Summary
Di seguito è descritta una procedura operativa standard semplificata per la profilazione del microbioma che utilizza il sequenziamento e l'analisi metagenomica del rRNA 16S utilizzando strumenti liberamente disponibili. Questo protocollo aiuterà i ricercatori che non hanno familiarità con il campo del microbioma e quelli che richiedono aggiornamenti sui metodi per ottenere una profilazione batterica a una risoluzione più elevata.
Abstract
L'intestino umano è colonizzato da trilioni di batteri che supportano le funzioni fisiologiche come il metabolismo alimentare, la raccolta di energia e la regolazione del sistema immunitario. È stato suggerito che la perturbazione del microbioma intestinale sano svolga un ruolo nello sviluppo di malattie infiammatorie, compresa la sclerosi multipla (MS). I fattori ambientali e genetici possono influenzare la composizione del microbioma; pertanto, l'identificazione delle comunità microbiche legate a un fenotipo della malattia è diventata il primo passo verso la definizione del ruolo del microbioma nella salute e nella malattia. L'uso del sequenziamento metagenomico di rRNA 16S per la profilazione della comunità batterica ha contribuito a far progredire la ricerca sul microbioma. Nonostante il suo ampio uso, non esiste un protocollo uniforme per l'analisi di profilazione tassonomica basata su rRNA 16S. Un'altra limitazione è la bassa risoluzione dell'assegnazione tassonomica a causa di difficoltà tecniche come letture di sequenziamento più piccole, così come l'uso di letture solo in avanti (R1) in ultima analisi a causa della bassa qualità delle letture inverse (R2). È necessario un metodo semplificato con alta risoluzione per caratterizzare la diversità batterica in una determinata biocampione. I progressi nella tecnologia di sequenziamento con la capacità di sequenziare letture più lunghe ad alta risoluzione hanno contribuito a superare alcune di queste sfide. L'attuale tecnologia di sequenziamento combinata con una pipeline di analisi metagenomica disponibile al pubblico, come l'Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basato su R, ha contribuito a far progredire la profilazione microbica ad alta risoluzione, poiché DADA2 può assegnare la sequenza al genere e i livelli delle specie. Di seguito è descritta una guida per l'esecuzione della profilazione batterica utilizzando l'amplificazione in due fasi della regione V3-V4 del gene rRNA 16S, seguita dall'analisi mediante analisi liberamente disponibili (ad esempio, DADA2, Phyloseq e METAGENassist). Si ritiene che questo flusso di lavoro semplice e completo servirà come un ottimo strumento per i ricercatori interessati a eseguire studi di profilazione del microbioma.
Introduction
Microbiota si riferisce a una raccolta di microrganismi (batteri, virus, archea, batteriofagi e funghi) che vivono in un particolare ambiente, e il microbioma si riferisce al genoma collettivo dei microrganismi residenti. Poiché i batteri sono uno dei microbi più abbondanti negli esseri umani e nei topi, questo studio si concentra solo sulla profilazione batterica. L'intestino umano è colonizzato da trilioni di batteri e centinaia di ceppi batterici1. Il microbiota intestinale normale svolge un ruolo vitale nel mantenere uno stato sano nell'ospite regolando le funzioni (cioè il mantenimento di una barriera intestinale intatta, il metabolismo alimentare, l'omeostasi energetica, l'inibizione della colonizzazione da parte di organismi patogeni, e regolazione delle risposte immunitarie)2,3,4,5. Le perturbazioni compositive del microbiota intestinale (disbiosi intestinale) sono state collegate a una serie di malattie umane, tra cui disturbi gastrointestinali6, obesità7,8, ictus9, cancro10, diabete8,11, artrite reumatoide12, allergie13, e malattie del sistema nervoso centrale come la sclerosi multipla (MS)14,15 e Morbo di Alzheimer malattia (AD)8,16. Pertanto, negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse per gli strumenti per identificare la composizione batterica in diversi siti del corpo. Un metodo affidabile dovrebbe avere caratteristiche come essere ad alto consumo e facile da usare, avere la capacità di classificare microbiota batterico ad alta risoluzione ed essere a basso costo.
Le tecniche microbiologiche basate sulla cultura non sono abbastanza sensibili da identificare e caratterizzare il complesso microbioma intestinale a causa del fallimento di diversi batteri intestinali a crescere in coltura. L'avvento della tecnologia basata sul sequenziamento, in particolare il sequenziamento metagenomico basato su rRNA 16S, ha superato alcune di queste sfide e ha trasformato la ricerca sul microbioma17. La tecnologia avanzata di sequenziamento basata sull'rRNA 16S ha contribuito a stabilire un ruolo fondamentale per il microbioma intestinale nella salute umana. Il Progetto microbioma umano, l'iniziativa18dei National Institutes of Health e il progetto MetaHIT (un'iniziativa europea)19 hanno entrambi contribuito a stabilire un quadro di base per l'analisi del microbioma. Queste iniziative hanno contribuito a dare il via a più studi per determinare il ruolo del microbioma intestinale nella salute umana e nella malattia.
