Summary
Gnagare skickliga nå används ofta för att studera skicklig färdigheter, men kräver betydande tid och ansträngning för att genomföra uppgiften och analysera beteendet. Vi beskriver en automatiserad version av kompetent sträcka med rörelsespårning och tredimensionell rekonstruktion av Reach-banor.
Abstract
Gnagare skickliga nå används ofta för att studera skicklig färdigheter, men kräver betydande tid och ansträngning för att genomföra uppgiften och analysera beteendet. Flera automatiserade versioner av kompetent att nå har utvecklats nyligen. Här beskriver vi en version som automatiskt presenterar pellets till råttor när du spelar in HD-video från flera vinklar vid höga bildhastigheter (300 fps). Paw och enskilda siffror spåras med DeepLabCut, en maskininlärningsalgoritm för markerless pose uppskattning. Detta system kan också synkroniseras med fysiologiska inspelningar, eller användas för att utlösa fysiologisk intervention (t. ex. elektrisk eller optisk stimulering).
Introduction
Människor är starkt beroende av skicklig skicklighet, definierad som rörelser som kräver exakt koordinerade multigemensamma och siffriga rörelser. Dessa färdigheter påverkas av en rad vanliga sjukdomar i centralanervsystemet, inklusive strukturella lesioner (t. ex. stroke, tumör, demyelinierande lesioner), neurodegenerativa sjukdomar (t. ex. Parkinsons sjukdom) och funktionella avvikelser i motoriska kretsar (t. ex. dystoni). Att förstå hur dexterösa färdigheter lärs och implementeras av centrala motor kretsar har därför potential att förbättra livskvaliteten för en stor befolkning. Dessutom är en sådan förståelse sannolikt att förbättra motoriska prestanda hos friska människor genom att optimera utbildning och Rehabiliteringsstrategier.
Dissekera neurala kretsar bakomliggande skicklig skicklighet hos människor begränsas av tekniska och etiska överväganden, vilket kräver användning av djurmodeller. Nonhuman primater används ofta för att studera dexterösa extremiteter rörelser med tanke på likheten mellan deras motorsystem och beteendemässiga repertoar till människor1. Emellertid, icke-mänskliga primater är dyra med långa generationen gånger, begränsa antalet försökspersoner och genetiska interventioner. Även om den neurovetenskapliga verktygslåda som gäller för icke-mänskliga primater är större än för människor, är många nya tekniska framsteg antingen otillgängliga eller betydligt begränsad i primater.
Gnagare skickliga nå är en kompletterande metod för att studera skicklig motorstyrning. Råttor och möss kan utbildas för att nå för, greppa, och hämta en sockerpellet i en stereotyp sekvens av rörelser homolog till mänskliga nå mönster2. På grund av sin relativt korta generationstid och lägre boendekostnader, samt deras förmåga att förvärva skickliga nå under dagar till veckor, är det möjligt att studera ett stort antal ämnen under både inlärning och skicklighet konsoliderings faser. Användningen av gnagare, särskilt möss, underlättar också användningen av kraftfulla moderna neurovetenskapliga verktyg (t. ex. optogenetik, kalcium avbildning, genetiska modeller av sjukdomar) för att studera dexterös skicklighet.
Gnagare kvalificerade nå har använts i årtionden för att studera normal motorstyrning och hur det påverkas av specifika patologier som stroke och Parkinsons sjukdom3. Men de flesta versioner av denna uppgift är arbete och tidskrävande, lindra fördelarna med att studera gnagare. Typiska implementeringar involverar att placera gnagare i en Reach-kammare med en hylla framför en smal lucka genom vilken gnagare måste nå. En forskare placerar manuellt sockerpelletar på hyllan, väntar på att djuret ska nå och placerar sedan ytterligare en. Når görs som framgångar eller misslyckanden antingen i realtid eller genom Video Review4. Men bara scoring når som framgångar eller misslyckanden ignorerar rika kinematiska data som kan ge insikt i hur (i motsats till helt enkelt om) nå är nedsatt. Detta problem åtgärdades genom att implementera detaljerad granskning av att nå videor för att identifiera och semi-kvantitativt Poäng nå under rörelser5. Även om detta lagt till några data om Reach kinematik, det också betydligt högre försöksledaren tid och ansträngning. Ytterligare, höga nivåer av experimenteraren engagemang kan leda till inkonsekvenser i metodik och dataanalys, även inom samma labb.
På senare tid har flera automatiserade versioner av kompetent att nå utvecklats. Vissa fäster hem buren6,7, vilket eliminerar behovet av att överföra djur. Detta både minskar stressen på djuren och eliminerar behovet av att vänja dem vid en specialiserad nå kammare. Andra versioner tillåter Paw tracking så att kinematiska förändringar under specifika interventioner kan studeras8,9,10, eller har mekanismer för att automatiskt avgöra om pellets slogs av hyllan11. Automatiserade kvalificerade att nå uppgifter är särskilt användbara för högintensiv träning, som kan krävas för rehabilitering efter en skada12. Automatiserade system gör det möjligt för djur att utföra ett stort antal räckvidder under långa tidsperioder utan att kräva intensiv forskar inblandning. Dessutom, system som tillåter Paw Tracking och automatiserad resultat scoring minska forskaren tid spenderas utföra dataanalys.
