Summary
げっ歯類の熟練したリーチは、一般的に器用なスキルを研究するために使用されますが、タスクを実装し、動作を分析するために多大な時間と労力を必要とします。モーショントラッキングとリーチ軌道の3次元再構成を用いて、熟練したリーチの自動化バージョンについて説明します。
Abstract
げっ歯類の熟練したリーチは、一般的に器用なスキルを研究するために使用されますが、タスクを実装し、動作を分析するために多大な時間と労力を必要とします。最近、熟練したリーチのいくつかの自動化されたバージョンが開発されました。ここでは、高フレームレート(300 fps)で複数の角度から高精細ビデオを記録しながら、自動的にラットにペレットを提示するバージョンを説明します。足と個々の数字は、マーカーレスポーズ推定のための機械学習アルゴリズムDeepLabCutで追跡されます。このシステムはまた、生理学的記録と同期させることができ、または生理学的介入(例えば、電気的または光学刺激)を引き起こすために使用することができる。
Introduction
人間は、多関節と数字の動きを正確に調整する動きとして定義される器用なスキルに大きく依存しています。これらのスキルは、構造病変(例えば、脳卒中、腫瘍、脱筋化病変)、神経変性疾患(例えば、パーキンソン病)、および運動の機能的異常を含む一般的な中枢神経系病理の範囲によって影響を受ける回路(例えば、ジストニア)。したがって、中央モーター回路によって器用なスキルがどのように学習され、実装されているかを理解することは、多くの人口の生活の質を向上させる可能性を秘めています。さらに、このような理解は、トレーニングおよびリハビリテーション戦略を最適化することにより、健康な人々の運動性能を向上させる可能性が高い。
人間の器用なスキルの根底にある神経回路を解剖することは、技術的および倫理的な考慮事項によって制限され、動物モデルの使用を必要とする。非ヒト霊長類は、運動系と行動レパートリーの類似性を考えると、器用な四肢の動きを研究するために一般的に使用される1.しかし、非ヒト霊長類は、長い生成時間で高価であり、研究対象の数と遺伝的介入の数を制限する。さらに、非ヒト霊長類に適用可能な神経科学的ツールボックスはヒトよりも大きいが、最近の多くの技術進歩は霊長類では利用できないか、著しく制限されている。
げっ歯類の熟練した手入れは、器用な運動制御を研究するための補完的なアプローチです。ラットおよびマウスは、ヒトの到達パターン2に相同な動きのステレオタイプ配列で糖ペレットに到達し、把握し、取り出す訓練を受けることができる。比較的短い発電時間と住宅費の削減、また数日から数週間にわたり熟練した人材を獲得する能力により、学習とスキルの統合の両方の段階で多数の科目を研究することが可能です。げっ歯類、特にマウスの使用は、強力な現代の神経科学ツール(例えば、光遺伝学、カルシウムイメージング、疾患の遺伝的モデル)を使用して器用なスキルを研究することを容易にする。
げっ歯類の熟練したリーチは、通常の運動制御を研究するために何十年も使用されており、脳卒中やパーキンソン病3のような特定の病理によってどのように影響を受けるか.しかし、このタスクのほとんどのバージョンは、げっ歯類を研究する利点を軽減し、労働と時間のかかるです。典型的な実装は、げっ歯類が到達しなければならない狭いスロットの前に棚を持つ到達室にげっ歯類を配置することを含みます。研究者は手動で棚に砂糖ペレットを置き、動物が届くのを待ってから、別のペレットを置きます。リーチは、リアルタイムまたはビデオレビュー4のいずれかで成功または失敗としてスコア付けされます。ただし、単にスコアリングは成功または失敗に達すると、(単に到達するかどうかではなく)どのように損なわれるかについての洞察を提供できる豊富なキネマティックデータを無視します。この問題は、リーチするビデオの詳細なレビューを実装して、リーチサブムーブメント5を識別し、半定量的にスコアを付けることによって解決されました。これにより、リーチキネマティクスに関するいくつかのデータが追加されましたが、実験時間と労力も大幅に増加しました。さらに、高レベルの実験者の関与は、同じラボ内であっても、方法論とデータ分析の不整合につながる可能性があります。
最近では、熟練したリーチのいくつかの自動化されたバージョンが開発されています。いくつかは、動物を転送する必要性を排除し、ホームケージ6、7に取り付けます。これは両方とも動物のストレスを減らし、専門の達する部屋にそれらを順応する必要性を除去する。他のバージョンでは、特定の介入下での運動的な変化を8、9、10、またはペレットが棚11からノックされたかどうかを自動的に判断するメカニズムを持つことができるように、足の追跡を可能にします。自動熟練した到達タスクは、怪我12後のリハビリテーションに必要とされ、高強度のトレーニングに特に役立ちます。自動化されたシステムは動物が集中的な研究者の関与を要求しないで長期間にわたって多数の達を行うことを可能にする。さらに、足の追跡と自動結果スコアリングを可能にするシステムは、データ分析の実行に費やす研究者の時間を短縮します。
我々は、いくつかの特殊な機能を備えた自動化されたラット熟練した到達システムを開発しました。まず、可動台座を使用してペレットを下から「到達位置」に導くことで、前肢のほぼ遮るもののない眺めを得ます。第二に、ミラーのシステムは、単一のカメラでリーチの複数の同時ビューを可能にし、高解像度、高速(300 fps)カメラを使用してリーチ軌道の3次元(3D)再構築を可能にします。マーカーレスモーショントラッキング13のための堅牢な機械学習アルゴリズムの最近の開発により、我々は今、詳細なリーチを抽出し、キネマティクスを把握するために、足だけでなく、個々のナックルを追跡します。第3に、簡単なビデオ処理を行うフレームグラバーは、異なる到達フェーズをリアルタイムで識別することができます。この情報は、ビデオ取得をトリガーするために使用されます (連続的なビデオ取得は、ファイルサイズのために実用的ではありません)、また、正確な瞬間に介入(例えば、光遺伝学)をトリガするために使用することができます。最後に、個々のビデオフレームはトランジスタトランジスタロジック(TTL)パルスによってトリガされ、ビデオを神経記録(例えば、電気生理学や光メトリー)と正確に同期させることができます。ここでは、このシステムを構築する方法、タスクを実行するラットのトレーニング、外部システムとの装置の同期、および3-D到達軌道の再構築方法について説明します。
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Protocol