Un certo numero di gruppi hanno mostrato disbiosi intestinale in pazienti con malattie infiammatorie12,14,15,20,21,22. Nonostante sia ampiamente usato per la profilazione tassonomica a causa della capacità di multiplex e dei bassi costi, non esistono protocolli uniformi per la profilazione tassonomica basata su rRNA 16S. Un'altra limitazione è la bassa risoluzione dell'assegnazione tassonomica a causa di letture di sequenziamento più piccole (150 bp o 250 bp) e l'uso di sola lettura di sequenziamento in avanti (R1) a causa di letture di sequenziamento inverso di bassa qualità (R2). Tuttavia, i progressi nella tecnologia di sequenziamento hanno contribuito a superare alcune di queste sfide, come la possibilità di sequenziare letture più lunghe utilizzando letture a coppie (ad esempio, Illumina MiSeq 2x300bp).
L'attuale tecnologia di sequenziamento è in grado di sequenziare letture di buona qualità da 600 bp, che consentono la fusione di letture R1 e R2. Queste letture R1 e R2 più lunghe consentono migliori assegnazioni tassonomiche, in particolare con la piattaforma Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) basata su R ad accesso aperto. DADA2 utilizza assegnazioni basate su variante di sequenza di ampiezza (ASV) anziché assegnazioni operative di unità tassonomiche (OTU) basate sulla somiglianza del 97% utilizzata da QIIME23. Le partite ASV generano una corrispondenza esatta nella sequenza nel database all'interno di 1–2 nucleotidi, il che porta all'assegnazione a livello di genere e specie. Così, la combinazione di letture accoppiate accoppiate più lunghe e di buona qualità e migliori strumenti di assegnazione tassonomica (come DADA2) hanno trasformato gli studi sul microbioma.
Di seguito è fornita una guida passo-passo per eseguire la profilazione batterica utilizzando l'amplificazione in due fasi della regione V3-V4 di rRNA 16S e l'analisi dei dati utilizzando pipeline DADA2, Phyloseq e METAGENassist. Per questo studio, vengono utilizzati topi transgenici di classe II dell'antigene leucocito umano (HLA), poiché alcuni alleli di classe HLA II sono collegati con una predisposizione a malattie autoimmuni come MS20,24,25. Tuttavia, l'importanza dei geni di classe II HLA nella regolazione della composizione del microbiota intestinale è sconosciuta. Si ipotizza che la molecola di classe HLA II influenzerà la comunità microbica intestinale selezionando per batteri specifici. I principali topi da knockout di classe II (MHC) di classe II (AE.KO) o topi che esprimono molecole umane HLA-DQ8 (HLA-DQ8)24,25,26 sono stati utilizzati per comprendere l'importanza delle molecole HLA di classe II plasmare la comunità microbica intestinale. Si ritiene che questo flusso di lavoro completo e semplificato con l'analisi dei dati basata su R servirà come un eccellente strumento per i ricercatori interessati a eseguire studi di profilazione del microbioma.
La generazione di topi privi di geni murini MHC di classe II (AE.KO) e AE-/-. I topi transgenici HLA-DQA1-0103, DQB1-0302 (HLA-DQ8) con sfondo C57BL/6J sono stati descritti in precedenza26. I campioni fecali sono raccolti da topi di entrambi i sessi (8-12 settimane di età). I topi sono stati precedentemente allevati e mantenuti nella struttura animale dell'Università dell'Iowa in base alle linee guida NIH e istituzionali. Le strategie di controllo della contaminazione come lo svebilamento dei topi all'interno di un armadio di flusso laminare, il cambio dei guanti tra diversi ceppi di topi e la corretta manutenzione dei topi sono i passaggi fondamentali per la profilazione del microbioma intestinale.
Durante l'intera procedura sono altamente raccomandati dispositivi di protezione personale (PPE) adeguati. Quando si eseguono l'isolamento del DNA, l'amplificazione PCR1 e PCR2 e i passaggi di sequenziamento, è necessario includere controlli negativi appropriati. Si raccomanda l'uso di forniture sterili, prive di DNase, senza RNase e pirogeni. Per tutto il protocollo è necessario utilizzare il pipettor designato per il lavoro con microbioma e le punte filtrate delle pipette. L'analisi microbiota è costituita da sette fasi: 1) raccolta e lavorazione dei campioni fecali; 2) estrazione del DNA; 3) 16S amplificazione del gene rRNA; 4) costruzione della libreria del DNA mediante PCR indicizzato; 5) pulizia e quantificazione della PCR indicizzata (libreria); 6) Sequenziamento MiSeq; e 7) elaborazione dei dati e analisi delle sequenze. Nella Figura 1viene illustrato un diagramma schematico di tutti i passaggi di protocollo.
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Protocol
Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università dell'Iowa.
1. Raccolta e movimentazione dei campioni fecali
- Sterilizzare le caselle divisorie (vedere Tabella dei materiali, Figura supplementare 1) con 70% di etanolo.
- Tubi di microcentrifuga pre-etichetta (uno per mouse) con l'ID del campione e il gruppo di trattamento (se applicabile).
- Mettere i topi in scatole divisorie sterilizzate e lasciarli defecare normalmente fino a 1 h.
- Raccogliere i pellet fecali in un tubo di microcentrifuga vuoto da 1,5 ml con pinze sterili e chiudere il tubo in modo sicuro. Sterilizzare le pinze dopo aver raccolto da ogni topo.
- Collocare il tubo di microcentrifuga contenente pellet fecali in un congelatore a -80 gradi centigradi fino a un'ulteriore lavorazione.
NOT: I divisori sono vantaggiosi perché consentono la raccolta simultanea di campioni fecali da più topi (fino a 12) contemporaneamente.
2. Estrazione di DNA
- Rimuovere i campioni fecali (topo o umano) dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente (RT).
