell 1.

  1. Konfokalmikroskopi avbildning av berøring reseptor Nevron synapser
    1. Hvis du vil avbilde Synaptic regionene, bruk en linjeskanning konfokalmikroskopi mikroskop koplet til en 488 NM og 552 NM optisk pumpet semi-dirigent Diode Laser og utstyrt med bilde fange programvare.
    2. Finn ormene med lavest forstørrelse.
    3. Når dyrene er vellykket plassert, bytte til en 40X forstørrelse og søke nedsenking medium (i denne studien: en 40X/1.10 HC PL APO CS2 multi-oppslukende mål med nedsenking i vann ble brukt).
    4. Visualisere Synaptic regionen ved spennende fluorophores med en 488 NM laser (2% strøm) for GFP fluoroforen og 552 NM (1% strøm) for tagRFP fluoroforen.
    5. Bestem optimal x og y ramme å fange hele Synaptic regionen. Sørg for å vurdere den optimale pikselstørrelsen når du velger rammen. I denne studien ble det oppnådd en konsistent pikselstørrelse på 56 NM.
    6. Ta bilder ved hjelp av en hybrid Foto-detektor og sett gevinsten for å hindre at fluorophores (100% for 488 NM eksitasjon og 15% for 552 NM eksitasjon).
    7. Samle z-stack-bilder for å dekke hele synapse, ved å bruke den optimale z-trinn størrelsen avhengig av den spesifikke målsettingen som brukes. I denne studien ble det brukt en optimal z-trinns størrelse på 0,211 NM.
      Merk: Sørg for at alle bilder er tatt under strenge vilkår for å tillate integrert fluorescens kvantifisering og sammenligning. Dette kan gjøres ved å holde mikroskopi parametere identiske på tvers av alle innspilte bilder (dvs. laser-og detektor innstillinger, pikselstørrelse, skannehastighet og optimal z-trinns størrelse). Optimale innstillinger avhenger av målsettingen og kan beregnes ved hjelp av tilgjengelige bioinformatikk programmer, for eksempel Nyquist kalkulator (https://svi.nl/NyquistCalculator). Avmerke profilen systematisk, denne ville være nyttig når benytter bioinformatikk programvare det vill organisere og forarbeide fil-størrelse basert på filnavn.
  2. Kvantifisering i Synaptic regionen
    1. Hvis du vil analysere Synaptic-regionen, eksporterer du bilder som TIFF-filer. Java basert tenkelig bearbeiding programvare som ImageJ, kan brukes (i denne studere, det MRI image omdanne makroen inne ImageJ var anvendt).
    2. Størrelsen og den integrerte fluorescens intensitet nivåer av synapser ble målt fra summen intensiteten av oppnådde z-stabler med CellProfiler-3.1.5. Legg bildene i CellProfiler 3.1.5 programvare. Hvis det er nødvendig, kan bilder filtreres basert på bildefilnavn.
    3. Sett opp modulen navn og type. Alternativt kan du trekke ut metadataene fra bilde etiketten for å organisere beregnede data i henhold til dette.
    4. Bestem Synaptic regionen for hånd definisjon av denne regionen ved hjelp av diffus tagRFP uttrykt fra uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) transgene. Dette kan gjøres ved å legge til angående-modulen til CellProfiler-3.1.5 rørledning.
    5. Hvis du vil måle størrelsen og fluorescens på hånd definerte synapse, legger du til mål objekt størrelsen og- formen og måler objekt intensitet modulen til rørledningen.
    6. Beregn den relative integrerte fluorescens intensiteten ved å legge til Beregn matte modulen. Del de integrerte intensitet enhetene innhentet fra jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP) av de integrerte enhetene innhentet for uIs115 (Pmec-17:: tagRFP).
    7. Eksporter målinger og beregninger.

