Summary
القوارض المهرة الوصول يستخدم عادة لدراسة المهارات البارعة، ولكن يتطلب وقتا كبيرا والجهد لتنفيذ المهمة وتحليل السلوك. نحن نصف نسخة آلية من الوصول المهرة مع تتبع الحركة وإعادة الإعمار ثلاثي الأبعاد من مسارات الوصول.
Abstract
القوارض المهرة الوصول يستخدم عادة لدراسة المهارات البارعة، ولكن يتطلب وقتا كبيرا والجهد لتنفيذ المهمة وتحليل السلوك. وقد تم مؤخرا تطوير عدة إصدارات آلية من الوصول المهرة. هنا، ونحن نصف النسخة التي تقدم تلقائيا الكريات للفئران في حين تسجيل الفيديو عالية الوضوح من زوايا متعددة بمعدلات إطارات عالية (300 إطارا في الثانية). يتم تعقب مخلب والأرقام الفردية مع DeepLabCut، خوارزمية التعلم الآلي لتقدير تشكل بلا علامات. ويمكن أيضا أن يتزامن هذا النظام مع التسجيلات الفسيولوجية، أو أن تستخدم لتحريك التدخلات الفسيولوجية (على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي أو البصري).
Introduction
يعتمد البشر بشكل كبير على المهارة البارعة، التي تعرف بأنها حركات تتطلب حركات متعددة المفاصل والأرقام منسقة بدقة. وتتأثر هذه المهارات بمجموعة من أمراض الجهاز العصبي المركزي الشائعة بما في ذلك الآفات الهيكلية (مثل السكتة الدماغية، والورم، والآفات التي لإزالة التميّز)، والأمراض العصبية (مثل مرض باركنسون)، والتشوهات الوظيفية للمحرك الدوائر (على سبيل المثال، خلل التوتر). وبالتالي فإن فهم كيفية تعلم المهارات البارعة وتنفيذها من قبل دوائر السيارات المركزية ينطوي على إمكانية تحسين نوعية الحياة بالنسبة لأعداد كبيرة من السكان. وعلاوة على ذلك، من المرجح أن يؤدي هذا الفهم إلى تحسين الأداء الحركي لدى الأشخاص الأصحاء عن طريق الاستفادة المثلى من استراتيجيات التدريب وإعادة التأهيل.
تشريح الدوائر العصبية الكامنة وراء المهارة البارعة في البشر محدودة بالاعتبارات التكنولوجية والأخلاقية، مما يستلزم استخدام النماذج الحيوانية. وتستخدم الرئيسيات غير البشرية عادة لدراسة حركات الأطراف حاذق نظرا لتشابه نظمها الحركية وذخيرة السلوكية للبشر1. ومع ذلك، فإن الرئيسيات غير البشرية مكلفة مع فترات طويلة من الجيل، مما يحد من أعداد مواضيع الدراسة والتدخلات الوراثية. وعلاوة على ذلك، في حين أن الأدوات العلمية العصبية المطبقة على الرئيسيات غير البشرية أكبر منها بالنسبة للبشر، فإن العديد من التطورات التكنولوجية الحديثة إما غير متوفرة أو محدودة بشكل كبير في الرئيسيات.
القوارض المهرة الوصول هو نهج تكميلي لدراسة السيطرة على السيارات حاذق. يمكن تدريب الفئران والفئران للوصول إلى، فهم، واسترداد بيليه السكر في تسلسل نمطي من الحركات متجانسة لأنماط الإنسان الوصول2. ونظراً لضيق وقت توليدها نسبياً وانخفاض تكاليف السكن، فضلاً عن قدرتها على اكتساب مهارات تصل إلى مدى أيام إلى أسابيع، فمن الممكن دراسة أعداد كبيرة من المواضيع خلال مرحلتي التعلم وتوحيد المهارات على حد سواء. كما أن استخدام القوارض، ولا سيما الفئران، يسهل استخدام أدوات علمية عصبية حديثة قوية (مثل علم الوراثة البصرية، وتصوير الكالسيوم، والنماذج الوراثية للمرض) لدراسة المهارة البارعة.
وقد استخدمت القوارض المهرة الوصول لعقود لدراسة السيطرة الحركية العادية وكيف يتأثر بأمراض محددة مثل السكتة الدماغية ومرض باركنسون3. ومع ذلك، فإن معظم إصدارات هذه المهمة هي العمل والوقت الكثيف، والتخفيف من فوائد دراسة القوارض. وتشمل عمليات التنفيذ النموذجية وضع القوارض في غرفة الوصول مع رف أمام فتحة ضيقة من خلالها القوارض يجب أن تصل. يضع الباحث كريات السكر يدويًا على الرف، وينتظر وصول الحيوان، ثم يضع واحدة أخرى. يتم تسجيل الوصول إلى النجاحات أو الفشل إما في الوقت الحقيقي أو عن طريق استعراض الفيديو4. ومع ذلك، فإن مجرد تسجيل النقاط يصل إلى النجاحات أو الفشل يتجاهل البيانات الحركية الغنية التي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول كيفية (بدلاً من مجرد ما إذا) الوصول إلى ضعف. وقد عولجت هذه المشكلة من خلال تنفيذ استعراض مفصل للوصول إلى أشرطة الفيديو لتحديد ودرجات شبه كمية تصل إلى الحركات الفرعية5. وفي حين أضاف هذا بعض البيانات المتعلقة بالوصول إلى الحركية، إلا أنه زاد أيضاً بشكل كبير من وقت التجربة وجهدها. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤدي المستويات العالية من مشاركة التجارب إلى عدم الاتساق في المنهجية وتحليل البيانات، حتى داخل المختبر نفسه.
وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير عدة إصدارات آلية من الوصول الماهر. بعض نعلق على القفص المنزلي6،7، والقضاء على الحاجة إلى نقل الحيوانات. وهذا يقلل من الضغط على الحيوانات ويلغي الحاجة إلى تكييفها إلى غرفة الوصول المتخصصة. إصدارات أخرى تسمح تتبع مخلب بحيث يمكن دراسةالتغييرات الحركية في إطار تدخلات محددة 8،9،10،أو لديها آليات لتحديد ما إذا كان قد طرقت الكريات من على الرف11. المهام الآلية الماهرة الوصول مفيدة بشكل خاص للتدريب عالية الكثافة، كما قد تكون هناك حاجة لإعادة التأهيل بعد إصابة12. تسمح الأنظمة الآلية للالحيوانات بإجراء أعداد كبيرة من الروافد على مدى فترات طويلة من الزمن دون الحاجة إلى مشاركة مكثفة من الباحثين. وعلاوة على ذلك، فإن النظم التي تسمح بتتبع الكفات وتسجيل النتائج الآلي تقلل من الوقت الذي يقضيه الباحث في إجراء تحليل البيانات.
قمنا بتطوير نظام آلي للوصول إلى الفئران الماهرة مع العديد من الميزات المتخصصة. أولا، باستخدام قاعدة متحركة لجلب بيليه في "موقف الوصول" من أدناه، نحصل على وجهة نظر دون عائق تقريبا من الطرف السفلي. ثانياً، يسمح نظام المرايا بمشاهدة متعددة في وقت واحد للوصول باستخدام كاميرا واحدة، مما يسمح بإعادة بناء مسارات الوصول ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) باستخدام كاميرا عالية الدقة وعالية السرعة (300 إطار في الثانية). مع التطور الأخير لخوارزميات التعلم الآلي قوية لتتبع الحركة بلا علامات13،ونحن الآن تتبع ليس فقط مخلب ولكن المفاصل الفردية لاستخراج الوصول مفصلة واستيعاب الحركية. ثالثاً، يسمح ممسك الإطار الذي يقوم بمعالجة فيديو بسيطة بتحديد المراحل التي تم الوصول إليها بشكل حقيقي. يتم استخدام هذه المعلومات لتحريك الحصول على الفيديو (الحصول المستمر على الفيديو ليس عمليا بسبب حجم الملف)، ويمكن أيضا أن تستخدم لتحريك التدخلات (على سبيل المثال، علم الوراثة البصرية) في لحظات دقيقة. وأخيراً، يتم تشغيل إطارات الفيديو الفردية بواسطة نبضات منطق الترانزستور-الترانزستور (TTL)، مما يسمح بمزامنة الفيديو بدقة مع التسجيلات العصبية (على سبيل المثال، الفيزيولوجيا الكهربائية أو القياس الضوئي). هنا، ونحن نصف كيفية بناء هذا النظام، وتدريب الفئران لأداء المهمة، ومزامنة الجهاز مع النظم الخارجية، وإعادة بناء مسارات الوصول 3-D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق التي تنطوي على استخدام الحيوانات المذكورة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة ميشيغان.
1. إنشاء غرفة الوصول
ملاحظة: انظر Ellens et al.14 للاطلاع على التفاصيل والرسوم البيانية للجهاز. تشير أرقام الأجزاء إلى الشكل 1.
- ربط لوحات البولي واضحة مع الاسمنت الاكريليك لبناء غرفة الوصول (15 سم واسعة من قبل 40 سم طويلة من قبل 40 سم طويل) (جزء #1). لوحة جانبية واحدة (جزء #2) لديه باب يتوقف (18 سم واسعة من قبل 15 سم طويل القامة) مع قفل. إذا كان سيتم ربط الفئران إلى كابل، وقطع شق (5 سم واسعة من قبل 36 سم طويلة) في سقف الغرفة لاستيعابذلك (الجزء #12). لوحة الكلمة لديها 18 ثقوب (1.75 سم قطرها) (جزء #13) مقطعة في ذلك، وليس المستعبدين لبقية الغرفة.
- قم بتركيب ومحاذاة مستشعرات الأشعة تحت الحمراء (الجزء #3) في الألواح الجانبية 4.5 سم من الجزء الخلفي من الغرفة و3.8 سم من الأرض. يحتوي البرنامج السلوكي على مؤشر ('IR Back') يكون أخضرًا عندما يكون شعاع الأشعة تحت الحمراء غير منكسر وأحمر عند كسر الحزمة. بمجرد إعداد البرنامج، يمكن استخدام هذا للتحقق من محاذاة أجهزة الاستشعار.
- قم بتركيب مرآة (15 سم × 5 سم، جزء #4) 10 سم فوق الفتحة الوصولية (الجزء #14). زاوية المرآة حتى بيليه قضيب التسليم مرئية للكاميرا.
- ضع الغرفة على صندوق دعم قابل للتعقيم (بعرض 59 سم بطول 67.3 سم وطوله 30.5 سم، وهو جزء #5). تقع الغرفة فوق ثقب في صندوق الدعم (بعرض 12 سم وطولها 25 سم) تسمح للقمامة بالسقوط من خلال فتحات الأرضية (الجزء #13) والخروج من الغرفة التي تصل. قطع ثقب ثان (7 سم واسعة من قبل 6 سم طويلة، جزء #15) في مربع الدعم أمام فتحة الوصول، والذي يسمح قضيب تسليم بيليه لجلب الكريات إلى فتحة الوصول.
- جبل اثنين من المرايا (8.5 سم واسعة × 18.5 سم طويل القامة، جزء #6) إلى الأرض مع المغناطيس على جانبي الغرفة بحيث الحافة الطويلة للمرآة هو لمس لوحة جانبية 3 سم من الجزء الأمامي من مربع الوصول. زاوية المرايا بحيث يمكن للكاميرا أن نرى في المربع والمنطقة أمام فتحة الوصول حيث سيتم تسليم بيليه.
- قم بتركيب الكاميرا عالية الوضوح (الجزء #7) 17 سم من الفتحة الوصولية، التي تواجه الصندوق.
- جبل ورقة سوداء (جزء #18) على جانبي الكاميرا حتى الخلفية في المرايا الجانبية مظلمة. وهذا يعزز التباين لتحسين الكشف عن مخلب في الوقت الحقيقي وخارج الخط.
- قم بتركيب المحرك الخطي (الجزء #16) على إطار قابل للتعقيم (بعرض 25 سم وطوله 55 سم وطوله 24 سم، #8 جزء) بمسامير. يتم تركيب هذا الكم بيّن ًا لمنع تراكم غبار بيليه داخل مقياس الجهد الذي يستشعر هُنا.
- إدراج رغوة O-الدائري في عنق خزان بيليه (قمع) (جزء #9) لمنع الغبار من تراكم في الجمعية. جبل قمع تحت حفرة (~ 6 سم قطرها، جزء #17) في الجزء العلوي من الإطار عن طريق الانزلاق حواف قمع فوق ثلاثة مسامير حفر في الجانب السفلي من الجزء العلوي الإطار. أدخل الأنبوب الإرشادي (الجزء #10) في عنق القمع.
- إرفاق موصل T البلاستيك إلى نهاية قضيب الصلب من المعمل. إدراج نهاية مدبب من قضيب تسليم بيليه في الجزء العلوي من الموصل ونهاية المقبب من خلال أنبوب دليل في خزان بيليه.
- وضع الجمعية المحرك الخطي تحت غرفة الوصول المهرة بحيث يمكن أن تمتد قضيب تسليم بيليه من خلال ثقب (جزء #15) أمام فتحة الوصول.
- ضع جهاز الوصول بأكمله في خزانة ذات عجلات (121 سم × 119 سم × 50 سم) مهواة مع مراوح الكمبيوتر (الداخلية تصبح دافئة عندما مضاءة جيدا) واصطف مع رغوة الصوتية.
- بناء خمس لوحات الضوء (جزء #11) عن طريق التمسك شرائط ضوء LED على 20.3 سم من قبل لوحات الدعم 25.4 سم. جبل فيلم الناشر على شرائط الضوء. جبل لوحة ضوء واحد على السقف على منطقة بيليه تسليم قضيب. جبل الأربعة الآخرين على جانبي خزانات على طول الغرفة الوصول.
ملاحظة: من المهم أن تضيء المنطقة حول فتحة الوصول وبيليه قضيب التسليم لتحديد مخلب في الوقت الحقيقي.
2. إعداد الكمبيوتر والأجهزة
- قم بتثبيت ممسك إطار FPGA وبطاقات التوسيع الرقمي حسب تعليمات الشركة المصنعة (راجع جدولالمواد).
ملاحظة: نوصي على الأقل 16 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي ومحرك أقراص ثابتة الحالة الصلبة الداخلية لتخزين البيانات، كما يتطلب دفق الفيديو عالي السرعة سعة التخزين المؤقت كبيرة. - قم بتثبيت برامج تشغيل للكاميرا عالية الوضوح وتوصيله بـ FPGA framegrabber. يجب تشغيل البرنامج السلوكي والتفاعل مع الكاميرا لاستخدام البرنامج المقترن بالكاميرا.
ملاحظة: التعليمات البرمجية المضمنة (راجع الملفات التكميلية) بالوصول إلى السجلات القابلة للبرمجة في الكاميرا وقد لا تكون متوافقة مع العلامات التجارية الأخرى. نوصي بتسجيل ما لا يقل عن 300 إطار في الثانية (إطارا في الثانية)؛ في 150 إطارا في الثانية وجدنا أن التغييرات الرئيسية في موقف مخلب غاب في كثير من الأحيان. - نسخ التعليمات البرمجية المضمنة (المشروع) في "SR Automation_dig_ext_card_64bit" إلى الكمبيوتر.
3. التدريب السلوكي
- إعداد الفئران قبل التدريب.
- بيت الفئران لونغ إيفانز (ذكر أو أنثى، الذين تتراوح أعمارهم بين 10-20 أسبوعا) في مجموعات من 2-3 لكل قفص على ضوء عكسي / دورة مظلمة. قبل ثلاثة أيام من التدريب، ضع الفئران على تقييد الطعام للحفاظ على وزن الجسم 10-20٪ تحت خط الأساس.
- التعامل مع الفئران لعدة دقائق في اليوم لمدة 5 أيام على الأقل. بعد المناولة، ضع 4-5 كريات سكر لكل فأر في كل قفص منزلي لتقديم الطعام الجديد.
- التعاشر الجرذ إلى غرفة الوصول (1-3 أيام)
- تشغيل أضواء LED ووضع 3 الكريات السكر في الجزء الأمامي والخلفي من الغرفة.
- وضع الفئران في الغرفة والسماح للفأر لاستكشاف لمدة 15 دقيقة. كرر هذه المرحلة حتى يأكل الجرذ كل الكريات من الأرض.
- تنظيف الغرفة مع الإيثانول بين الفئران.
ملاحظة: إجراء التدريب والاختبار أثناء المرحلة المظلمة. تدريب الفئران في نفس الوقت يوميا.
- تدريب الفئران للوصول ومراقبة تفضيل مخلب (1-3 أيام).
- تشغيل الأضواء ووضع الفئران في غرفة الوصول المهرة.
- باستخدام ملقط، عقد بيليه من خلال فتحة الوصولفي الجزء الأمامي من مربع (الشكل 1، الشكل2). السماح للفأر لتناول الطعام 3 الكريات من ملقط.
- في المرة القادمة يحاول الفئران أكل بيليه من ملقط، وسحب بيليه مرة أخرى. في نهاية المطاف، فإن الفئران محاولة للوصول إلى بيليه مع مخلب لها.
- كرر هذا 11 مرة. مخلب أن الفئران يستخدم أكثر من 11 محاولات هو "تفضيل مخلب" الفئران.
ملاحظة: يتم تعريف محاولة كمخلب الوصول إلى الماضي الفتحة الوصول. الفئران لا تحتاج إلى الحصول بنجاح وأكل بيليه.
- تدريب الفئران للوصول إلى قضيب تسليم بيليه (1-3 أيام)
- محاذاة قضيب التسليم بيليه مع جانب فتحة الوصول contralateral إلى مخلب الفئران المفضلة (استخدام دليل لضمان وضع متسقة 1.5 سم من الجزء الأمامي من الغرفة الوصول). يجب أن تتماشى الجزء العلوي من قضيب التسليم مع الجزء السفلي من فتحة الوصول (الشكل2B). وضع بيليه على قضيب التسليم.
ملاحظة: وضع قضيب التسليم مقابل مخلب الفئران المفضل يجعل من الصعب على الفئران الحصول على بيليه مع مخلب غير المفضل. لم يكن لدينا مشاكل مع الفئران باستخدام مخلب غير المفضلة. ومع ذلك، في بعض النماذج (مثل السكتة الدماغية) قد لا يزال يحدث هذا ويمكن إضافة ضبط النفس على الطرف الوصول غير المفضل. - طعم الفئران مع بيليه عقد باستخدام ملقط، ولكن توجيه الفئران نحو قضيب التسليم بحيث مخلب يضرب بيليه على قضيب. إذا كان الجرذ يطرق بيليه من قضيب، واستبدالها. بعض الفئران قد لا تصل في البداية بعيدا بما فيه الكفاية. في هذه الحالة، نقل قضيب التسليم بيليه أقرب إلى فتحة الوصول ومن ثم تتحرك ببطء بعيدا كما يحسن الفئران.
- بعد حوالي 5-15 الطعم يصل إلى الفئران سوف تبدأ في الوصول إلى بيليه على قضيب التسليم تلقائيا. مرة واحدة وقد حاول الفئران 10 تصل إلى قضيب التسليم دون أن يكون الطعم، فإنه يمكن أن تتقدم إلى المرحلة التالية.
- محاذاة قضيب التسليم بيليه مع جانب فتحة الوصول contralateral إلى مخلب الفئران المفضلة (استخدام دليل لضمان وضع متسقة 1.5 سم من الجزء الأمامي من الغرفة الوصول). يجب أن تتماشى الجزء العلوي من قضيب التسليم مع الجزء السفلي من فتحة الوصول (الشكل2B). وضع بيليه على قضيب التسليم.
- تدريب الفئران لطلب بيليه (2-8 أيام).
ملاحظة: على الرغم من أن لدينا 100٪ نجاح الفئران التدريب للوصول إلى الكريات، حوالي 10٪ من الفئران تفشل في تعلم طلب بيليه عن طريق الانتقال إلى الجزء الخلفي من الغرفة.- وضع قضيب التسليم بيليه على أساس تفضيل مخلب الفئران وتعيينها إلى موقف 2 (الشكل2A). تعيين مواقف الارتفاع من قضيب التسليم بيليه باستخدام جهاز التحكم عن بعد المعمل. أزرار عقد 1 و 2 يتحرك في وقت واحد قضيب التسليم حتى، في حين عقد أزرار 3 و 2 يتحرك قضيب التسليم إلى أسفل. عندما يكون قضيب التسليم في الارتفاع الصحيح، اضغط باستمرار على الرقم المطلوب حتى يومض الضوء باللون الأحمر لتعيين.
- وضع الفئران في الغرفة وطعم الفئران إلى الخلف مع بيليه. عندما يتحرك الفئران بعيدا بما فيه الكفاية إلى الجزء الخلفي من الغرفة أنه سيتم كسر شعاع الأشعة تحت الحمراء إذا كان الإصدار الآلي قيد التشغيل، نقل قضيب التسليم بيليه إلى موقف 3 (الشكل2B).
- انتظر الفئران للوصول إلى بيليه ومن ثم نقل قضيب التسليم بيليه مرة أخرى إلى موقف 2 (الشكل2A). وضع بيليه جديدة على قضيب التسليم إذا كان طرقت قبالة.
- كرر هذه الخطوات، وطعم تدريجيا الفئران أقل وأقل، حتى يبدأ الفئران إلى: '1' الانتقال إلى الخلف لطلب بيليه دون أن يتم اصطيادها، و (2) الانتقال على الفور إلى الجبهة بعد طلب بيليه في الظهر. مرة واحدة وقد فعلت الفئران هذا 10 مرات، وأنها على استعداد للتدريب على المهمة الآلية.
4- تدريب الفئران باستخدام النظام الآلي
- إعداد النظام التلقائي.
- تشغيل الأضواء في الغرفة وإعادة ملء الخزان بيليه إذا لزم الأمر.
- وضع قضيب التسليم بيليه وفقا لتفضيل مخلب الفئران. تحقق من تعيين مواضع الشغل بشكل صحيح (كما هو الحال في الشكل 2A).
- تشغيل الكمبيوتر وفتح برنامج "الوصول المهرة" (SR_dig_extension_card_64bit_(HOST)_3.vi). أدخل رقم معرف الفئران ضمن الموضوع وحدد تفضيل الكفة من القائمة المنسدلة اليد. حدد مسار حفظ لمقاطع الفيديو.
- تعيين وقت الجلسة ومقاطع فيديو Max (عدد مقاطع الفيديو التي يتم فيها إنهاء الجلسة في). سيتوقف البرنامج عن التشغيل في أي حد يتم الوصول إليه أولاً.
- تعيين بيليه رفع المدة (مدة الوقت الذي لا يزال قضيب التسليم في موقف "3" بعد الفئران يطلب بيليه). تمكين أو تعطيل عقوبة الوصول المبكر (إعادة تعيين قضيب التسليم إلى موقف "1" ثم العودة إلى "2" إذا وصل الفئران قبل طلب بيليه).
- التقاط صور المعايرة. يستخدم إعادة إنشاء المسار ثلاثي الدّي مجموعة أدوات رؤية حاسوبية لتحديد مصفوفات التحويل المناسبة، الأمر الذي يتطلب تحديد النقاط المتطابقة في كل طريقة عرض. للقيام بذلك، استخدم مكعب صغير مع أنماطرقعة الداما على كل جانب (الشكل 3).
- وضع يد المساعدة داخل غرفة الوصول وكزة مقطع التمساح من خلال فتحة الوصول. عقد المكعب أمام فتحة الوصول مع مقطع التمساح.
- ضع المكعب بحيث يظهر الجانب الأحمر في المرآة العليا، والجانب الأخضر في المرآة اليسرى، والجانب الأزرق في المرآة اليمنى. يجب أن يكون الوجه بأكمله لكل من الجوانبالثلاثة مرئية في المرايا (الشكل 3).
- في البرنامج السلوكي، تأكد من تعيين عتبة عائد الاستثمار إلى قيمة كبيرة جداً (على سبيل المثال، 60000). انقر فوق زر التشغيل (سهم أبيض). بمجرد أن يتحول الزر تهيئة الكاميرا إلى اللون الأخضر، اضغط START. لاحظ أنه يتم الحصول على الفيديو.
- انقر فوق وضع Cal. ثم، التقاط صورة بالنقر فوق التقاط صورة Cal. سيظهر مسار دليل الصورة الآن ضمن مسار ".png" مع تنسيق اسم الملف .png كـ "GridCalibration_YYYYMMDD_img#.png".
- نقل المكعب قليلا، واتخاذ صورة أخرى. كرر مرة أخرى لما مجموعه 3 صور.
- إيقاف البرنامج بالنقر فوق إيقاف ثم زر علامة الإيقاف. إزالة يد المساعدة والمكعب من المربع.
- يجب الحرص على عدم عثرة أي شيء في الغرفة السلوكية بعد أن تم التقاط صور المعايرة في ذلك اليوم. إذا تحرك أي شيء، يجب التقاط صور معايرة جديدة.
- تشغيل النظام التلقائي.
ملاحظة: تحديد إعدادات "عتبة عائد الاستثمار" (الموضحة أدناه) لكل نسخة متطابقة قبل تشغيل الفئران للحصول على البيانات الفعلية. بمجرد تحديد هذه الإعدادات، قم بتعيينها مسبقًا قبل بدء البرنامج وضبطها أثناء الاكتساب إذا لزم الأمر.- ضع الجرذ في غرفة الوصول الماهرة. انقر على السهم الأبيض لتشغيل البرنامج.
- قبل النقر فوق START، قم بتعيين موضع عائد الاستثمار للكشف عن المخلب عن طريق ضبط x-Offset (x-coordinate من الزاوية العلوية اليسرى من مستطيل عائد الاستثمار)، وإزاحة y (إحداثيات y في الزاوية العلوية اليسرى من عائد الاستثمار)، وعرض عائد الاستثمار و عائد الاستثمار الارتفاع.
- ضع عائد الاستثمار في المرآة الجانبية التي تظهر دوروم مخلب، مباشرة أمام فتحة الوصول (الشكل2C). تأكد من أن قضيب تسليم بيليه لا يدخل عائد الاستثمار وأن عائد الاستثمار لا يمتد إلى المربع لمنع بيليه أو فرو الفئران من تشغيل الفيديو عندما لا يصل الفئران.
- انقر فوق ابدأ لبدء تشغيل البرنامج.
- اضبط قيمة "عتبة عائد الاستثمار المنخفض" حتى تتأرجح "قيمة مشتيد عائد الاستثمار المباشر" بين "0" و"1" (عندما لا يصل الجرذ). هذه القيمة هي عدد وحدات البكسل داخل عائد الاستثمار مع قيم الكثافة في نطاق العتبة.
- تعيين عتبة عائد الاستثمار. مراقبة قيمة الزناد العائد على الاستثمار لايف عندما الفئران كدس أنفه في عائد الاستثمار وعندما يصل الفئران لبيليه. تعيين عتبة عائد الاستثمار لتكون أكبر بكثير من "قيمة الزناد العائد على الاستثمار لايف" أثناء كدس الأنف وأقل من "قيمة الزناد العائد على الاستثمار لايف" عندما يصل الفئران. ضبط حتى يتم تشغيل أشرطة الفيديو باستمرار عندما يصل الفئران ولكن ليس عندما كدس أنفه من خلال فتحة
ملاحظة: هذا يفترض مخلب أخف الملونة من الأنف; سيتم عكس التعديلات إذا كان مخلب أغمق من الأنف. - مراقبة التجارب القليلة الأولى للتأكد من أن كل شيء يعمل بشكل صحيح. عندما يصل الجرذ قبل طلب بيليه (قضيب التسليم في الموقف "2")، يزيد عدد "الوصول المبكر". عندما يصل فأر بعد طلب بيليه (قضيب التسليم في الموضع "3")، يزيد عدد "أشرطة الفيديو" ويتم حفظ الفيديو كملف .bin مع اسم "RXXXX_YYYYMMDDD_HH_MM_SS_trial#".
ملاحظة: الافتراضي لأشرطة الفيديو أن تحتوي على 300 إطارات (أي 1 ق) قبل و 1000 إطارات بعد الحدث الزناد (وهذا هو شكلي في البرنامج)، وهو طويل بما فيه الكفاية لاحتواء حركة الوصول إلى قبضة كاملة بما في ذلك تراجع مخلب. - بمجرد الوصول إلى وقت الجلسة أو مقاطع الفيديو القصوى، يتوقف البرنامج. اضغط على زر علامة الإيقاف.
- تنظيف الغرفة مع الإيثانول وكرر مع فأر آخر، أو إذا فعلت لهذا اليوم المضي قدما لتحويل أشرطة الفيديو.
- تحويل ملفات .bin إلى ملفات .avi.
ملاحظة: ضغط أشرطة الفيديو أثناء الحصول على يؤدي الإطارات التي تم إسقاطها، بحيث يتم دفق الملفات الثنائية إلى القرص أثناء الاكتساب (استخدام محرك أقراص حالة صلبة بسبب ارتفاع معدلات نقل البيانات). يجب ضغط هذه الملفات الثنائية خارج الخط أو متطلبات التخزين كبيرة بشكل لا يمكن.- افتح البرنامج "bin2avi-color_1473R_noEncode.vi".
- ضمن "التحكم في مسار الملف" انقر فوق زر المجلد لتحديد جلسة العمل (على سبيل المثال، R0235_20180119a) الذي تريد تحويله. كرر لكل جلسة (حتى ستة).
- انقر فوق السهم الأبيض (تشغيل) ثم "ابدأ" للبدء. يمكنك مراقبة ضغط الفيديو في "التقدم العام (%)" بار. دع البرنامج يعمل بين عشية وضحاها.
- قبل البدء في تدريب الحيوانات في اليوم التالي، تحقق من أن مقاطع الفيديو قد تم تحويلها وحذف ملفات .bin بحيث تتوفر مساحة كافية للحصول على مقاطع فيديو جديدة.
5. تحليل أشرطة الفيديو مع DeepLabCut
ملاحظة: يتم تدريب شبكات مختلفة لكل تفضيل مخلب (مخلب اليمين ومخلب اليسار) ولكل عرض (عرض مباشر وعرض مرآة اليسار للفئران مخلب الحق، وعرض مباشر وعرض مرآة الحق للفئران مخلب اليسار). لا يتم استخدام عرض المرآة العلوية لإعادة الإعمار ثلاثي الدُعد - فقط للكشف عن الوقت الذي يدخل فيه الأنف الفتحة، والتي قد تكون مفيدة لتحريك التدخلات (على سبيل المثال، علم الوراثة البصرية). ثم يتم استخدام كل شبكة لتحليل مجموعة من أشرطة الفيديو اقتصاص لمخلب المقابلة وعرض.
- تدريب شبكات DeepLabCut (يتم توفير تعليمات مفصلة في وثائق DeepLabCut على https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
- إنشاء وتكوين مشروع جديد في DeepLabCut، خوارزمية التعلم الآلي لتقدير تشكل بلا علامات13.
- استخدم البرنامج لاستخراج الإطارات من مقاطع الفيديو الماهرة التي تصل إلى الصور والاقتصاص إلى طريقة العرض لتضمين (عرض مباشر أو متطابق) في واجهة البرنامج. إطارات المحاصيل كبيرة بما فيه الكفاية بحيث الفئران وكلا الكفوف الأمامية مرئية.
ملاحظة: تتطلب الشبكات عادةً 100-150 إطار تدريب. هناك حاجة إلى المزيد من أطر التدريب عندما يكون مخلب داخل بالمقارنة مع خارج الغرفة بسبب الإضاءة. يقلل الاقتصاص الأكثر إحكامًا من وقت المعالجة، ولكن كن حذراً من أن المناطق المزروعة كبيرة بما يكفي للكشف عن المسار الكامل للمخلب لكل فأر. وينبغي أن تكون واسعة بما فيه الكفاية لجسم الفئران بأكمله لتناسب في الإطار (وجهة نظر مباشرة)، ونرى بقدر العودة إلى الغرفة قدر الإمكان وأمام قضيب التسليم (مرآة عرض). - استخدم واجهة المستخدم الرسومية للبرنامج لتسمية أجزاء الجسم. تسمية 16 نقطة في كل إطار: 4 المفاصل metacarpophalangeal (MCP)، 4 المفاصل بين الكتائب القريبة (PIP)، 4 نصائح أرقام، وdorsum من مخلب الوصول، والأنف، وdorsum من مخلب غير الوصول، وبيليه (الشكل4).
- اتبع تعليمات DeepLabCut (المختصرة باسم DLC من الآن فصاعداً) لإنشاء مجموعة بيانات التدريب، وتدريب الشبكة، وتقييم الشبكة المدربة.
- تحليل مقاطع الفيديو وتحسين الشبكة.
- قبل تحليل جميع مقاطع الفيديو باستخدام شبكة مدربة حديثًا، قم بتحليل 10 مقاطع فيديو لتقييم أداء الشبكة. إذا كانت هناك أخطاء متسقة في أوضاع معينة، استخراج إطارات تدريب إضافية تحتوي على تلك يطرح وإعادة تدريب الشبكة.
- عند تحليل مقاطع الفيديو، تأكد من إخراج ملفات .csv، والتي سيتم إدخالها في التعليمات البرمجية لإعادة بناء المسار ثلاثي الدقة.
6. مربع معايرة
ملاحظة: يتم استخدام هذه الإرشادات لتحديد مصفوفات التحويل لتحويل النقاط المحددة في طرق العرض المباشرة والمتطابقة إلى إحداثيات ثلاثية الد. للحصول على أحدث إصدار ومزيد من التفاصيل حول كيفية استخدام حزمة boxCalibration، راجع مختبر الحادي عشر GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration، والذي يتضمن إرشادات خطوة بخطوة لاستخدامها.
- جمع كافة صور المعايرة في نفس المجلد.
- باستخدام ImageJ/Fiji، قم بوضع علامة على نقاط لوحة الداما يدويًا لكل صورة معايرة. حفظ هذه الصورة باسم "GridCalibration_YYYYMMDD_#.tif" حيث "YYYYMMDD" هو التاريخ الذي تتوافق معه صورة المعايرة و '#' هو رقم الصورة لذلك التاريخ.
- استخدم وظيفة القياس في ImageJ (في شريط الأدوات، حدد تحليل | قياس). سيؤدي ذلك إلى عرض جدول يحتوي على إحداثيات لكافة النقاط التي تم وضع علامة عليها. حفظ هذا الملف مع اسم "GridCalibration_YYYYYMMDD_#.csv"، حيث التاريخ ورقم الصورة هي نفس ملف .tif المطابق.
- من حزمة المعايرة المربعة، افتح الملف 'setParams.m'. يحتوي هذا الملف على كافة المتغيرات المطلوبة ووصفها. تحرير المتغيرات حسب الحاجة لاحتواء مواصفات المشروع.
- تشغيل وظيفة معايرة مربعات. ستظهر عدة مطالبات في إطار الأوامر. يسأل كُلّ المطالبة الأولى ما إذا كان سيتم تحليل كافة الصور في المجلد. سوف كتابة Y إنهاء المطالبات، وسيتم تحليل جميع الصور لجميع التواريخ. ستطالب كتابة N المستخدم بإدخال التواريخ لتحليلها.
ملاحظة: سيتم إنشاء دليلين جديدين في مجلد صور المعايرة: 'markedImages' يحتوي على ملفات .png مع علامات الداما المعرفة من قبل المستخدم على صورة المعايرة. يحتوي المجلد 'boxCalibration' على ملفات .mat مع معلمات معايرة المربع. - تشغيل الدالة checkBoxالمعايرة. سيؤدي هذا إلى إنشاء مجلد جديد، 'checkالمعايرة' في المجلد 'boxCalibration'. سيكون لكل تاريخ مجلد فرعي يحتوي على الصور والعديد من ملفات .fig، والتي يتم استخدامها للتحقق من اكتمال معايرة المربع بدقة.
7. إعادة بناء مسارات 3D
- تجميع ملفات .csv التي تحتوي على إخراج برنامج التعلم في بنية الدليل الموضحة في البرنامج النصي إعادة بناء 3Dtrajectories.
- تشغيل إعادة بناء3Dtrajectories. سيقوم هذا البرنامج النصي بالبحث في بنية الدليل ومطابقة النقاط المباشرة/المتطابقة استناداً إلى أسمائها في البرنامج المائل (من المهم استخدام نفس أسماء أجزاء النص في كلا العرضين).
- تشغيل حسابالكينماتيكس. يستخرج هذا البرنامج النصي ميزات حركية بسيطة من عمليات إعادة بناء المسار ثلاثي الد، والتي يمكن تصميمها لتلبية احتياجات محددة.
ملاحظة: يقدّر البرنامج موضع أجزاء الجسم المُكَكَفّة استنادًا إلى جيرانها وموقعها في طريقة العرض التكميلية (على سبيل المثال، يحد موقع جزء من الجسم في عرض الكاميرا المباشر من مواقعه المحتملة في طريقة العرض المتطابقة). في الأوقات التي يتم فيها الانسداد مخلب في عرض المرآة كما يمر من خلال فتحة، يتم استيفاء إحداثيات مخلب على أساس الإطارات المجاورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الفئران تكتسب مهمة الوصول المهرة بسرعة مرة واحدة تكييفها إلى الجهاز، مع استقرار الأداء منحيث كل من أعداد تصل والدقة على مدى 1-2 أسابيع (الشكل 5). ويبين الشكل 6 نماذج إطارات الفيديو التي تشير إلى الهياكل التي حددتها DeepLabCut، ويبين الشكل 7 مسارات الوصول الفردية المفروضة من جلسة واحدة. وأخيراً، في الشكل8، نوضح ما يحدث إذا لم يتم تعيين مشغل الكشف عن الكف (الخطوات 4.3.4-4.3.6) بدقة. هناك تباين كبير في الإطار الذي مخلب ينتهك فتحة الوصول. هذه ليست مشكلة رئيسية من حيث تحليل الوصول إلى الحركية. ومع ذلك، فإنه يمكن أن يؤدي إلى تباين في عندما يتم تشغيل التدخلات (على سبيل المثال، علم الوراثة البصرية) أثناء الوصول إلى الحركات.
الشكل 1: غرفة الوصول الماهرة.
في اتجاه عقارب الساعة من أعلى اليسار هي وجهة نظر جانبية، وجهة نظر من الأمام وما فوق، والإطار الذي يتم تحميل الكمّل (انظر الخطوة 1.8)، وعرض من الجانب وما فوق. غرفة الوصول المهرة (1) لديها باب (2) مقطعة إلى جانب واحد للسماح للفئران ليتم وضعها في وإخراجه من الغرفة. يتم قطع شق في لوحة السقف (12) للسماح للالحيوان أن تكون مربوطة ويتم قطع الثقوب في لوحة الكلمة (13) للسماح للقمامة أن تسقط من خلال. يتم محاذاة اثنين من أجهزة الاستشعار بالأشعة تحت الحمراء (3) على جانبي الجزء الخلفي من الغرفة. يتم تركيب مرآة (4) فوق فتحة الوصول (14) في الجزء الأمامي من غرفة الوصول واثنين من المرايا الأخرى (6) شنت على جانبي الغرفة الوصول. غرفة الوصول المهرة يجلس فوق مربع الدعم (5). يتم تركيب الكاميرا عالية الوضوح (7) على مربع الدعم أمام فتحة الوصول. يتم تركيب قطعتين من الورق الأسود (18) على جانبي الكاميرا (7) لتعزيز التباين من مخلب في المرايا الجانبية (6). أسفل مربع الدعم هو الإطار (8) الذي يدعم المحرك الخطي (16) وخزان بيليه (9). أنبوب دليل تغلف قضيب تسليم بيليه (10) يصلح في خزان بيليه وتسيطر عليها المحرك الخطي. يتم قطع الثقوب في إطار التحريك (17) وصندوق الدعم (15) فوق خزان بيليه للسماح لقضيب تسليم بيليه للتحرك صعودا وهبوطا بحرية. يضيء الصندوق بألواح خفيفة (11) مثبتة على جدران وسقف الخزانة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: هيكل تجريبي واحد.
(أ) تبدأ التجربة بقضيب تسليم بيليه (الذي يتحكم فيه المحرك الخطي) المتمركزة في موضع "جاهز" (الوضع 2 - منتصف الطريق بين الأرض وأسفل الفتحة الوصول). (ب) يتحرك الفئران إلى الجزء الخلفي من الغرفة لكسر شعاع الأشعة تحت الحمراء (IR)، مما يؤدي إلى قضيب تسليم بيليه لترتفع إلى الموقف 3 (محاذاة مع الجزء السفلي من فتحة الوصول). (C) الفئران تصل من خلال فتحة الوصول إلى فهم بيليه. يتم الكشف عن الوصول في الوقت الحقيقي باستخدام FPGA framegrabber الذي يكشف عن التغيرات كثافة بكسل داخل منطقة ذات أهمية (ROI) في عرض المرآة الجانبية مباشرة أمام الفتحة. عندما تتطابق وحدات البكسل الكافية مع المستخدم المعرّف "كثافة مخلب"، يتم تشغيل الحصول على الفيديو. (D) بعد ثانيتين يتم خفض بيليه إلى موقف 1، والتقاط بيليه جديدة من خزان بيليه قبل إعادة تعيين إلى موقف 2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صورة معايرة العينة.
يتم وضع يد العون داخل غرفة الوصول المهرة. مقطع التمساح كدس من خلال فتحة الوصول لعقد مكعب المعايرة في مكان خارج الغرفة الوصول. والأنماط الثلاثة لألواح الداما مرئية تماماً في العرض المباشر ومناظر المرآة المقابلة (الأخضر: اليسار؛ الأحمر: الأعلى؛ والأزرق: اليمين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مواضع علامة خوارزمية التعلم.
العمود الأيسر: طريقة العرض المباشرة; العمود الأيمن: عرض النسخة المتطابقة. علامات 1-4: مفاصل MCP; 5-8: المفاصل PIP; 9-12: نصائح أرقام; 13: دورسوم من مخلب الوصول؛ 14: الأنف؛ 15: دورسوم من مخلب غير الوصول. العلامة 16 (بيليه) غير مرئية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الفئران تكتسب بسرعة مهمة الوصول الماهرة الآلية.
متوسط معدل نجاح الوصول الأول (الأخضر والمحور الأيسر) ومتوسط إجمالي التجارب (الأزرق والمحور الأيمن) خلال الدورات التدريبية العشرين الأولى في مهمة الوصول الماهرالآلي (n = 19). استمرت كل جلسة تدريبية 30 دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نموذج إطارات الفيديو التي تم وضع علامة عليها بواسطة برنامج التعلم.
العمود الأيسر: عرض النسخة المتطابقة; العمود الأيمن: طريقة العرض المباشرة. علامات النقاط السماوية والحمراء والصفراء والخضراء 1-4 على التوالي. النقطة البيضاء علامات الأنف، نقطة سوداء علامات بيليه. تم تحديد الدوائر المليئة من قبل DeepLabCut. تضع الدوائر المفتوحة علامة على مواضع الكائن المقدرة بالمكان الذي يظهر فيه هذا الكائن في طريقة العرض المقابلة. X هي نقاط إعادة إسقاط على إطارات الفيديو من تقديرات مواقعها ثلاثية الد. تم تشغيل هذا الفيديو في الإطار 300، كما مرت مخلب من خلال فتحة. أعلى الصور هي من الإطار الأول عندما تم الكشف عن مخلب الوصول. الصور السفلية هي من الإطار الذي تم توسيع الرقم الثاني إلى أقصى حد. تم تحديد هذه الإطارات بواسطة برنامج معالجة الصور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: عينة مسارات ثلاثية الدمن من جلسة اختبار واحدة.
يظهر كلا المحورين نفس البيانات، ولكن استدارة لسهولة العرض التقديمي. الخطوط السوداء تشير إلى متوسط المسارات. السماوي والأحمر والأصفر والأخضر هي مسارات فردية لأطراف الأرقام 1-4، على التوالي. الخطوط الزرقاء تشير إلى مسار دورسوم مخلب. يشير النقطة كبيرة سوداء السكر بيليه يحدّد في (0,0,0). وهذا لا يمثل سوى تقدم مخلب الأولية لسهولة العرض (بما في ذلك التراجع اتلاف وتصل متعددة يجعل الرقم غير قابل للتفسير تقريبا). ومع ذلك، فإن جميع البيانات الحركية متاحة للتحليل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: الرسوم البيانية لأرقام الإطارات التي تم فيها تحديد مراحل محددة للوصول لجلستين مختلفتين.
في جلسة واحدة (خطوط صلبة داكنة)، تم تعيين قيم تحريك عائد الاستثمار بعناية، وتم تحديد مخلب خرق فتحة داخل نفس الإطارات القليلة في كل محاكمة. في الجلسة الأخرى (خطوط متقطعة خفيفة)، غالبا ً ما تم التعرف على الأنف على أنه مخلب الوصول، مما أدى إلى الحصول على الفيديو قبل الأوان. لاحظ أن هذا لن يكون له تأثير يذكر على التحليلات الحركية خارج الخط ما لم يتم التقاط الوصول الكامل. ومع ذلك، فإن التدخلات المحتملة الناجمة عن مخلب الوصول ستكون في الوقت المناسب سيئة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أصبح وصول القوارض المهرة أداة قياسية لدراسة علم وظائف الأعضاء نظام المحرك والفيزيولوجيا المرضية. لقد وصفنا كيفية تنفيذ مهمة الفئران المهرة الآلي الوصول الذي يسمح: التدريب والاختبار مع الحد الأدنى من الإشراف، 3-D مخلب وأرقام مسار إعادة الإعمار (أثناء الوصول، واستيعاب، وتراجع مخلب)، وتحديد في الوقت الحقيقي من مخلب أثناء الوصول، والتزامن مع الالكترونيات الخارجية. وهي مناسبة تماما لربط الحركية النُفَسة مع علم وظائف الأعضاء أو للقيام بتدخلات دقيقة التوقيت أثناء الوصول إلى الحركات.
منذ أن أبلغنا في البداية هذا التصميم14، وقد تحسنت كفاءة التدريب لدينا بحيث ما يقرب من 100٪ من الفئران الحصول على هذه المهمة. وقد حددنا عدة عوامل هامة تؤدي إلى التدريب الناجح باستمرار. كما هو الحال مع العديد من المهام بدافع الجوع، يجب رصد الفئران بعناية خلال تقييد السعرات الحرارية للحفاظ على 80-90٪ من وزن الجسم المتوقع. التعامل مع الفئران يوميا، حتى قبل التدريب، أمر بالغ الأهمية لتكييفها للبشر. وينبغي تدريب الفئران للوصول قبل تعلم العودة إلى الجزء الخلفي من الغرفة لطلب الكريات - وهذا يقلل إلى حد كبير من وقت التدريب ويحسن من احتمال أن الفئران الحصول على هذه المهمة. وأخيرا، عندما تنقل بين غرف متطابقة على ما يبدو، والفئران غالبا ما تؤدي عدد أقل من الروافد. ويصدق ذلك بصفة خاصة عندما استخدمت الغرف لأول مرة. ونحن نتكهن بأن هذا يرجع إلى الاختلافات في الرائحة بين الغرف. وأياً كان السبب، فمن المهم الحفاظ على بيئة تدريب مستقرة قدر الإمكان، أو تكييف الفئران مع جميع الصناديق التي قد يحدث فيها الاختبار.
والجهاز الموصوف هنا قابل للتكيف بسهولة مع احتياجات محددة. وصفنا إصدار الفئران من المهمة، ولكن أيضا تنفيذ إصدار الماوس (على الرغم من أنه من الصعب تحديد الأرقام الفردية مع DeepLabCut في الفئران). نظرًا لأن إطارات الفيديو الفردية تتميز بنبضات TTL، يمكن مزامنة مقاطع الفيديو مع أي نظام تسجيل يقبل المدخلات الرقمية أو التناظرية (على سبيل المثال، مكبرات الصوت الكهربائية أو القياس الضوئي). وأخيرا، الفئران رئيس ثابت أداء بسهولة المهرة تصل إلى9، ويمكن تنفيذ نسخة ثابتة الرأس من هذه المهمة للتصوير 2 فوتون أو تسجيلات جاور. الأهم من ذلك، لقد استخدمنا هذا النظام فقط مع الفئران لونغ إيفانز، الذي الأنف والفراء مخلب (الأسود والأبيض، على التوالي) تختلف بما فيه الكفاية في اللون أن كدس الأنف ليست خاطئة للوصول (مع إعدادات العائد على الاستثمار المناسبة، الشكل 8). قد يكون هذا مشكلة للفئران مع تلوين مماثلة على الكفوف وأنوف (على سبيل المثال، الفئران المهق)، ولكن يمكن حلها عن طريق تلوين مخلب مع الحبر، طلاء الأظافر، أو الوشم.
النسخة المقدمة من الوصول المهرة لديها العديد من الميزات المتميزة، والتي قد تكون مفيدة اعتمادا على تطبيق معين. الأجهزة المعقدة نسبيا والحاجة إلى معالجة الفيديو في الوقت الحقيقي جعلها مناسبة بشكل سيء للتدريب قفص المنزل6،7. من ناحية أخرى، التدريب قفص المنزل يجعل من الصعب الحصول على عالية السرعة عالية الدقة الفيديو من زوايا متعددة، أو ربط الحيوانات للتسجيلات الفسيولوجية / التدخلات. بطاقات الحصول على البيانات والمتطلبات لجهاز كمبيوتر واحد لكل غرفة يجعل كل غرفة مكلفة نسبيا، وأشرطة الفيديو تتطلب مساحة تخزين رقمية كبيرة (~ 200 ميغابايت لكل 4 ق الفيديو). لقد قمنا بتنفيذ نسخة أبسط المستندة إلى متحكم بتكلفة حوالي 300 دولار للغرفة الواحدة، على الرغم من أنها تفتقر إلى التغذية المرتدة في الوقت الحقيقي أو القدرة على المزامنة مع الأجهزة الخارجية. هذه المربعات هي أساسا متطابقة مع تلك الموصوفة هنا، ولكن استخدام كاميرا الفيديو التجارية ولا تتطلب جهاز كمبيوتر إلا لبرمجة متحكم (تفاصيل هذا الإعداد والبرامج المرتبطة بها متوفرة عند الطلب). معالجة الفيديو في الوقت الحقيقي على FPGA الإطار المختطف مفيد بشكل خاص; نجد أنه يحدد بقوة أكثر تصل في الوقت الحقيقي من الأشعة تحت الحمراء أو أجهزة الاستشعار القرب (التي قد تخطئ خطم الفئران لمخلب الوصول). وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام مشغلات متعددة لتحديد مخلب في مراحل مختلفة الوصول (على سبيل المثال، نهج لفتحة، ورفع مخلب، والتمديد من خلال فتحة). هذا لا يسمح فقط استنساخ, اضطرابات الخلايا العصبية في الوقت المناسب بدقة, ولكن يمكن استخدامها لتحريك تخزين أشرطة الفيديو قصيرة عالية السرعة.
في حين لدينا نسخة الآلي من الوصول المهرة لديها العديد من المزايا لتطبيقات محددة، كما أن لديها بعض القيود. وكما ذُكر أعلاه، فإن الكاميرا عالية السرعة وعالية الدقة مكلفة إلى حد ما، ولكنها ضرورية لإدراج المرايا والمشاهدات المباشرة في صورة واحدة والتقاط الحركة السريعة جداً. استخدام كاميرا واحدة يلغي الحاجة إلى مزامنة وتسجيل تيارات الفيديو متعددة في وقت واحد، أو شراء كاميرات متعددة والمختطفين الإطار. مخلب في عرض ينعكس هو على نحو فعال حوالي ضعف بعيدا عن الكاميرا (عن طريق تتبع راي) كما هو الحال في العرض المباشر. وهذا يعني أن أحد وجهات النظر هو دائما ً خارج التركيز، على الرغم من أن DLC لا يزال يحدد بقوة الأرقام الفردية في كلا العرضين (الشكل 4، الشكل 6). وأخيرا، استخدمنا كاميرا ملونة لأنه، قبل توافر DLC، حاولنا لون الترميز الأرقام مع الوشم. في حين أنه من الممكن أن يكون هذا البرنامج القائم على التعلم فعالا ً على قدم المساواة على الفيديو بالأبيض والأسود (أو أقل دقة)، يمكننا فقط التحقق من فعالية الأجهزة الموضحة هنا. وأخيرا، فإن رمز التحليل الخاص بنا (بخلاف DLC) مكتوب في المقام الأول في مجموعة برامج تجارية (انظر جدولالمواد) ولكن ينبغي أن يكون مباشرا للتكيف مع لغات البرمجة المفتوحة المصدر (على سبيل المثال، بيثون) حسب الحاجة.
وهناك عدة طرق نعمل بها على تحسين هذا النظام. حاليا، يتم إغلاق طريقة العرض المتطابقة جزئيا من قبل اللوحة الأمامية. ولذلك، فإننا نستكشف سبل الحصول على وجهات نظر متزامنة متعددة للمخلب مع تقليل العوائق إلى أدنى حد. وهناك تطور هام آخر هو تسجيل النقاط تلقائياً (يمكن للنظام تتبع الحركية، ولكن يجب على الإنسان أن يسجل النجاح مقابل التوصل إلى فشل). وقد وضعت أساليب لتحديد ما إذا كان قد طرقت الكريات قبالة الرف / قاعدة التمثال، ولكن لا يمكن تحديد ما إذا كان قد تم استيعاب بيليه أو غاب تماما11. من خلال تتبع بيليه مع DLC، ونحن استكشاف خوارزميات لتحديد عدد من يصل لكل محاكمة، فضلا عن ما إذا كان قد تم القبض على بيليه، طرقت قبالة قاعدة التمثال، أو غاب تماما. وعلى هذا المنوال، نعمل أيضًا على أتمتة سير العمل بشكل كامل من خلال جمع البيانات من خلال تحويل الفيديو، ومعالجة DLC، والتسجيل التلقائي. في نهاية المطاف، ونحن نتصور نظام الذي يمكن تشغيل تجارب متعددة في يوم واحد، وبحلول صباح اليوم التالي تم تحديد الحركية الطرف الكامل والوصول إلى عشرات لكل تجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا كارونيش جانجولي ومختبره على المشورة بشأن مهمة الوصول الماهرة، وألكسندر وماكينزي ماثيس على مساعدتهم في تكييف ديب لابكوت. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (رقم المنحة K08-NS072183) وجامعة ميشيغان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| clear polycarbonate panels | TAP Plastics | cut to order (see box design) | |
| infrared source/detector | Med Associates | ENV-253SD | 30" range |
| camera | Basler | acA2000-340kc | 2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link |
| camera lens | Megapixel (computar) | M0814-MP2 | 2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus |
| camera cables | Basler | #2000031083 | Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables |
| mirrors | Amazon | ||
| linear actuator | Concentrics | LACT6P | Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer |
| pellet reservoir/funnel | Amico (Amazon) | a12073000ux0890 | 6" funnel |
| guide tube | ePlastics | ACREXT.500X.250 | 1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long |
| pellet delivery rod | ePlastics | ACRCAR.250 | 0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length) |
| plastic T connector | United States Plastic Corp | #62065 | 3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee |
| LED lights | Lighting EVER | 4100066-DW-F | 12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool |
| Light backing | ePlastics | ACTLNAT0.125X12X36 | 0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet |
| Light diffuser films | inventables | 23114-01 | .007x8.5x11", matte two sides |
| cabinet and custom frame materials | various (Home Depot, etc.) | 3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure) | |
| acoustic foam | Acoustic First | FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick) | |
| ventilation fans | Cooler Master (Amazon) | B002R9RBO0 | Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers |
| cabinet door hinges | Everbilt (Home Depot | #14609 | continuous steel hinge (1.4" x 48") |
| cabinet wheels | Everbilt (Home Depot | #49509 | Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake |
| cabinet door handle | Everbilt (Home Depot | #15094 | White light duty door pull (4.5") |
| computer | Hewlett Packard | Z620 | HP Z620 Desktop Workstation |
| Camera Link Frame Grabber | National Instruments | #781585-01 | PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full |
| Multifunction RIO Board | National Instruments | #781100-01 | PCIe-17841R |
| Analog RIO Board Cable | National Instruments | SCH68M-68F-RMIO | Multifunction Cable |
| Digital RIO Board Cable | National Instruments | #191667-01 | SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series |
| Analog Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| Digital Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| 24 position relay rack | Measurement Computing Corp. | SSR-RACK24 | Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel |
| DC switch | Measurement Computing Corp. | SSR-ODC-05 | Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A |
| DC Sense | Measurement Computing Corp. | SSR-IDC-05 | solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC |
| DC Power Supply | BK Precision | 1671A | Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply |
| sugar pellets | Bio Serv | F0023 | Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored) |
| LabVIEW | National Instruments | LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions | 64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW |
| MATLAB | Mathworks | Matlab R2019a | box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox |
References
- Chen, J., et al. An automated behavioral apparatus to combine parameterized reaching and grasping movements in 3D space. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Sacrey, L. A. R. A., Alaverdashvili, M., Whishaw, I. Q. Similar hand shaping in reaching-for-food (skilled reaching) in rats and humans provides evidence of homology in release, collection, and manipulation movements. Behavioural Brain Research. 204, 153-161 (2009).
- Whishaw, I. Q., Kolb, B. Decortication abolishes place but not cue learning in rats. Behavioural Brain Research. 11, 123-134 (1984).
- Klein, A., Dunnett, S. B. Analysis of Skilled Forelimb Movement in Rats: The Single Pellet Reaching Test and Staircase Test. Current Protocols in Neuroscience. 58, 8.28.1-8.28.15 (2012).
- Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41, 49-59 (1990).
- Zeiler, S. R., et al. Medial premotor cortex shows a reduction in inhibitory markers and mediates recovery in a mouse model of focal stroke. Stroke. 44, 483-489 (2013).
- Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavioural Brain Research. 281, 137-148 (2015).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. , (2014).
- Guo, J. Z. Z., et al. Cortex commands the performance of skilled movement. Elife. 4, e10774 (2015).
- Nica, I., Deprez, M., Nuttin, B., Aerts, J. M. Automated Assessment of Endpoint and Kinematic Features of Skilled Reaching in Rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 255 (2017).
- Wong, C. C., Ramanathan, D. S., Gulati, T., Won, S. J., Ganguly, K. An automated behavioral box to assess forelimb function in rats. Journal of Neuroscience Methods. 246, 30-37 (2015).
- Torres-Espín, A., Forero, J., Schmidt, E. K. A., Fouad, K., Fenrich, K. K. A motorized pellet dispenser to deliver high intensity training of the single pellet reaching and grasping task in rats. Behavioural Brain Research. 336, 67-76 (2018).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21, 1281-1289 (2018).
- Ellens, D. J., et al. An automated rat single pellet reaching system with high-speed video capture. Journal of Neuroscience Methods. 271, 119-127 (2016).
