Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Behavior

Acquisto automatico di ratti a pellet con ricostruzione tridimensionale delle traiettorie di paw e cifre

doi: 10.3791/59979 Published: July 10, 2019

Summary

Il roditore è comunemente usato per studiare abilità abili, ma richiede tempo e sforzi significativi per implementare il compito e analizzare il comportamento. Descriviamo una versione automatizzata di persone che raggiungono con il tracciamento del movimento e la ricostruzione tridimensionale delle traiettorie di raggiungimento.

Abstract

Il roditore è comunemente usato per studiare abilità abili, ma richiede tempo e sforzi significativi per implementare il compito e analizzare il comportamento. Diverse versioni automatizzate di raggiungere qualificati sono stati sviluppati di recente. Qui, descriviamo una versione che presenta automaticamente pellet ai ratti durante la registrazione di video ad alta definizione da più angolazioni ad alte frequenze di fotogrammi (300 fps). La zampa e le singole cifre vengono monitorate con DeepLabCut, un algoritmo di apprendimento automatico per una stima della posa senza marcatori. Questo sistema può anche essere sincronizzato con registrazioni fisiologiche, o essere utilizzato per innescare interventi fisiologici (ad esempio, stimolazione elettrica o ottica).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gli esseri umani dipendono fortemente dall'abilità abile, definita come movimenti che richiedono movimenti multi-joint e digit coordinati con precisione. Queste competenze sono influenzate da una serie di patologie comuni del sistema nervoso centrale, tra cui lesioni strutturali (ad esempio ictus, tumore, lesioni demielinanti), malattie neurodegenerative (ad esempio, morbo di Parkinson) e anomalie funzionali (ad es. distonia). Comprendere come le abilità abili vengono apprese e implementate dai circuiti motori centrali ha quindi il potenziale per migliorare la qualità della vita di una grande popolazione. Inoltre, tale comprensione è probabile che migliori le prestazioni motorie nelle persone sane ottimizzando le strategie di formazione e riabilitazione.

Dissezionare i circuiti neurali alla base dell'abilità abile nell'uomo è limitato da considerazioni tecnologiche ed etiche, che richiedono l'uso di modelli animali. I primati non umani sono comunemente usati per studiare i movimenti degli arti abili data la somiglianza dei loro sistemi motori e il repertorio comportamentale agli esseri umani1. Tuttavia, i primati non umani sono costosi con tempi di lunga generazione, limitando il numero di soggetti di studio e interventi genetici. Inoltre, mentre la cassetta degli attrezzi neuroscientifica applicabile ai primati non umani è più grande che per gli esseri umani, molti recenti progressi tecnologici non sono disponibili o significativamente limitati nei primati.

La portata abile dei roditori è un approccio complementare allo studio del controllo motorio abile. Ratti e topi possono essere addestrati a raggiungere, afferrare e recuperare un pellet di zucchero in una sequenza stereotipata di movimenti omologhi omologi ai modelli di raggiungimento dell'uomo2. A causa del loro tempo relativamente breve di generazione e dei costi di alloggio più bassi, così come la loro capacità di acquisire competenze che raggiungono da giorni a settimane, è possibile studiare un gran numero di materie sia durante le fasi di apprendimento che di consolidamento delle competenze. L'uso di roditori, in particolare topi, facilita anche l'uso di potenti strumenti neuroscientifici moderni (ad esempio, optogenetica, imaging del calcio, modelli genetici della malattia) per studiare abilità abile.

Roditore difficile raggiungere è stato utilizzato per decenni per studiare il normale controllo motorio e come è influenzato da patologie specifiche come ictus e morbo di Parkinson3. Tuttavia, la maggior parte delle versioni di questo compito sono di lavoro e dispendiosa in termini di tempo, mitigando i benefici dello studio dei roditori. Le implementazioni tipiche comportano il posizionamento dei roditori in una camera di raggiungendo con uno scaffale davanti a una stretta fessura attraverso la quale il roditore deve raggiungere. Un ricercatore posiziona manualmente i pellet di zucchero sullo scaffale, attende che l'animale raggiunga e poi ne posiziona un altro. I raggiunti sono segnati come successi o fallimenti sia in tempo reale che tramite recensione video4. Tuttavia, il semplice punteggio raggiunge come successi o fallimenti ignora i dati cinematici ricchi che possono fornire informazioni su come (anziché semplicemente se) raggiungere è compromessa. Questo problema è stato affrontato implementando una revisione dettagliata del raggiungimento di video per identificare e raggiungere in modo semi-quantitativo i sottomovimenti5. Mentre questo ha aggiunto alcuni dati riguardanti la cinematica di copertura, ha anche aumentato significativamente il tempo e lo sforzo dello sperimentatore. Inoltre, alti livelli di coinvolgimento dello sperimentatore possono portare a incoerenze nella metodologia e nell'analisi dei dati, anche all'interno dello stesso laboratorio.

Più recentemente, sono state sviluppate diverse versioni automatizzate di raggiungere esperti. Alcuni si attaccano alla gabbia di casa6,7, eliminando la necessità di trasferire gli animali. Questo riduce lo stress sugli animali ed elimina la necessità di acclimatarli ad una camera di raggiungendo specializzata. Altre versioni consentono il tracciamento delle zampe in modo che i cambiamenti cinematici nell'ambito di interventi specifici possano essere studiati8,9,10o avere meccanismi per determinare automaticamente se i pellet sono stati buttati giù dallo scaffale11. I compiti automatizzati di raggiungere qualificati sono particolarmente utili per l'allenamento ad alta intensità, come può essere necessario per la riabilitazione dopo un infortunio12. I sistemi automatizzati consentono agli animali di eseguire un gran numero di partecipanti per lunghi periodi di tempo senza richiedere un intenso coinvolgimento dei ricercatori. Inoltre, i sistemi che consentono il tracciamento delle zampe e il punteggio automatico dei risultati riducono il tempo dedicato al ricercatore nell'analisi dei dati.

Abbiamo sviluppato un sistema automatizzato di raccolta dei ratti con diverse caratteristiche specializzate. In primo luogo, utilizzando un piedistallo mobile per portare il pellet in "posizione di raggiungimento" dal basso, otteniamo una vista quasi libera dell'arto anteriore. In secondo luogo, un sistema di specchi consente più viste simultanee della portata con una singola telecamera, consentendo la ricostruzione tridimensionale (3D) delle traiettorie di velocità utilizzando una telecamera ad alta risoluzione ad alta velocità (300 fps). Con il recente sviluppo di robusti algoritmi di apprendimento automatico per il tracciamento del movimento senza marcatori13, ora tracciamo non solo la zampa ma le singole nocche per estrarre la portata dettagliata e afferrare la cinematica. In terzo luogo, un frame-grabber che esegue l'elaborazione video semplice consente l'identificazione in tempo reale di fasi di raggiungimento distinte. Queste informazioni vengono utilizzate per attivare l'acquisizione video (l'acquisizione video continua non è pratica a causa delle dimensioni del file), e possono anche essere utilizzate per attivare interventi (ad esempio, optogenetica) in momenti precisi. Infine, i singoli fotogrammi video sono attivati da impulsi di logica a transistor-transistor (TTL), che consentono al video di essere sincronizzato con precisione con le registrazioni neurali (ad esempio, elettrofisiologia o fotometria). Qui, descriviamo come costruire questo sistema, addestrare i ratti per eseguire il compito, sincronizzare l'apparato con sistemi esterni e ricostruire le traiettorie di portata 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tutti i metodi che coinvolgono l'uso di animali descritti qui sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Michigan.