5. kvantifisere kropps vegg muskel struktur

  1. Fluorescens bilde av kroppens vegg muskel struktur
    1. Få en belastning (for eksempel RW1596) som frakter transgene stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: Myo-3 + ROL-6 (su1006))8, som merker myosin fibre med gfp.
      Merk: innføring av transgene i dyr kan oppnås ved enten å krysse en stamme av interesse med dyr som allerede uttrykker transgene, eller microinjecting DNA i den gonad armen. The ' rullende ' fenotype indusert av ROL-6 mutasjon i denne transgene forenkler visualisering av musklene. Kroppen veggen musklene går langs rygg og ventrale sider som normalt utelukket fra visningen i vill-type dyr fordi de vanligvis ligger på en av sine laterale sider. Den ROL-6 (su1006) allel induserer vridning av dyrene, og dermed utsette noen muskler celler for Imaging.
    2. Image dyrene ved hjelp av en fluorescens mikroskop kombinert med en høy oppløsning ladet kombinert enhet kamera (CCD), 40X objektiv eller høyere, GFP filter og oppkjøp programvare.
    3. Juster eksponeringstid og lys intensitet for å forhindre overmettet bilder.
    4. Fange og bevare profilen av muskelen (400X forstørrelsen) fra en avdeling av det dyr inneholder det vil si ettall fullstendig synlig skrå muskelen cellen. Unngå områder med en enkelt muskel celle som er ufullstendig eller inndelinger som er ute av fokus. Også ekskludere bilder fra ekstreme fremre og bakre områder, og områder ved siden av snappe.
      Merk: Hvis dyret ikke har en eneste synlig komplett muskel celle, forsiktig Skyv dekkglass å slå dyret slik utsette en komplett celle.
  2. Måling av muskel celleområdet
    1. Åpne bildet i Fiji programvare9 (versjon 2.0.0 ble brukt i denne studien).
    2. Bruk mangekantet utvalg til å spore nøye rundt en enkelt skrå muskel celle. Juster linjen på polygon på slutten ved å dra anker prikken for å forbedre sporingen.
    3. Gå til analyser -fanen øverst i programvaren, og klikk mål for å beregne området i utvalget. En egen resultat tabell som inneholder området og andre målinger, vises. Hvis arealmålingen mangler i resultattabellen, går du til Angi målinger under kategorien analyser og kontrollerer at det er merket av for område boksen. Likeledes, rotete andre målinger som ikke er nødvendig.
    4. For muskelceller med et utartet/manglende område kan du spore det manglende området med polygon markeringsverktøyet og klikke på mål igjen. Hvis det er flere hull i cellen, sporer du hvert gap separat.
    5. Beregn forholdet mellom gap området til hele enkelt muskel celle. Et høyt forhold indikerer en høyere grad av muskel degenerasjon på grunn av store hull i cellen. Hvis det ikke er noen manglende regioner, som vanlig sett i vill-type dyr, forholdet vil bli beregnet som null.
      Merk: som en kontroll, scorer også for muskel struktur defekter visuelt og sammenligne resultater med den kvantitative målingen. Dette er spesielt nyttig hvis belastningen blir undersøkt for første gang i laboratoriet. For fenotypiske scoring, vurdere dyrene som defekt eller ikke-defekt basert på integriteten til filamenter. For eksempel, dyr med tap av distinkte filament striations, GFP klumper, eller hull i muskelceller på grunn av strukturelle sammenbrudd, ville bli scoret som defekt.
  3. Segmentering og kvantifisering av myosin fiber lengde
    1. Om nødvendig, først konvertere filer til. TIF bruker Fiji eller annenprogramvare pakke. Lagre TIFF-filene på ønsket sted.
    2. Åpen ilastik10 (fri programvare, versjon 1.3.2 kan lastes ned fra https://www.ilastik.org/).
    3. Når du er i ilastik, velger du piksel klassifisering under Opprett nytt prosjekt. Programvaren vil be om at prosjektet skal lagres. Gi nytt navn til prosjektet og lagre det på ønsket sted.
      Merk: et nytt prosjekt må bare opprettes én gang. Senere segmentering kan gjøres ved hjelp av samme prosjekt. Å bruk det likt prosjekt innfatningene, gå til prosjekt tab på høyden, og falle i staver opp på åpen prosjekt å adgang prosjektet arkiv.
    4. Det bør være 5 kategorier på venstre panel (input data, funksjonsvalg, opplæring, prediksjon eksport og satsvis behandling). I Input data kategorien, klikk på Legg til ny og deretter legge til separate bilde (s). Direkte popup-vinduet til mappen som inneholder TIFF-filene, og velg bildet som skal åpnes.
    5. Inne morgendagen tab neden (ansiktstrekk utvalg), falle i staver opp på velge vise egenskaper å velge alle pixel vise egenskaper, angitt av grønn billett boksene. Piksel valget i dette trinnet brukes til å skille mellom de ulike bilde klassene i neste trinn.
      Merk: valg av piksel funksjon avhenger av bildeoppløsningen. Derfor, utviklerne foreslår å velge alle eller så mange funksjoner som mulig, hvis behandlingen makt og tid tillater.
    6. Følgende opplæring panel tillater klassifisering av ulike objektklasser basert på piksler. I dette tilfellet er de to klassene de enkelte GFP-uttrykker myosin filamenter og uønsket bakgrunn eller uskarpe kanter. Klikk på Legg til etikett for å ha den første etiketten. Rable ned over en rekke filamenter for å begynne klassifiserer trening.
      Merk: ved å dobbeltklikke på etiketten kan du endre navn (for eksempel gi etiketten 1 til filament). Hvis du dobbeltklikker den fargede boksen, kan farger for tegning og Sannsynlighets visning endres. Standardstørrelsen på pensel er 1, selv om størrelsen kan økes til 61. Hvis feil piksel er trukket, bruker du viskelærverktøyet til å fjerne tegningen. Tastaturkontroller (-) og (Shift +) kan brukes til å zoome inn og ut av bildet, henholdsvis. Piltastene brukes til å navigere rundt i bildet.
    7. Legg til en ny etikett, og endre navnet til bakgrunnen. Rable ned over uønskede bakgrunner og mellomrom mellom filamenter.
    8. Klikk på Live Update og sørg for at klassifiseringen er gjort av programvaren riktig. Legg til flere scrawls og Finjuster treningen om nødvendig.
      Merk: det er viktig å holde et øye med sammenslåtte fibre og uklare kanter (for eksempel Kroppslinje) i dette trinnet. Forbedre prediksjon her så mye som mulig for å øke nøyaktigheten av målingene. Prognosen nøyaktighet likeledes avhenger opp på image resolution, idet pixels inne lav kvalitet profilen er flere vanskelig å tease et stykke unna. Det er en likeledes frivillig bortsett fra anbefalt å løpe filteret metoden inne det foreslå vise egenskaper funksjonen nærmest bo oppdatere administrere.
    9. Når trening klassifiserer er tilstrekkelig utført, gå til prediksjon eksport panel. Klikk på Velg Eksporter bilde Innstillinger med sannsynligheter som kilde.
    10. Bruk følgende innstillinger. Cut-out under region x og y krysset, og c unticked. Start-og stopp verdiene for c skal være henholdsvis 0 og 1. Tick og konvertere datatypen i transformasjoner til usignerte 8-bit, tick renormalize [min, Max] og bruke standardverdiene. Endre formatet på utdatafilen video til PNG, og endre navn på filen og katalogen som ønsket.
    11. Lukk vinduet for eksport innstillinger, og Eksporter det spesifikke bildet som nettopp har blitt segmentert.
    12. Åpne det lagrede PNG-bildet i Fiji-programvare. Bildet skal vises i svart-hvitt.
    13. Juster bildets terskel ved hjelp av standardinnstillingene.
    14. Påfør skeletonization plugin (Skeletonize 2D/3D, og deretter analyser Skeleton). En egen tabell med resultater vil bli vist, som inkluderer gren lengde. Lengden på grenen representerer fiber lengden. Andre data i resultatene kan også være nyttig, for eksempel euklidsk avstand.
      Merk: Utelat fibre med lengder på 0 μm eller mer enn 250 μm, da disse størrelsene ikke fysiologisk mulig.