ここに記載されている動物の使用に関するすべての方法は、ミシガン大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 到達室の設定
注:装置の詳細と図については、Ellens et al.14を参照してください。部品番号は図 1を参照してください。
- クリアなポリカーボネートパネルをアクリルセメントでボンドし、到達室(幅15cm、長さ40cm×高さ40cm)を構築します(一部#1)。片側パネル(#2部分)にはヒンジ付きドア(幅18cm、高さ15cm)、ロック付き。ラットがケーブルにつながれる場合は、それを収容するために室内の天井にスリット(幅5cm×長さ36cm)をカットします(一部#12)。床パネルに18の穴(直径1.75 cm)(一部#13)が切り取られ、チャンバーの残りの部分に接着されていません。
- サイドパネルに赤外線センサー(一部#3)を取り付け、床から3.8cmの側面パネルに取り付け、位置合わせします。動作ソフトウェアには、赤外線ビームが壊れていないときに緑色のインジケータ(「IRバック」)があり、ビームが壊れているときに赤色になります。ソフトウェアをセットアップしたら、これを使用してセンサーの位置合わせを確認できます。
- ミラー(15 cm x 5 cm、一部#4)を到達スロット(一部#14)の上に10cm取り付けます。ペレットデリバリーロッドがカメラに見えるようにミラーを角度付けします。
- 可佐サポートボックス(幅59cm、縦67.3cm、高さ30.5cm、一部#5)にチャンバーを置きます。チャンバーは、床の穴(一部#13)を通って、到達室の外にゴミが落ちることを可能にするサポートボックス(幅12センチメートル、長さ25センチメートル)の穴の上に休みます。2番目の穴(幅7cm、長さ6cm、一部#15)を、到達スロットの前のサポートボックスに切り込み、ペレットデリバリーロッドがペレットを到達スロットに持ち込むことを可能にします。
- 2つのミラー(幅8.5cm×高さ18.5cm、一部#6)をチャンバーの両側に磁石で床に取り付け、ミラーの長い端が手の届く箱の前面から3cmのサイドパネルに触れられるようにします。カメラがボックスとペレットが配達される到達スロットの前の領域を見ることができるようにミラーを角度します。
- 高精細カメラ(一部#7)を、ボックスに面したスロットから17cm取り付けます。
- カメラの両側に黒い用紙(一部#18)を取り付け、サイドミラーの背景が暗くなります。これは、リアルタイムおよびオフラインの足の検出を改善するためにコントラストを強化します。
- 直線アクチュエータ(#16部)をネジでサニタイブルフレーム(幅25cm、縦55cm、高さ24cm、#8部)に取り付けます。アクチュエータは、ペレットダストが位置検出ポテンショメータ内に蓄積するのを防ぐために逆さまに取り付けられています。
- ペレットリザーバ(じょうご)(一部#9)の首に発泡Oリングを挿入し、アセンブリにほこりが蓄積するのを防ぎます。フレーム上部の穴(直径約6cm、一部#17)の下に、フレーム上部の下側に掘削された3本のネジの上の端を滑り込んで、漏斗を下に取り付けます。導管(一部#10)を漏斗の首に差し込みます。
- アクチュエータのスチールロッドの端にプラスチックTコネクタを取り付けます。ペレットデリバリーロッドのテーパードエンドをコネクタの上部に挿入し、ガイドチューブを通してカッピングされた端をペレットリザーバに挿入します。
- ペレットデリバリーロッドが到達スロットの前の穴(一部#15)を通して伸びることができるように、熟練した到達室の下に線形アクチュエータアセンブリを配置します。
- コンピュータファン(照明が点灯すると内部が暖かくなる)で換気し、音響発泡体で裏打ちされたホイール付きキャビネット(121 cm x 119 cm x 50 cm)に到達装置全体を配置します。
- 20.3 cm x 25.4 cmのサポートパネルにLEDライトストリップを付着させ、5つのライトパネル(一部#11)を構築します。ライトストリップの上にディフューザーフィルムを取り付けます。ペレットデリバリーロッドエリアの天井に1つのライトパネルを取り付けます。到達室に沿ってキャビネットの側面に他の4を取り付けます。
注:リアルタイムの足の識別のために到達スロットとペレット配達ロッドの周りの領域を照らすことが重要です。
2. コンピュータとハードウェアのセットアップ
- 製造元の指示に従って FPGA フレーム グラバとデジタル拡張カードを取り付けます (資料の表を参照)。
注: 高速ビデオをストリーミングするにはかなりのバッファリング容量が必要なため、少なくとも 16 GB の RAM とデータ ストレージ用の内部ソリッド ステート ハード ドライブをお勧めします。 - 高精細カメラ用のドライバを取り付け、FPGAフレームグラバーに接続します。カメラに関連付けられたソフトウェアを使用するには、動作ソフトウェアが実行され、カメラとインターフェイスされている必要があります。
注:付属のコード(補足ファイルを参照)は、カメラ内のプログラム可能なレジスタにアクセスし、他のブランドと互換性がない可能性があります。少なくとも 300 フレーム/秒 (fps) を記録することをお勧めします。150 fps で、足の姿勢の主要な変更がしばしば見逃されることがわかりました。 - 「SR オートメーション_dig_ext_card_64bit」の含まれているコード (プロジェクト) をコンピュータにコピーします。
3. 行動訓練
- 訓練の前にラットを準備します。
- ハウスロングエバンスラット(オスまたはメス、10〜20週)は、逆光/暗いサイクルでケージあたり2〜3のグループで。トレーニングの3日前に、ラットを食物制限に置き、体重をベースラインより10~20%低く保つ。
- ラットを1日数分、少なくとも5日間取り扱う。取り扱い後、ラット1匹につき4~5個の砂糖ペレットを各ホームケージに入れ、新しい食品を紹介します。
- 到達室にラットを習慣化 (1-3 日)
- LEDライトをオンにし、チャンバーの前面と背面に3つの砂糖ペレットを配置します。
- ラットをチャンバーに入れ、ラットがペレットを食べるかどうかを15分間調べるようにします。ラットが床からすべてのペレットを食べるまで、この段階を繰り返します。
- ラットの間にエタノールでチャンバーをきれいにします。
注: 暗いフェーズでトレーニングとテストを実行します。毎日同時にネズミを訓練する。