NOT: Si consiglia di scongelare i campioni di feci umane durante la notte a 4 gradi centigradi, se necessario, per raccogliere 200 mg o la quantità richiesta da campioni di magazzino. - Utilizzare 200 mg di materiali di partenza ed eluire il DNA ad un volume finale di 50 .L.
- Includere un kit di isolamento del DNA vuoto in cui non viene aggiunto alcun campione fecale, ma viene elaborato attraverso tutte le fasi di estrazione del DNA.
NOT: È stato utilizzato uno specifico kit di isolamento del DNA (vedi Tabella dei materiali),in quanto contiene reagenti specifici per rimuovere materiali inibitori come biosolidi, materiale vegetale non digerito e composti ezoi dai globuli rossi lisci presenti nelle feci umane e murine Campioni. - Mettere il tubo di perline in un omogeneizzatore (vedi Tabella dei materiali)e omogeneizzare i campioni per 45 s a RT e una velocità di 4,5 m/s.
NOT: È possibile utilizzare l'omogeneizzatore perline di qualsiasi produttore. Tuttavia, si consiglia di standardizzare il metodo, in particolare la velocità e la durata dell'omogeneizzazione, quando si utilizza l'omogeneizzatore pertine da un altro fornitore. - Isolare il DNA da singoli campioni fecali del topo utilizzando un kit di isolamento del DNA batterico seguendo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali)con piccole modifiche. Quantificare il DNA isolato caricando 1 oL del DNA su un fluorimetro o sul chip di elettroforesi ad alta sensibilità (vedere Tabella dei materiali).
NOT: La resa prevista di DNA può variare da 500 a 2.500 ng quando si inizia con 200 mg del campione fecale. - Regolare la concentrazione del DNA a 4-20 ng/L utilizzando il buffer di eluizione. Riquanti il DNA (come fatto al punto 2.5) prima di procedere all'amplificazione genica rRNA 16S (PCR1), se PCR1 non viene eseguito nello stesso giorno.
3. 16S rRNA Gene Amplification (PCR1)
- Impostare l'amplificazione del gene rRNA 16S (PCR1) in una piastra PCR da 96 pozzetti utilizzando un volume di reazione di 25.
- Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 12,5 ll di 2 volte miscela di enzimi polimerasi ad alta fedeltà incluso buffer, oltre a dNTP (vedi Tabella dei materiali): 40 ng di DNA in un massimo di 10,5 l volume totale (regolare il volume totale con acqua di grado PCR): 1 (ciascuno) di in avanti e primer invertiti a una concentrazione di M.
NOT: Le sequenze dei primer sono le seguenti:
primer in avanti 5'-TCGTCGGCGTCA GATGTATAAGAGACACACACACAAGGGNGGGGGGGGCWGCAG-3' invertito primer 5'-GTCTCGTGGGCTGGAGATGTA TAAGAGACAGGGGAACHVGGGTATCTATCtAATC C-3'. Includere un kit vuoto dal passaggio 2.3 (controllo del reagente del kit) nella piastra PCR. - Sigillare la piastra PCR e la centrifuga a 1.000 x g a 20 s per 1 min in una centrifuga piastra da tavolo (vedi Tabella dei materiali)ed eseguire la PCR in un ciclore termico programmato per: 95 s per 3 min; 25 cicli di 1) 95 gradi centigradi per 30 s, 2) 55 gradi centigradi per 30 s, 3) 72 gradi centigradi per 30 s; estensione finale a 72 gradi centigradi per 5 min; e tenere a 4 gradi centigradi.
NOT: Anche se questo metodo di amplificazione genica rRNA 16S dovrebbe funzionare con diversi tipi di biocampioni, si consiglia di standardizzare il numero di cicli di amplificazione quando si avvia un nuovo progetto. - Confermare le dimensioni del prodotto PCR1 caricando 1 -L del DNA su un chip di elettroforesi ad alta sensibilità. In alternativa, eseguire 5 Ll di 16S prodotto amplificato rRNA su un gel di agarose dell'1,5% per confermare 550 bp del prodotto PCR1.
NOT: La pulizia del prodotto amplificato rRNA 16S è facoltativa e dipende dall'utilizzo del kit/metodo di isolamento del DNA. Se si utilizza un metodo interno di isolamento del DNA, il prodotto PCR1 può essere pulito utilizzando un kit di purificazione del DNA microbioma in base al protocollo del produttore (vedere Tabella dei materiali). Il kit di isolamento del DNA qui utilizzato produce un DNA ultrapuro e non richiede la pulizia del prodotto PCR1.
4. Costruzione della libreria del DNA utilizzando PCR indicizzato (PCR2)
-
Inserire le prime primer Con codice a barre Index 1 e Index 2 in un rack speciale (vedere Tabella dei materiali) per 96 librerie.
- Disporre l'indice 1 primer nelle colonne 1–12 e Indice 2 nelle righe A–H del rack speciale.
- Aggiungete 2,5 L dell'indice 1 nelle colonne 1–12 e indice 2 nelle righe A–H utilizzando pipette multicanale. Posizionare il nuovo tappo (vedere Tabella dei materiali)sui primer dell'indice 1 e dell'indice 2 e conservarlo in un congelatore a -20 gradi centigradi.
- Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 12,5 L di 2 volte miscela di enzimi polimerasi ad alta fedeltà contenente un buffer, oltre ai dNTP(vedere Tabella dei materiali); 5 -L di acqua di grado PCR e 2,5 l l di 16S prodotto amplificato da rRNA.
NOT: Aggiungere indici univoci a ogni campione per il multiplexing di più di 96 librerie in un'unica esecuzione, come descritto in Kiernan et al.27. Il presente protocollo utilizza adattatori di un kit commerciale (ad esempio, Nextera XT Index Kit) in base alle istruzioni fornite dal produttore nel metodo di sequenziamento della metagenomica 16S (ad esempio, Illumina). - Sigillare e centrifugare la piastra PCR indicizzata a 1.000 x g a 20 s per 1 min ed eseguire la PCR in un ciclore termico programmato per: 95 s per 3 min; 8 cicli di 1) 95 gradi centigradi per 30 s, 2) 55 gradi centigradi per 30 s, 3) 72 gradi centigradi per 30 s; e l'estensione finale a 72 gradi centigradi per 5 min.
- Confermare la 630 dimensioni di base del prodotto PCR indicizzato caricando 1 : L di DNA su un chip di elettroforesi ad alta sensibilità. In alternativa, eseguire 5 L di prodotto PCR indicizzato su un gel di agarose dell'1,5% per confermare le dimensioni e l'intensità del prodotto.
5. Pulizia della PCR indicizzata (PCR2) e quantificazione
- Pool 5 - L di amplificatore PCR2 utilizzando pipette multicanale da ogni pozzo in un vassoio serbatoio multicanale privo di DNase rilevabili, RNase, DNA umano e batteri pirogenici (vedere Tabella dei materiali).
- Trasferire il prodotto in pool dal vassoio del serbatoio multicanale in un tubo di microcentrizzazione e vortice da 1,5 ml vuoti e preetichettati da 1,5 ml da mescolare.
- Purificare il prodotto PCR2 utilizzando il kit di perline magnetiche standard(vedere Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Sigillare e conservare i restanti 20 gradi di PCR2 nella stessa piastra a -80 gradi centigradi per un ulteriore utilizzo, se necessario.
- Preparare l'80% di etanolo fresco aggiungendo 4 mL di 100% di etanolo a 1 mL di acqua di grado PCR.
- E' il tallone magnetico a RT e vortice per 30 s per disperdere le perline in modo uniforme.
- Vortice brevemente e girare verso il basso i campioni di amplificatore PCR2 in pool.
- Aggiungete 80 gradi di perline magnetiche in un tubo di microcentrifuga sterile da 1,5 ml sterile con 80 ll di prodotti PCR in pool, quindi vortice e girate brevemente per rimettere in modo uniforme le perline magnetiche.
- Incubare il contenuto a RT senza disturbare i tubi per 15 min.
- Posizionare il tubo con il DNA e le perle magnetiche su un supporto magnetico (vedi Tabella dei materiali) per 5 min.
- Rimuovere e scartare con cura 150 l del super-natante.
- Aggiungere 200 l di etanolo appena preparato all'80% senza disturbare le perline e incubare per 30 s.
- Rimuovere con attenzione, e scartare tutti i supernatali.
- Ripetere i passaggi da 5.11 a 5.12. Rimuovere il volume rimanente con una pipetta P10. Lasciare asciugare all'aria le perline per 15 minuti, con l'indice tubo PCR rimanente sul supporto magnetico.
- Togliere dal supporto magnetico. Aggiungere 33 l di tampone di eluizione (il buffer di eluizione del kit DNA è accettabile). Vorticare bene, ed eseguire un rapido giro per rimuovere il liquido rimanente sul lato. Incubare per 2 min e posizionare sul supporto magnetico per 5 min.
- Trasferire 30 -L del supernatore (prodotti PCR puliti) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml pre-etichettato.
- Quantificare la piscina purificata caricando 1 OL della piscina purificata su un chip di elettroforesi fluorimetrico o ad alta sensibilità, in quanto ciò sarà necessario durante il sequenziamento. Eseguire MiSeq come descritto di seguito.
6. Sequenziamento MiSeq
- Creare un foglio di esempio contenente informazioni sui codici a barre specifici del campione per il flusso di lavoro della metagenomica e il demultiplexing sullo strumento MiSeq(vedere Tabella dei materiali). Caricare questo foglio di esempio nel software (ad esempio, Illumina Experiment Manager).
- Diluire le librerie in pool dal passaggio 5.15 a 4 nM.
- Denature ha unito le librerie combinando 5.L della piscina della biblioteca 4 nM con 5 -L di 0,2 M NaOH appena preparati in un tubo di microcentrismo da 1,5 ml. Vortice brevemente per mescolare, centrifugare brevemente e incubare per 5 min a temperatura ambiente RT.
- Aggiungere 990 ldi di cuscinetto di ibridazione ghiacciato (tamponi HB) e pipetta delicatamente da mescolare. Questo produrrà una libreria di 20 pM.
- Unire 2 l l della libreria di controllo da 10 nM con 3 l l di buffer EBT (10 mM Tris-HCl, pH 8,5, con 0,1% Tween 20) per produrre una libreria di controllo da 4 nM. Aggiungere brevemente 5 OL di 0,2 N NaOH appena preparati e il vortice per mescolare. Incubare per 5 min a RT.
-
Aggiungere delicatamente il buffer di ibridazione ghiacciato (HB buffer) e la pipetta da mescolare per 990 l'l, e pipetta. Questo produrrà 20 pM librerie di controllo.
NOTA: Le librerie di controllo Denatured 20 pM possono essere conservate a -20 gradi centigradi fino a 4 settimane. Dopo 4 settimane, i numeri dei cluster tendono a diminuire.- Unire 210 l della libreria da 20 pM con 40 Litri della libreria di controllo da 20 pM (concentrazione finale - 18%) e aggiungere 350 l di buffer HB. Caricare la libreria ad una concentrazione finale di 7 pM.
NOT: I dettagli di input devono essere regolati in base alle prestazioni di esecuzione.
- Unire 210 l della libreria da 20 pM con 40 Litri della libreria di controllo da 20 pM (concentrazione finale - 18%) e aggiungere 350 l di buffer HB. Caricare la libreria ad una concentrazione finale di 7 pM.
- Incubare campioni per 2 min a 96 gradi centigradi. Mettere sul ghiaccio per 5 min.
NOT: La sezione 6 di cui sopra può essere eseguita in una struttura del nucleo genomico/DNA.
7. Elaborazione dei dati e analisi della sequenza
- Utilizzare il software R (versione 3.5) per l'elaborazione e le analisi dei dati DADA2. Per i passaggi 7.1–7.4, utilizzare il software open-access come descritto nell'esercitazione online DADA2 sviluppata in precedenza disponibile all'indirizzo
NOT: Uno script R facilmente utilizzabile è stato allegato come file supplementare 2e gli utenti devono modificare il nome e l'origine dei file di sequenziazione (ad esempio, SAMPLENAME_R1_001.fastq e SAMPLENAME_R2_001.fastq). - Visualizzare i profili di qualità delle letture in avanti e inretro utilizzando il comando plotQualityProfile.
- Tagliare i nucleotidi dalle letture in avanti e in retromarcia in base al grafico di qualità. Questi parametri vengono specificati dal parametro truncLen in DADA2.
NOT: In questo caso, 280 viene utilizzato come soglia di lunghezza per la quale le letture in avanti verrebbero eliminate e 260 come soglia di lunghezza per la quale le letture inverse verrebbero eliminate. - Elaborare i dati 16S non elaborati come file fastq dalla pipeline DADA2 come descritto nell'esercitazione online (disponibile all'indirizzo
NOTA: una tabella di variante di sequenza di amplificatori di esempio di esempio generata dalla pipeline DADA2 è inclusa come File supplementare 3 . È possibile utilizzare un database di riferimento Greengene o Silva, in quanto non sono state riscontrate differenze nella classificazione batterica utilizzando uno di questi database. - Generare un file di mapping definito dall'utente che contiene i metadati (ad esempio, genotipo, sesso, trattamento e così via) per ogni campione. Un file di metadati di esempio è stato incluso come File supplementare 4.
- Calcolare la diversità alfa (indice Shannon) e la diversità beta utilizzando l'analisi delle coordinate principali (PCA) in base ai conteggi OTU rarefatti utilizzando Phyloseq28 come descritto nell'esercitazione online, disponibile all'indirizzo
- Eseguire la seguente analisi in METAGENassist29.
NOTA: Eseguire l'analisi dell'abbondanza differenziale utilizzando il test di somma di classificazione Wilcoxon a livello del genere. Mappe di calore e taxa differenzialmente abbondanti sono evidenziati utilizzando METAGENassist29, una pipeline di analisi pubblicamente disponibile e basata sul web.- Caricare la tabella di abbondanza tassonomica (formato CSV) e selezionare Esempi nella colonna.
- Caricare il file di mapping (formato CSV) e selezionare Esempi in una riga.
- Selezionare Opzioni per rimuovere le variabili con oltre il 50% zeri ed escludere le letture non assegnate e non mappate.
- Selezionare Opzioni per normalizzare le righe per somma e registrazione delle colonne di normalizzazione.
- Crea un grafico Vulcano, PCA o PLSDA facendo clic sullo stesso nella colonna di sinistra e fai clic su Rimuovi nome campione per creare il grafico.
- Eseguire un test t(se solo due gruppi) o ANOVA (se maggiore di due gruppi) per visualizzare le caratteristiche (batteri) che differiscono tra i gruppi. Fare clic su Funzioni selezionate per visualizzare batteri specifici che differiscono da un gruppo all'altro.
- Fare clic su Dendrogramma o Mappa di calore per creare i rispettivi grafici. È possibile eseguire analisi aggiuntive, ad esempio la visualizzazione di esempio per gruppi o le prime 25 funzionalità basate su t-test/ANOVA.
- Fare clic su RandomForest per creare grafici che mostrano le feature che possono essere utilizzate per la classificazione. Fare clic sulla scheda Scostamento in alto per creare grafici per le caratteristiche principali che differiscono tra/tra i gruppi. Fare clic su Dettagli feature per visualizzare un elenco di batteri che differiscono tra i gruppi e fare clic su ogni batterio per creare un riepilogo grafico dello stesso.
- Fare clic sulla scheda Outlier in alto per visualizzare i campioni che sono outlier.
- Infine, fare clic su Scarica e selezionare 1) un file zip contenente tutte le analisi eseguite o 2) le funzioni desiderate da scaricare. Questo file deve essere salvato come nome univoco e dovrà essere decompresso prima dell'uso.
NOT: Per test statistici dettagliati eseguiti durante l'analisi del microbioma, fare riferimento alleopere di Chen et al.
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Representative Results
Poiché le molecole MHC di classe II (HLA negli esseri umani) sono attori centrali nella risposta immunitaria adattiva e mostrano forti associazioni con una predisposizione alla MS24,25,26, si è ipotizzato che la molecola HLA di classe II influenzerebbe la composizione microbica intestinale. Pertanto, i topi privi del gene MHC di classe II (AE.KO) o che esprimono il gene umano HLA-DQ8 (HLA-DQ8) sono stati utilizzati per comprendere l'importanza delle molecole HLA di classe II nel plasmare la comunità microbica intestinale.
Sono stati raccolti campioni fecali da topi transgenici AE.KO (n n n ) e HLA-DQ8 (n - 12), è stato estratto il DNA batterico e la regione V3-V4 del gene rRNA 16S è stata amplificata. La dimensione dell'amplificatore (550 bp) è stata confermata eseguendo i campioni su un gel di agarose dell'1,5%(Figura 2A, corsie 1–6). Un'ulteriore conferma della dimensione dell'amplificatore rRNA 16S (550 bp) è stata eseguita caricando 1 l del prodotto PCR1 su un chip di elettroforesi ad alta sensibilità(Figura 2B, corsie 1–7).
Un elettropherogramma è stato generato dal prodotto PCR 16S rRNA, che ha mostrato regioni di picco con frammenti di dimensioni di 550 pb (Figura 2C). Gli indici doppi e gli adattatori di sequenza sono stati collegati utilizzando PCR (INDEXed PCR2) che ha assegnato un'identità univoca a ogni campione e ha consentito il multiplexing di molti campioni in una singola esecuzione della sequenza MiSeq. La conferma della PCR indicizzata è stata eseguita dall'elettroforesi gel agarose (Figura 2A, corsie 7–12) e da un chip di elettroforesi ad alta sensibilità (Figura 2B, corsie 8–12), Figura 2D]. Tutti i campioni di PCR2 sono stati raggruppati, purificati e caricati su un sequencer di nuova generazione che ha prodotto letture R1 e R2 inverse di buona qualità (Figura 3). La mediana ottenuta letture dopo il filtraggio di qualità e il taglio sono state 88.125 (intervallo di 9.597–111.848).
L'analisi ecologica comunitaria è stata eseguita utilizzando la pipeline di analisi DADA2 e visualizzata con Phyloseq e METAGENassist per dimostrare le differenze nella diversità alfa(Figura 4) e nella diversità beta (Figura 5), nonché le differenze genere e i livelli di specie tra i gruppi. L'analisi DADA2 ha generato una tabella di abbondanza con valori delimitati da virgole in formato csv, che è stata utilizzata per un'ulteriore analisi a valle utilizzando una piattaforma basata sul Web (ad esempio, Phyloseq e/o METAGENassist). Le analisi della diversità alfa e beta sono state eseguite in base alle categorie definite dall'utente elencate in un file di mapping.
L'analisi della diversità di Shannon ha rivelato una diversità alfa complessivamente inferiore per i topi AE.KO rispetto ai topi transgenici HLA-DQ8 (Figura 3). L'ordinazione con l'analisi delle coordinate principali ha mostrato un raggruppamento spaziale distinto tra topi AE.KO e topi transgenici HLA-DQ8 (Figura 5). Una tabella di abbondanza da DADA2 è stata utilizzata anche per eseguire un'analisi metagenomica completa utilizzando il software ad accesso aperto METAGENassist29. Sono stati generati clustering basato su mappe di calore di abbondanza batterica (livello del genere)(Figura 6A) e un box plot per batteri specifici che mostra le differenze tra due gruppi (Figura 6B) utilizzando una pipeline METAGENassist.
L'analisi della mappa termica ha mostrato che alcuni batteri come Allobacullum, Desufovibrio e Rikenella erano più abbondanti nei topi transgenici HLA-DQ8. Al contrario, la biolophila era più abbondante nei topi AE.KO (Figura 6B). In un box plot rappresentativo (Figura 6B) sono riportate le abbondanze relative di singoli batteri (Bilophila e Rikenella). Complessivamente, i dati dimostrano che i topi AE.KO possiedono una comunità microbica distinta rispetto a quella dei topi transgenici HLA-DQ8, con un'assenza di batteri specifici nei topi AE.KO. I dati suggeriscono anche che le molecole MHC di classe II svolgono un ruolo importante nell'abbondanza di alcuni batteri. In sintesi, questo protocollo semplice e dettagliato aiuterà i ricercatori che non hanno familiarità con il campo del microbioma e coloro che hanno bisogno di aggiornamenti sui metodi per ottenere una risoluzione tassonomica più elevata.
Figura 1: Diagramma di flusso del sequenziamento del microbioma intestinale. Vengono visualizzati tutti i passaggi del sequenziamento del microbioma (raccolta dei campioni per l'analisi dei dati del microbioma). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: 16S amplificazione genica rRNA e analisi del controllo qualità della regione V3-V4. (A) Immagine rappresentativa dell'elettroforesi del gel di agarose dell'amplificatore 16S (PCR1, taglia 550 bp) e della PCR indicizzata (PCR2, dimensione 630 bp) dei topi AE.KO (corsie 1–3 e 7–9) e dei mouse transgenici HLA-DQ8 (corsie 4–6 e 10–12). (B) Immagine rappresentativa gel dell'amplificatore 16S (PCR1, dimensione 550 bp) e della PCR indicizzata (PCR2, dimensione - 630 bp) dei topi AE.KO (corsie 1–3 e 8–10) e dei topi transgenici HLA-DQ8 (corsie 4–7 e 11–12) risolti dall'elettroforesi. (C) L'elettroforogramma rappresentativo dell'amplificatore 16S (PCR1) ha mostrato una regione di picco contenente frammenti di dimensioni paria550 bp. 630 bp. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Profilo di qualità delle letture in avanti (R1, superiore) per due campioni rappresentativi e letture inverse corrispondenti (R2, fondo) per gli stessi campioni. L'analisi è stata eseguita utilizzando una pipeline DADA2, in cui l'asse x mostra la lunghezza di lettura (0-300 basi) e l'asse y mostra la qualità delle letture. La linea verde rappresenta il punteggio di qualità mediano, mentre la linea arancione rappresenta i quartili della distribuzione del punteggio di qualità in ogni posizione di base. Le letture in avanti (R1) hanno sempre mostrato una qualità migliore rispetto alle letture inverse (R2). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Misure di diversità alfa (diversità di Shannon) di topi AE.KO e topi transgenici HLA-DQ8. Ogni punto rappresenta la diversità di z (diversità di Shannon) in un campione da un singolo topo. La diversità di Shannon era complessivamente inferiore per i topi AE.KO rispetto ai topi transgenici HLA-DQ8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: L'ordinazione con il grafico parziale dell'analisi delle quote dei minimi quadrati. La trama mostra una netta separazione tra topi AE.KO e topi transgenici HLA-DQ8. Ogni punto rappresenta la composizione batterica all'interno di un campione, e le eclissi punteggiate indicano intervalli di confidenza dell'80%. I grafici PLS-DA sono stati generati utilizzando METAGENassist. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Topi AE.KO che mostrano una comunità microbica distinta rispetto ai topi transgenici HLA-DQ8, con un'assenza di batteri specifici nei topi AE.KO. (A) Mappa di calore combinata con clustering gerarchico agglomerativo che mostra l'abbondanza relativa di batteri (livello del genere). (B) Trama a scatola che mostra un'abbondanza relativa normalizzata di due batteri rappresentativi (Bilophila e Rikenella) nei topi transgenici AE.KO e HLA-DQ8. Entrambi i grafici sono stati generati utilizzando METAGENassist. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare Figura 1: Immagine rappresentativa del divisore per la raccolta di campioni fecali da più topi alla volta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 2: DADA2 R-script per la generazione di tabella di abbondanza da sequenze non elaborate. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: Tabella di abbondanza del genere rappresentativo (formato CSV). Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 4: File di mapping rappresentativo (formato CSV). Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il protocollo descritto è semplice, con misure facili da seguire per eseguire la profilazione del microbioma utilizzando il sequenziamento metagenomico di rRNA 16S da un gran numero di biocampioni di interesse. Il sequenziamento di nuova generazione ha trasformato gli studi sull'ecologia microbica, in particolare nei modelli di malattia umana e pre-clinica31,32. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di analizzare con successo complesse composizioni microbiche (microbi di cultura e non di cultura) in un dato biospecimen ad un alto livello di throughput e a basso costo32. Tuttavia, diversi fattori (ad esempio, effetti batch, selezione di primer per il gene rRNA 16S e analisi dei dati di sequenza) rimangono un ostacolo importante nell'uso diffuso di questa tecnologia.
Le tecnologie avanzate di sequenziamento MiSeq basate sul rRNA 16S (2x300bp)33 consentono il sequenziamento di 600 nucleotidi del gene di 16S rRNA 16S lungo nucleotide, che ha superato il collo di bottiglia precedente delle letture di sequenziamento breve. I primer specifici per una diversa regione di rRNA come V1–V2, V3–V5 o V6-V9 possono essere utilizzati con ogni primer specifici della regione che mostrano alcune distorsioni per il rilevamento eccessivo o sotto-rilevamento di particolare taxa34,35. Alcuni gruppi preferiscono la regione V1–V221, che mostra un aumento della distorsione per il Clostridium, ma un sottorilevamento per alcune specie di Bacteroidetes. Al contrario, altri gruppi preferiscono le regioni V4, V3–V4 e V3–V5, che dimostrano la classificazione meno distorta di taxa batterica15,20,36,37.
Il presente protocollo utilizza primer specifici per le regioni V3-V4 del gene rRNA 16S, in quanto copre la regione più lunga di rRNA 16S con due regioni ipervariabili (V3 e V4) rispetto al solo V4. Inoltre, l'amplificatore specifico V3-V4 consente la fusione di letture sia in avanti (R1) che inretro (R2), portando a una migliore risoluzione della classificazione batterica. Anche se l'area V3-V5 fornisce letture più lunghe e copre più aree ipervariabili (V3, V4 e V5), è difficile unire letture R1 e R2 a causa di aree sovrapposte no/little tra le letture R1 e R2. Pertanto, una serie di studi ha utilizzato i dati provenienti solo da R1 letture per la classificazione batterica quando si esegue 16S rRNA sequenziamento metagenomico utilizzando V3–V5 regione14.
Una corretta conservazione e manipolazione delle biocampioni e sono fondamentali per l'analisi del microbioma per prevenire la degradazione del DNA batterico o la contaminazione ambientale38 . Lo stoccaggio a lungo termine di biocampioni a RT o 4 gradi centigradi può portare a una crescita eccessiva di alcuni batteri o funghi. I campioni possono essere congelati immediatamente o trasportati a 4 gradi centigradi (per 1-3 giorni), quindi congelati. Il biocampione può anche essere conservato direttamente in conservanti come la soluzione di stabilizzazione dell'acido nucleico (ad esempio, RNA-più tardi), 95% etanolo o un kit di stoccaggio commerciale. Il consenso generale è che uno di questi metodi di conservazione non causa differenze significative nei profili della comunità batterica39,40. Sebbene una soluzione con conservanti consenta lo stoccaggio e il trasporto presso RT, questi campioni non possono essere utilizzati per analisi a base di RNA, analisi dei metaboliti o esperimenti di trapianto fecale. Questi temi sono stati discussi in dettaglio altrove39,40.
Uno dei passaggi critici di questo protocollo è l'uso di un metodo basato sul battimento di perline per l'interruzione meccanica dei batteri gram-positivi e Archaea. Uno studio precedente ha mostrato la più alta diversità batterica utilizzando il metodo basato sul battito di perline rispetto ad altri metodi di lisi cellulare41. Una lisi batterica incompleta o contaminazione durante l'estrazione del DNA può introdurre distorsioni nei dati del microbioma intestinale42. Un altro punto importante da considerare è la contaminazione dovuta ai reagenti di laboratorio inclusi nei kit chiamatikitome 43,44,45. I campioni con grande biomassa e ricca diversità batterica come il suolo o le feci mostrano meno di questi problemi rispetto ai campioni con biomassa inferiore come la pelle. Pertanto, un controllo dell'estrazione dell'acqua deve essere incluso in ogni estrazione ed elaborato con altri campioni per identificare l'introduzione di una potenziale contaminazionedovuta all'estrazionedel DNA 43,44,45.
Nell'analisi del microbioma, la diversità all'interno di un campione può essere misurata dalla diversità alfa, da una misura della ricchezza delle specie, o dalla diversità beta, che stima le differenze tra campioni/gruppi. Tra i metodi più diffusi per la misurazione della diversità a z figurano UniFrac (pesato e non ponderato) accoppiato con tecniche statistiche multivariate come la dissimilità delle coordinate principali (PCoA) o la dissimilità Brey-Curtis. Mentre UniFrac si basa su distanze filogenetiche, l'analisi della dissimilarità di Brey-Curtis utilizza l'abbondanza batterica per generare grafici. Descrizioni approfondite sulla diversità di z e z sono discusse altrove30,46,47. È possibile utilizzare diversi metodi statistici per confrontare le differenze nelle comunità microbiche tra i gruppi14,48. Si consiglia di utilizzare valori p regolati anziché valori p non elaborati per correggere più test14.
C'è una varietà di software di bioinformatica per analizzare i dati di sequenziamento mirati in modo indipendente49. Il protocollo proposto utilizza pacchetti software open source basati su R, che consentono una profilazione intuitiva e rapida dei taxa batterici attraverso pipeline DADA2 basate su R. La tabella di abbondanza generata da DADA2 può essere utilizzata per l'analisi a valle utilizzando phyloseq e METAGENassist. La pipeline DADA2 è vantaggiosa rispetto a QIIME perché non richiede funzionalità speciali (ad esempio, l'installazione di macchine virtuali o contenitori Docker), che richiedono risorse di calcolo relativamente grandi e particolari competenze tecniche. Soprattutto per i principianti per l'analisi 16S, R è attraente, in quanto è gratuito e consente agli utenti di sfruttare tutorial online accessibili e script di analisi che sono facili da eseguire. È importante sottolineare che questi strumenti di analisi richiedono risorse di calcolo relativamente piccole e possono essere eseguiti su una piattaforma basata su PC, Macintosh o Linux. Inoltre, METAGENassist può utilizzare tabelle di abbondanza generate da tubazioni DADA2 e file BIOM (Biological Observation Matrix) generati da QIIME/MG-RAST per eseguire analisi come PCA, analisi parziale dei minimi quadrati (PLS-DA), grafici vulcanici, test t(confronto di due gruppi), ANOVA (confronto di tre o più gruppi), grafici di mappe termiche, analisi casuale delle foreste, ecc. METAGENassist è stato trovato essere molto user-friendly.
In sintesi, questo protocollo descrive una semplice pipeline di profilazione metagenomica rRNA 16S, con una guida dettagliata sulla raccolta dei campioni, l'estrazione del DNA, la preparazione della libreria metagenomica, il sequenziamento su Illumina MiSeq e l'analisi dei dati user-friendly utilizzando liberamente piattaforme disponibili (ad esempio DADA2, phyloseq e METAGENassist). Sebbene la profilazione tassonomica basata sulla metagenomica di rRNA 16S sia affidabile per la caratterizzazione dei batteri presenti in particolari biocampioni, il sequenziamento metagenomico dei fucili può essere un approccio migliore per un'analisi dettagliata delle percorsi metabolici e l'identificazione batterica.
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Disclosures
A. M. ha ricevuto royalty dalla Mayo Clinic (pagata da Evelo Biosciences) come uno degli inventori di una tecnologia che sostiene l'uso di Prevotella histicola per il trattamento delle malattie autoimmuni.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il finanziamento del NIAID/NIH (1R01AI137075-01), del Carver Trust Medical Research Initiative Grant e del Centro di ricerca sulle scienze ambientali dell'Università dell'Iowa, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
- Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
- Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
- Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
- Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
- Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
- Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
- Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
- Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
- Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
- Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
- Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
- Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
- Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
- Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, Suppl 1 23-28 (2010).
- Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
- Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
- Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
- Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
- Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
- Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
- Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
- Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
- Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
- Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
- Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
- Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
- Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
- Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
- Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
- Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).