1. Creazione della camera di

NOT: Vedere Ellens et al.14 per i dettagli e i diagrammi dell'apparato. I numeri di parte si riferiscono alla figura 1.

  1. Legare pannelli in policarbonato chiaro con cemento acrilico per costruire la camera di raggiungimento (15 cm di larghezza per 40 cm di lunghezza per 40 cm di altezza) (parte #1). Un pannello laterale (parte #2) ha una porta incernierata (18 cm di larghezza per 15 cm di altezza) con una serratura. Se il ratto sarà legato ad un cavo, tagliare una vetrata (5 cm di larghezza per 36 cm di lunghezza) nel soffitto della camera per ospitarlo (parte #12). Il pannello del pavimento ha 18 fori (1,75 cm di diametro) (parte #13) tagliati in esso e non è legato al resto della camera.
  2. Montare e allineare i sensori a infrarossi (parte #3) nei pannelli laterali 4,5 cm dal retro della camera e 3,8 cm dal pavimento. Il software comportamentale ha un indicatore ('IR Back') che è verde quando il fascio infrarosso è ininterrotto e rosso quando il fascio è rotto. Una volta configurato il software, questo può essere utilizzato per controllare l'allineamento del sensore.
  3. Montare uno specchio (15 cm x 5 cm, parte #4) 10 cm sopra la fessura raggiungente (parte #14). Angolare lo specchio in modo che l'asta di consegna del pellet sia visibile alla fotocamera.
  4. Posizionare la camera su una scatola di supporto disinfettante (59 cm di larghezza per 67,3 cm di lunghezza per 30,5 cm di altezza, parte #5). La camera poggia sopra un foro nella scatola di supporto (12 cm di larghezza per 25 cm di lunghezza) che permette alla lettiera di cadere attraverso i fori del pavimento (parte #13) e fuori dalla camera di raggiungendo. Tagliare un secondo foro (7 cm di larghezza per 6 cm di lunghezza, parte #15) nella scatola di supporto di fronte alla fessura di copertura, che consente una canna di consegna pellet per portare pellet alla fessura di raggiungimento.
  5. Montare due specchi (8,5 cm di larghezza x 18,5 cm di altezza, parte #6) sul pavimento con magneti su entrambi i lati della camera in modo che il bordo lungo dello specchio tocchi il pannello laterale di 3 cm dalla parte anteriore della scatola di arrivo. Angolare gli specchi in modo che la fotocamera possa vedere nella scatola e nell'area di fronte alla fessura di raggiungimento in cui verrà consegnato il pellet.
  6. Montare la telecamera ad alta definizione (parte #7) a 17 cm dalla fessura di arrivo, di fronte alla scatola.
  7. Montare la carta nera (parte #18) su entrambi i lati della fotocamera in modo che lo sfondo degli specchietti laterali sia scuro. Ciò migliora il contrasto per migliorare il rilevamento delle zampe in tempo reale e off-line.
  8. Montare l'attuatore lineare (parte #16) su un telaio disinfettante (25 cm di larghezza per 55 cm di lunghezza per 24 cm di altezza, parte #8) con viti. L'attuatore è montato a testa in giù per evitare che la polvere di pellet si accumuli all'interno del suo potentemetro di rilevamento della posizione.
  9. Inserire un o-ring di schiuma nel collo del serbatoio di pellet (funnel) (parte #9) per evitare che la polvere si accumuli nell'assieme. Montare l'imbuto sotto un foro (diametro di 6 cm, parte #17) nella parte superiore del telaio scivolando i bordi dell'imbuto sopra tre viti perforate nella parte inferiore della parte superiore del telaio. Inserire il tubo guida (parte #10) nel collo dell'imbuto.
  10. Fissare il connettore T in plastica all'estremità dell'asta d'acciaio dell'attuatore. Inserire l'estremità affidata dell'asta di consegna del pellet nella parte superiore del connettore e l'estremità a pallottola attraverso il tubo guida nel serbatoio del pellet.
  11. Posizionare l'assemblaggio lineare dell'attuatore sotto l'abile camera di raggiungimento in modo che l'asta di consegna del pellet possa estendersi attraverso il foro (parte #15) davanti alla fessura di raggiungimento.
  12. Posizionare l'intero apparato di apalto in un mobile a ruote (121 cm x 119 cm x 50 cm) ventilato con ventilatori per computer (l'interno si riscalda quando è ben illuminato) e rivestito con schiuma acustica.
  13. Costruisci cinque pannelli luminosi (parte #11) aderendo strisce luminose a LED su pannelli di supporto da 20,3 cm da 25,4 cm. Montare pellicola diffusore sopra le strisce luminose. Montare un pannello luminoso sul soffitto sopra l'area dell'asta di consegna del pellet. Montare gli altri quattro ai lati degli armadi lungo la camera di raggiungendo.
    NOTA: È importante illuminare l'area intorno alla fessura di portata e all'asta di consegna del pellet per l'identificazione delle zampe in tempo reale.

2. Configurazione del computer e dell'hardware

  1. Installare le schede di acquisizione telaio FPGA e le schede di estensione digitale in base alle istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
    NOTA: si consiglia di utilizzare almeno 16 GB di RAM e un disco rigido interno a stato solido per l'archiviazione dei dati, poiché lo streaming del video ad alta velocità richiede una notevole capacità di buffering.
  2. Installare i driver per la fotocamera ad alta definizione e collegarlo al framegrabber FPGA. Il software comportamentale deve essere in esecuzione e interfacciarsi con la fotocamera per utilizzare il software associato alla fotocamera.
    NOTA: il codice incluso (vedere i file supplementari) accede ai registri programmabili nella fotocamera e potrebbe non essere compatibile con altre marche. Si consiglia di registrare almeno 300 fotogrammi al secondo (fps); a 150 fps abbiamo scoperto che i cambiamenti chiave nella postura della zampa erano spesso mancati.
  3. Copiare il codice incluso (progetto) in "SR Automation_dig_ext_card_64bit" nel computer.