- 手に届き、足の好みを観察するためにラットを訓練します(1-3日)。
- ライトをオンにし、熟練した到達室にラットを配置します。
- 鉗子を使用して、ボックスの前部にある到達スロットを通してペレットを保持します(図1、図2)。ラットが鉗子から3ペレットを食べるようにします。
- 次にラットが鉗子からペレットを食べようとすると、ペレットを引き戻します。最終的に、ラットは足でペレットに到達しようとします。
- これを11回繰り返します。ラットが11回の試みのうち最も多くを使用する足は、ラットの「足の好み」です。
注: 試行は、手の届くスロットを越えて手を伸ばす足として定義されます。ラットはペレットを正常に得て食べる必要はありません。
- ネズミを訓練してペレットデリバリーロッド(1~3日)
- ペレットデリバリーロッドを、ラットの好ましい足と反対側に到達スロットの側面に合わせます(手の届くチャンバの前部から1.5cmの一貫した配置を確保するためにガイドを使用してください)。デリバリーロッドの上部は、到達スロットの下部に位置合わせする必要があります(図2B)。配達棒にペレットを置く。
注:ラットの好ましい足の反対側に送達ロッドを配置すると、ラットが好ましくない足でペレットを得ることが困難になります。私たちは、彼らの好ましくない足を使用してラットに問題を抱えていなかった。しかし、特定のモデル(例えば、ストローク)では、これは依然として起こり得、好ましくない手の届く手足に拘束を加えることができる。 - 鉗子を使用して保持されたペレットでラットを餌にするが、その足がロッド上のペレットに当たるように、配達ロッドに向かってラットを指示します。ラットがロッドのペレットをノックする場合は、交換してください。一部のラットは、最初は十分に手を伸ばさないかもしれません。この場合、ペレットデリバリーロッドを到達スロットに近づけ、ラットが良くなるにつれてゆっくりと遠ざけていきます。
- 約5-15餌が到達した後、ラットは自発的に送達ロッド上のペレットに到達し始めます。ラットが餌を与えられずに送達棒に10に達しようとすると、次の段階に進むことができる。
- ペレットデリバリーロッドを、ラットの好ましい足と反対側に到達スロットの側面に合わせます(手の届くチャンバの前部から1.5cmの一貫した配置を確保するためにガイドを使用してください)。デリバリーロッドの上部は、到達スロットの下部に位置合わせする必要があります(図2B)。配達棒にペレットを置く。
- ネズミを訓練してペレット(2~8日)を要求します。
注:私たちはペレットに到達するために100%の成功トレーニングラットを持っていましたが、ラットの約10%は、チャンバーの背面に移動することによってペレットを要求することを学ぶことができない。- ラットの足の好みに基づいてペレット送達ロッドを配置し、位置2(図2A)に設定します。 アクチュエータリモコンを使用してペレット送達ロッドの高さ位置を設定します。ボタン1と2を押すと、ボタン3と2を押しながら配信ロッドを上に動かします。 配達ロッドが正しい高さになったら、ライトが赤く点滅するまで所望の数を押し続けます。
- ラットをチャンバーに入れ、ネズミをペレットで背中に餌を与える。ラットがチャンバーの背面まで十分に移動し、自動バージョンが実行されている場合は赤外線ビームを壊す場合は、ペレット送達ロッドを位置3(図2B)に移動します。
- ラットがペレットに到達するのを待ってから、ペレット送達ロッドを位置2(図2A)に戻します。 ノックオフされた場合は、配達ロッドに新しいペレットを置きます。
- これらの手順を繰り返し、ラットが少しずつ餌を与え始めるまで、(i)餌を与えられずにペレットを要求するために背中に移動し、(ii)背中にペレットを要求した後、直ちに前に移動する。ラットがこれを10回行うと、自動化されたタスクに関するトレーニングの準備が整います。
4. 自動化システムを用いてラットを訓練する
- 自動化システムをセットアップします。
- チャンバーのライトをオンにし、必要に応じてペレットリザーバを補充します。
- ラットの足の好みに応じてペレット送達ロッドを配置します。アクチュエータの位置が正しく設定されていることを確認します (図 2Aのように)。
- コンピュータの電源を入れ、スキル・リーチ・プログラム(SR_dig_extension_card_64bit_(HOST)_3.vi)を開きます。[件名]の下にラット ID 番号を入力し、[ハンドドロップダウン] メニューから足の設定を選択します。ビデオの保存パスを指定します。
- セッション時間と最大動画(セッションを終了するビデオの数) を設定します。プログラムは、最初に制限に達した方が実行を停止します。
- ペレットリフト持続時間を設定します(ラットがペレットを要求した後、送達ロッドが位置「3」のままである時間の持続時間)。早期リーチペナルティを有効または無効にする(デリバリーロッドは「1」の位置にリセットし、ラットがペレットを要求する前に到達した場合は「2」に戻る)。
- キャリブレーション画像を撮ります。3-D 軌道の再構築では、コンピュータ ビジョン ツールボックスを使用して適切な変換行列を決定します。これを行うには、両側にチェッカーボードパターンを持つ小さな立方体を使用します(図3)。
- 手を伸ばすチャンバーの中に助けの手を置き、到達スロットを通してワニクリップを突きます。ワニクリップで到達スロットの前に立方体を保持します。
- 上のミラーに赤い面、左側のミラーの緑色の面、右側のミラーの青い面が表示されるようにキューブを配置します。3 つの辺の面全体が鏡に表示されます (図3)。
- 動作プログラムでは、ROIしきい値が非常に大きい値 (60000 など) に設定されていることを確認します。実行ボタン(白い矢印)をクリックします。カメラ初期化ボタンが緑色に変わったら、START キーを押します。 ビデオが取得中であることに注意してください。
- カルモードをクリックします。次に、[カル画像を撮影] をクリックして画像を撮影します。イメージ ディレクトリ パスが ".png パス" の下に表示され、.png ファイル名が "GridCalibration_YYYYMMDD_img#.png" として書式設定されます。
- キューブを少し動かして、別のイメージを撮ります。合計 3 つの画像についてもう一度繰り返します。
- 停止をクリックしてプログラムを停止し、[停止] ボタンをクリックします。箱から手とキューブを取り外します。