6. kvantifisere mitokondrie morfologi

Merk: for kvantifisering av mitokondrie morfologi, denne studien brukte BXN0387 stammen inneholder uIs115 (Pmec-17:: tagRFP)5 transgene å visualisere PLM neurons og JSIS609 (Pmec-4:: MLS:: GFP)11 å visualisere mitokondrier spesielt innenfor PLM neurons. Denne studien ble utført i synkroniserte 3 dager gamle voksne ormer, men har blitt utført i andre aldre, så vel som i andre vev7.

  1. Fluorescens avbildning av mitokondrier innenfor PLM neurons
    1. For å måle størrelse og formendringer av mitokondrier innenfor PLM neurons, visualisere både bakgrunnen Nevron og mitokondrier ved hjelp av fluorescerende transgenes.
    2. Til bilde PLM Nevron, bruk en konfokalmikroskopi mikroskop koblet til en 488 NM og 552 NM optisk pumpet semi-dirigent Diode Laser og utstyrt med bilde fange programvare.
    3. Image ormen som per trinn 4.1.1-4.1.4 ovenfor, som sikrer ikke-mette eksponerings forhold.
    4. For å visualisere hele Nevron, kan et flislagt bilde være nødvendig. For å oppnå dette, bruke programvare med en flis skanning muligheten til å finne og slippe en markør på et hjørne av Nevron og deretter finne den motsatte enden og slipp den andre markøren. Programvaren vil beregne det optimale antallet fliser som trengs for å fange det nødvendige området.
      Merk: for å redusere skanne tiden, er det ofte lettere å finne neurons som følger ett enkelt fly, noe som resulterer i færre fliser.
    5. For å få tak i flis skanningen med en Z-stabel angir du nedre og øvre grense før du starter flis skanningen, og sørger for at den optimale sektorstørrelsen er angitt.
    6. Sikre oppløsning er optimalisert, som segmentering vil være mer raffinert med høyere oppløsninger (her en oppløsning på 3224 x 3224 piksler ble brukt).
      Merk: mens uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) transgene brukes til å markere PLM og vellykket posisjon kameraet, det trenger ikke nødvendigvis å bli avbildet på grunn av liten bakgrunn fluorescens observert fra jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP) transgene i PLM-axon. Dermed kan skanne-og bildebehandlings tiden reduseres ved å fjerne 552 NM-filteret fra eksperimentet.
  2. Objekt segmentering ved hjelp av SQUASSH
    1. Konvertere image fil-størrelse i . TIFF profilen og utvikle maksimum intensiteten prognosene fra Z-stabler benytter Fiji tenkelig programvare. Beskjær bilder til minimal størrelse mens du fremdeles inneholder den komplette Nevron å redusere beregningsorientert belastning og redusere bakgrunnsstøy.
      Merk: for representative resultater, bare mitokondrier innenfor de lange axonal prosessene ble vurdert, slik at cellen kroppen og eventuelle mitokondrier innenfor ble ekskludert fra hvert bilde.
    2. Ved hjelp av Mosaic Suite SQUASSH-makro for ImageJ, utfører du Split Bregman segmentering12 på maksimalt anslag. En detaljert guide til installasjon og anvendelse av denne makroen er tilgjengelig på Mosaic nettsiden (http://mosaic.mpi-cbg.de/) og beskrevet av Rizk et al. 201413. Prosessen med bilde segmentering er beskrevet i kort nedenfor.
      Merk: denne segmentering identifiserer objekter (i dette tilfellet individuelle mitokondrie) over en terskel på fluorescens intensitet, noe som åpner for nøyaktig måling av hvert enkelt objekt størrelse og form.
    3. Fjern bakgrunnsstøy fra et bilde ved hjelp av rullende kulen metoden, der et brukerdefinert vindu beveger seg over bildet, tillegge den lokale bakgrunnen intensiteten anslaget fra den hyppigst forekommende intensiteten i hvert vindu. Dette korrigerer ujevn bakgrunns intensitet.
    4. Bruk objekt gjenkjenning til å finne områder av bildet som inneholder objekter (mitokondrier) av interesse, basert på fluorescens intensitet og antall piksler. Parametrene som styrer dette trinnet er regularization og minimum objekt intensitet.
      Merk: regularization brukes for å unngå å segmentere små intensitet, støy-indusert topper, og minimum objekt intensitet terskelen bidrar til å definere subcellulære organeller fra bakgrunns vev fluorescens. Dette er de viktigste to parametrene som er manipulert for å finne en optimal segmentering av mitokondrier, og optimaliseringsprosessen har en tendens til å være prøving og feiling av ulike parametre for en test bilde, etterfulgt av manuell inspeksjon.
    5. Bruk programvaren til å anslå den lokale bakgrunnen intensitet rundt hvert objekt for å hjelpe beregning av optimal segmentering.
    6. Mål individuelle objekter for størrelse, omkrets, lengde via piksel nummer, samt signal intensitet og x/y-plassering på bildet. For å beregne mål i størrelse (NM), faktor i pikselstørrelsen til det opprinnelige bildet.
      Merk: for hvert eksperiment må optimale parametre først beregnes. For å sikre nøyaktigheten av segmentering, er det tilrådelig å utføre en SQUASSH analyse på en test bilde og manuelt inspisere nøyaktigheten av segmentering. Makroen gir output filer som viser de enkelte objektene som ble identifisert på det opprinnelige bildet, og inspisere disse nøye og justere parametere som passer vil sikre en nøyaktig segmentering. De definerte parametrene må deretter brukes for hele eksperimentet for sammenlignbarhet. Parametrene som brukes for representative resultater er inkludert i tabell 2.
    7. Åpne Fiji eller ImageJ analyseprogramvare, Naviger til makro beholderen Mosaic og åpne SQUASSH-menyen.
      1. Åpne undermenyen bakgrunns subtraksjon og sikre Fjern bakgrunn? er avmerket. Standardverdien for vindusstørrelse er 10.
      2. Still inn ønsket regularization og minimum objekt intensitet, kanal 1- verdier for best å identifisere og segmentere objekter (se trinn 6.2.4). Channel 2 -verdier er ikke nødvendig for objekter som er merket med en enkelt transgene.
      3. Klikk ESTIMAT PSF fra objektive egenskaper for å estimere punkt Spread-funksjonen basert på egenskapene til mikroskopet. Dette bidrar til segmentering av tett plassert objekter av regnskap for påvirkning av hver piksel på sin nærliggende piksel.
        Merk: underpiksel segmentering ble ikke brukt i dette eksperimentet på grunn av sin økte belastningen på datamaskinen prosessorkraft. Celle masker ble heller ikke brukt som axon er lett definert. Disse innstillingene er nyttige for mer komplekse vev og for å definere objekter på en celle etter celle basis.
      4. For visualiserings alternativer må du kontrollere at objekt omriss og Lagre objekt-og bilde karakteristikker er avmerket. For bruk senere i grafikk og statistisk programvare, sikre riktig antall forhold er innspill.
    8. Finn mappen med TIFF- bilder og Kjør makroen. Denne prosessen kan utføres på et individuelt bilde eller på en gruppe med bilder per genotype plassert i en mappe. Output filer vil bli plassert i mappen sammen med de opprinnelige bildene.
  3. Analyse og mål av form
    1. Bruk utdataene fra SQUASSH til å angi en spesifisert objektdata . csv -fil, som gir hvert enkelt objekt per rad inkludert målene som beskrevet ovenfor.
      Merk: mens denne makro prosessen automatiserer objekt målinger, er det alltid viktig å manuelt sjekke utdata-bilder etter SQUASSH segmentering for å sikre at makroen har riktig identifisert mitokondrier.
    2. For å analysere formen på hver mitokondrier, bruk et todimensjonal mål for sfærisitet, sirkularitet, for å anslå avviket for objektet fra en perfekt sirkel.
      Merk: sirkularitet er en funksjon av areal og omkrets (sirkularitet = (4 x π) x (areal/perimeter2) der 1 = en perfekt sirkel og 0 = en rett linje. Dette kan oppnås ved hjelp av en formel i grafikk og statistisk programvare.
    3. For å bestemme variansen i størrelse og form på tvers av mitokondrier, Beregn histogrammer og en tilpasset Gaussian-fordeling ved hjelp av grafikk og statistisk programvare, med hyller på 0,2 μm for mitokondrie størrelse og 0,05 for mitokondrie sirkularitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C. elegans er en ideell modell organisme for å studere morfologi av ulike vev og organeller på grunn av sin enkelhet, kjent celle avstamning, åpenhet, og tilgjengelige verktøy. Her gir vi kvantitative tilnærminger for å studere organeller (f. eks mitokondrier) og vev, inkludert synapser og muskler ved hjelp av Live fluorescens Imaging og gratis bio-bilde prosessering programvare.