3. Formazione comportamentale

  1. Preparare i ratti prima dell'allenamento.
    1. Torati di Casa Long-Evans (maschio o femmina, di età compresa tra 10 e 20 settimane) in gruppi di 2-3 per gabbia su un ciclo di luce/buio inverso. Tre giorni prima dell'allenamento, mettere i ratti sulla restrizione alimentare per mantenere il peso corporeo 10–20% al di sotto della linea di base.
    2. Maneggiare i ratti per diversi minuti al giorno per almeno 5 giorni. Dopo la manipolazione, mettere 4-5 pellet di zucchero per ratto in ogni gabbia di casa per introdurre il nuovo cibo.
  2. Abituare il ratto alla camera di perquisire (1-3 giorni)
    1. Accendere le luci a LED e posizionare 3 pellet di zucchero nella parte anteriore e posteriore della camera.
    2. Posizionare il ratto nella camera e lasciare che il ratto di esplorare per 15 min. Monitor se mangia i pellet. Ripetere questa fase fino a quando il ratto mangia tutti i pellet fuori dal pavimento.
    3. Pulire la camera con etanolo tra i topi.
      NOTA: eseguire l'allenamento e il test durante la fase oscura. Addestrare ratti allo stesso tempo ogni giorno.
  3. Addestrare il ratto a raggiungere e osservare la preferenza zampa (1-3 giorni).
    1. Accendere le luci e posizionare il topo nella camera di raggiungendo abile.
    2. Utilizzando le pinze, tenere premuto un pellet attraverso lo slot di raggiungimento nella parte anteriore della scatola (Figura 1, Figura 2). Lasciare che il topo mangi 3 pellet dalle pinze.
    3. La prossima volta che il ratto cerca di mangiare il pellet dalle pinze, tira indietro il pellet. Alla fine, il ratto tenterà di raggiungere il pellet con la zampa.
    4. Ripetere questa operazione 11 volte. La zampa che il ratto utilizza di più degli 11 tentativi è la "preferenza della zampa" del ratto.
      NOTA: un tentativo è definito come la zampa che raggiunge oltre lo slot di raggiungimento. Il ratto non ha bisogno di ottenere con successo e mangiare il pellet.
  4. Allenare il ratto a raggiungere l'asta di consegna del pellet (1-3 giorni)
    1. Allineare l'asta di consegna del pellet con il lato della fessura di raggiungimento contralaterale alla zampa preferita del ratto (utilizzare una guida per garantire un posizionamento coerente a 1,5 cm dalla parte anteriore della camera di raggiungendo). La parte superiore dell'asta di consegna deve essere allineata con la parte inferiore dello slot di raggiungimento (Figura 2B). Posizionare un pellet sull'asta di consegna.
      NOTA: Posizionare l'asta di consegna di fronte alla zampa preferita del ratto rende difficile per il ratto ottenere il pellet con la zampa non preferita. Non abbiamo avuto problemi con i ratti che usano la loro zampa non preferita. Tuttavia, in alcuni modelli (ad esempio, ictus) questo può ancora verificarsi e può essere aggiunto un vincolo sull'arto di raggiungendo non preferito.
    2. Esca il ratto con un pellet tenuto con pinze, ma dirigere il ratto verso l'asta di consegna in modo che la zampa colpisce il pellet sulla canna. Se il topo butta il pellet dalla canna, sostituirlo. Alcuni ratti potrebbero inizialmente raggiungere abbastanza lontano. In questo caso, spostare l'asta di consegna del pellet più vicino alla fessura di raggiungimento e quindi allontanarlo lentamente più lontano man mano che il ratto migliora.
    3. Dopo circa 5-15 esca raggiunge il ratto inizierà a raggiungere per il pellet sulla canna di consegna spontaneamente. Una volta che il ratto ha tentato 10 raggiunge l'asta di consegna senza essere esca, può avanzare alla fase successiva.
  5. Addestrare il ratto per richiedere un pellet (2-8 giorni).
    NOTA: Anche se abbiamo avuto 100% successo ratti di formazione per raggiungere per pellet, circa il 10% dei ratti non riescono a imparare a richiedere un pellet spostandosi nella parte posteriore della camera.
    1. Posizionare l'asta di consegna del pellet in base alla preferenza di zampa del ratto e impostarla sulla posizione 2 (Figura2A). Impostare le posizioni di altezza dell'asta di consegna del pellet utilizzando il telecomando dell'attuatore. Tenendo premuti i pulsanti 1 e 2 si muove contemporaneamente l'asta di consegna, mentre tenendo premuti i pulsanti 3 e 2 si sposta l'asta di consegna verso il basso. Quando l'asta di consegna è all'altezza corretta, tenere premuto il numero desiderato fino a quando la luce lampeggia in rosso per impostare.
    2. Mettere il ratto nella camera e esca il ratto alla parte posteriore con un pellet. Quando il ratto si muove abbastanza lontano sul retro della camera da rompere il fascio infrarosso se la versione automatizzata fosse in esecuzione, spostare l'asta di consegna del pellet nella posizione 3 (Figura 2B).
    3. Attendere che il ratto raggiunga il pellet e quindi spostare nuovamente l'asta di consegna del pellet nella posizione 2 (Figura 2A). Posizionare un nuovo pellet sull'asta di consegna se è stato buttato fuori.
    4. Ripetere questi passaggi, esca gradualmente il topo sempre meno, fino a quando il ratto inizia a: (i) spostare verso la parte posteriore per richiedere un pellet senza essere esca, e (ii) immediatamente spostare alla parte anteriore dopo aver richiesto un pellet nella parte posteriore. Una volta che il ratto ha fatto questo 10 volte, è pronto per l'allenamento sul compito automatizzato.