- その日のキャリブレーション画像が撮影された後、行動室で何かをぶつけないように注意してください。何かが動く場合は、新しいキャリブレーション画像を撮影する必要があります。
- 自動化されたシステムを実行します。
注: 実際のデータ取得のためにラットを実行する前に、各ミラーの「ROI しきい値」設定 (後述) を決定します。これらの設定が決定されたら、プログラムを開始する前に事前に設定し、必要に応じて取得時に調整します。- 熟練した到達室にラットを置く。プログラムを実行するには、白い矢印をクリックします。
- STARTをクリックする前に、Xオフセット(ROI 四角形の左上隅の X 座標)、Yオフセット(ROI の左上隅の y 座標)、ROI 幅と ROI 幅とを調整して、足検出用のROIの位置を設定します。ROIの高さ.
- 足のドーサムを示すサイドミラーにROIを配置し、到達スロットの正面に配置します(図2C)。ペレット送達ロッドがROIに入らず、ラットが到達していないときにペレットまたはラットの毛皮がビデオをトリガするのを防ぐために、ROIがボックスに伸びていないことを確認してください。
- [スタート]をクリックしてプログラムを開始します。
- 「ライブROIトリガー値」が「0」と「1」の間で振動するまで(ラットが到達していない場合)、「低ROIしきい値」の値を調整します。この値は、しきい値範囲内の強度値を持つ ROI 内のピクセル数です。
- ROI しきい値を設定します。ラットがROIに鼻を突くとき、そしてラットがペレットに達したとき、ライブROIトリガー値を観察してください。ROIしきい値を、鼻突中の「ライブROIトリガー値」よりも大幅に大きく設定し、ラットが到達したときに「ライブROIトリガー値」よりも低くなります。ラットがスロットを通して鼻を突くときではなく、一貫してビデオがトリガされるまで調整する
注: これは、足が鼻よりも明るい色であることを前提としています。足が鼻よりも暗い場合、調整は反転します。 - 最初のいくつかの試行を監視して、すべてが正しく動作していることを確認します。ラットがペレット(位置「2」の配達ロッド)を要求する前に到達すると、「早期到達」数が増加します。ラットがペレット(位置「3」の配達ロッド)を要求した後に到達すると、「動画」の数が増加し、ビデオは「RXXXX_YYYYMMDD_HH_MM_SS_trial#」という名前の.binファイルとして保存されます。
注: デフォルトでは、ビデオにはトリガーイベントの前に 300 フレーム (つまり、1 秒) とトリガー イベントの後に 1000 フレームが含まれており(これはソフトウェアで設定可能です)、足の引き込みなどの範囲から把握までの動きを含むのに十分な長さです。 - セッション時間または最大ビデオに達すると、プログラムは停止します。停止標識ボタンを押します。
- エタノールでチャンバーをきれいにし、別のラットで繰り返す、またはその日のために行われた場合は、ビデオを変換に進みます。
- .bin ファイルを .avi ファイルに変換します。
注: 集録中にビデオを圧縮するとフレームが切断されるため、バイナリ ファイルは取得時にディスクにストリーミングされます (データ転送速度が高いため、ソリッド ステート ドライブを使用します)。これらのバイナリ ファイルは、オフラインで圧縮する必要があります。- "bin2avi-color_1473R_noEncode.vi" プログラムを開きます。
- [ファイル パスコントロール] でフォルダ ボタンをクリックして、変換するセッション (R0235_20180119a など) を選択します。セッションごとに繰り返します (最大 6 つ)。
- 白い矢印(実行)をクリックし、開始する「START」をクリックします。ビデオ圧縮を監視できるのは、「全体的な進捗状況(%)」です。バー。プログラムを一晩実行します。
- 次の日に動物のトレーニングを開始する前に、ビデオが変換されたことを確認し、新しいビデオを取得するのに十分なスペースがあるように .bin ファイルを削除します。
5. DeepLabCutで動画を分析する
注:各足の好み(右足と左足)と各ビュー(右足ラットの直接ビューと左ミラービュー、左足ラットの直接ビューと右ミラービュー)ごとに異なるネットワークがトレーニングされます。トップミラービューは、鼻がスロットに入ったタイミングを検出するために3D再構成には使用されません。各ネットワークは、対応する足とビューのためにトリミングされた一連のビデオを分析するために使用されます。
- DeepLabCut ネットワークをトレーニングする (詳細な手順は、https://github.com/AlexEMG/DeepLabCutの DeepLabCut ドキュメントを参照)。
- マーカーレスポーズ推定13の機械学習アルゴリズム DeepLabCut で新しいプロジェクトを作成および構成します。
- プログラムを使用して、熟練したリーチビデオからフレームを抽出し、画像をトリミングして、プログラムインターフェイスに(直接またはミラービュー)を含めます。ラットと両方の前足が見えるように十分な大きさのフレームをトリミングします。
注: ネットワークには通常、100 ~ 150 のトレーニング フレームが必要です。照明のために部屋の外と比較して足が中にある場合は、より多くのトレーニングフレームが必要です。トリミングを厳しくすると処理時間は短縮されますが、トリミングされた領域は、各ラットの足の完全な軌道を検出するのに十分な大きさに注意してください。ラットの全身がフレーム(直接視野)に収まるのに十分な広さで、可能な限りチャンバーに戻り、配達ロッド(ミラービュー)の前に戻って見る必要があります。 - プログラム GUI を使用して、本文パーツにラベルを付けます。各フレームのラベル16点:4メタカルポパランゲル(MCP)関節、4近位間咽頭(PIP)関節、4桁の先端、到達する足のドーサム、鼻、手の届く足のドーサム、およびペレット(図4)。
- DeepLabCut (DLC の省略形) の指示に従って、トレーニング データセットを作成し、ネットワークをトレーニングし、トレーニング済みのネットワークを評価します。
- ビデオを分析し、ネットワークを洗練します。
- 新しくトレーニングされたネットワークを使用してすべてのビデオを分析する前に、10 本のビデオを分析してネットワークのパフォーマンスを評価します。特定のポーズで一貫したエラーがある場合は、それらのポーズを含む追加のトレーニング フレームを抽出し、ネットワークを再トレーニングします。