Streng regulering av MEC-17-uttrykket er nødvendig for normal synapse utvikling

For ytterligere å forstå funksjonen av Alpha-tubulin acetyl-glutamyltransferase MEC-1714, 15, 16 i nervesystemet, studerte vi Synaptic morfologi i berøring reseptor neurons i C. elegans overexpressing proteinet17. Disse cellulære strukturer er avgjørende for Nevron funksjon som de tillater signaler å bli gitt videre til nabo neurons. Bilder av PLM-synapse ble samlet inn ved hjelp av en laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop og kvantitativ morfologi analyse ble utført ved hjelp av tilgjengelig bio-bilde prosessering programvare (figur 1a, B). Overuttrykte av MEC-17 resulterer i betydelige reduksjoner i området pre-Synaptic ansamlinger i PLM og redusert relativ integrert fluorescens intensitet av SNB-1:: GFP markør (figur 1C, D). Sammen disse resultatene tyder på at overuttrykte av MEC-17 forstyrrer normal synapse utvikling i PLM touch reseptor neurons.

Størrelsen på presynaptiske nerve området og relative integrerte fluorescens ble studert ved hjelp av gratis bio-bilde prosessering programvare CellProfiler 3.1.5. På grunn av sin komplekse struktur, ble synapser definert for hånd ved hjelp av diffus tagRFP protein uttrykt fra uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) transgene. Området for den definerte synapse ble beregnet av antall piksler i det definerte området. Sammenlignet med den ville-type kontroll, dyr overexpressing MEC-17 har betydelig redusert pre-Synaptic regioner (P = 0,0025; n ≥ 10) (figur 1C). I tillegg, for å studere Synaptic integritet, relative integrerte fluorescens intensitet nivåer ble sammenlignet. Dette ble beregnet ved å måle integrerte fluorescens intensitet i den definerte synapse for både SNB-1:: GFP og ekstremt tagRFP. Deretter ble SNB-1:: GFP fluorescens verdier i forhold til tagRFP-verdier sammenlignet der en signifikant reduksjon (P = 0,0479; n ≥ 10) ble observert med OVERUTTRYKTE av MEC-17 (figur 1d). Sammen, disse resultatene tyder på at riktig regulering av MEC-17 er viktig for synapse utvikling.

Kvantitativ måling av kroppens vegg muskel celle areal og fiber lengde avslører vesentlige defekter som følge av mutasjoner i CMT2-relaterte gener

Mutasjon i genene MFN2, DNM2 og KIF5A har vist å forårsake Charcot-Marie-Tooth type 2 (CMT2), en axonal form av de vanligste arvet Perifer nevropati18, 19. CMT2 er vanligvis forbundet med langsomt progressive, og kan bli svekket av muskelsvakhet og atrofi, og det er en langsom sensorisk svekkelse, fot misdannelser og sekundær steppage gange. Som følge av dette lider pasientene ofte ødeleggende funksjonsevne i livslang mobilitet. Det er for øyeblikket ingen kur for sykdommen, delvis på grunn av genetiske og kliniske heterogenitet assosiert med CMT219, samt mangel på dyremodeller for å studere sykdom patofysiologi. Derfor, ved hjelp av dyremodeller for å forstå de underliggende cellulære defekter kan gi svar på det ukjente CMT2 sykdommen mekanismer.