Vi utvecklade ett automatiserat rått kompetent att nå system med flera specialiserade funktioner. Först, genom att använda en rörlig piedestal för att få pelleten i "nå position" underifrån, får vi en nästan obehindrad bild av forelimb. För det andra tillåter ett system av speglar flera samtidiga vyer av Reach med en enda kamera, vilket möjliggör tredimensionell (3-D) rekonstruktion av Reach banor med hjälp av en högupplöst, hög hastighet (300 fps) kamera. Med den senaste utvecklingen av robusta maskininlärningsalgoritmer för markerless rörelsespårning13, spårar vi nu inte bara Paw utan enskilda knogar för att extrahera detaljerad räckvidd och förstå kinematik. För det tredje tillåter en Frame-Grabber som utför enkel videobearbetning i realtid identifiering av distinkta nå faser. Denna information används för att utlösa video förvärv (kontinuerlig video förvärv är inte praktiskt på grund av filstorlek), och kan också användas för att utlösa interventioner (t. ex., optogenetik) vid exakta tidpunkter. Slutligen, enskilda videobildrutor utlöses av transistor-transistor logic (TTL) pulser, vilket gör att videon exakt synkroniseras med neurala inspelningar (t. ex., elektrofysiologi eller fotometri). Här beskriver vi hur man bygger detta system, utbilda råttor för att utföra uppgiften, synkronisera apparaten med externa system, och rekonstruera 3-D nå Trajectories.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som omfattar användning av djur som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Michigan.
1. ställa in den gående kammaren
Anmärkning: Se Ellens et al.14 för detaljer och scheman över apparaten. Artikelnummer se figur 1.
- Bond Clear polykarbonat paneler med akryl cement för att bygga den når kammaren (15 cm bred med 40 cm lång med 40 cm lång) (del #1). En sidopanel (del #2) har en gångdörr (18 cm bred och 15 cm lång) med lås. Om råttan kommer att vara bundna till en kabel, skär en slits (5 cm bred med 36 cm lång) i kammaren taket för att rymma den (del #12). Golv panelen har 18 hål (1,75 cm diameter) (del #13) skuren i den och är inte bunden till resten av kammaren.
- Montera och rikta in infraröda sensorer (del #3) i sidopanelerna 4,5 cm från baksidan av kammaren och 3,8 cm från golvet. Beteende programvaran har en indikator ("IR tillbaka") som är grön när den infraröda strålen är obruten och röd när strålen bryts. När programvaran är inställd, kan detta användas för att kontrollera sensor justering.
- Montera en spegel (15 cm x 5 cm, del #4) 10 cm ovanför den sträcka (del #14). Vinkel spegeln så pellets leverans staven är synlig för kameran.
- Placera kammaren på en sanitiserbart support Box (59 cm bred med 67,3 cm lång med 30,5 cm lång, del #5). Kammaren vilar ovanför ett hål i stöd boxen (12 cm bred med 25 cm lång) som gör att strö kan falla genom golv hålen (del #13) och ut ur den gående kammaren. Skär ett andra hål (7 cm brett med 6 cm lång, del #15) i stöd boxen framför den nå facket, vilket gör att en pellet leverans spö för att få pellets till att nå facket.
- Montera två speglar (8,5 cm bred x 18,5 cm lång, del #6) till golvet med magneter på vardera sidan av kammaren så att den långa kanten av spegeln vidrör sidopanelen 3 cm från framsidan av att nå rutan. Vinkel speglarna så att kameran kan se in i lådan och området framför den nå springan där pelleten kommer att levereras.
- Montera högupplöst kamera (del #7) 17 cm från den springare öppningen, vänd mot boxen.
- Montera svart papper (del #18) på vardera sidan av kameran så att bakgrunden i sidospeglarna är mörk. Detta förbättrar kontrasten för att förbättra realtid och off-line Paw identifiering.
- Montera den linjära ställdon (del #16) på en sanitiserbart ram (25 cm bred med 55 cm lång med 24 cm lång, del #8) med skruvar. Ställdonet monteras upp och ner för att förhindra att pellets damm ackumuleras inuti sin positions Avkännings potentiometer.
- Sätt i en skum O-ring i nacken på pellets behållaren (tratt) (del #9) för att förhindra att damm samlas i aggregatet. Montera tratten under ett hål (~ 6 cm diameter, del #17) i toppen av ramen genom att glida kanterna på tratten ovanför tre skruvar borras in undersidan av ramen toppen. Sätt i styrröret (del #10) i halsen på tratten.
- Anslut plast T-kontakten till änden av stål staven på manöverdonet. Sätt in den avsmalnande änden av pelleten i den övre delen av kontakten och den kupade änden genom styrröret i pellets behållaren.
- Placera den linjära ställdon församlingen under den skickliga nå kammaren så att pellets leverans spö kan sträcka sig genom hålet (del #15) framför den nå facket.
- Placera hela nå apparaten i ett hjulförsett skåp (121 cm x 119 cm x 50 cm) ventilerade med datorfläktar (interiören blir varm när väl upplyst) och fodrad med akustiskt skum.
- Bygg fem ljuspaneler (del #11) genom att följa LED-ljusremsor på 20,3 cm med 25,4 cm stöd paneler. Montera diffusor film över de ljusa remsorna. Montera en ljuspanel på taket över pellets leverans spö området. Montera de andra fyra på sidorna av skåpen längs den gående kammaren.
Obs: det är viktigt att belysa området runt nå facket och pellets leverans spö för realtid Paw identifiering.
2. Installera datorn och hårdvaran
- Installera FPGA Frame Grabber och digitala förlängnings kort enligt tillverkarens anvisningar (se material tabellen).
Obs: Vi rekommenderar minst 16 GB RAM-minne och en intern solid state-hårddisk för datalagring, eftersom streaming av Höghastighetsvideo kräver betydande buffringskapacitet. - Installera drivrutiner för HD-kameran och Anslut den till FPGA framegrabber. Beteende programvaran måste vara igång och gränssnitt med kameran för att använda programvara som är associerad med kameran.
Obs: den medföljande koden (se kompletterande filer) har åtkomst till programmerbara register i kameran och kanske inte är kompatibel med andra märken. Vi rekommenderar att du spelar in minst 300 bildrutor per sekund (FPS); vid 150 fps fann vi att viktiga förändringar i Paw hållning var ofta missade. - Kopiera den medföljande koden (projekt) i "SR Automation_dig_ext_card_64bit" till datorn.
3. beteende träning
- Förbered råttor före träningen.
- House Long-Evans råttor (man eller kvinna, åldrar 10 – 20 veckor) i grupper om 2 – 3 per bur på en omvänd ljus/mörk cykel. Tre dagar före träning, placera råttor på livsmedel begränsning att bibehålla kroppsvikt 10 – 20% under baslinjen.
- Hantera råttor i flera minuter per dag i minst 5 dagar. Efter hantering, placera 4 – 5 socker pellets per råtta i varje hem bur för att introducera det nya livsmedlet.
- Habituate råttan till den gående kammaren (1 – 3 dagar)
- Slå på LED-lamporna och placera 3 socker pellets i fram-och baksidan av kammaren.
- Placera råttan i kammaren och låt råttan att utforska för 15 min. Monitor om det äter pellets. Upprepa denna fas tills råttan äter alla pellets bort av golvet.
- Rengör kammaren med etanol mellan råttor.
Obs: utför träning och testning under den mörka fasen. Utbilda råttor vid samma tid dagligen.
- Utbilda råttan att nå och observera Paw preferens (1 – 3 dagar).
- Slå på lamporna och placera råttan i den skickliga nå kammaren.
- Med hjälp av tång, håll en pellet genom den främre öppningen framtill på boxen (figur 1, figur 2). Låt råttan att äta 3 pellets från tång.
- Nästa gång råttan försöker äta pelleten från tång, dra pelleten tillbaka. Så småningom kommer råttan försöka nå för pelleten med sin tass.
- Upprepa detta 11 gånger. Tass att råttan använder mest av de 11 försöken är råttans "Paw preferens".
Anmärkning: ett försök definieras som Paw nå ut förbi nå facket. Råttan behöver inte framgångsrikt erhålla och äta pelleten.
- Utbilda råttan att nå till pellets leverans stången (1 – 3 dagar)
- Rikta in pellets leveransen spö med sidan av den nå facket kontralaterala till råttans föredragna tass (Använd en guide för att säkerställa konsekvent placering 1,5 cm från framsidan av den gående kammaren). Den övre delen av leverans staven bör överensstämma med botten av den nå facket (figur 2b). Placera en pellet på leverans stången.
Anmärkning: positionering av leverans stången mittemot råttans föredragna tass gör det svårt för råtta att få pelleten med sin icke-föredragna tass. Vi har inte haft problem med råttor med deras icke-föredragna Paw. Men i vissa modeller (t. ex. stroke) Detta kan fortfarande förekomma och en återhållsamhet på den icke-föredragna nå lem kan tillsättas. - Bete råttan med en pellet som innehas med hjälp av tång, men direkt råttan mot leveransen spö så att dess tass träffar pelleten på stången. Om råttan knackar på pelleten av staven, ersätta den. Vissa råttor kan inte initialt nå ut tillräckligt långt. I detta fall, flytta pellets leverans staven närmare den nå facket och sedan sakta flytta den längre bort som råttan förbättras.
- Efter ca 5 till 15 agnade når råttan kommer att börja nå för pelleten på leveransen staven spontant. När råttan har försökt 10 når till leveransen spö utan att vara baited, kan det avancera till nästa fas.
- Rikta in pellets leveransen spö med sidan av den nå facket kontralaterala till råttans föredragna tass (Använd en guide för att säkerställa konsekvent placering 1,5 cm från framsidan av den gående kammaren). Den övre delen av leverans staven bör överensstämma med botten av den nå facket (figur 2b). Placera en pellet på leverans stången.
- Utbilda råttan att begära en pellet (2 – 8 dagar).
Obs: även om vi har haft 100% framgång utbildning råttor att nå för pellets, om 10% av råttor misslyckas med att lära sig att begära en pellet genom att flytta till bak i kammaren.- Placera pellets leverans staven baserat på råttans Paw preferens och Ställ in den på position 2 (figur 2A). Ställ in höjd positionerna för pellets leverans staven med manöverdonets fjärrkontroll. Håll knappar 1 och 2 samtidigt flyttar leverans stången upp, medan du håller knapparna 3 och 2 flyttar leverans stången nedåt. När leverans staven är på rätt höjd, håll ned önskat nummer tills lampan blinkar rött för att ställa in.
- Placera råttan i kammaren och bete råttan på ryggen med en pellet. När råttan rör sig tillräckligt långt till bak i kammaren att det skulle bryta den infraröda strålen om den automatiserade versionen kördes, flytta pelleten leverans spö till position 3 (figur 2b).
- Vänta på råttan att nå för pelleten och sedan flytta pelleten leverans staven tillbaka till position 2 (figur 2A). Placera en ny pellet på leverans staven om den slogs av.
- Upprepa dessa steg, gradvis baiting råttan mindre och mindre, tills råttan börjar: (i) flytta till ryggen för att begära en pellet utan att vara agnade, och (II) omedelbart flytta till fronten efter att ha begärt en pellet i ryggen. När råttan har gjort detta 10 gånger, är det redo för utbildning på den automatiserade uppgiften.
4. utbilda råttor med hjälp av det automatiserade systemet
- Konfigurera det automatiserade systemet.
- Slå på lamporna i kammaren och fyll på pellets behållaren om det behövs.
- Placera pelleten leverans spö enligt råttans Paw preferens. Kontrollera att ställdons positionerna är korrekt inställda (som i figur 2A).
- Slå på datorn och öppna den skickliga nå program (SR_dig_extension_card_64bit_ (värd) _ 3. vi). Ange råttans ID-nummer under ämne och välj Paw-inställningen från rullgardinsmenyn hand . Ange Spara sökväg för videorna.
- Ställ in sessionstid och Max videor (antal videor som sessionen ska avslutas på). Programmet kommer att sluta köras på vilken gräns som nås först.
- Ställ in pellets lyftens längd (varaktigheten av tiden som leverans staven förblir i läge "3" efter att råttan har begärt en pellet). Aktivera eller inaktivera tidig räckvidd påföljd (Delivery Rod återställs till position "1" och sedan tillbaka till "2" om råttan når innan du begär en pellet).
- Ta kalibrerings bilder. Den 3-D bana rekonstruktion använder en dator vision verktygslåda för att bestämma lämpliga transformering matriser, som kräver att identifiera matchade punkter i varje vy. För att göra detta, Använd en liten kub med schackbräde mönster på varje sida (figur 3).
- Placera den hjälpande handen i den gående kammaren och peta på alligator klämman genom den gående öppningen. Håll kuben framför den springare öppningen med alligator klämman.
- Placera kuben så att den röda sidan visas i den övre spegeln, den gröna sidan i den vänstra spegeln och den blå sidan i den högra spegeln. Hela ansiktet på var och en av de tre sidorna ska vara synligt i speglarna (figur 3).
- I beteende programmet, se till att ROI tröskeln är inställd på ett mycket stort värde (t. ex., 60000). Klicka på knappen Kör (vit pil). När knappen kamera initierad blir grön trycker du på Start. Observera att videon förvärvas.
- Klicka på Cal-läge. Ta sedan en bild genom att klicka på ta Cal-bild. Sökvägen till avbildnings katalogen visas nu under ". png Path" med. png-filnamnet formaterat som "GridCalibration_YYYYMMDD_img #. png".
- Flytta kuben något och ta en annan bild. Upprepa igen för totalt 3 bilder.
- Stoppa programmet genom att klicka på stopp och sedan på knappen stopptecken. Ta bort hjälp handen och kuben från kartongen.
- Var noga med att inte stöta något i beteende kammaren efter kalibrering bilder har tagits den dagen. Om något rör sig måste nya kalibrerings bilder tas.
- Kör det automatiserade systemet.
Notera: Bestäm "ROI Threshold" Inställningar (beskrivs nedan) för varje spegel innan du kör råttor för faktiska datainsamling. När dessa inställningar har fastställts, förinställda dem innan du påbörjar programmet och justera under förvärvet om det behövs.- Placera råttan i den skickliga nå kammaren. Klicka på den vita pilen för att köra programmet.
- Innan du klickar på Start, ange positionen för ROI för Paw Detection genom att justera x-offset (x-koordinat i det övre vänstra hörnet av ROI-rektangeln), y-offset (y-koordinat för det övre vänstra hörnet av ROI), ROI-bredd och ROI-höjd.
- Placera ROI i sido spegeln som visar dorsum av tass, direkt framför den nå facket (figur 2C). Var noga med att pellets leveransen spö inte in i ROI och att ROI inte sträcker sig in i rutan för att förhindra att pelleten eller råttans päls från att utlösa en video när råttan inte når.
- Klicka på Start för att Starta programmet.
- Justera värdet "låg ROI tröskel" tills "Live ROI utlösa värdet" oscillerar mellan "0" och "1" (När råttan inte når). Det här värdet är antalet pixlar inom ROI med intensitetsvärden i tröskel intervallet.
- Ange ROI-tröskelvärdet. Observera Live ROI utlösa värde när råtta Petar näsan i Roi och när råttan når för pelleten. Ange ROI tröskeln ska vara betydligt större än "Live ROI utlösa värdet" under näsan Petar och lägre än "Live ROI utlösa värdet" När råttan når. Justera tills videor är konsekvent utlöses när råttan når men inte när det Petar näsan genom facket
Obs: Detta förutsätter att tass är ljusare färgad än näsan; justeringarna skulle vändas om tass är mörkare än näsan. - Övervaka de första försöken att se till att allt fungerar korrekt. När en råtta når innan du begär en pellet (Delivery Rod i position "2"), den "Early når" antalet ökar. När en råtta når efter be om en pellet (leveransen stav i position "3"), den "video" antal ökar och en video är bevarat som en. bin arkivera med det namn "RXXXX_YYYYMMDD_HH_MM_SS_trial #".
ANMÄRKNINGAR: Standardinställningen är att videor innehåller 300 bildrutor (dvs. 1 s) före och 1000 bildrutor efter utlösarhändelsen (detta är konfigurerbart i programvaran), som är tillräckligt lång för att innehålla hela Reach-to-fattnings rörelsen, inklusive Paw Retraction. - När sessionstid eller Max videor har nåtts avbryts programmet. Tryck på knappen stopptecken.
- Rengör kammaren med etanol och upprepa med en annan råtta, eller om det görs för dagen fortsätter att konvertera video.
- Konvertera. bin-filer till AVI-filer.
Om du komprimerar videor under anskaffningen orsakar det ignorerade bildrutor, så att binära filer strömmas till disk under anskaffningen (Använd en solid state-hårddisk på grund av höga dataöverföringshastigheter). Dessa binära filer måste komprimeras off-line eller lagringskraven är oöverkomligt stora.- Öppna programmet "bin2avi-color_1473R_noEncode. vi".
- Under "filsökväg kontroll" Klicka på knappen mapp för att välja sessionen (t. ex., R0235_20180119a) du vill konvertera. Upprepa för varje session (upp till sex).
- Klicka på den vita pilen (kör) och sedan "START" för att börja. Du kan övervaka video komprimeringen i "total Progress (%)" Bar. Låt programmet köras över natten.
- Innan du börjar träna djur nästa dag, kontrollera att videorna har konverterats och ta bort. bin-filerna så att det finns tillräckligt med utrymme för att skaffa nya videor.
5. analysera videor med DeepLabCut
MÄRKA olik nätverken är tränad för var tass preferensen (rätt tass och lämna tass) och för var syn (rikta syn och lämna spegel syn för rätt pawed råtta, rikta syn och rätt spegel syn för lämna pawed råtta). Den översta spegelbilden används inte för 3D-rekonstruktion-bara för att upptäcka när näsan går in i facket, vilket kan vara användbart för att utlösa interventioner (t. ex., optogenetik). Varje nätverk används sedan för att analysera en uppsättning videoklipp som beskärs för motsvarande Paw och vy.
- Utbilda DeepLabCut-nätverken (detaljerade instruktioner finns i dokumentationen för DeepLabCut på https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
- Skapa och konfigurera ett nytt projekt i DeepLabCut, en maskininlärningsalgoritm för markerless pose uppskattning13.
- Använd programmet för att extrahera ramar från skickliga nå videor och beskära bilder till vyn för att inkludera (direkt eller spegelbild) i programmets gränssnitt. Beskär ramar tillräckligt stora så att råtta och båda främre tassar är synliga.
Obs: nätverk kräver normalt 100 – 150 tränings ramar. Fler tränings ramar behövs när tass är inne jämfört med utanför kammaren på grund av belysning. Hårdare beskärning minskar bearbetningstiden, men var försiktig så att de beskurna regionerna är tillräckligt stora för att upptäcka tass fulla bana för varje råtta. Det bör vara tillräckligt bred för råttans hela kroppen att passa i ramen (direkt uppfattning), och att se så långt tillbaka in i kammaren som möjligt och framför leverans stången (spegelbild). - Använd programmets GUI för att märka kroppsdelar. Etikett 16 punkter i varje ram: 4 metacarpophalangeal (MCP) leder, 4 proximala interfalangeala (PIP) lederna, 4 siffriga tips, den dorsum av nå tass, näsan, den dorsum av den icke-gående tass, och pelleten (figur 4).
- Följ DeepLabCut (förkortat DLC hädanefter) instruktioner för att skapa träningsdata uppsättningen, utbilda nätverket och utvärdera det tränade nätverket.
- Analysera videor och förfina nätverket.
- Innan du analyserar alla videor med ett nyligen tränat nätverk, analysera 10 videor för att utvärdera nätverkets prestanda. Om det finns konsekventa fel i vissa poser, extrahera ytterligare utbildning ramar som innehåller dessa utgör och omskola nätverket.
- När du analyserar videor, se till att output. csv filer, som kommer att matas in i koden för 3D bana rekonstruktion.
6. Box kalibrering
Anmärkning: dessa instruktioner används för att bestämma transformering matriser för att konvertera punkter som identifierats i direkt och spegel vyer i 3D-koordinater. För den senaste versionen och mer information om hur du använder boxCalibration-paketet, se Leventhal Lab GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration, som innehåller steg-för-steg-instruktioner för deras användning.
- Samla alla kalibrerings bilder i samma mapp.
- Använda imagej/Fiji, manuellt markera rutmönster punkter för varje kalibrerings bild. Spara den här bilden som "GridCalibration_YYYYMMDD_ #. tif" där ' ÅÅÅÅMMDD ' är det datum som kalibrerings bilden motsvarar och ' # ' är bildnumret för det datumet.
- Använd mätnings funktionen i ImageJ (i verktygsfältet, Välj analysera | Åtgärd). Då visas en tabell med koordinater för alla markerade punkter. Spara filen med namnet "GridCalibration_YYYYMMDD_ #. csv", där datum och bildnummer är desamma som motsvarande TIF-fil.
- Öppna filen "setParams. m" från Boxcalibration -paketet. Den här filen innehåller alla nödvändiga variabler och deras beskrivning. Redigera variabler efter behov för att passa projektets specifikationer.
- Kör funktionen Kalibrateboxes . Flera uppmaningar visas i kommandofönstret. Den första prompten frågar om huruvida alla bilder i mappen ska analyseras. Att skriva Y kommer att avsluta prompter, och alla bilder för alla datum kommer att analyseras. När du skriver N uppmanas användaren att ange datumen som ska analyseras.
ANMÄRKNINGAR: två nya kataloger kommer att skapas i mappen kalibrerings bilder: "markedImages" innehåller. png-filer med användardefinierade schackbräde markeringar på kalibrerings bilden. Mappen ' boxCalibration ' innehåller. mat-filer med parametrarna för Box kalibrering. - Kör funktionen Checkboxcalibration . Detta kommer att skapa en ny mapp, "checkCalibration" i "boxCalibration" mappen. Varje datum kommer att ha en undermapp som innehåller bilder och flera. Fig filer, som används för att kontrollera att rutan kalibrering slutfördes korrekt.
7. rekonstruera 3D banor
- Montera CSV-filer som innehåller inlärningprogramutdata i katalogstrukturen som beskrivs i reconstruct3Dtrajectories -skriptet.
- Kör reconstruct3Dtrajectories. Detta skript kommer att söka i katalogstrukturen och matcha direkt/speglings punkter baserat på deras namn i det lutande programmet (det är viktigt att använda samma kropps dels namn i båda vyerna).
- Kör Calculatekinematics. Det här manuset extraherar enkla kinematiska funktioner från 3-D-rekonstruktioner, som kan skräddarsys efter specifika behov.
Anmärkning: programvaran uppskattar positionen för ockluderade kroppsdelar baserat på deras grannar och deras placering i den kompletterande vyn (t. ex. placeringen av en kroppsdel i direkt kameravyn begränsar dess möjliga platser i spegeln). Paw-koordinater interpoleras baserat på angränsande ramar för tillfällen när Paw är ockluderad i speglings läget när den passerar genom facket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Råttor förvärva skickliga nå uppgift snabbt en gång acklierat till apparaten, med prestanda plateauing i termer av både antal når och noggrannhet över 1 – 2 veckor (figur 5). Figur 6 visar prov videobildrutor som indikerar strukturer som identifierats av DeepLabCut, och figur 7 visar överlagda individuella räckvidds banor från en enda session. Slutligen, i figur 8, illustrerar vi vad som händer om Paw Detection-utlösaren (steg 4.3.4 – 4.3.6) inte är korrekt inställd. Det finns betydande variationer i den ram som Paw bryter mot den nå facket. Detta är inte ett stort problem när det gäller att analysera Reach kinematik. Det kan dock leda till variationer i när interventioner (t. ex. optogenetik) utlöses under nå rörelser.
Figur 1: den skickliga att nå kammaren.
Medurs uppifrån vänster finns en sidovy, en vy framifrån och uppåt, den ram i vilken ställdonet monteras (se steg 1,8) och en vy från sidan och uppåt. Den skickliga nå kammaren (1) har en dörr (2) skuren i en sida för att tillåta råttor att placeras i och tas ut ur kammaren. En slits skärs in i takpanelen (12) så att djuret kan tjudras och hålen skärs i golv panelen (13) så att strö kan falla igenom. Två infraröda sensorer (3) är justerade på vardera sidan av kammarens baksida. En spegel (4) monteras ovanför den främre luckan (14) på framsidan av den gående kammaren och två andra speglar (6) monteras på vardera sidan av den gående kammaren. Den skickliga nå kammaren sitter ovanpå en stödbox (5). HD-kameran (7) monteras på stöd boxen framför den framgående öppningen. Två stycken svart papper (18) monteras på vardera sidan av kameran (7) för att öka kontrasten på tass i sidospeglarna (6). Understöd boxen finns en ram (8) som stöder det linjära manöverdonet (16) och pellets behållaren (9). Ett styr rör innesluta pelleten leverans stav (10) är lämplig i pellets behållaren och kontrolleras av den linjära ställdon. Hålen skärs in i manöverdonet ram (17) och stöd Box (15) ovanför pellets behållaren så att pellets leverans staven att flytta upp och ner fritt. Boxen belyses med ljuspaneler (11) monterade på skåpets väggar och tak. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: en enda försöks struktur.
(A) en rättegång inleds med pellets leverans staven (styrd av ett linjärt ställdon) placerad i läget "Ready" (läge 2 – halvvägs mellan golv och botten på öppningen). (B) råttan rör sig på baksidan av kammaren för att bryta den INFRARÖDA (IR) strålen, vilket gör att pellets leverans staven stiger till position 3 (justerad med botten av att nå facket). (C) råttan når genom den springande öppningen för att ta tag i pelleten. Räckvidder upptäcks i realtid med hjälp av en FPGA-framegrabber som detekterar pixelintensitetsändringar inom en intresse region (ROI) i sido speglings läget direkt framför facket. När tillräckligt med pixlar matchar den användardefinierade "Paw intensitet", video förvärv utlöses. (D) två sekunder senare pelleten sänks till position 1, plocka upp en ny pellet från pellets behållaren innan du återställer till position 2. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: prov kalibrerings bild.
En hjälpande hand placeras inuti den skickliga nå kammaren. En alligator klämma Petar genom att nå facket för att hålla kalibrerings kuben på plats utanför den gående kammaren. De tre rutmönster är helt synliga i direktvisning och motsvarande spegelvyer (grön: vänster; röd: Top; och blå: höger). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Inlärningsalgoritmens markör positioner.
Vänster kolumn: direktvisning; höger kolumn: speglings läge. Markörer 1 – 4: MCP-fogar; 5 – 8: PIP-fogar; 9 – 12: siffer tips; 13: dorsum av att nå tass; 14: näsa; 15: dorsum av icke-nå tass. Markör 16 (pellet) är inte synlig. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: råttor förvärvar snabbt den automatiserade kvalificerade nå uppgiften.
Genomsnittlig första nå framgång (grön, vänster axel) och genomsnittliga totala prövningar (blå, höger axel) under de första 20 träningspassen i automatiserad skicklig nå uppgift (n = 19). Varje träningspass varade i 30 minuter. felstaplar representerar standardfel för medelvärdet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: exempel på videobildrutor som är markerade med inlärningsprogrammet.
Vänster kolumn: spegelbild; höger kolumn: direktvisning. Cyanfärgade, röda, gula och gröna prickar markerar siffrorna 1 – 4. Den vita pricken markerar näsan, den svarta pricken markerar pelleten. Fyllda cirklar identifierades av DeepLabCut. Öppna cirklar Markera objekt positioner uppskattas av där objektet dök upp i motsatt vy. X: s är Poäng som omprojiceras till videobildrutorna från uppskattningarna av deras 3-D-platser. Denna video utlöstes vid Frame 300, som Paw passerade genom facket. De översta bilderna är från den första bildrutan när den nådde Paw upptäcktes. Botten bilder är från den ram där den andra siffran maximally förlängdes. Dessa ramar identifierades av bildbehandlings programmet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: prov 3-D-banor från en enda provsession.
Båda axlarna visar samma data, men roteras för att underlätta presentationen. Svarta linjer indikerar medelvärden för trajectorier. Cyan, röd, gul, och grön är individuella banor av tips av siffrorna 1-4, respektive. Blå linjer indikerar bollbana av Paw dorsum. Den stora svarta pricken indikerar sockerpelleten som finns på (0, 0, 0). Detta representerar endast inledande Paw avancemang för enkel presentation (inklusive retractions och flera når gör siffran nästan uninterpretable). Alla kinematiska data är dock tillgängliga för analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: histogram med bildrutenummer där specifika faser identifierades för två olika sessioner.