- ビデオを分析するときは、3D 軌道の再構築のためにコードに供給される .csv ファイルを出力してください。
6. ボックスキャリブレーション
注: これらの手順は、直接ビューとミラー ビューで識別されたポイントを 3-D 座標に変換する変換行列を決定するために使用されます。最新バージョンおよび boxCalibration パッケージの使用方法の詳細については、Leventhal Lab GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration を参照してください。
- 同じフォルダ内のすべてのキャリブレーション画像を収集します。
- ImageJ/Fiji を使用して、各キャリブレーション イメージのチェッカーボード ポイントを手動でマークします。このイメージを "GridCalibration_YYYYMMDD_#.tif" として保存します。
- ImageJ で測定機能を使用します (ツールバーで[分析]を選択します|メジャー)。マークされたすべてのポイントの座標を含むテーブルが表示されます。日付とイメージ番号が対応する .tif ファイルと同じである "GridCalibration_YYYYMMDD_#.csv" という名前でこのファイルを保存します。
- boxCalibrationパッケージから 'setParams.m' ファイルを開きます。このファイルには、必要なすべての変数とその説明が含まれています。プロジェクトの仕様に合わせて必要に応じて変数を編集します。
- キャリブレーションボックス機能を実行します。コマンド ウィンドウに複数のプロンプトが表示されます。最初のプロンプトは、フォルダ内のすべての画像を分析するかどうかを確認します。Yと入力するとプロンプトが終了し、すべての日付のすべてのイメージが分析されます。Nと入力すると、分析する日付を入力するように求められます。
注: キャリブレーション イメージ フォルダーには、2 つの新しいディレクトリが作成されます: 'markedImages' には、キャリブレーション イメージ上のユーザー定義のチェッカーボード マークを持つ .png ファイルが含まれています。'boxCalibration' フォルダには、ボックスキャリブレーションパラメータを持つ .mat ファイルが含まれています。 - チェックボックスキャリブレーション機能を実行します。これにより、'boxCalibration' フォルダーに新しいフォルダ 「チェックキャリブレーション」が作成されます。各日付には、画像と複数の .fig ファイルを含むサブフォルダが含まれ、ボックスのキャリブレーションが正確に完了したことを確認するために使用されます。
7. 3D軌道の再構築
- 学習プログラム出力を含む .csv ファイルを、reconstruct3Dtrajecstoriesスクリプトで説明されているディレクトリ構造体に組み立てます。
- 再構築3Dtrajectoriesを実行します。このスクリプトは、ディレクトリ構造を検索し、傾斜プログラム内の名前に基づいて直接/ミラー ポイントと一致します (両方のビューで同じボディ パーツ名を使用することが重要です)。
- 計算キネマティクスを実行します。このスクリプトは、特定のニーズに合わせて調整できる 3D 軌道の再構築から単純なキネマティック機能を抽出します。
注: ソフトウェアは、近傍に基づいて閉塞したボディ パーツの位置と相補ビュー内の位置を推定します(例えば、ダイレクト カメラ ビュー内のボディ パーツの位置は、ミラー ビュー内の可能な位置を制約します)。スロットを通過する際に足がミラー ビューに閉塞されている場合、足の座標は隣接するフレームに基づいて補間されます。
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Representative Results
ラットは、装置に順応するとすぐに熟練した到達タスクを取得し、1~2週間のリーチ数と精度の両方の点でパフォーマンスが高くなります(図5)。図 6は DeepLabCut で識別された構造を示すサンプル ビデオ フレームを示し、図 7は単一のセッションから重ね合わせた個々のリーチ軌跡を示しています。最後に、図 8では、足検出トリガー (手順 4.3.4 - 4.3.6) が正確に設定されていない場合の動作を示します。足が到達スロットを突破するフレームには大きなばらつきがあります。これは、リーチキネマティクスを分析する上で大きな問題ではありません。しかし、それは、介入(例えば、光遺伝学)が到達運動中にトリガされたときに変動性につながる可能性があります。
図1:熟練した到達室。
左上から時計回りに、側面図、前面と上からの眺め、アクチュエータが取り付けられているフレーム(ステップ1.8を参照)、側面と上からの眺めです。熟練した到達室(1)は、ラットをチャンバーに入れて取り出すことを可能にするために片側に切断されたドア(2)を有する。スリットを天井パネル(12)に切断して動物をつなぎ、床パネル(13)に穴を開けてゴミが落ちるようにします。2つの赤外線センサ(3)は、チャンバの両側に位置合わせされています。ミラー(4)は、到達室の前部にある到達スロット(14)の上に取り付けられ、他の2つのミラー(6)は、到達室の両側に取り付けられる。熟練した到達室はサポートボックス(5)の上に座る。高精細カメラ(7)は、到達スロットの前のサポートボックスに取り付けられています。カメラ(7)の両側に2枚の黒紙(18)を取り付け、サイドミラー(6)の足のコントラストを高めます。支持ボックスの下には、線形アクチュエータ(16)およびペレットリザーバ(9)を支持するフレーム(8)がある。ペレット送達ロッド(10)を包むガイドチューブは、ペレット貯留部にフィットし、線形アクチュエータによって制御される。ペレット貯蔵所の上のアクチュエータフレーム(17)およびサポートボックス(15)に穴を開け、ペレット送達ロッドが自由に上下に動くことを可能にする。箱はキャビネットの壁および天井に取付けられるライトパネル(11)と照らされる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単一試用構造。