Hittil publiserte studier evaluere kroppen veggen muskel feil i C. elegans har stolt på visuell scoring snarere enn kvantitative målinger20. For å unngå subjektive bias som kan oppstå under kvalitativ vurdering, kvantitative målinger av kroppen veggen muskelområdet og myosin fiber lengde var trialed ved hjelp av tilgjengelige bildebehandling programmer. Vi brukte disse metodene for å vurdere muskel morfologi hos dyr som frakter mutasjoner i FZO-1/MFN2, Dyn-1/DNM2 og UNC-116/KIF5A gener i 3-dagers gammel voksen C. elegans. For begge målinger, en rekke forhold ble brukt, slik at minst én komplett skrå muskel celle var innenfor syn, muskelceller som var uklar eller ute av fokus ble ekskludert, og ekstreme fremre og bakre områder, samt områder ved siden av den snappe ble utelatt. I tillegg til mutasjoner i CMT2-assosierte gener, dyr også gjennomført stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: Myo-3 + ROL-6 (su1006)) transgene som merker en C. elegans myosin Heavy Chain delenhet med gfp (figur 2a-E). Den enkle polygon verktøy i Fiji programvare9 (versjon 2.0.0) ble brukt til å måle arealet av en enkelt muskel celle. Hvis et dyr opplevde kroppen veggen muskel struktur sammenbrudd, etterlot tomme rom i muskelceller, forholdet mellom gap området totalt enkelt muskel celleområdet ble beregnet og sammenlignet med vill-type kontroll (figur 3a). For å oppnå målinger av myosin fiber lengde, ble hvert bilde først segmentert med ilastik programvare10 (version 1.3.0) (figur 3b). Segmentering er en prosess som gjør at den enkelte muskelfibre å bli klassifisert og separert fra uønskede deler som bakgrunnen. Etter segmentering ble bildet eksportert som et ikke-tilordnet 8-biters binært bilde. Fiji (versjon 2.0.0) ble neste brukt til å Skeletonize det binære bildet for å filtrere ut grensen piksler, etterlot fragmenter representerer den opprinnelige fibrene. Grenen lengder av skjeletter, eller individuelle myosin filamenter, ble deretter analysert i Fiji. Lengdemålinger på 0 eller mer enn 250 μm, som er den maksimale fornuftige lengden for en filament selv med muskel stretching, ble ekskludert. Alt mellom 2000 og 3000 myosin fiber lengder ble målt. Et sammendrag av segmentering arbeidsflyten vises i figur 3b. Resultater fra den kvantitative analysen ble ytterligere sammenlignet med visuell scoring av kroppens veggen muskel feil, der 3-dagers gamle dyr ble kategorisert som defekt eller ikke-defekt basert på muskel struktur integritet.

Defekter i kroppen veggen muskel morfologi ble observert mellom 2,5 til 3,5 ganger høyere i FZO-1 (cjn020), Dyn-1 (ky51) og UNC-116 (e2310) dyr enn i vill-type dyr under visuell vurdering (figur 4a). De fleste dyr med mutasjoner i FZO-1 og UNC-116 erfarne iøynefallende tap av muskel striations, store GFP klumper på grunn av opphopning av cellulære rusk, og muskel fiber degenerasjon som forlot gapende rom i muskelceller ( Figur 2C, E). I kontrast, mens mer enn 60% av Dyn-1 mutanter ble scoret visuelt defekt, var omfanget av defekter minimal i forhold til de to andre genetiske mutanter. Det var bare små tap av striations, ingen GFP samlinger og bare mindre muskel degenerasjon i forhold til de to andre mutanter (figur 2D og figur 4a). Som med andre fenotypiske scoring, kan omfanget av feilene ikke bli vurdert, og en tendens til bias kan føre til en høyere andel av defekter som skal registreres. Derfor, kvantitative målinger av muskel celle areal og fiber lengde ville gi en mer nøyaktig representasjon av omfanget av muskel feil enn visuell vurdering alene. I tråd med de store hullene observert med visuell scoring, forholdet mellom gap området til totalt enkelt celleområde ble vist å være 5 til 6 ganger høyere i FZO-1 og UNC-116 mutant dyr i forhold til Wild-type gruppe, som bare opplevde ubetydelig muskel struktur sammenbrudd (figur 4b). Mangelen på strukturell kollaps i Dyn-1 mutanter resulterte i en ikke-signifikant, 3-fold økning i gapet muskel celleområdet ratio (figur 4b). Dette indikerer også at eksperimentator bias kan være en faktor som bidrar til den høye andelen av defekter som tildeles ved kvalitativ vurdering. Likevel reduserte de små hullene gjennomsnittlig fiber lengde fra 24 μm i vill-type til 22 μm i Dyn-1 mutanter (figur 4c). Den gjennomsnittlige fiber lengden var dramatisk kortere i FZO-1 og UNC-116 mutanter, samkjøre med tilstedeværelsen av større hull i degenereres muskelceller i disse dyrene (figur 2C,E og figur 4c ). Disse resultatene er i samsvar med våre nylige funn studere virkningene av mutere CMT2-asscoiated gener i C. elegans20. Videre, de markere mer presis vurdering av muskel morfologi ved hjelp av disse kvantitative metoder sammenlignet med visuell scoring alene, og gi bevis for at FZO-1 og UNC-116 er nødvendig for normal muskel morfologi.

Kvantitative målinger av mitokondrie morfologi ved hjelp av SQUASSH objekt segmentering

For å forstå hvordan fraværet av mitokondrie fisjon påvirker mitokondrie morfologi i C. elegans neurons, utførte vi kvantitative analyser i PLM mechanosensory neurons. DRP-1, C. elegans orthologue av pattedyr dynamin-relaterte protein 1 (DRP1), kontroller mitokondrie fisjon, der ved aktivering er rekruttert fra stoffer å danne en spiral rundt mitokondrier, constricting og til slutt severing både den indre og ytre mitokondrie membraner21, 22. Vi fluorescensmerkete merket mitokondrier med en vev spesifikke transgene i PLM neurons, som har en lang axonal prosess som lett kan visualisere bruke epifluorescence mikroskopi. Et tap av fisjon er hypotetisk gjennomsnitt å forstyrre den generelle mitokondrie dynamikk, og dermed redusere opprettelsen av nyere, mindre mitokondrier gjennom en prosess kjent som spirende23.

Vi utførte SQUASSH segmentering for å sammenligne mitokondrie morfologi i vill-type og DRP-1 mutant dyr. Vi analyserte mitokondrier fra 6 PLM neurons per genotype, noe som resulterer i en n verdi av større at 200 mitokondrier for hver. Skjematisk og representative bilder er vist i figur 5a, B. Vi fant at mutanter manglet DRP-1 hadde større og mer langstrakt mitokondrier (figur 5B-F). Mitokondrier i DRP-1 mutant bakgrunn var 32% større enn vill-type (p = 0,0006, figur 5c), og 14% mer langstrakt (videre fra en perfekt sirkel) (P < 0,0001, figur 5D). For en mer detaljert vurdering av variansen i størrelse og form, plottet vi histogrammer for hvert tiltak, montering av data til Gaussian distribusjoner (figur 5e, F). Vi fant at for både størrelse og sirkularitet, mutanter mangler fisjon protein hadde en større varians (p < 0,0001 for begge), fremhevet av tilstedeværelsen av større og mer langstrakt mitokondrier/mitokondrie nettverk (se figur 5Bii for eksempler ). Samlet fant vi bevis som tyder på at mutasjon av DRP-1 forårsaker mangel på FISJON innen PLM neurons, noe som resulterer i større og mer langstrakt mitokondrier. Vi har også demonstrert at avbrudd av mitokondrie fisjon forårsaker en økning i variansen av mitokondrie morfologi.

Figure 1
Figur 1: kvantifisering av synapse integritet i PLM neurons. (A) bilder er maksimum z-anslag av PLM Synaptic regionen i et ikke-transgene dyr. Den venstre panel viser PLM Nevron merket med tagRFP, den andre panelet viser pre-Synaptic regionen merket med SNB-1:: GFP, er det tredje bildet et overlegg med co-lokalisering representert i gult, og den fjerde panel er en skjematisk av overlay bildet. (B) maksimal z-projeksjon konfokalmikroskopi bilder av Synaptic regionen i dyr overexpressing MEC-17. Bilder vises som per panel A. (C) størrelse kvantifisering i pre-Synaptic regionen i ikke-transgene sammenlignet med transgene dyr overexpressing MEC-17. (D) kvantifisering av den relative integrerte fluorescens nivåer av SNB-1:: GFP i ikke-transgenics versus transgene dyr overexpressing MEC-17. For (C) og (D), individuelle synapser analysert er representert av sirkler; n ≥ 10; gjennomsnittlig ± S.E. vist i svart. P -verdier * < 0,05, * * < 0,01 fra ikke-sammenkoblet t-tester; skala barer representerer 2 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: visualisering av C. elegans kroppen veggen muskler. (A) et dyr uttrykker stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: Myo-3 + ROL-6 (su1006)) transgene, som merker MYOSIN tunge kjeden med gfp i kroppen veggen muskler. Matrisen induserer også en rullende fenotype i dyret som letter visualisering av muskelceller arrangert langs rygg og ventrale sider av kroppen. Representative forstørret visning av myosin fibre i (B) Wild-type, (C) FZO-1 (cjn020), (D) Dyn-1 (ky51) og (E) UNC-116 (e2310) dyr. Alle dyrene ble avbildet på den 3-dagers gamle voksen scenen. Skala bar representerer 60 μm i (A), og 30 μm i (B-E). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: måle kroppens vegg muskel areal og fiber lengde ved hjelp av tilgjengelige beregningsorientert algoritmer. (A) eksempel bilde som viser hvordan den interne gap plass innenfor en enkelt muskel celle (rød-vedlagt), og arealet av hele cellen (gul-vedlagt) er tegnet og beregnet i Fiji for å oppnå muskel areal forholdet. (B) omriss av segmentering protokollen på et enkelt eksempel bilde ved hjelp av en kombinasjon av Fiji og ilastik. Scale bar representerer 30 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: kvalifisering og kvantifisering av kroppens vegg muskel feil. (A) visuell vurdering av kroppens vegg muskel feil. (B) sammenligning av blank areal til totalt muskel celleområde forholdet mellom WT og indikerte mutanter. (C) måling av myosin fiber lengde. For (B) og (C), bare bilder med minst en komplett synlig skrå muskel celle ble inkludert for analyse. Fibre med lengde på 0 μm eller mer enn 250 μm ble også ekskludert. Stolper representerer prosent defekte dyr i (A) og gjennomsnittlig ± S.E.M. i (B) og (C); n -verdier som er oppført i hver stolpe. Chi-kvadrat test med falsk oppdagelse rate ble utført for å sammenligne visuelle defekter i (A), mens enveis ANOVA med Dunnett ' s post hoc tester for flere sammenligning ble brukt til å analysere kvantitative målinger i (B) og (C). *P < 0,05, * * * *p < 0,0001, NS = ikke signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: mitokondrie morfologi innenfor axons av PLM neurons. (A) skjematisk av en bakre lateral mikrotubulinettverket (PLM) mechanosensory Nevron i halen av C. elegans. Den røde boksen indikerer omtrentlig plassering av de markerte seksjonene i (B), som viser representative bilder av GFP-merket mitokondrier (Pmec-4:: MLS:: GFP) i PLM-axon. Lyse grønne puncta indikerer mitokondrier. Sammenlignet med WT (i), DRP-1 (tm1108) mutanter (II) viser større, mer langstrakt mitokondrier. Bilder er representative for n = 6 PLM axons fra 6 ormer per genotype; vektstenger = 15 μm. (C) gjennomsnittlig størrelse (μm2) av individuelle MITOKONDRIE som kvantifisert av SQUASSH objekt segmentering i 3-dagers gammel voksen (3DOA) ormer. (D) mener sirkularitet av individuelle MITOKONDRIE innenfor PLM-axon, som KVANTIFISERT fra SQUASSH objekt målinger i 3DOAs. (E) histogram og Gaussian fordeling som viser variansen av mitokondrie størrelse. F-test (P < 0,0001) viser at avvik er signifikant forskjellig mellom DRP-1 og WT. (F) histogram og Gaussian Distribution som viser variansen for mitokondrie sirkularitet. Data representeres som gjennomsnittet +/-SEM. * * * p < 0,001, * * * * P < 0.0001 fra Welch ' s t-test; n ≥ 204 mitokondrier for kvantitativ analyse fra n = 6 ormer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Navn på stamme Genotype Kilde Referanse #
BXN038 uIs115 (Pmec-17:: tagRFP); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP) Neumann-laboratoriet 7
BXN366 FZO-1 (cjn020); Myo-3 (st386); zdIs5 (Pmec-4:: GFP); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: Myo-3 + ROL-6 (su1006)) Neumann-laboratoriet 20
BXN419 DRP-1 (tm1108); jsIs609 (Pmec-4:: MLS:: GFP); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) Neumann-laboratoriet 7
BXN507 cjnEx036 (Pmec-4:: MEC-17, Pmyo-2:: mCherry); jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP); Lin-15B & Lin-15A (n765); uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) Neumann-laboratoriet 17
BXN675 UNC-116 (e2310); Myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: Myo-3 + ROL-6 (su1006)) Neumann-laboratoriet 20
BXN685 Dyn-1 (ky51); Myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: Myo-3 + ROL-6 (su1006)) Neumann-laboratoriet 20
NM664 jsIs37 (Pmec-7:: SNB-1:: GFP); Lin-15B & Lin-15A (n765) Caenorhabditis Genetikk Center 6
RW1596 Myo-3 (st386); stEx30 (Pmyo-3:: gfp:: Myo-3 + ROL-6 (su1006)) Caenorhabditis Genetikk Center 8
TU4065 uIs115 (Pmec-17:: tagRFP) Martin Chalfie 5

Tabell 1. Liste over C. elegans stammer som brukes i denne studien.

PLM axon bilder
Målet 40x
Bildeoppløsning (per panel for tilescan) 3224 x 3224
Vindusstørrelse for fjerning av bakgrunn 20
PSF XY 0,78
PSF z 0,68
Regularisation 0,15
Minimum fluorescens intensitet GFP 0,4

Tabell 2. SQUASSH parametere for segmentering av mitokondrier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Morfologiske variasjoner har ofte blitt vurdert via manuell telling av merkbare forskjeller eller ved hjelp av vilkårlige terskler for å fastslå defekter i forhold til en vill-type fenotype. Mer nylig har imidlertid kvantitative metoder blitt brukt for sammenlignende studier av morfologi til nøyaktig å måle og beskrive endringer på mobilnettet og subcellulære nivå på en upartisk måte. Evnen til å identifisere subtile, men biologisk relevante forskjeller mellom fenotyper er et kraftig middel for å forstå de underliggende molekylære mekanismene som kontrollerer endringer i morfologi forårsaket av miljømessige faktorer eller genetiske sykdommer. Den fortsatte økningen i beregningen kraft og mikroskopi Imaging oppløsning, kombinert med den enkle veksten og allsidigheten til C. elegans genetikk har gitt den perfekte plattformen for kombinasjonen av sofistikerte, men gratis tenkelig programvare med fine, detaljerte konfokalmikroskopi bilder. Her har vi demonstrert metoder for å evaluere og kvantifisere Synaptic størrelse og protein lokalisering, kropp vegg muskel område og fiber lengde, og mitokondrie morfologi i en rekke genetiske bakgrunner.

Selv om disse analysene har vist en evne til å kvantifisere subtile morfologiske forskjeller, er det begrensninger. Selv om hver av disse analysene gjøre bruk av åpen kildekode og lett tilgjengelig programvare, de er avhengige av høy kvalitet, skarpe bilder for å nøyaktig løse cellulære strukturer og subcellulære organeller. Dette kan ofte være et begrensende trinn, ettersom sensitivt avansert utstyr, for eksempel konfokalmikroskopi mikroskop med avanserte detektorer, er nødvendig for å ta bilder med tilfredsstillende oppløsning. Disse er ikke alltid tilgjengelige for laboratorier, og analyse med sub-par-teknologi kan føre til unøyaktige og unrepeatable resultater. I tillegg, mens hver teknikk som mål å redusere eksperimentator bias ved hjelp av datamaskinen algoritmer, er det fortsatt trinn som kan innebære et element av menneskelig feil. Den manuelle definisjonen av synapse for hånd, disponering av muskel celleområdet, parameteren optimaliseringer av mitokondrie segmentering av øyet er alle områder som kan forbedres i denne sammenhengen. For å redusere sjansen for menneskelig feil, studier kan gjennomføres på en blindet måte eller alternativt bildeanalyse programvare kan brukes til å definere regionen av interesse selv. Ved hjelp av celle masker, der det ønskede området for analyse er definert av fluorescens på en annen bølgelengde, kan hjelpe dette. Dette brukes til å begrense analysen til en del av et bilde som viser fluorescens over en angitt terskel, for eksempel en Celles kjerne eller en transfekterte celle13,24. Videre er bruken av enkelt tidspunkt bilder begrenser spørsmålene disse teknikkene kan henvende seg. Prosessene som regulerer organelle morfologi, synapse dannelse og muskel struktur er mest sannsynlig dynamisk, og forskjellene kan sees innenfor samme celle avhengig av utviklingsmessige eller biologiske status. Analyse av disse strukturene på et bestemt sluttpunkt kan derfor begrense og tidsforløp avbildning vil være fordelaktig for overvåking av strukturelle endringer over tid. Til slutt, mens morfologiske endringer kan være en god indikator for avbrudd i cellulære prosesser, er korrelasjon ikke alltid implisitt. For eksempel har nylige funn i forskjellige arter vist at mitokondrie funksjon og form kan faktisk være dissosiert7,25. Derfor må flere analyser tas i betraktning når inferring funksjonelle endringer som følge av morfologiske forskjeller.

Vi har vært i stand til å demonstrere bruken av disse kvantitative teknikkene i et bestemt sett av vev og genetisk bakgrunn; bruken kan imidlertid brukes mer generelt. Fluorescens kvantifisering via tenkelig programvare kan brukes til å analysere en rekke ulike subcellulære organeller som kjerner og endosomes, eller ulike strukturer som neurons og epitelceller, alt innenfor rammen av ulike mutant eller sykdom Bakgrunner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Neumann-laboratoriet for verdifulle diskusjoner og innspill. Noen stammer ble gitt av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure programmer (P40 OD010440). Forfatterne takker WormBase for sin vell av informasjon om C. elegans, og erkjenner Monash Micro Imaging, Monash University, for levering av instrumentering, opplæring og teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av CMTAA forskningsstipend (2015 og 2018), og NHMRC Project Grants 1101974 og 1099690 tildelt B.N.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-agar Merck 1.01614.1000
Agarose Invitrogen 16500-500
Confocal microscope Leica TCS SP8 Inverted platform
Fluorescence microscope Carl Zeiss AG Zeiss Axio Imager M2
Glass coverslips #1 Thermo scientifique MENCS22221GP
Glass coverslips #1.5 Zeiss 474030-9000-000 Made by SCHOTT
Glass slides Thermo scientifique MENS41104A/40
Light LED Schott KL 300 LED
Stereo Microscope Olympus SZ51
Tryptone (Peptone from casein) Merck 107213 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Yeast Extract Merck 103753 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for Lysogeny Broth (LB) medium
Peptone (Peptone from meat) Merck 107214 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Agar Sigma A1296 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Cholesterol Sigma C8667-25G Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Calcium chloride Merck 102382 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Magnesium sulfate Merck 105886 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Dipotassium phosphate Merck 105101 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 Ingredients for Nematode Growth Media (NGM) agar
Disodium phosphate Merck 106586 Ingredients for M9 buffer
Sodium chloride Merck 106404 Ingredients for M9 buffer
Potassium dihydrogen phosphate Merck 104873 Ingredients for M9 buffer
Magnesium sulfate Merck 105886 Ingredients for M9 buffer
Pasteur pipette Corning CLS7095D5X-200EA
Petri dishes Corning CLS430589-500EA
Platinum wire Sigma 267201-2G
Spatula Met-app 2616
Tetramisole hydrochloride Sigma L9756-5G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. , (1974).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human diseases in Caenorhabditis elegans. Biotechnology Journal. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  3. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. , (2017).
  4. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of C. elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Genetics. , (2014).
  5. Zheng, C., Jin, F. Q., Chalfie, M. Hox Proteins Act as Transcriptional Guarantors to Ensure Terminal Differentiation. Cell Reports. 13 (7), 1343-1352 (2015).
  6. Koushika, S. P., et al. Mutations in Caenorhabditis elegans cytoplasmic dynein components reveal specificity of neuronal retrograde cargo. Journal of Neuroscience. 24 (16), 3907-3916 (2004).
  7. Byrne, J. J., et al. Disruption of mitochondrial dynamics affects behaviour and lifespan in Caenorhabditis elegans. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
  8. Campagnola, P. J., et al. Three-Dimensional High-Resolution Second-Harmonic Generation Imaging of Endogenous Structural Proteins in Biological Tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , (2011).
  11. Mondal, S., Ahlawat, S., Koushika, S. P. Simple microfluidic devices for in vivo imaging of C. elegans, Drosophila and zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  12. Paul, G., Cardinale, J., Sbalzarini, I. F. Coupling image restoration and segmentation: A generalized linear model/bregman perspective. International Journal of Computer Vision. , (2013).
  13. Rizk, A., et al. Segmentation and quantification of subcellular structures in fluorescence microscopy images using Squassh. Nature Protocols. 9, 586-586 (2014).
  14. Akella, J. S., et al. MEC-17 is an alpha-tubulin acetyltransferase. Nature. 467 (7312), 218-222 (2010).
  15. Neumann, B., Hilliard, M. A. Loss of MEC-17 leads to microtubule instability and axonal degeneration. Cell Reports. 6 (1), 93-103 (2014).
  16. Shida, T., Cueva, J. G., Xu, Z., Goodman, M. B., Nachury, M. V. The major alpha-tubulin K40 acetyltransferase alphaTAT1 promotes rapid ciliogenesis and efficient mechanosensation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21517-21522 (2010).
  17. Teoh, J. -S., Wang, W., Chandhok, G., Pocock, R., Neumann, B. Development and maintenance of synaptic structure is mediated by the alpha-tubulin acetyltransferase MEC-17/αTAT1. bioRxiv. 84, 522904-522904 (2019).
  18. Bird, T. D. Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Type 2. , GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2019. [Updated 2016 Apr 14] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1285/ (1998).
  19. Chandhok, G., Lazarou, M., Structure Neumann, B. Structure, function, and regulation of mitofusin-2 in health and disease. Biological Reviews. 93 (2), 933-949 (2018).
  20. Soh, M. S., Cheng, X., Liu, J., Neumann, B. Disruption of genes associated with Charcot-Marie-Tooth type 2 lead to common behavioural, cellular and molecular defects in Caenorhabditis elegans. bioRxiv. , 605584 (2019).
  21. Kamerkar, S. C., Kraus, F., Sharpe, A. J., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Dynamin-related protein 1 has membrane constricting and severing abilities sufficient for mitochondrial and peroxisomal fission. Nature Communications. , (2018).
  22. Zhu, P. -P., et al. Intra- and Intermolecular Domain Interactions of the C-terminal GTPase Effector Domain of the Multimeric Dynamin-like GTPase Drp1. Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35967-35974 (2004).
  23. Osellame, L. D., et al. Cooperative and independent roles of the Drp1 adaptors Mff, MiD49 and MiD51 in mitochondrial fission. Journal of Cell Science. , (2016).
  24. Dima, A. A., et al. Comparison of segmentation algorithms for fluorescence microscopy images of cells. Cytometry Part A. 79 (7), 545-559 (2011).
  25. Trevisan, T., et al. Manipulation of Mitochondria Dynamics Reveals Separate Roles for Form and Function in Mitochondria Distribution. Cell Reports. , (2018).

Tags

Biologi Caenorhabditis elegans kvantitative målinger Imaging Synaptic morfologi kropp veggen muskel myosin lengde mitokondrie morfologi Charcot-Marie-Tooth sykdom
Kvantitative tilnærminger for Studying Cellular strukturer og organelle morfologi i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teoh, J. S., Soh, M. S., Byrne, J.More

Teoh, J. S., Soh, M. S., Byrne, J. J., Neumann, B. Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (149), e59978, doi:10.3791/59978 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter