Summary
啮齿动物技能达到通常用于研究灵巧的技能,但需要大量的时间和精力来实现任务和分析行为。我们描述了一个自动化版本的熟练到达与运动跟踪和三维重建的到达轨迹。
Abstract
啮齿动物技能达到通常用于研究灵巧的技能,但需要大量的时间和精力来实现任务和分析行为。最近开发了几个自动的熟练接触版本。在这里,我们描述了一个版本,它会自动向大鼠显示颗粒,同时以高帧速率(300 fps)从多个角度录制高清视频。爪子和单个数字使用 DeepLabCut 进行跟踪,DeepLabCut 是一种用于无标记姿势估计的机器学习算法。该系统也可以与生理记录同步,或用于触发生理干预(例如,电刺激或光学刺激)。
Introduction
人类严重依赖灵巧的技能,即需要精确协调的多关节和数字运动的运动。这些技能受一系列常见的中枢神经系统疾病的影响,包括结构病变(如中风、肿瘤、脱骨髓性病变)、神经退行性疾病(如帕金森病)和运动功能异常电路(例如肌张力障碍)。因此,了解中央电机电路如何学习并实施灵巧的技能,有可能提高大量人口的生活质量。此外,这种理解有可能通过优化训练和康复策略来改善健康人的运动性能。
解剖人类灵巧技能背后的神经回路受到技术和伦理因素的限制,因此有必要使用动物模型。非人类灵长类动物通常用于研究灵巧的肢体运动,因为它们的运动系统和行为与人类相似1。然而,非人类灵长类动物由于生成时间长而昂贵,限制了研究对象和基因干预的数量。此外,虽然适用于非人类灵长类动物的神经科学工具箱比人类大,但许多最近的技术进步在灵长类动物中要么不可用,要么被大大限制。
啮齿熟练达到是研究灵巧电机控制的一种互补方法。大鼠和小鼠可以训练达到,抓住,并检索糖颗粒在一个定型的动作序列,与人类到达模式2一样。由于其相对较短的生成时间和较低的住房成本,以及他们获得技能的能力,在几天到数周内达到,有可能在学习和技能巩固阶段学习大量的科目。使用啮齿动物,特别是小鼠,也有助于使用强大的现代神经科学工具(如光遗传学,钙成像,疾病遗传模型)来研究灵巧的技能。
几十年来,啮齿熟练接触已经被用来研究正常的运动控制,以及它是如何受到中风和帕金森病等特定疾病的影响。然而,大多数版本的这个任务是劳动密集型和时间密集型的,减轻了研究啮齿动物的好处。典型的实现包括将啮齿动物放在一个接触室中,在狭窄的槽前有一个搁板,啮齿动物必须通过这个槽到达。研究人员手动将糖粒放在架子上,等待动物到达,然后放置另一个。实时或视频评论4将到达作为成功或失败进行评分。然而,只要成功或失败就达到,就忽略丰富的运动学数据,这些数据可以洞察(而不是简单地说是否)到达是如何受损的。此问题已通过实施详细的审查达到视频,以确定和半定量得分达到子运动5。虽然这增加了一些关于到达运动学的数据,但它也大大增加了实验者的时间和工作量。此外,高水平实验者参与可能导致方法和数据分析的不一致,即使在同一实验室内也是如此。
最近,已经开发出了几个自动版本的熟练接触。有的附着在家里的笼子里6、7号,省去了转移动物的需要。这既减轻了动物的压力,也无需将它们适应专门的接触室。其他版本允许爪子跟踪,以便运动学的变化在特定干预下可以研究8,9,10,或有机制自动确定颗粒是否从货架上敲下来11。自动熟练的到达任务是特别有用的高强度训练,可能需要在受伤后的康复12。自动化系统允许动物长时间执行大量到达,而无需研究人员的密集参与。此外,允许爪子跟踪和自动结果评分的系统减少了研究人员执行数据分析的时间。
我们开发了一个自动化的大鼠熟练到达系统,具有几个专业功能。首先,通过使用可移动的底座将颗粒从下方置于"到达位置",我们获得了前肢几乎一览无余的视图。其次,镜子系统允许使用单个摄像机同时查看多个覆盖视图,允许使用高分辨率、高速 (300 fps) 摄像机对到达轨迹进行三维 (3-D) 重建。随着最近开发强大的机器学习算法的无标记运动跟踪13,我们现在不仅跟踪爪子,但个别关节提取详细的伸手和掌握运动学。第三,执行简单视频处理的帧抓取器允许实时识别不同的到达阶段。此信息用于触发视频采集(由于文件大小,连续视频采集不可行),还可用于在精确时刻触发干预(例如,光遗传学)。最后,单个视频帧由晶体管-晶体管逻辑 (TTL) 脉冲触发,使视频能够与神经记录(例如电生理学或光度测量)精确同步。在这里,我们描述了如何构建这个系统,训练大鼠执行任务,将设备与外部系统同步,以及重建三维到达轨迹。
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Protocol
此处描述的所有涉及动物使用的方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。
1. 设置接触室
注:有关仪器的详细信息和图表,请参阅 Ellens 等人14。零件号参见图1。
- 用丙烯酸水泥粘结透明聚碳酸酯面板,以构建到达室(宽15厘米,长40厘米,高40厘米)(部分#1)。一侧面板(部分#2)有一个铰链门(18 厘米宽 x 15 厘米高)带锁。如果大鼠将系在电缆上,将一条狭缝(5厘米宽乘36厘米长)切入室天花板,以容纳它(部分#12)。地板板有 18 个孔(直径 1.75 厘米)(部分#13)切入其中,未粘合到腔室的其余部分。
- 在侧面板中安装和对齐红外传感器(部分#3),面板距造型室背面 4.5 厘米,距地板 3.8 厘米。行为软件有一个指示灯("IR 后退"),当红外光束未中断时为绿色,当光束断开时为红色。设置软件后,可用于检查传感器对齐。
- 将镜子(15 厘米 x 5 厘米,部分#4)安装在到达槽上方 10 厘米(部分#14)。将镜面对准,以便摄像机可以看到颗粒传送杆。
- 将腔室放在可消毒的支撑箱上(宽 59 厘米,长 67.3 厘米,高 30.5 厘米,部分#5)。室位于支撑箱(12 厘米宽 x 25 厘米长)的孔上方,允许垃圾从地板孔(部分#13)中落下,然后从接触室中流出。将第二个孔(7 厘米宽 x 6 厘米长,部分#15)切入到达槽前面的支撑盒,允许颗粒输送杆将颗粒带到到达槽。
- 将两面镜子(8.5 厘米宽 x 18.5 厘米高,部分#6)安装到地板上,在造型室的两侧安装磁铁,以便镜子的长边从触动箱前部接触侧面板 3 厘米。将镜子对准,以便摄像机能够看到盒子和到达槽前面的区域,以便将颗粒传送。
- 将高清摄像机(部分#7)安装到距到达槽 17 厘米的位置,朝向盒子。
- 将黑色纸张(部分#18)安装在相机的两侧,使侧视镜的背景变暗。这增强了对比度,提高了实时和线下爪检测。
- 使用螺钉将线性执行器(部分#16)安装在可消毒的机架上(25 厘米宽 x 55 厘米长 x 24 厘米高,部分#8)。执行器倒置安装,以防止颗粒灰尘积聚在其位置感应电位计内。
- 将泡沫 O 型环插入颗粒储液罐(漏斗)(部分#9)的颈部,以防止灰尘积聚在组件中。将漏斗安装在框架顶部的孔(直径约 6 厘米,#17部分)下方,将漏斗的边缘滑到框架顶部下方的三颗螺钉上方。将导管(部分#10)插入漏斗的颈部。
- 将塑料 T 接头连接到执行器的钢棒末端。将颗粒输送杆的锥形端插入连接器顶部,并通过导管将杯状端插入颗粒储液罐中。
- 将线性执行器组件放在熟练的接触室下方,以便颗粒输送杆可以穿过到达槽前面的孔(部分#15)。
- 将整个接触装置放在一个带工作台的柜子里(121 厘米 x 119 厘米 x 50 厘米),通风时配有计算机风扇(光线充足时内部会变热),并内衬有声学泡沫。
- 通过在 20.3 厘米 x 25.4 厘米支撑板上粘附 LED 灯条,构建五个灯板(部分#11)。将扩散膜安装在光条上。在颗粒输送杆区域的天花板上安装一个照明面板。沿接触室将其他四个安装在机柜的两侧。
注:照亮到达槽和颗粒输送杆周围的区域非常重要,以便进行实时爪子识别。
2. 设置计算机和硬件
- 根据制造商的说明安装 FPGA 帧抓取器和数字扩展卡(参见材料表)。
注: 我们建议至少使用 16 GB 的 RAM 和用于数据存储的内部固态硬盘,因为流式传输高速视频需要大量的缓冲容量。 - 安装高清摄像机的驱动程序并将其连接到 FPGA 帧抓取器。行为软件必须运行并与相机连接才能使用与相机关联的软件。
注: 随附的代码(请参阅补充文件)可访问摄像机中的可编程寄存器,并且可能与其他品牌不兼容。我们建议至少每秒录制 300 帧 (fps);在150fps,我们发现,爪子姿势的关键变化经常被错过。 - 将"SR 自动化_dig_ext_card_64bit"中附带的代码(项目)复制到计算机。
3. 行为训练
- 训练前为大鼠准备。
- 房子长埃文斯大鼠(男性或雌性,年龄10-20周)在反向光/暗循环中,每笼2⁄3组。训练前三天,对大鼠进行食物限制,使体重比基线低10-20%。
- 每天处理大鼠几分钟,至少5天。处理后,在每只大鼠的笼子里放置4~5粒糖丸,介绍这种新奇的食物。
- 将大鼠转移到到达室(1~3天)
- 打开 LED 灯,在造型室的前部和后部放置 3 个糖颗粒。
- 将大鼠放入室内,让大鼠探索15分钟。重复这个阶段,直到大鼠吃掉地板上的所有颗粒。
- 用乙醇清洁大鼠之间的腔室。
注:在黑暗阶段执行训练和测试。每天在同一时间训练老鼠。
- 训练大鼠达到并观察爪子偏好(1~3天)。
- 打开灯,把老鼠放在熟练的伸手室里。
- 使用钳子,通过盒子前部到达槽中保持一个颗粒(图1,图2)。让老鼠吃3粒从钳子。
- 下次老鼠试图从钳子中吃颗粒时,将颗粒拉回来。最终,老鼠会试图用爪子到达颗粒。
- 重复 11 次。在11次尝试中,老鼠使用最多的爪子是老鼠的"爪子偏好"。
注: 尝试定义为爪子伸出到达槽。大鼠不需要成功获得和吃掉颗粒。
- 训练大鼠到达颗粒输送杆(1~3天)
- 将颗粒输送杆与到达槽的一侧与大鼠首选爪子的一侧对齐(使用导板确保从到达室前部放置 1.5 厘米)。输送杆的顶部应与到达槽的底部对齐(图 2B)。在输送杆上放置一个颗粒。
注:将传送杆放置在大鼠首选爪子对面,使大鼠很难用其非首选爪子获得颗粒。我们没有使用老鼠非首选爪子的问题。然而,在某些模型中(例如,中风),这种情况仍然可能发生,并且可以添加对非首选到达肢体的限制。 - 用钳子将颗粒诱饵,但将大鼠引向传送杆,使其爪子击中杆上的颗粒。如果大鼠将颗粒从杆上敲掉,请更换它。有些老鼠最初可能接触得不够远。在这种情况下,将颗粒输送杆移近到到达槽的位置,然后随着大鼠的好转而缓慢地将其移向更远的位置。
- 在大约5-15次诱饵到达后,大鼠将开始自发地到达传送杆上的颗粒。一旦大鼠尝试了10到达传递杆而不被诱饵,它可以推进到下一阶段。
- 将颗粒输送杆与到达槽的一侧与大鼠首选爪子的一侧对齐(使用导板确保从到达室前部放置 1.5 厘米)。输送杆的顶部应与到达槽的底部对齐(图 2B)。在输送杆上放置一个颗粒。
- 训练大鼠请求颗粒(2~8天)。
注:虽然我们已经100%成功地训练大鼠达到颗粒,约10%的老鼠未能学会要求颗粒移动到室的后面。- 根据大鼠的爪子偏好定位颗粒输送杆并将其设置为位置 2(图 2A)。 使用执行器遥控器设置颗粒输送杆的高度位置。按住按钮1和2同时向上移动传送杆,而按住按钮3和2则向下移动传送杆。当输送杆处于正确的高度时,按住所需数字,直到指示灯呈红色闪烁以设置。
- 将大鼠放入室内,用小球将老鼠诱饵到背部。当大鼠移动到室的后面足够远,如果自动版本运行,它会打破红外光束时,将颗粒输送杆移到位置 3(图 2B)。
- 等待大鼠到达颗粒,然后将颗粒输送杆移回位置 2(图 2A)。 如果被击倒,在输送杆上放置新颗粒。
- 重复这些步骤,逐渐诱饵大鼠越来越少,直到大鼠开始:(i) 移动到背部请求颗粒而不被诱饵,和 (ii) 在要求在后面的颗粒后立即移动到前面。一旦大鼠做了10次,它就可以进行自动化任务的培训了。
4. 使用自动化系统训练大鼠
- 设置自动化系统。
- 打开造型室中的灯,并根据需要重新加注颗粒储液罐。
- 根据大鼠的爪子偏好定位颗粒输送杆。检查执行器位置设置是否正确(如图 2A所示 )。
- 打开计算机并打开技能到达程序 (SR_dig_扩展_卡_64bit_(HOST)_3.vi。在"主题"下输入大鼠 ID 号,并从"手动"下拉菜单中选择爪子首选项。指定视频的保存路径。
- 设置会话时间和最大视频(结束会话的视频数量)。程序将停止以先达到的限制之一运行。
- 设置小球提升持续时间(在大鼠请求颗粒后,输送杆保持在"3"位置的持续时间)。启用或禁用早期到达惩罚(传递杆重置为位置"1",然后返回"2",如果大鼠到达之前请求颗粒)。
- 拍摄校准图像。三维轨迹重建使用计算机视觉工具箱来确定适当的变换矩阵,这需要识别每个视图中的匹配点。为此,请使用每边带有棋盘图案的小立方体(图3)。
- 将帮助之手放在接触室内,将鳄鱼夹穿过接触槽。用鳄鱼夹将立方体放在到达槽的前面。
- 放置立方体,使红色一侧显示在上镜中,绿色一侧显示在左后视镜中,蓝色一侧显示在右后视镜中。三面的整个面应在镜像中可见(图3)。
- 在行为程序中,请确保ROI 阈值设置为非常大的值(例如 60000)。单击运行按钮(白色箭头)。相机初始化按钮变为绿色后,按"开始"。请注意,正在获取视频。
- 单击"卡路里模式"。然后,通过单击"取卡路里图像"拍摄图像。图像目录路径现在将显示在".png 路径"下,其 .png 文件名的格式为"GridCalibration_YYYYMMD_img_.png"。
- 稍微移动立方体,然后拍摄另一个图像。再次重复 3 张图像。
- 单击"停止",然后单击停止符号按钮,停止程序。从包装盒中取出帮助手和立方体。
- 当天拍摄校准图像后,请注意不要在行为室中碰撞任何内容。如果有任何动向,则需要拍摄新的校准图像。
- 运行自动化系统。
注:在运行大鼠进行实际数据采集之前,确定每个镜像的"ROI 阈值"设置(如下所述)。确定这些设置后,在开始程序之前对其进行预先设置,并在必要时在采集期间进行调整。- 把老鼠放在熟练的伸手室里。单击白色箭头以运行程序。
- 在单击"开始"之前,通过调整x-Offset(ROI矩形左上角的 x 坐标)、y-Offset(ROI 左上角的 y 坐标)、ROI宽度和ROI 高度.
- 将 ROI 放置在侧镜中,该反射镜显示爪子的倒向,直接位于到达槽的前面(图 2C)。确保颗粒输送杆未进入 ROI,并且 ROI 不会延伸到包装盒中,以防止颗粒或大鼠的毛皮在大鼠未达到时触发视频。
- 单击"开始"以开始程序。
- 调整"低 ROI 阈值"值,直到"实时 ROI 触发值"在"0"和"1"之间振荡(当大鼠未达到时)。此值是 ROI 中的像素数,强度值在阈值范围内。
- 设置ROI 阈值。观察实时 ROI 触发值,当大鼠伸入 ROI 的鼻子,当大鼠到达颗粒时。将 ROI 阈值设置为明显大于鼻子戳期间的"实时 ROI 触发值",并在大鼠达到时低于"实时 ROI 触发值"。调整,直到视频持续触发时,老鼠到达,但不是当它戳它的鼻子通过插槽
注:这假定爪子的颜色比鼻子浅;如果爪子比鼻子暗,调整将反转。 - 监视前几个试验,确保一切工作正常。当大鼠在请求颗粒(在位置"2"的传递杆)之前到达时,"早期到达"数量增加。当大鼠在请求颗粒(传送杆位于位置"3")后到达时,"视频"数量增加,视频将保存为名为"RXXXX_YYYYMMDD_HH_MM_SS_试用"的.bin文件。
注: 默认为视频在触发事件之前包含 300 帧(即 1 秒),触发事件后包含 1000 帧(这在软件中是可配置的),这足够长,可以包含整个触手可及的移动,包括爪子回缩。 - 到达会话时间或视频数上限后,程序将停止。按停止标志按钮。
- 用乙醇清洁腔室,然后与另一只大鼠重复,或者如果当天完成,则继续转换视频。
- 将 .bin 文件转换为 .avi 文件。
注: 采集期间压缩视频会导致帧丢弃,因此二进制文件在采集期间流式传输到磁盘(由于数据传输速率高,请使用固态驱动器)。这些二进制文件必须在线压缩,否则存储要求会非常大。- 打开"bin2avi 颜色_1473R_noEncode.vi"程序。
- 在"文件路径控制"下,单击文件夹按钮以选择要转换的会话(例如 R0235_20180119a)。对每个会话重复一遍(最多六次)。
- 单击白色箭头(运行),然后开始"开始"。您可以在"总体进度 (%)"中监视视频压缩酒吧。让程序在一夜之间运行。
- 在第二天开始训练动物之前,请检查视频是否已转换并删除 .bin 文件,以便有足够的空间来获取新视频。
5. 使用深度实验室分析视频
注: 针对每个爪子偏好(右爪和左爪)和每个视图(右爪大鼠的直接视图和左镜像视图、左爪大鼠的直接视图和右镜像视图)训练不同的网络。顶部镜像视图不用于 3D 重建 - 只是为了检测鼻子何时进入槽,这可能有助于触发干预(例如,光遗传学)。然后,每个网络用于分析裁剪为相应爪子和视图的一组视频。
- 训练 DeepLabCut 网络(详细说明在 https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut 的 DeepLabCut 文档中提供)。
- 在 DeepLabCut 中创建和配置一个新项目,这是一种用于无标记姿势估计13的机器学习算法。
- 使用程序从熟练的到达视频中提取帧,并将图像裁剪到视图以在程序界面中包括(直接视图或镜像视图)。裁剪足够大的框架,使大鼠和前爪可见。
注:网络通常需要 100-150 个训练帧。由于光线不足,当爪子在室内时,需要更多的训练框架。更紧的裁剪可以缩短处理时间,但请注意,裁剪区域足够大,足以检测每只大鼠的爪子的完整轨迹。它应该足够宽,使大鼠的整个身体适合框架(直接视图),并尽可能远离房间和在传送杆前面(镜像视图)。 - 使用程序 GUI 标记身体部位。在每帧中标记 16 点:4 个元卡波巴兰(MCP) 关节、4 个近端间 (PIP) 关节、4 位数字尖端、到达爪的端点、鼻子、非接触爪的交错和颗粒(图 4)。
- 按照 DeepLabCut(以后缩写为 DLC)说明创建训练数据集、训练网络并评估已训练的网络。
- 分析视频并优化网络。
- 在使用新培训的网络分析所有视频之前,先分析 10 个视频以评估网络的性能。如果某些姿势存在一致错误,则提取包含这些姿势的其他训练帧,然后重新训练网络。
- 分析视频时,请确保输出 .csv 文件,这些文件将输入到代码中,以便进行 3D 轨迹重建。
6. 箱体校准
注: 这些说明用于确定变换矩阵,用于将直接视图和镜像视图中标识的点转换为三维坐标。有关如何使用 boxCalibration 包的最新版本和更多详细信息,请参阅 Leventhal 实验室 GitHub:https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration,其中包括有关其使用的分步说明。
- 在同一文件夹中收集所有校准图像。
- 使用 ImageJ/Fiji,手动标记每个校准图像的棋盘点。将此图像另存为"网格校准_YYYYMMDD_.tif",其中"YYYYMMDD"是校准图像对应的日期,"*"是该日期的图像编号。
- 在 ImageJ 中使用测量功能(在工具栏中,选择"分析" |测量)这将显示一个表,其中包含标记的所有点的坐标。保存此文件的名称为"GridCalibration_YYYYMMD_.csv",其中日期和图像编号与相应的 .tif 文件相同。
- 从框校准包中,打开"setParams.m"文件。此文件包含所有必需的变量及其描述。根据需要编辑变量,以适应项目的规范。
- 运行校准盒功能。命令窗口中将显示多个提示。第一个提示询问是否分析文件夹中的所有图像。键入Y将结束提示,并将分析所有日期的所有图像。键入N将提示用户输入要分析的日期。
注: 校准图像文件夹中将创建两个新目录:"标记图像"包含 .png 文件,校准图像上带有用户定义的棋盘标记。"框校准"文件夹包含带有框校准参数的 .mat 文件。 - 运行"复选框校准"功能。这将在"框校准"文件夹中创建一个新文件夹"检查校准"。每个日期将有一个包含图像的子文件夹和几个 .fig 文件,用于验证框校准是否准确完成。
7. 重建 3D 轨迹
- 将包含学习程序输出的 .csv 文件组装到reconstruct3Drajeces脚本中描述的目录结构中。
- 运行重建3Drajecs。此脚本将搜索目录结构,并根据倾斜程序中的名称匹配直接/镜像点(在两个视图中使用相同的正文部件名称非常重要)。
- 运行计算Kinematics。此脚本从三维轨迹重建中提取简单的运动学特征,这些功能可根据特定需求进行定制。
注: 软件根据相邻实体的位置及其在互补视图中的位置来估计被遮挡的身体部位的位置(例如,直摄像头视图中的实体零件的位置会约束其在镜像视图中的可能位置)。对于当爪子通过槽时在镜像视图中被遮挡时,爪坐标会根据相邻帧进行插值。
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Representative Results
一旦适应了仪器,大鼠就会迅速获得熟练的到达任务,在1⁄2周内达到达到和精度方面,其性能趋于稳定(图5)。图 6显示了指示 DeepLabCut 标识的结构的示例视频帧,图 7显示了单个会话中叠加的单个到达轨迹。最后,在图8中,我们说明了如果爪子检测触发器(步骤4.3.4~4.3.6)未准确设置会发生什么情况。爪子突破到达槽的帧存在显著变异性。在分析到达运动学方面,这不是一个主要问题。然而,当干预(例如光遗传学)在到达运动过程中触发时,它可能导致变异。
图1:熟练的到达室。
从左上方顺时针是侧视图、正面和上方视图、安装执行器的机架(参见步骤 1.8)以及侧面和上方的视图。熟练的到达室 (1) 有一个门 (2) 切成一侧,让大鼠被放入和带出腔室。将缝隙切入天花板面板(12),以便将动物系在一起,将孔切入地板(13),让垃圾掉落。两个红外传感器 (3) 在造型室背面的两侧对齐。后视镜 (4) 安装在到达室前部到达槽 (14) 的上方,另外两个后视镜 (6) 安装在接触室的两侧。熟练的到达室位于支撑箱 (5) 上。高清摄像机 (7) 安装在到达槽前面的支撑盒上。相机 (7) 两侧安装两片黑纸 (18),以提高侧镜 (6) 中爪子的对比度。支撑箱下方是一个框架 (8),用于支持线性执行器 (16) 和颗粒储液罐 (9)。包裹颗粒输送杆 (10) 的导管可放入颗粒储液罐中,并由线性执行器控制。孔被切入执行器框架 (17) 和支撑箱 (15) 上方的颗粒储液罐,使颗粒输送杆自由上下移动。箱体由安装在橱柜墙壁和天花板上的灯板 (11) 照明。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:单一试验结构。
(A) 试验从位于"就绪"位置(位置 2 = 到达槽底部之间的中间位置)的颗粒输送杆(由线性执行器控制)开始。(B) 大鼠移动到腔室的后面,以打破红外 (IR) 光束,导致颗粒输送杆上升到位置 3(与到达槽的底部对齐)。(C) 大鼠通过到达槽抓住颗粒.使用 FPGA 帧抓取器实时检测到达,该帧抓取器可直接检测插槽前方侧镜像视图中感兴趣区域 (ROI) 内的像素强度变化。当足够的像素与用户定义的"paw 强度"匹配时,将触发视频采集。(D) 两秒钟后,颗粒降至位置 1,从颗粒储液罐中拾取新颗粒,然后再重置至位置 2。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:样品校准图像。
伸出援助之手,放在熟练的伸手室内。鳄鱼夹穿过到达槽,将校准立方体放在到达室外的位置。三个棋盘图案在直接视图和相应的镜像视图中完全可见(绿色:左侧;红色:顶部;蓝色:右侧)。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:学习算法标记位置。
左列:直接视图;右列:镜像视图。标记 1⁄4:MCP 接头;5~8:PIP接头;9-12:数字提示;13: 到达爪子的二元;14: 鼻子;15:非接触爪的二元数。标记 16(颗粒)不可见。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:大鼠快速获得自动化技能到达任务。
在自动化技能到达任务中的前 20 个培训课程中,平均首次达到成功率(绿色、左轴)和平均总试验(蓝色、右轴)每个训练会话持续 30 分钟。错误条表示平均值的标准误差。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6:由学习程序标记的视频帧示例。
左列:镜像视图;右列:直接视图。青色、红色、黄色和绿色点分别标记数字 1⁄4。白点标记鼻子,黑点标记颗粒。填充的圆圈由 DeepLabCut 标识。打开的圆圈标记对象位置估计的位置,该对象出现在相反视图中的位置。X 是从三维位置的估计值重新投影到视频帧上的点。此视频在帧 300 时触发,因为爪子通过插槽。顶部图像来自检测到到达的爪子时的第一帧。底部图像来自第二个数字最大扩展的帧。这些帧由图像处理软件标识。请点击此处查看此图的较大版本。
图 7:单个测试会话中的三维轨迹示例。
两个轴都显示相同的数据,但为了便于显示而旋转。黑色线表示平均轨迹。青色、红色、黄色和绿色分别是数字 1⁄4 的提示的单个轨迹。蓝线表示爪子的轨迹。大黑点表示位于 (0,0,0) 的糖粒。这仅代表初始爪子提升,便于显示(包括回缩和多次到达使图形几乎无法解释)。但是,所有运动学数据都可用于分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图 8:在两个不同会话中确定特定到达阶段的帧数的直方图。
在一个会话(暗实线)中,仔细设置了 ROI 触发器值,并在每个试验中发现爪子在相同的几个帧内违反了插槽。在其他会话(光虚线),鼻子经常被误认为是伸手的爪子,过早地触发视频采集。请注意,除非未捕获完全覆盖,否则这对线外运动学分析影响不大。然而,由伸手的爪子触发的潜在干预将不及时。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
啮齿动物熟练达到已成为研究运动系统生理学和病理生理学的标准工具。我们已经描述了如何实现自动大鼠熟练到达任务,允许:训练和测试与最小的监督,三维爪和数字轨迹重建(在达到,抓握,和爪子缩回),实时识别爪子在到达,并与外部电子同步。它非常适合将前肢运动学与生理学联系起来,或在到达运动过程中进行精确时间的介入。
自从我们最初报告这个设计14以来,我们的训练效率提高了,以至于几乎100%的老鼠获得了任务。我们确定了几个导致持续成功培训的重要因素。与许多由饥饿引起的任务一样,在热量限制期间应仔细监测大鼠,以保持其预期体重的80-90%。每天处理老鼠,甚至在训练之前,对于它们适应人类是至关重要的。在学会返回室后面请求颗粒之前,应训练大鼠达到,这大大减少了训练时间,提高了大鼠完成任务的可能性。最后,当在看似相同的腔室之间转移时,大鼠通常执行较少的到达。当第一次使用腔室时尤其如此。我们推测,这是由于腔室之间的气味差异。无论什么原因,重要的是保持尽可能稳定的训练环境,或使大鼠适应所有可能进行测试的盒子。
此处描述的仪器可随时适应特定需求。我们描述了任务的鼠版本,但也实现了鼠标版本(尽管很难在小鼠中用DeepLabCut识别各个数字)。由于单个视频帧都标有 TTL 脉冲,因此视频可以与任何接受数字或模拟输入的录制系统(例如电生理学放大器或光度测量)同步。最后,头固定小鼠很容易执行熟练达到9,和头部固定版本的这个任务可以实现双光子成像或并列细胞记录。重要的是,我们只使用这个系统与长埃文斯大鼠,其鼻子和爪子毛皮(黑色和白色,分别)在颜色上有足够的差异,鼻子戳没有误认为达到(与适当的ROI设置,图8)。对于爪子和鼻子上颜色相似的大鼠(例如白化鼠)来说,这可能是个问题,但可以通过用墨水、指甲油或纹身给爪子着色来解决。
所呈现的熟练接触版本具有几个明显的功能,根据具体应用可能更有利。相对复杂的硬件和实时视频处理的需要,使得它不适合家庭笼训练6,7。另一方面,家庭笼训练使得很难从多个角度获取高速高分辨率视频,或将动物系在一起进行生理记录/干预。数据采集卡和每个腔室一台计算机的要求使得每个腔室都相对昂贵,并且视频需要大量的数字存储空间(每 4 s 视频约 200 MB)。我们实现了一个更简单的基于微控制器的版本,每个腔室的成本约为 300 美元,尽管它缺乏实时反馈或与外部设备同步的能力。这些框基本上与此处描述的相同,但使用商用摄像机,并且不需要计算机,除非对微控制器进行编程(此设置和相关软件的详细信息可应要求提供)。在FPGA帧抓取器上进行实时视频处理特别有用;我们发现,它比红外光束或接近传感器(这可能误认为大鼠的鼻出是到达的爪子)更有力地识别实时到达。此外,多个触发器可用于识别不同到达阶段的爪子(例如,接近槽、爪子提升、通过槽延伸)。这不仅允许可重现的、精确定时的神经扰动,还可用于触发存储短高速视频。
虽然我们的自动技术接触版本对于特定应用有几个优点,但它也有一些局限性。如上所述,高速高分辨率摄像机价格适中,但需要将镜像和直接视图包含在单个图像中,并捕获非常快速的移动。使用一台摄像机无需同步和录制多个视频流,或购买多个摄像机和帧抓取器。反射视图中的爪子实际上距离摄像机(通过光线跟踪)大约是直接视图的两倍。这意味着其中一个视图始终不集中,尽管 DLC 仍然能够有效地标识两个视图中的单个数字(图4,图 6)。最后,我们使用彩色相机,因为在 DLC 可用之前,我们尝试了用纹身对数字进行颜色编码。虽然这种基于学习的程序在黑白(或低分辨率)视频上可能同样有效,但我们只能验证此处描述的硬件的有效性。最后,我们的分析代码(DLC之外)主要写在商业软件包(参见材料表)中,但应根据需要直接适应开源编程语言(例如 Python)。
我们有几种方法可以改进这一系统。目前,镜像视图被前面板部分遮挡。因此,我们一直在探索如何获得多个同时视图的爪子,同时尽量减少阻碍。另一个重要的发展是自动对到达进行评分(系统可以跟踪运动学,但人类仍必须得分成功与失败到达)。已经开发的方法,以确定颗粒是否被敲下货架/底座,但不能确定颗粒是被抓住或完全错过11。通过使用 DLC 跟踪颗粒,我们正在探索算法,以确定每次试验的到达次数,以及颗粒是否被抓住、击倒底座或完全错过。本着这些,我们还致力于从数据收集到视频转换、DLC 处理和自动评分,实现工作流程的完全自动化。最终,我们设想了一个系统,其中多个实验可以在一天内运行,第二天早上,整个前肢运动学和达到每个实验的分数已经确定。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢卡鲁内什·甘古利和他的实验室对熟练完成任务的建议,并感谢亚历山大和麦肯齐·马希斯帮助改编DeepLabCut。这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所(授予编号K08-NS072183)和密歇根大学的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| clear polycarbonate panels | TAP Plastics | cut to order (see box design) | |
| infrared source/detector | Med Associates | ENV-253SD | 30" range |
| camera | Basler | acA2000-340kc | 2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link |
| camera lens | Megapixel (computar) | M0814-MP2 | 2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus |
| camera cables | Basler | #2000031083 | Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables |
| mirrors | Amazon | ||
| linear actuator | Concentrics | LACT6P | Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer |
| pellet reservoir/funnel | Amico (Amazon) | a12073000ux0890 | 6" funnel |
| guide tube | ePlastics | ACREXT.500X.250 | 1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long |
| pellet delivery rod | ePlastics | ACRCAR.250 | 0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length) |
| plastic T connector | United States Plastic Corp | #62065 | 3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee |
| LED lights | Lighting EVER | 4100066-DW-F | 12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool |
| Light backing | ePlastics | ACTLNAT0.125X12X36 | 0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet |
| Light diffuser films | inventables | 23114-01 | .007x8.5x11", matte two sides |
| cabinet and custom frame materials | various (Home Depot, etc.) | 3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure) | |
| acoustic foam | Acoustic First | FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick) | |
| ventilation fans | Cooler Master (Amazon) | B002R9RBO0 | Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers |
| cabinet door hinges | Everbilt (Home Depot | #14609 | continuous steel hinge (1.4" x 48") |
| cabinet wheels | Everbilt (Home Depot | #49509 | Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake |
| cabinet door handle | Everbilt (Home Depot | #15094 | White light duty door pull (4.5") |
| computer | Hewlett Packard | Z620 | HP Z620 Desktop Workstation |
| Camera Link Frame Grabber | National Instruments | #781585-01 | PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full |
| Multifunction RIO Board | National Instruments | #781100-01 | PCIe-17841R |
| Analog RIO Board Cable | National Instruments | SCH68M-68F-RMIO | Multifunction Cable |
| Digital RIO Board Cable | National Instruments | #191667-01 | SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series |
| Analog Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| Digital Terminal Block | National Instruments | #782536-01 | SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block |
| 24 position relay rack | Measurement Computing Corp. | SSR-RACK24 | Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel |
| DC switch | Measurement Computing Corp. | SSR-ODC-05 | Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A |
| DC Sense | Measurement Computing Corp. | SSR-IDC-05 | solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC |
| DC Power Supply | BK Precision | 1671A | Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply |
| sugar pellets | Bio Serv | F0023 | Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored) |
| LabVIEW | National Instruments | LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions | 64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW |
| MATLAB | Mathworks | Matlab R2019a | box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox |
References
- Chen, J., et al. An automated behavioral apparatus to combine parameterized reaching and grasping movements in 3D space. Journal of Neuroscience Methods. , (2018).
- Sacrey, L. A. R. A., Alaverdashvili, M., Whishaw, I. Q. Similar hand shaping in reaching-for-food (skilled reaching) in rats and humans provides evidence of homology in release, collection, and manipulation movements. Behavioural Brain Research. 204, 153-161 (2009).
- Whishaw, I. Q., Kolb, B. Decortication abolishes place but not cue learning in rats. Behavioural Brain Research. 11, 123-134 (1984).
- Klein, A., Dunnett, S. B. Analysis of Skilled Forelimb Movement in Rats: The Single Pellet Reaching Test and Staircase Test. Current Protocols in Neuroscience. 58, 8.28.1-8.28.15 (2012).
- Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41, 49-59 (1990).
- Zeiler, S. R., et al. Medial premotor cortex shows a reduction in inhibitory markers and mediates recovery in a mouse model of focal stroke. Stroke. 44, 483-489 (2013).
- Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavioural Brain Research. 281, 137-148 (2015).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. , (2014).
- Guo, J. Z. Z., et al. Cortex commands the performance of skilled movement. Elife. 4, e10774 (2015).
- Nica, I., Deprez, M., Nuttin, B., Aerts, J. M. Automated Assessment of Endpoint and Kinematic Features of Skilled Reaching in Rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 255 (2017).
- Wong, C. C., Ramanathan, D. S., Gulati, T., Won, S. J., Ganguly, K. An automated behavioral box to assess forelimb function in rats. Journal of Neuroscience Methods. 246, 30-37 (2015).
- Torres-Espín, A., Forero, J., Schmidt, E. K. A., Fouad, K., Fenrich, K. K. A motorized pellet dispenser to deliver high intensity training of the single pellet reaching and grasping task in rats. Behavioural Brain Research. 336, 67-76 (2018).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21, 1281-1289 (2018).
- Ellens, D. J., et al. An automated rat single pellet reaching system with high-speed video capture. Journal of Neuroscience Methods. 271, 119-127 (2016).