(A) 試験は、「準備完了」位置(位置2 –到達スロットの床と底の中間)に配置されたペレット送達ロッド(線形アクチュエータによって制御される)から始まります。(B) ラットは、赤外線(IR)ビームを破るためにチャンバーの背面に移動し、ペレット送達ロッドが位置3(到達スロットの底部に位置する)に上昇させる。(C) ラットは、ペレットをつかむのに到達スロットを通って到達する。リーチは、スロットの正面にあるサイドミラービューの対象領域(ROI)内のピクセル強度変化を検出するFPGAフレームグラバーを使用してリアルタイムで検出されます。十分なピクセルがユーザー定義の「足の強度」と一致すると、ビデオ取得がトリガーされます。(D) 2秒後にペレットを1位に下げ、ペレット貯留部から新しいペレットを拾ってから位置2にリセットする。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:サンプルキャリブレーション画像。
助けの手は熟練した達する部屋の中に置かれる。ワニクリップは、到達するチャンバーの外側の所定の位置にキャリブレーションキューブを保持するために、到達スロットを突き抜けます。3 つのチェッカーボード パターンは、直接ビューと対応するミラー ビュー (緑: 左、赤:上、青: 右) に完全に表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アルゴリズムマーカーの位置を学習する。
左の列: 直接ビュー;右列: ミラー ビュー。マーカー 1-4: MCP ジョイント;5-8: PIP ジョイント;9-12: 数字のヒント;13:手に到達する足のドーサム;14: 鼻;15:手が届かない足のドーサム。マーカー16(ペレット)は表示されません。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ラットは、自動化された熟練した到達タスクを迅速に取得します。
自動熟練到達タスク(n = 19)の最初の20回のトレーニングセッションにおける平均最初の到達成功率(緑、左軸)と平均総試行率(青、右軸)。各トレーニング セッションは 30 分続きました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 学習プログラムによってマークされたビデオ フレームのサンプル。
左列: ミラー ビュー;右の列:直接ビュー。シアン、赤、黄、緑の点はそれぞれ 1 ~ 4 桁をマークします。白い点は鼻をマークし、黒い点はペレットをマークします。塗りつぶされた円はDeepLabCutによって識別された。開いた円は、そのオブジェクトが反対側のビューに表示された場所によって推定されるオブジェクトの位置をマークします。X は、3-D 位置の推定値からビデオ フレームに再投影されるポイントです。このビデオは、足がスロットを通過するフレーム 300 でトリガーされました。上の画像は、到達する足が検出されたときに最初のフレームから生成されます。下のイメージは、2 桁目が最大に延長されたフレームから得られます。これらのフレームは、画像処理ソフトウェアによって識別された。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: 単一のテスト セッションから 3-D 軌道をサンプルします。
どちらの軸も同じデータを表示しますが、プレゼンテーションを容易にするために回転します。黒い線は平均軌道を示します。シアン、赤、黄、緑は、それぞれ数字1~4の先端の個々の軌道です。青い線は足の軌道を示す。大きな黒い点は、(0,0,0)に位置する砂糖ペレットを示します。これは、プレゼンテーションの容易さのための最初の足の進歩のみを表します(引き込みや複数のリーチを含む)、数字はほとんど解釈できません。ただし、すべてのキネマティック データは分析に使用できます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 8: 2 つの異なるセッションで特定の到達フェーズが識別されたフレーム番号のヒストグラム。
1つのセッション(暗い実線)では、ROIトリガ値が慎重に設定され、各トライアルで同じ数フレーム内のスロットに違反する足が識別されました。他のセッション(軽い破線)では、鼻はしばしば手の届く足と誤認され、ビデオの取得が途中で引き起こされました。これは、完全なリーチがキャプチャされない限り、オフラインキネマティック解析にはほとんど影響を与えないことに注意してください。しかし、到達する足によって引き起こされる潜在的な介入は不十分なタイミングになります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
げっ歯類の熟練した手入れは、運動システム生理学と病態生理学を研究するための標準的なツールとなっています。私たちは、最小限の監督によるトレーニングとテスト、3D足と数字の軌道再構築(到達中、把握、および足の引き込み中)、リアルタイムの識別を可能にする自動化されたラットの熟練した到達タスクを実装する方法を説明しました。手を伸ばし、外部エレクトロニクスと同期する間に足。前肢運動学と生理学との相関や、動きに到達する際に正確にタイミングの良い介入を行うのに適しています。
我々は最初にこの設計14を報告したので、私たちのトレーニング効率が改善され、ほぼ100%のラットがタスクを取得します。トレーニングの成功につながる重要な要素をいくつか特定しました。飢餓によって動機付けられた多くのタスクと同様に、ラットは、彼らの予想体重の80〜90%を維持するために、カロリー制限中に慎重に監視する必要があります。トレーニングの前であっても、毎日ラットを取り扱ることは、ヒトに順応するために非常に重要です。ラットは、ペレットを要求するためにチャンバーの背面に戻ることを学ぶ前に到達するように訓練する必要があります - これは大幅にトレーニング時間を短縮し、ラットがタスクを取得する可能性を向上させます。最後に、一見同一のチャンバー間で転送されると、ラットはしばしばより少ないリーチを行います。これは、チャンバーが初めて使用された場合に特に当てはまります。これは、チャンバー間の香りの違いによるものと推測されます。理由が何であれ、可能な限り安定したトレーニング環境を維持するか、またはテストが行われる可能性のあるすべてのボックスにラットを順応することが重要です。
ここで説明する装置は、特定のニーズに容易に適応可能である。タスクのラットバージョンについて説明しましたが、マウス版も実装しています(ただし、マウスのDeepLabCutで個々の数字を識別することは困難です)。個々のビデオフレームはTTLパルスでマークされているため、デジタルまたはアナログ入力を受け入れる任意の記録システム(例えば、電気生理学アンプやフォトメトリー)とビデオを同期することができます。最後に、ヘッド固定マウスは、容易に9に達する熟練した実行を行い、このタスクのヘッド固定バージョンは、2光子イメージングまたは並置細胞記録のために実装することができる。重要なのは、このシステムを使用したのは、鼻と足の毛皮(それぞれ黒と白)が、鼻突きがリーチと間違えない色で十分に異なるロングエバンスラット(適切なROI設定、図8)でのみ使用されています。これは、足と鼻に同様の着色を持つラット(例えば、アルビノラット)の問題である可能性がありますが、インク、マニキュア、またはタトゥーで足を着色することによって解決することができます。
熟練したリーチの提示されたバージョンは、特定のアプリケーションに応じて有利な場合があり、いくつかの異なる機能を持っています。比較的複雑なハードウェアとリアルタイムビデオ処理の必要性は、ホームケージトレーニング6、7に適していません。一方、ホームケージトレーニングでは、高速高解像度ビデオを複数の角度から取得したり、生理的な記録/介入のために動物をつなぐことが困難になります。データ取得カードとチャンバあたり 1 台のコンピュータの要件により、各チャンバは比較的高価になり、ビデオには重要なデジタル記憶領域 (4 s ビデオあたり約 200 MB) が必要です。私たちは、リアルタイムのフィードバックや外部デバイスと同期する機能を欠いているが、チャンバーあたり約300ドルのコストのシンプルなマイクロコントローラベースのバージョンを実装しています。これらのボックスは、本質的にここに記載されているものと同じですが、商用ビデオカメラを使用し、マイクロコントローラをプログラムする以外にコンピュータを必要としません(このセットアップと関連ソフトウェアの詳細は、要求に応じて利用可能です)。FPGAフレームグラバー上のリアルタイムビデオ処理は特に便利です。赤外線ビームや近接センサーよりもリアルタイムでリーチを識別する(これは、到達する足のためにラットのスナウトを間違える可能性があります)。さらに、複数のトリガを使用して、異なる到達段階(例えば、スロットへのアプローチ、足リフト、スロットを介した延長)で足を識別することができます。これは、再現可能な、正確にタイミングの速い神経摂動を可能にするだけでなく、短い高速ビデオのストレージをトリガするために使用することができます。
当社の自動バージョンの熟練したリーチには、特定のアプリケーションにはいくつかの利点がありますが、いくつかの制限もあります。前述のように、高速、高解像度カメラは適度に高価ですが、単一の画像にミラーと直接ビューを含め、非常に速い手の動きをキャプチャする必要があります。1台のカメラを使用すると、複数のビデオストリームを同時に同期して録画したり、複数のカメラやフレームグラバを購入したりする必要がなくなります。反射ビューの足は、直接のビューと同じカメラ (レイ トレーシングによる) の約 2 倍の距離です。つまり、DLC は両方のビューで個々の桁を堅牢に識別しますが、ビューの 1 つが常にピントが合っていないということです (図4、図6)。最後に、DLCが利用可能になれる前に、タトゥーで数字を色分けしてみたため、カラーカメラを使用しました。この学習ベースのプログラムは、白黒(または低解像度)のビデオでも同様に有効である可能性がありますが、ここで説明するハードウェアの有効性のみを検証できます。最後に、分析コード(DLCを除く)は主に商用ソフトウェアパッケージ(材料の表を参照)で書かれていますが、必要に応じてオープンソースプログラミング言語(Pythonなど)に適応するのは簡単です。
このシステムの改善に取り組む方法はいくつかあります。現在、ミラー ビューはフロント パネルによって部分的に遮蔽されています。そこで、障害物を最小限に抑えながら、足の複数の同時ビューを取得する方法を模索してきました。もう 1 つの重要な開発は、自動的にリーチをスコア付けすることです (システムはキネマティクスを追跡できますが、人間は成功したリーチと失敗したリーチをスコア付けする必要があります)。ペレットが棚/台座からノックされたかどうかを判断する方法が開発されましたが、ペレットが完全に把握されたか見逃されたかを判断することはできません11.DLCでペレットを追跡することにより、試用ごとのリーチ数、ペレットが把握されたか、台座をノックしたか、または完全に見逃されたかを判断するアルゴリズムを探っています。これらのラインに沿って、我々はまた、ビデオ変換、DLC処理、および自動スコアリングを通じて、データ収集からワークフローを完全に自動化するために取り組んでいます。最終的には、1日に複数の実験を行うことができるシステムを想定し、翌朝までに各実験の完全な前肢運動学と到達スコアが決定されました。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、熟練した到達タスクに関するアドバイスをカルネシュ・ガングリと彼の研究室に感謝したいと思います, そして、アレクサンダーとマッケンジー・マティスは、DeepLabCutを適応させる彼らの助けのために.この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(助成番号K08-NS072183)とミシガン大学によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| clear polycarbonate panels | TAP Plastics | cut to order (see box design) | |
| infrared source/detector | Med Associates | ENV-253SD | 30" range |
| camera | Basler | acA2000-340kc | 2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link |
| camera lens | Megapixel (computar) | M0814-MP2 | 2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus |
| camera cables | Basler | #2000031083 | Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables |
| mirrors | Amazon | ||
| linear actuator | Concentrics | LACT6P | Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer |
| pellet reservoir/funnel | Amico (Amazon) | a12073000ux0890 | 6" funnel |
| guide tube | ePlastics | ACREXT.500X.250 | 1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long |
| pellet delivery rod | ePlastics | ACRCAR.250 | 0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length) |
| plastic T connector | United States Plastic Corp | #62065 | 3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee |
| LED lights | Lighting EVER | 4100066-DW-F | 12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool |
| Light backing | ePlastics | ACTLNAT0.125X12X36 | 0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet |
| Light diffuser films | inventables | 23114-01 | .007x8.5x11", matte two sides |
| cabinet and custom frame materials | various (Home Depot, etc.) | 3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure) | |
| acoustic foam | Acoustic First | FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick) | |
| ventilation fans | Cooler Master (Amazon) | B002R9RBO0 | Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers |
| cabinet door hinges | Everbilt (Home Depot | #14609 | continuous steel hinge (1.4" x 48") |
| cabinet wheels | Everbilt (Home Depot | #49509 | Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake |
| cabinet door handle | Everbilt (Home Depot | #15094 | White light duty door pull (4.5") |
| computer | Hewlett Packard | Z620 | HP Z620 Desktop Workstation |
| Camera Link Frame Grabber | National Instruments | #781585-01 | PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full |
| Multifunction RIO Board | National Instruments | #781100-01 | PCIe-17841R |
| Analog RIO Board Cable | National Instruments | SCH68M-68F-RMIO | Multifunction Cable |
| Digital RIO Board Cable | National Instruments | #191667-01 | SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series |
| Analog Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| Digital Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| 24 position relay rack | Measurement Computing Corp. | SSR-RACK24 | Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel |
| DC switch | Measurement Computing Corp. | SSR-ODC-05 | Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A |
| DC Sense | Measurement Computing Corp. | SSR-IDC-05 | solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC |
| DC Power Supply | BK Precision | 1671A | Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply |
| sugar pellets | Bio Serv | F0023 | Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored) |
| LabVIEW | National Instruments | LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions | 64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW |
| MATLAB | Mathworks | Matlab R2019a | box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox |
References
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