I en session (mörka heldragna linjer), ROI-utlösarvärden var noggrant inställda och Paw identifierades bryter facket inom samma få ramar i varje testperiod. I den andra sessionen (ljus streckade linjer), var näsan ofta felidentifierade som den når Paw, utlöser video förvärv i förtid. Observera att detta skulle ha liten effekt på off-line kinematiska analyser om inte hela räckvidden inte fångades. Potentiella åtgärder som utlöses av den uppnående Paw skulle dock vara dåligt tidsinställda. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rodent skicklig att nå har blivit ett standardverktyg för att studera motoriskt system fysiologi och patofysiologi. Vi har beskrivit hur man genomför en automatiserad råtta skicklig nå uppgift som tillåter: utbildning och testning med minimal övervakning, 3-D Paw och Digit bana rekonstruktion (under nå, gripa och tass indragning), realtid identifiering av Paw under nå, och synkronisering med extern elektronik. Det är väl lämpad att korrelera forelimb kinematik med fysiologi eller att utföra exakt tidsinställda interventioner under nå rörelser.
Eftersom vi inledningsvis rapporterade denna design14, vår utbildning effektivitet har förbättrats så att nästan 100% av råttor förvärva uppgiften. Vi har identifierat flera viktiga faktorer som leder till konsekvent framgångsrik utbildning. Som med många uppgifter motiverade av hunger, råttor bör övervakas noggrant under kalori begränsning att bibehålla 80 – 90% av deras förväntade kroppsvikt. Hantering av råttor dagligen, även före träning, är mycket viktigt att vänja dem till människor. Råttor bör utbildas för att nå innan lära sig att återvända till baksidan av kammaren för att begära pellets-detta kraftigt minskar träningstiden och ökar sannolikheten för att råttor förvärva uppgiften. Slutligen, när de överförs mellan till synes identiska kammare, råttor ofta utför färre når. Detta var särskilt sant när kamrarna användes för första gången. Vi spekulerar i att detta beror på skillnader i doft mellan kamrarna. Oavsett anledning är det viktigt att bibehålla en så stabil träningsmiljö som möjligt, eller att vänja råttorna på alla boxar där tester kan förekomma.
Den apparat som beskrivs här är lätt att anpassa till specifika behov. Vi beskrev en råtta version av uppgiften, men har också genomfört en mus version (även om det är svårt att identifiera enskilda siffror med DeepLabCut i möss). Eftersom enskilda videobildrutor är markerade med TTL-pulser kan videor synkroniseras med alla inspelningssystem som tar emot digitala eller analoga ingångar (t. ex. elektrofysiologin förstärkare eller fotometri). Slutligen, Head-fast möss utföra lätt skicklig nå9, och en head-fast version av denna uppgift skulle kunna genomföras för 2-Photon Imaging eller juxtacellulära inspelningar. Viktigt, vi har bara använt detta system med Long-Evans råttor, vars näsa och tass päls (svart och vitt, respektive) skiljer sig tillräckligt i färg som näsan Petar inte misstas för når (med lämpliga ROI-inställningar, figur 8). Detta kan vara ett problem för råttor med liknande färg på sina tassar och näsor (t. ex., Albino råttor), men kunde lösas genom att färga tass med bläck, nagellack, eller tatueringar.
Den presenterade versionen av skickliga nå har flera distinkta funktioner, som kan vara fördelaktigt beroende på den specifika ansökan. Den relativt komplicerade hårdvara och behov av realtidsvideo bearbetning gör det dåligt lämpade för hem buren utbildning6,7. Å andra sidan, hem buren utbildning gör det svårt att förvärva hög hastighet högupplöst video från flera vinklar, eller tjudra djuren för fysiologiska inspelningar/interventioner. Den datainsamling kort och krav för en dator per kammare gör varje kammare relativt dyra, och videorna kräver betydande digitalt lagringsutrymme (~ 200 MB per 4 s video). Vi har implementerat en enklare MicroController-baserad version som kostar ca $300 per kammare, men den saknar återkoppling i realtid eller möjlighet att synkronisera med externa enheter. Dessa lådor är i huvudsak identiska med dem som beskrivs här, men använder en kommersiell videokamera och inte kräver en dator förutom att programmera mikrokontroller (Detaljer om denna uppsättning och tillhörande programvara finns tillgängliga på begäran). Real tids videobearbetning på FPGA Frame-Grabber är särskilt användbart; Vi finner att det mer robust identifierar når i realtid än infraröda strålar eller sensorer närhet (som kan förväxla råttans nos för att nå tass). Dessutom kan flera utlösare användas för att identifiera Paw vid olika når faser (t. ex., inställning till facket, Paw Lift, förlängning genom facket). Detta tillåter inte bara reproducerbara, exakt tidsinställda neuronala perturbations, men kan användas för att utlösa lagring av korta höghastighets filmer.
Även om vår automatiserade version av kompetent att nå har flera fördelar för specifika applikationer, har det också vissa begränsningar. Som nämnts ovan, hög hastighet, högupplöst kamera är måttligt dyrt, men nödvändigt att inkludera spegel och direkt utsikt i en enda bild och fånga mycket snabbt nå rörelse. Med hjälp av en kamera eliminerar behovet av att synkronisera och spela in flera videoströmmar samtidigt, eller köpa flera kameror och ram grabbers. Tass i den reflekterade vyn är effektivt ungefär dubbelt så långt från kameran (av ray-tracing) som i direkt uppfattning. Det innebär att en av vyerna alltid är ur fokus, även om DLC fortfarande robust identifierar enskilda siffror i båda vyerna (figur 4, figur 6). Slutligen använde vi en färgkamera eftersom, innan tillgängligheten av DLC, vi försökte färgkodning siffrorna med tatueringar. Även om det är möjligt att detta lärande-baserade program skulle vara lika effektivt på svart och vitt (eller lägre upplösning) video, kan vi bara kontrollera effektiviteten av den maskinvara som beskrivs här. Slutligen är vår analyskod (förutom DLC) skriven främst i en kommersiell programpaket (se tabell över material) men bör vara enkelt att anpassa sig till öppen källkod programmeringsspråk (t. ex., python) efter behov.
Vi arbetar på flera olika sätt för att förbättra systemet. För närvarande är speglingsvyn delvis ockluderad av frontpanelen. Vi har därför utforskat sätt att få flera samtidiga vyer av Paw samtidigt minimera hinder. En annan viktig utveckling kommer att vara att automatiskt göra mål når (systemet kan spåra kinematik, men en mänsklig måste fortfarande värdering framgångsrika kontra misslyckade når). Metoder har utvecklats för att avgöra om pellets slogs av hyllan/piedestalen, men kan inte avgöra om pelleten var grep eller missade helt11. Genom att spåra pelleten med DLC, utforskar vi algoritmer för att bestämma antalet når per rättegång, samt om pelleten var grep, knackade av piedestal, eller missade helt. Längs dessa linjer arbetar vi också för att helt automatisera arbetsflödet från datainsamling genom video konvertering, DLC-bearbetning och automatisk poängsättning. I slutändan, vi föreställa ett system där flera experiment kan köras på en dag, och nästa morgon den fullständiga forelimb kinematik och nå Poäng för varje experiment har fastställts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka Karunesh Ganguly och hans laboratorium för råd om den skickliga nå uppgift, och Alexander och Mackenzie Mathis för deras hjälp med att anpassa DeepLabCut. Detta arbete stöddes av det nationella institutet för neurologisk sjukdom och stroke (Grant Number K08-NS072183) och University of Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| clear polycarbonate panels | TAP Plastics | cut to order (see box design) | |
| infrared source/detector | Med Associates | ENV-253SD | 30" range |
| camera | Basler | acA2000-340kc | 2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link |
| camera lens | Megapixel (computar) | M0814-MP2 | 2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus |
| camera cables | Basler | #2000031083 | Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables |
| mirrors | Amazon | ||
| linear actuator | Concentrics | LACT6P | Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer |
| pellet reservoir/funnel | Amico (Amazon) | a12073000ux0890 | 6" funnel |
| guide tube | ePlastics | ACREXT.500X.250 | 1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long |
| pellet delivery rod | ePlastics | ACRCAR.250 | 0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length) |
| plastic T connector | United States Plastic Corp | #62065 | 3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee |
| LED lights | Lighting EVER | 4100066-DW-F | 12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool |
| Light backing | ePlastics | ACTLNAT0.125X12X36 | 0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet |
| Light diffuser films | inventables | 23114-01 | .007x8.5x11", matte two sides |
| cabinet and custom frame materials | various (Home Depot, etc.) | 3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure) | |
| acoustic foam | Acoustic First | FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick) | |
| ventilation fans | Cooler Master (Amazon) | B002R9RBO0 | Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers |
| cabinet door hinges | Everbilt (Home Depot | #14609 | continuous steel hinge (1.4" x 48") |
| cabinet wheels | Everbilt (Home Depot | #49509 | Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake |
| cabinet door handle | Everbilt (Home Depot | #15094 | White light duty door pull (4.5") |
| computer | Hewlett Packard | Z620 | HP Z620 Desktop Workstation |
| Camera Link Frame Grabber | National Instruments | #781585-01 | PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full |
| Multifunction RIO Board | National Instruments | #781100-01 | PCIe-17841R |
| Analog RIO Board Cable | National Instruments | SCH68M-68F-RMIO | Multifunction Cable |
| Digital RIO Board Cable | National Instruments | #191667-01 | SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series |
| Analog Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| Digital Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| 24 position relay rack | Measurement Computing Corp. | SSR-RACK24 | Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel |
| DC switch | Measurement Computing Corp. | SSR-ODC-05 | Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A |
| DC Sense | Measurement Computing Corp. | SSR-IDC-05 | solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC |
| DC Power Supply | BK Precision | 1671A | Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply |
| sugar pellets | Bio Serv | F0023 | Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored) |
| LabVIEW | National Instruments | LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions | 64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW |
| MATLAB | Mathworks | Matlab R2019a | box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox |
References
- Chen, J., et al. An automated behavioral apparatus to combine parameterized reaching and grasping movements in 3D space. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Sacrey, L. A. R. A., Alaverdashvili, M., Whishaw, I. Q. Similar hand shaping in reaching-for-food (skilled reaching) in rats and humans provides evidence of homology in release, collection, and manipulation movements. Behavioural Brain Research. 204, 153-161 (2009).
- Whishaw, I. Q., Kolb, B. Decortication abolishes place but not cue learning in rats. Behavioural Brain Research. 11, 123-134 (1984).
- Klein, A., Dunnett, S. B. Analysis of Skilled Forelimb Movement in Rats: The Single Pellet Reaching Test and Staircase Test. Current Protocols in Neuroscience. 58, 8.28.1-8.28.15 (2012).
- Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41, 49-59 (1990).
- Zeiler, S. R., et al. Medial premotor cortex shows a reduction in inhibitory markers and mediates recovery in a mouse model of focal stroke. Stroke. 44, 483-489 (2013).
- Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavioural Brain Research. 281, 137-148 (2015).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. , (2014).
- Guo, J. Z. Z., et al. Cortex commands the performance of skilled movement. Elife. 4, e10774 (2015).
- Nica, I., Deprez, M., Nuttin, B., Aerts, J. M. Automated Assessment of Endpoint and Kinematic Features of Skilled Reaching in Rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 255 (2017).
- Wong, C. C., Ramanathan, D. S., Gulati, T., Won, S. J., Ganguly, K. An automated behavioral box to assess forelimb function in rats. Journal of Neuroscience Methods. 246, 30-37 (2015).
- Torres-Espín, A., Forero, J., Schmidt, E. K. A., Fouad, K., Fenrich, K. K. A motorized pellet dispenser to deliver high intensity training of the single pellet reaching and grasping task in rats. Behavioural Brain Research. 336, 67-76 (2018).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21, 1281-1289 (2018).
- Ellens, D. J., et al. An automated rat single pellet reaching system with high-speed video capture. Journal of Neuroscience Methods. 271, 119-127 (2016).