4. Formazione dei ratti utilizzando il sistema automatizzato

  1. Impostare il sistema automatizzato.
    1. Accendere le luci nella camera e riempire il serbatoio di pellet, se necessario.
    2. Posizionare l'asta di consegna del pellet in base alla preferenza di zampa del ratto. Verificare che le posizioni dell'attuatore siano impostate correttamente (come nella Figura 2A).
    3. Accendere il computer e aprire il programma Skilled Reaching (SR_dig_extension_card_64bit_(HOST)_3.vi). Immettere il numero ID ratto in Oggetto e selezionare la preferenza di zampa dal menu a discesa Mano. Specificare il percorso di salvataggio per i video.
    4. Imposta il tempo della sessione e il numero massimo di video (numero di video a cui terminare la sessione). L'esecuzione del programma verrà interrotta a qualsiasi limite venga raggiunto per primo.
    5. Impostare Pellet Lift Duration (durata del tempo in cui l'asta di consegna rimane in posizione "3" dopo che il ratto richiede un pellet). Attivare o disattivare la penalità di copertura anticipata (l'asta di consegna viene reimpostata nella posizione "1" e quindi di nuovo su "2" se il ratto raggiunge prima di richiedere un pellet).
  2. Prendere immagini di calibrazione. La ricostruzione della traiettoria 3D utilizza una casella degli strumenti di visione artificiale per determinare le matrici di trasformazione appropriate, che richiede l'identificazione dei punti corrispondenti in ogni vista. A tale scopo, utilizzare un cubo piccolo con motivi a scacchiera su ciascun lato (Figura 3).
    1. Posizionare la mano all'interno della camera di raggiungimento e colpire la clip di alligatore attraverso lo slot di raggiungimento. Tenere il cubo davanti alla fessura di raggiungimento con la clip di alligatore.
    2. Posizionare il cubo in modo che il lato rosso venga visualizzato nello specchio superiore, il lato verde nello specchio sinistro e il lato blu nello specchio destro. L'intera faccia di ciascuno dei tre lati dovrebbe essere visibile negli specchi (Figura 3).
    3. Nel programma comportamentale, assicurarsi che Soglia ROI sia impostato su un valore molto grande (ad esempio, 60000). Fare clic sul pulsante Esegui (freccia bianca). Quando il pulsante Inizializzato dalla fotocamera diventa verde, premere START. Si noti che il video viene acquisito.
    4. Fare clic su Modalità Cal. Quindi, scattare un'immagine facendo clic su Prendi immagine Cal. Il percorso della directory dell'immagine verrà ora visualizzato in ".png path" con il nome file .png formattato come "GridCalibration_YYYYMMDD_img'.png".
    5. Spostare leggermente il cubo e scattare un'altra immagine. Ripetere l'operazione per un totale di 3 immagini.
    6. Arrestare il programma facendo clic su STOP e quindi sul pulsante di arresto del segnale. Togliere la mano e il cubo dalla scatola.
    7. Fare attenzione a non urtare nulla nella camera comportamentale dopo che le immagini di calibrazione sono state scattate quel giorno. Se qualcosa si muove, è necessario prendere nuove immagini di calibrazione.
  3. Eseguire il sistema automatizzato.
    NOTA: determinare le impostazioni "Soglia ROI" (descritte di seguito) per ogni mirror prima di eseguire i ratti per l'acquisizione effettiva dei dati. Una volta determinate queste impostazioni, preimpostarle prima di iniziare il programma e regolarle durante l'acquisizione, se necessario.
    1. Posizionare il ratto nella camera di raggiungendo abile. Fare clic sulla freccia bianca per eseguire il programma.
    2. Prima di fare clic su START, impostare la posizione del ROI per il rilevamento delle zampe regolando x-Offset (coordinata x dell'angolo superiore sinistro del rettangolo ROI), y-Offset (coordinata y dell'angolo superiore sinistro del ROI), Larghezza ROI e Altezza ROI.
    3. Posizionare il ROI nello specchio laterale che mostra il dondo della zampa, direttamente davanti allo slot di raggiungimento (Figura 2C). Assicurarsi che l'asta di consegna del pellet non entri nel ROI e che il ROI non si estenda nella scatola per evitare che il pellet o la pelliccia del ratto inneschi un video quando il ratto non raggiunge.
    4. Fare clic su START per avviare il programma.
    5. Regolate il valore "Soglia ROI bassa" fino a quando il "Valore di attivazione del ROI dal vivo" non oscilla tra "0" e "1" (quando il ratto non raggiunge). Questo valore è il numero di pixel all'interno del ROI con valori di intensità nell'intervallo di soglia.
    6. Impostare la soglia ROI. Osservare il valore di trigger LIVE ROI quando il ratto ficca il naso nel ROI e quando il ratto raggiunge il pellet. Impostare la soglia del ROI in modo che sia significativamente maggiore del "Valore di attivazione del ROI vivo" durante i colpi del naso e inferiore al "Valore di attivazione del ROI dal vivo" quando il ratto raggiunge. Regolare fino a quando i video vengono attivati costantemente quando il ratto raggiunge, ma non quando colpisce il naso attraverso lo slot
      NOTA: Questo presuppone che la zampa sia di colore più chiaro del naso; le regolazioni sarebbero invertite se la zampa è più scura del naso.
    7. Monitorare le prime prove per assicurarsi che tutto funzioni correttamente. Quando un ratto raggiunge prima di richiedere un pellet (asta di consegna in posizione "2"), aumenta il numero "Early Reaches". Quando un ratto raggiunge dopo aver richiesto un pellet (asta di consegna nella posizione "3"), il numero "Video" aumenta e un video viene salvato come file .bin con il nome "RXXXX_YYYYMMDD_HH_MM_SS_trial".
      NOTA: l'impostazione predefinita prevede che i video contengano 300 fotogrammi (ad esempio, 1 s) prima e 1000 fotogrammi dopo l'evento trigger (questo è configurabile nel software), che è abbastanza lungo da contenere l'intero movimento reach-to-grasp inclusa la retrazione della zampa.
    8. Una volta raggiunto il tempo di sessione o il numero massimo di video, il programma si arresta. Premere il pulsante del segnale di stop.
    9. Pulire la camera con etanolo e ripetere con un altro ratto, o se fatto per il giorno procedere alla conversione di video.
  4. Convertire i file .bin in file .avi.
    NOTA: la compressione dei video durante l'acquisizione causa il caduto dei frame, quindi i file binari vengono trasmessi su disco durante l'acquisizione (utilizzare un'unità a stato solido a causa delle elevate velocità di trasferimento dei dati). Questi file binari devono essere compressi off-line o i requisiti di archiviazione sono proibitivi.
    1. Aprire il programma "bin2avi-color_1473R_noEncode.vi".
    2. In "Controllo percorso file" fare clic sul pulsante della cartella per selezionare la sessione (ad esempio, R0235_20180119a) che si desidera convertire. Ripetere l'operazione per ogni sessione (fino a sei).
    3. Fare clic sulla freccia bianca (esegui) e quindi su "START" per iniziare. È possibile monitorare la compressione video in "Progresso generale (%)" bar. Lasciare che il programma si esaurisa durante la notte.
    4. Prima di iniziare ad addestrare gli animali il giorno successivo, verifica che i video siano stati convertiti ed elimina i file .bin in modo che ci sia spazio sufficiente per acquisire nuovi video.

5. Analisi dei video con DeepLabCut

NOTA: vengono addestrate reti diverse per ogni preferenza di zampa (zampa destra e zampa sinistra) e per ogni vista (vista diretta e vista speculare sinistra per i ratti zampa destra, vista diretta e vista speculare destra per i ratti zampa sinistra). La vista speculare superiore non viene utilizzata per la ricostruzione 3D, solo per rilevare quando il naso entra nello slot, che può essere utile per innescare interventi (ad esempio, optogenetica). Ogni rete viene quindi utilizzata per analizzare un set di video ritagliati per la zampa e la vista corrispondenti.

  1. Formare le reti DeepLabCut (istruzioni dettagliate sono fornite nella documentazione di DeepLabCut su https://github.com/AlexEMG/DeepLabCut).
    1. Creare e configurare un nuovo progetto in DeepLabCut, un algoritmo di apprendimento automatico per la stima della posa senza marcatori13.
    2. Utilizzare il programma per estrarre i fotogrammi dai video di raggiungere e ritagliare le immagini alla vista da includere (vista diretta o speculare) nell'interfaccia del programma. Ritagliare i telai abbastanza grandi in modo che il ratto ed entrambe le zampe anteriori siano visibili.
      NOTA: le reti in genere richiedono 100-150 frame di allenamento. Sono necessari più telai di allenamento quando la zampa è all'interno rispetto all'esterno della camera a causa dell'illuminazione. Il ritaglio più stretto riduce il tempo di elaborazione, ma fai attenzione che le regioni ritagliate siano abbastanza grandi da rilevare la traiettoria completa della zampa per ogni ratto. Dovrebbe essere abbastanza largo per l'intero corpo del ratto per adattarsi nel telaio (vista diretta), e per vedere il più lontano possibile nella camera e di fronte all'asta di consegna (vista a specchio).
    3. Utilizzare la GUI del programma per etichettare le parti del corpo. Etichetta 16 punti in ogni fotogramma: 4 giunti metacarpophalangeal (MCP), 4 giunti interfalangeal (PIP) propizia, punte a 4 cifre, il dorsum della zampa di raggiunge, il naso, il dorsum della zampa non portante e il pellet (Figura 4).
    4. Seguire le istruzioni DeepLabCut (abbreviato come DLC d'ora in poi) per creare il set di dati di training, eseguire il training della rete e valutare la rete addestrata.
  2. Analizzare i video e perfezionare la rete.
    1. Prima di analizzare tutti i video con una rete appena addestrata, analizza 10 video per valutare le prestazioni della rete. Se sono presenti errori coerenti in determinate pose, estrarre i frame di allenamento aggiuntivi contenenti tali pose e riqualificare la rete.
    2. Quando si analizzano i video, assicurarsi di output di file .csv, che verranno inseriti nel codice per la ricostruzione della traiettoria 3D.

6. Calibrazione della scatola

NOTA: queste istruzioni vengono utilizzate per determinare le matrici di trasformazione per convertire i punti identificati nelle viste diretta e speculare in coordinate 3D. Per la versione più aggiornata e ulteriori dettagli su come utilizzare il pacchetto boxCalibration, vedere il Leventhal Lab GitHub: https://github.com/LeventhalLab/boxCalibration, che include istruzioni dettagliate per il loro utilizzo.

  1. Raccogliere tutte le immagini di calibrazione nella stessa cartella.
  2. Utilizzando ImageJ/Fiji, contrassegnare manualmente i punti della scacchiera per ogni immagine di calibrazione. Salvare l'immagine come "GridCalibration_YYYYMMDD_'.tif" dove 'AAAAMMGG' corrisponde alla data a cui l'immagine di calibrazione corrisponde e ''' è il numero dell'immagine per tale data.
    1. Utilizzare la funzione di misurazione in ImageJ (nella barra degli strumenti, selezionare Analizza Misura). Verrà visualizzata una tabella contenente le coordinate per tutti i punti contrassegnati. Salvare il file con il nome "GridCalibration_YYYYMMDd_'.csv", dove il numero di data e di immagine sono gli stessi del file tif corrispondente.
  3. Dal pacchetto boxCalibration aprire il file 'setParams.m'. Questo file contiene tutte le variabili necessarie e la relativa descrizione. Modificare le variabili in base alle esigenze per adattarle alle specifiche del progetto.
  4. Eseguire la funzione calibrateBoxes. Nella finestra di comando verranno visualizzati diversi prompt. Il primo prompt chiede se analizzare tutte le immagini nella cartella. Digitando Y i prompt verranno ripersi i prompt e verranno analizzate tutte le immagini per tutte le date. Digitando N verrà richiesto all'utente di immettere le date da analizzare.
    NOTA: nella cartella delle immagini di calibrazione verranno create due nuove directory: 'markedImages' contiene file .png con i segni a scacchiera definiti dall'utente sull'immagine di calibrazione. La cartella 'boxCalibration' contiene file .mat con i parametri di calibrazione della casella.
  5. Eseguire la funzione checkBoxCalibration. Verrà creata una nuova cartella, 'checkCalibration' nella cartella 'boxCalibration'. Ogni data avrà una sottocartella contenente le immagini e diversi file .fig, che vengono utilizzati per verificare che la calibrazione della scatola è stata completata con precisione.

7. Ricostruzione delle traiettorie 3D

  1. Assemblare i file .csv contenenti l'output del programma di apprendimento nella struttura di directory descritta nello script reconstruct3Dtrajectories.
  2. Eseguire reconstruct3Dtrajectories. Questo script cercherà la struttura della directory e corrisponderà ai punti diretti/mirror in base ai loro nomi nel programma di pendente (è importante utilizzare gli stessi nomi di parti del corpo in entrambe le viste).
  3. Eseguire calculateKinematics. Questo script estrae semplici caratteristiche cinematiche dalle ricostruzioni della traiettoria 3D, che possono essere adattate alle esigenze specifiche.
    NOTA: Il software stima la posizione delle parti del corpo occluse in base ai loro vicini e alla loro posizione nella vista complementare (ad esempio, la posizione di una parte del corpo nella vista diretta della telecamera vincola le sue possibili posizioni nella vista speculare). Per i casi in cui la zampa è occlusa nella vista speculare mentre passa attraverso lo slot, le coordinate della zampa vengono interpolate in base ai fotogrammi adiacenti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I ratti acquisiscono rapidamente il compito di raggiungere una volta che si è avvicinato all'apparato, con un plateauing delle prestazioni in termini di entrambi i numeri di raggiungono e precisione nell'arco di 1-2 settimane (Figura 5). Figura 6 Mostra fotogrammi video di esempio che indicano le strutture identificate da DeepLabCut, e Figura 7 Mostra traiettorie di portata individuali sovrapposte da una singola sessione. Infine, nella Figura 8viene illustrato cosa accade se il trigger di rilevamento delle zampe (passaggi da 4.3.4–4.3.6) non è impostato in modo accurato. C'è una notevole variabilità nel telaio in cui la zampa viola lo slot di raggiungimento. Questo non è un grosso problema in termini di analisi della cinetica di portata. Tuttavia, potrebbe portare a variabilità in quando gli interventi (ad esempio, l'optogenetica) vengono attivati durante il raggiungimento dei movimenti.

Figure 1
Figura 1: L'abile camera di raggiungendo.
In senso orario dall'alto a sinistra sono una vista laterale, una vista dalla parte anteriore e superiore, la cornice in cui è montato l'attuatore (vedere il passaggio 1.8) e una vista dal lato e dall'alto. L'abile camera di fissazione (1) ha una porta (2) tagliata in un lato per consentire ai ratti di essere collocati e portati fuori dalla camera. Una vela viene tagliata nel pannello del soffitto (12) per consentire all'animale di essere legato e i fori vengono tagliati nel pannello del pavimento (13) per consentire alla lettiera di cadere attraverso. Due sensori a infrarossi (3) sono allineati su entrambi i lati della parte posteriore della camera. Uno specchio (4) è montato sopra lo slot di raggiungimento (14) nella parte anteriore della camera di fissazione e altri due specchi (6) sono montati su entrambi i lati della camera di raggiungimento. L'abile raggiungere camera si trova in cima a una scatola di supporto (5). La telecamera ad alta definizione (7) è montata sulla scatola di supporto davanti allo slot di raggiungendo. Due pezzi di carta nera (18) sono montati su entrambi i lati della fotocamera (7) per migliorare il contrasto della zampa negli specchietti laterali (6). Sotto la scatola di supporto c'è un telaio (8) che supporta l'attuatore lineare (16) e il serbatoio del pellet (9). Un tubo guida che racchiude l'asta di consegna del pellet (10) è inserito nel serbatoio del pellet e controllato dall'attuatore lineare. I fori vengono tagliati nel telaio dell'attuatore (17) e nella scatola di supporto (15) sopra il serbatoio del pellet per consentire all'asta di consegna del pellet di muoversi liberamente su e giù. La scatola è illuminata con pannelli luminosi (11) montati sulle pareti e sul soffitto dell'armadio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Struttura di prova singola.
(A) Una prova inizia con l'asta di consegna del pellet (controllata da un attuatore lineare) posizionata nella posizione "pronta" (posizione 2 – intermedia tra il pavimento e la parte inferiore dello slot di raggiungimento). (B) Il ratto si sposta sul retro della camera per rompere il fascio infrarosso (IR), il che fa salire l'asta di consegna del pellet alla posizione 3 (allineata con il fondo dello slot di raggiungimento). (C) Il ratto raggiunge lo slot di raggiungimento per afferrare il pellet. Le ture vengono rilevate in tempo reale utilizzando un framegrabber FPGA che rileva i cambiamenti di intensità dei pixel all'interno di una regione di interesse (ROI) nella vista speculare laterale direttamente davanti allo slot. Quando un numero sufficiente di pixel corrisponde all'"intensità della zampa" definita dall'utente, viene attivata l'acquisizione del video. (D) Due secondi dopo il pellet viene abbassato alla posizione 1, prelevando un nuovo pellet dal serbatoio del pellet prima di tornare alla posizione 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagine di calibrazione di esempio.
Una mano di aiuto è posto all'interno della camera di raggiungimento abile. Una clip di alligatore sfonda lo slot di raggiungimento per tenere il cubo di calibrazione in posizione al di fuori della camera di raggiungimento. I tre motivi a scacchiera sono interamente visibili nella vista diretta e nelle viste speculari corrispondenti (verde: sinistra; rosso: superiore; e blu: destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: posizioni dei marcatori dell'algoritmo di apprendimento.
Colonna sinistra: vista diretta; colonna destra: vista speculare. Marcatori 1–4: giunti MCP; 5-8: giunti PIP; 9–12: punte delle cifre; 13: dorsum di raggiungere la zampa; 14: naso; 15: dodb di zampa non raggiunge. Il marcatore 16 (pellet) non è visibile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: I ratti acquisiscono rapidamente il compito automatizzato di raggiungere.
Frequenza media del successo della prima copertura (verde, asse sinistro) e prova totale media (asse blu, destro) nelle prime 20 sessioni di formazione nell'attività di raggiungimento qualificata automatizzata (n - 19). Ogni sessione di formazione è durata 30 min. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Fotogrammi video di esempio contrassegnati dal programma di apprendimento.
Colonna sinistra: vista speculare; colonna destra: vista diretta. I punti ciano, rosso, giallo e verde contrassegnano rispettivamente le cifre da 1 a 4. Il punto bianco segna il naso, il punto nero segna il pellet. I cerchi riempiti sono stati identificati da DeepLabCut. I cerchi aperti contrassegnano le posizioni degli oggetti stimate in base alla posizione in cui l'oggetto è apparso nella vista opposta. Le X sono punti riproiettati sui fotogrammi video dalle stime delle loro posizioni 3D. Questo video è stato attivato al fotogramma 300, mentre la zampa passava attraverso lo slot. Le immagini superiori sono dal primo fotogramma quando è stata rilevata la zampa di raggiunge. Le immagini inferiori sono dal fotogramma in cui la seconda cifra è stata estesa al massimo. Questi fotogrammi sono stati identificati dal software di elaborazione delle immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Campione di traiettorie 3D da una singola sessione di test.
Entrambi gli assi mostrano gli stessi dati, ma ruotati per facilitare la presentazione. Le linee nere indicano traiettorie medi. Ciano, rosso, giallo e verde sono singole traiettorie delle punte delle cifre da 1 a 4, rispettivamente. Le linee blu indicano la traiettoria del dorsum della zampa. Il grande punto nero indica il pellet di zucchero situato a (0,0,0). Questo rappresenta solo l'avanzamento iniziale della zampa per facilità di presentazione (comprese le ritrazioni e le ritrazioni multiple rende la figura quasi incomprensibile). Tuttavia, tutti i dati cinematici sono disponibili per l'analisi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Istogrammi di numeri di fotogrammi in cui sono state identificate fasi di raggiungimento specifiche per 2 sessioni diverse.
In una sessione (linee continue scure), i valori del trigger ROI sono stati impostati con attenzione e la zampa è stata identificata violando lo slot all'interno degli stessi pochi fotogrammi in ogni prova. Nell'altra sessione (linee luminose tratteggiate), il naso è stato spesso erroneamente identificato come la zampa di copertura, innescando prematuramente l'acquisizione video. Si noti che questo avrebbe poco effetto sulle analisi cinematiche off-line a meno che la piena portata non sia stata catturata. Tuttavia, i potenziali interventi innescati dalla zampa di portata sarebbero scarsamente programmati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Il roditore è diventato uno strumento standard per studiare la fisiologia e la fisiopatologia del sistema motorio. Abbiamo descritto come implementare un ratto automatizzato abile compito di raggiungere che permette: formazione e test con supervisione minima, 3-D zampa e ricostruzione della traiettoria cifra (durante la raggiungimento, presa, e la ritrazione zampa), l'identificazione in tempo reale del zampa durante la raggiungimento e la sincronizzazione con l'elettronica esterna. È adatto per correlare la cinematica dell'anteriore con la fisiologia o per eseguire interventi con tempi preciso durante il raggiungimento dei movimenti.

Dal momento che abbiamo inizialmente segnalato questo design14, la nostra efficienza di formazione è migliorata in modo che quasi 100% dei ratti acquisire il compito. Abbiamo identificato diversi fattori importanti che portano a una formazione costantemente di successo. Come con molti compiti motivati dalla fame, ratti dovrebbero essere attentamente monitorati durante la restrizione calorica per mantenere 80-90% del loro peso corporeo previsto. La manipolazione quotidiana dei ratti, anche prima dell'allenamento, è di fondamentale importanza per acclimatarli agli esseri umani. I ratti devono essere addestrati a raggiungere prima di imparare a tornare sul retro della camera per richiedere pellet, questo riduce notevolmente il tempo di allenamento e aumenta la probabilità che i ratti acquisiscano il compito. Infine, quando vengono trasferiti tra camere apparentemente identiche, i ratti spesso eseguono meno raggiunge. Ciò era particolarmente vero quando le camere sono state utilizzate per la prima volta. Ipotizziamo che ciò sia dovuto alle differenze di profumo tra le camere. Qualunque sia la ragione, è importante mantenere il più stabile un ambiente di allenamento possibile, o acclimatari i ratti a tutte le caselle in cui potrebbero verificarsi i test.

L'apparato qui descritto è facilmente adattabile a specifiche esigenze. Abbiamo descritto una versione ratto del compito, ma abbiamo anche implementato una versione del mouse (anche se è difficile identificare le singole cifre con DeepLabCut nei topi). Poiché i singoli fotogrammi video sono contrassegnati con impulsi TTL, i video possono essere sincronizzati con qualsiasi sistema di registrazione che accetti ingressi digitali o analogici (ad esempio, amplificatori di elettrofisiologia o fotometria). Infine, i topi fissati alla testa eseguono prontamente un'abilità raggiungendo9e una versione fissa alla testa di questo compito potrebbe essere implementata per l'imaging a 2 fotoni o le registrazioni giustapcellulari. È importante sottolineare che abbiamo usato questo sistema solo con i ratti Long-Evans, il cui naso e zampa pelliccia (bianco e nero, rispettivamente) differiscono abbastanza a colori che i poke del naso non sono scambiati per raggiunge (con le impostazioni ROI appropriate, Figura 8). Questo può essere un problema per i ratti con colorazione simile sulle zampe e sul naso (ad esempio, ratti albini), ma potrebbe essere risolto colorando la zampa con inchiostro, smalto o tatuaggi.

La versione presentata di raggiungere qualificato ha diverse caratteristiche distinte, che possono essere vantaggiose a seconda dell'applicazione specifica. L'hardware relativamente complicato e la necessità di elaborazione video in tempo reale lo rendono poco adatto per l'addestramento gabbia domestica6,7. D'altra parte, l'addestramento della gabbia a casa rende difficile l'acquisizione di video ad alta velocità ad alta risoluzione da più angolazioni, o di deformare gli animali per registrazioni/interventi fisiologici. Le schede di acquisizione dati e il requisito per un computer per camera rende ogni camera relativamente costosa, e i video richiedono uno spazio di archiviazione digitale significativo (200 MB per video da 4 s). Abbiamo implementato una versione più semplice basata su microcontroller che costa circa 300 dollari per camera, anche se manca di feedback in tempo reale o la possibilità di sincronizzarsi con dispositivi esterni. Queste scatole sono essenzialmente identiche a quelle qui descritte, ma utilizzano un camcorder commerciale e non richiedono un computer se non per programmare il microcontrollore (i dettagli di questa configurazione e del software associato sono disponibili su richiesta). L'elaborazione video in tempo reale sul frame-grabber FPGA è particolarmente utile; troviamo che identifica più robustamente raggiunge in tempo reale rispetto raggi infrarossi o sensori di prossimità (che possono confondere il muso del ratto per la zampa di raggiungimento). Inoltre, più trigger possono essere utilizzati per identificare la zampa in diverse fasi di raggiungimento (ad esempio, l'approccio allo slot, l'ascensore della zampa, l'estensione attraverso lo slot). Questo non solo permette di riprodurre, perturbazioni neuronali con precisione temporizzato, ma può essere utilizzato per innescare l'archiviazione di brevi video ad alta velocità.

Mentre la nostra versione automatizzata di raggiungere qualificati ha diversi vantaggi per applicazioni specifiche, ha anche alcune limitazioni. Come notato in precedenza, la fotocamera ad alta velocità e ad alta risoluzione è moderatamente costosa, ma è necessaria per includere viste speculari e dirette in una singola immagine e catturare il movimento di raggiungere molto rapidamente. L'utilizzo di una telecamera elimina la necessità di sincronizzare e registrare più flussi video contemporaneamente o di acquistare più telecamere e frame grabr. La zampa nella vista riflessa è effettivamente circa il doppio della distanza dalla fotocamera (per ray-tracing) rispetto alla vista diretta. Ciò significa che una delle visualizzazioni è sempre fuori fuoco, anche se DLC identifica ancora in modo affidabile singole cifre in entrambe le visualizzazioni (Figura 4, Figura 6). Infine, abbiamo usato una fotocamera a colori perché, prima della disponibilità di DLC, abbiamo provato a codificare le cifre con tatuaggi. Mentre è possibile che questo programma basato sull'apprendimento sia ugualmente efficace sul video in bianco e nero (o a bassa risoluzione), possiamo solo verificare l'efficacia dell'hardware descritto qui. Infine, il nostro codice di analisi (diverso da DLC) viene scritto principalmente in un pacchetto software commerciale (vedere Tabella dei materiali), ma dovrebbe essere semplice da adattare ai linguaggi di programmazione open source (ad esempio, Python) in base alle esigenze.

Ci sono diversi modi in cui stiamo lavorando per migliorare questo sistema. Attualmente, la vista speculare è parzialmente occlusa dal pannello frontale. Abbiamo quindi esplorato modi per ottenere più visualizzazioni simultanee della zampa riducendo al minimo gli ostacoli. Un altro importante sviluppo sarà quello di segnare automaticamente i raggiunge (il sistema può monitorare la cinematica, ma un essere umano deve ancora segnare successo contro raggiunto fallito). Sono stati sviluppati metodi per determinare se i pellet sono stati buttati dallo scaffale/piedistallo, ma non sono in grado di determinare se il pellet è stato afferrato o perso del tutto11. Monitorando il pellet con DLC, stiamo esplorando algoritmi per determinare il numero di traslochi per trial, così come se il pellet è stato afferrato, buttato fuori dal piedistallo o perso del tutto. Lungo queste linee, stiamo anche lavorando per automatizzare completamente il flusso di lavoro dalla raccolta dei dati attraverso la conversione video, l'elaborazione DLC e il punteggio automatico. In definitiva, immaginiamo un sistema in cui più esperimenti possono essere eseguiti in un giorno, e la mattina successiva sono state determinate la cinetica completa degli arti anteriori e il raggiungimento dei punteggi per ogni esperimento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Karunesh Ganguly e il suo laboratorio per consigli sul compito di raggiungere, e Alexander e Mackenzie Mathis per il loro aiuto nell'adattamento di DeepLabCut. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disease and Stroke (numero di sovvenzione K08-NS072183) e dall'Università del Michigan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
clear polycarbonate panels TAP Plastics cut to order (see box design)
infrared source/detector Med Associates ENV-253SD 30" range
camera Basler acA2000-340kc 2046 x 1086 CMV2000 340 fps Color Camera Link
camera lens Megapixel (computar) M0814-MP2 2/3" 8mm f1.4 w/ locking Iris & Focus
camera cables Basler #2000031083 Cable PoCL Camera Link SDR/MDR Full, 5 m - Data Cables
mirrors Amazon
linear actuator Concentrics LACT6P Linear Actuator 6" Stroke (nominal), 110 Lb Force, 12 VDC, with Potentiometer
pellet reservoir/funnel Amico (Amazon) a12073000ux0890 6" funnel
guide tube ePlastics ACREXT.500X.250 1/2" OD x 1/4" ID Clear. Extruded Plexiglass Acrylic Tube x 6ft long
pellet delivery rod ePlastics ACRCAR.250 0.250" DIA. Cast Acrylic Rod (2' length)
plastic T connector United States Plastic Corp #62065 3/8" x 3/8" x 3/8" Hose ID Black HDPE Tee
LED lights Lighting EVER 4100066-DW-F 12V Flexible Waterproof LED Light Strip, LED Tape, Daylight White, Super Bright 300 Units 5050 LEDS, 16.4Ft 5 M Spool
Light backing ePlastics ACTLNAT0.125X12X36 0.125" x 12" x 36" Natural Acetal Sheet
Light diffuser films inventables 23114-01 .007x8.5x11", matte two sides
cabinet and custom frame materials various (Home Depot, etc.) 3/4" fiber board (see protocol for dimensions of each structure)
acoustic foam Acoustic First FireFlex Wedge Acoustical Foam (2" Thick)
ventilation fans Cooler Master (Amazon) B002R9RBO0 Rifle Bearing 80mm Silent Cooling Fan for Computer Cases and CPU Coolers
cabinet door hinges Everbilt (Home Depot #14609 continuous steel hinge (1.4" x 48")
cabinet wheels Everbilt (Home Depot #49509 Soft rubber swivel plate caster with 90 lb. load rating and side brake
cabinet door handle Everbilt (Home Depot #15094 White light duty door pull (4.5")
computer Hewlett Packard Z620 HP Z620 Desktop Workstation
Camera Link Frame Grabber National Instruments #781585-01 PCIe-1473 Virtex-5 LX50 Camera Link - Full
Multifunction RIO Board National Instruments #781100-01 PCIe-17841R
Analog RIO Board Cable National Instruments SCH68M-68F-RMIO Multifunction Cable
Digital RIO Board Cable National Instruments #191667-01 SHC68-68-RDIO Digital Cable for R Series
Analog Terminal Block National Instruments #782536-01 SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
Digital Terminal Block National Instruments #782536-01 SCB-68A Noise Rejecting, Shielded I/O Connector Block
24 position relay rack Measurement Computing Corp. SSR-RACK24 Solid state relay backplane (Gordos/OPTO-22 type relays), 24-channel
DC switch Measurement Computing Corp. SSR-ODC-05 Solid state relay module, single, DC switch, 3 to 60 VDC @ 3.5 A
DC Sense Measurement Computing Corp. SSR-IDC-05 solid state relay module, single, DC sense, 3 to 32 VDC
DC Power Supply BK Precision 1671A Triple-Output 30V, 5A Digital Display DC Power Supply
sugar pellets Bio Serv F0023 Dustless Precision Pellets, 45 mg, Sucrose (Unflavored)
LabVIEW National Instruments LabVIEW 2014 SP1, 64 and 32-bit versions 64-bit LabVIEW is required to access enough memory to stream videos, but FPGA coding must be performed in 32-bit LabVIEW
MATLAB Mathworks Matlab R2019a box calibration and trajectory reconstruction software is written in Matlab and requires the Computer Vision toolbox

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, J., et al. An automated behavioral apparatus to combine parameterized reaching and grasping movements in 3D space. Journal of Neuroscience Methods. (2018).
  2. Sacrey, L. A. R. A., Alaverdashvili, M., Whishaw, I. Q. Similar hand shaping in reaching-for-food (skilled reaching) in rats and humans provides evidence of homology in release, collection, and manipulation movements. Behavioural Brain Research. 204, 153-161 (2009).
  3. Whishaw, I. Q., Kolb, B. Decortication abolishes place but not cue learning in rats. Behavioural Brain Research. 11, 123-134 (1984).
  4. Klein, A., Dunnett, S. B. Analysis of Skilled Forelimb Movement in Rats: The Single Pellet Reaching Test and Staircase Test. Current Protocols in Neuroscience. 58, 8.28.1-8.28.15 (2012).
  5. Whishaw, I. Q., Pellis, S. M. The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a proximally driven movement with a single distal rotatory component. Behavioural Brain Research. 41, 49-59 (1990).
  6. Zeiler, S. R., et al. Medial premotor cortex shows a reduction in inhibitory markers and mediates recovery in a mouse model of focal stroke. Stroke. 44, 483-489 (2013).
  7. Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavioural Brain Research. 281, 137-148 (2015).
  8. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. (2014).
  9. Guo, J. Z. Z., et al. Cortex commands the performance of skilled movement. Elife. 4, e10774 (2015).
  10. Nica, I., Deprez, M., Nuttin, B., Aerts, J. M. Automated Assessment of Endpoint and Kinematic Features of Skilled Reaching in Rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 255 (2017).
  11. Wong, C. C., Ramanathan, D. S., Gulati, T., Won, S. J., Ganguly, K. An automated behavioral box to assess forelimb function in rats. Journal of Neuroscience Methods. 246, 30-37 (2015).
  12. Torres-Espín, A., Forero, J., Schmidt, E. K. A., Fouad, K., Fenrich, K. K. A motorized pellet dispenser to deliver high intensity training of the single pellet reaching and grasping task in rats. Behavioural Brain Research. 336, 67-76 (2018).
  13. Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 21, 1281-1289 (2018).
  14. Ellens, D. J., et al. An automated rat single pellet reaching system with high-speed video capture. Journal of Neuroscience Methods. 271, 119-127 (2016).
Acquisto automatico di ratti a pellet con ricostruzione tridimensionale delle traiettorie di paw e cifre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bova, A., Kernodle, K., Mulligan, K., Leventhal, D. Automated Rat Single-Pellet Reaching with 3-Dimensional Reconstruction of Paw and Digit Trajectories. J. Vis. Exp. (149), e59979, doi:10.3791/59979 (2019).More

Bova, A., Kernodle, K., Mulligan, K., Leventhal, D. Automated Rat Single-Pellet Reaching with 3-Dimensional Reconstruction of Paw and Digit Trajectories. J. Vis. Exp. (149), e59979, doi:10.3791/59979 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter