Summary
Beskrivs här är en förenklad standard operativ förfarande för mikrobiomet profilering med 16s rRNA potenta sekvensering och analys med hjälp av fritt tillgängliga verktyg. Detta protokoll kommer att hjälpa forskare som är nya på mikrobiomet fältet samt de som kräver uppdateringar om metoder för att uppnå bakteriell profilering med en högre upplösning.
Abstract
Den mänskliga tarmen är koloniserad av biljoner bakterier som stöder fysiologiska funktioner såsom mat metabolism, energi skörd, och reglering av immunförsvaret. Störning av den friska tarmen mikrobiomet har föreslagits att spela en roll i utvecklingen av inflammatoriska sjukdomar, inklusive multipel skleros (MS). Miljömässiga och genetiska faktorer kan påverka sammansättningen av mikrobiomen; Därför har identifiering av mikrobiella samhällen kopplade till en sjukdoms fenotyp blivit det första steget mot att definiera microbiome roll i hälsa och sjukdom. Användning av 16s rRNA potenta sekvensering för profilering bakteriell samfundet har bidragit till att främja mikrobiomet forskning. Trots sin breda användning, det finns inget enhetligt protokoll för 16S rRNA-baserade taxonomiska profilering analys. En annan begränsning är den låga upplösningen av taxonomisk tilldelning på grund av tekniska svårigheter såsom mindre sekvensering läsningar, samt användning av endast framåt (R1) läser i den slutliga analysen på grund av låg kvalitet på omvänd (R2) läsningar. Det finns behov av en förenklad metod med hög upplösning för att karakterisera bakterie mångfalden i ett givet bio prov. Framsteg i sekvensering teknik med förmågan att sekvens längre läsningar med hög upplösning har bidragit till att övervinna några av dessa utmaningar. Nuvarande sekvenserings teknik i kombination med en allmänt tillgänglig metagenomisk analyspipeline som R-baserad Divisive Amlicon denoising algoritm-2 (DADA2) har hjälpt till att främja mikrobiell profilering med hög upplösning, eftersom DADA2 kan tilldela sekvens på släktet och artnivåer. Beskrivs här är en guide för att utföra bakteriell profilering med hjälp av två steg förstärkning av v3-v4 regionen av 16S rRNA genen, följt av analys med fritt tillgängliga analysverktyg (dvs., DADA2, Phyloseq, och METAGENassist). Man tror att detta enkla och kompletta arbetsflöde kommer att fungera som ett utmärkt verktyg för forskare intresserade av att utföra mikrobiomet profilering studier.
Introduction
Microbiota hänvisar till en samling av mikroorganismer (bakterier, virus, Archaea, bakteriofages, och svampar) som lever i en viss miljö, och mikrobiomet hänvisar till det kollektiva genomet av inhemska mikroorganismer. Eftersom bakterier är en av de vanligast förekommande mikroberna hos människor och möss är denna studie endast inriktad på bakterie profilering. Den mänskliga tarmen är koloniserad av biljoner bakterier och hundratals bakteriestammar1. Den normala tarmfloran spelar en viktig roll för att upprätthålla en hälsosam tillstånd i värden genom att reglera funktioner (dvs., underhåll av en intakt tarm barriär, mat metabolism, energi homeostas, hämning av koloniseringen av patogena organismer, och reglering av immunsvar)2,3,4,5. Kompositionella störningar i tarmfloran (Gut dysbios) har kopplats till ett antal mänskliga sjukdomar, inklusive gastrointestinala sjukdomar6, fetma7,8, stroke9, cancer10, diabetes8,11, reumatoid artrit12, allergier13, och centralanervsystemet-relaterade sjukdomar såsom multipel skleros (MS)14,15 och Alzheimers sjukdom (AD)8,16. Därför har det under de senaste åren funnits ett växande intresse för verktyg för att identifiera bakterie sammansättningen på olika kropps platser. En tillförlitlig metod bör ha egenskaper såsom hög genomströmning och lätt att använda, med möjlighet att klassificera bakteriell bakterieflora med hög upplösning, och att vara låg kostnad.
Kulturbaserade mikrobiologiska tekniker är inte tillräckligt känsliga för att identifiera och karakterisera den komplexa tarmfloran på grund av att flera tarmbakterier har misslyckats med att växa i kulturen. Tillkomsten av sekvenserings-baserad teknik, särskilt 16s rRNA-baserade potenta sekvensering, har övervunnit några av dessa utmaningar och omvandlas mikrobiomet forskning17. Avancerad 16s rRNA-baserade sekvenserings teknik har bidragit till att etablera en kritisk roll för Gut mikrobiomet i människors hälsa. Den mänskliga mikrobiomet Project, en National Institutes of Health initiativ18, och metahit projektet (ett europeiskt initiativ)19 har båda bidragit till att upprätta en grundläggande ram för mikrobiomet analys. Dessa initiativ bidrog till att kickstarta flera studier för att fastställa den roll som Gut mikrobiomet i människors hälsa och sjukdom.
Ett antal grupper har visat tarm dysbios hos patienter med inflammatoriska sjukdomar12,14,15,20,21,22. Trots att de ofta används för taxonomisk profilering på grund av förmågan att multiplex och låga kostnader, det finns inga enhetliga protokoll för 16S rRNA-baserade taxonomisk profilering. En annan begränsning är den låga upplösningen av taxonomisk tilldelning på grund av mindre sekvensering läsningar (150 BP eller 250 BP) och användning av endast framåt sekvensering läsa (R1) på grund av låg kvalitet omvänd sekvensering läsningar (R2). Framsteg inom sekvenserings teknik har dock bidragit till att övervinna några av dessa utmaningar, till exempel möjligheten att sekvensera längre läsningar med Parade-end läsningar (t. ex., Illumina MiSeq 2x300bp).
Den nuvarande sekvenserings teknik kan sekvens 600 BP god kvalitet läser, som tillåter sammanslagning av R1 och R2 läsningar. Dessa sammanslagna längre R1 och R2 läsningar tillåta bättre taxonomiska tilldelningar, särskilt med Open-Access R-baserade Divisive amplicon denoising algoritm-2 (DADA2) plattform. DADA2 använder amplikon Sequence variant (ASV)-baserade uppdrag i stället för operativa taxonomiska enhet (OTU) uppdrag baserat på 97% likhet utnyttjas av qiime23. ASV-matcher resulterar i en exakt sekvens matchning i databasen inom 1 – 2 nukleotider, vilket leder till tilldelning på genus och artnivåer. Sålunda, kombinationen av längre, god kvalitet Parade-end läsningar och bättre taxonomiska tilldelnings verktyg (såsom DADA2) har förändrat mikrobiomet studier.
Tillhandahålls här är en steg-för-steg-guide för att utföra bakteriell profilering med två steg förstärkning av v3-v4 regionen 16S rRNA och dataanalys med hjälp av DADA2, Phyloseq, och METAGENassist pipelines. För denna studie används humana leukocytantigen (HLA) klass II-transgena möss, eftersom vissa HLA-klass II-alleler är kopplade till en predisposition för autoimmuna sjukdomar som MS20,24,25. Emellertid, betydelsen av HLA klass II gener i regleringen av sammansättningen av Gut bakterieflora är okänd. Det är en hypotes om att HLA klass II-molekylen kommer att påverka tarmmikrobiell gemenskap genom att välja för specifika bakterier. Större histocompatibility complex (MHC) klass II knockout-möss (AE. ko) eller möss som uttrycker humana HLA-DQ8-molekyler (HLA-DQ8)24,25,26 användes för att förstå betydelsen av HLA-klass II-molekyler i forma tarmfloran. Man tror att detta kompletta och förenklade arbetsflöde med R-baserad dataanalys kommer att fungera som ett utmärkt verktyg för forskare intresserade av att utföra mikrobiomet profilering studier.
Generering av möss som saknar endogena murina MHC klass II-gener (AE. KO) och AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) transgena möss med en C57BL/6J bakgrund har beskrivits tidigare26. Fekal prover samlas in från möss av båda könen (8 – 12 veckors ålder). Möss har tidigare fötts upp och underhålls i University of Iowa djur anläggning enligt NIH och institutionella riktlinjer. Strategier för föroreningskontroll såsom avvänjning av möss i ett laminärt flödes skåp, byte av handskar mellan olika möss stammar och korrekt underhåll av möss är kritiska steg för profilering av tarmmikrobiomen.
Lämplig personlig skyddsutrustning rekommenderas starkt under hela proceduren. Lämpliga negativa kontroller bör inkluderas när du utför DNA-isolering, PCR1 och PCR2 amplifiering och sekvenserings steg. Användning av sterila, DNase-fri, RNase-fri, och pyrogenfria leveranser rekommenderas. En särskild multikanalspipettor för mikrobiomet arbete och filtrerade pipettspetsar bör användas i hela protokollet. Microbiota analys består av sju steg: 1) fekal provinsamling och bearbetning; 2) extraktion av DNA; 3) 16S rRNA genamplifiering; 4) DNA-biblioteksbyggande med indexerad PCR; 5) sanering och kvantifiering av indexerad PCR (bibliotek); 6) MiSeq sekvensering; och 7) databehandling och sekvensanalys. Ett Schematiskt diagram över alla protokoll steg visas i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommitté vid University of Iowa.
1. insamling och hantering av fekal prov
- Sterilisera avdelare lådor (se tabell över material, kompletterande figur 1) med 70% etanol.
- Pre-Label mikrocentrifug rör (en per mus) med provet ID och behandlingsgrupp (om tillämpligt).
- Placera mössen i steriliserade avdelare lådor och låt dem att uträtta sina behov normalt för upp till 1 h.
- Samla fekal pellets i en tom, förmärkt 1,5 mL microcentrifug röret med hjälp av sterila tång och Stäng röret säkert. Sterilisera tång efter insamling från varje mus.
- Placera microcentrifugeröret som innehåller fekal pellets i en-80 ° c frys tills vidare bearbetning.
Anmärkning: Avdelare rutorna är fördelaktiga eftersom de tillåter samtidig insamling av fekal prover från flera möss (upp till 12) på en gång.
2. extraktion av DNA
- Ta bort fekal prover (mus eller människa) från frysen och Tina vid rumstemperatur (RT).
Anmärkning: Det är tillrådligt att Tina mänskliga avföringsprov över natten vid 4 ° c som behövs för att samla 200 mg eller erforderligt belopp från varuprover. - Använd 200 mg utgångsmaterial och eluera-DNA till en slutlig volym på 50 μl.
- Inkludera ett DNA-isoleringspaket som är tomt där inget fekal-prov läggs till men bearbetas genom alla steg för DNA-extraktion.
Anmärkning: En specifik DNA-isolerings sats (se tabell över material) användes, eftersom den innehåller specifika reagenser för att avlägsna hämmande material såsom bio partiklar, osmält växtmaterial och heme föreningar från lyserade röda blodkroppar som finns i human och Mouse pall Prover. - Placera pärlröret i en homogenisator (se tabell över material) och homogenisera proverna för 45 s vid RT och en hastighet på 4,5 m/s.
Anmärkning: Bead-slog Homogenisatorer från alla tillverkare kan användas. Emellertid, det rekommenderas att standardisera metoden, särskilt hastigheten och varaktigheten av homogenisering, när du använder pärla-slog Homogenisatorer från en annan leverantör. - Isolera DNA från enskilda musfekala prover med hjälp av en bakterie-DNA-isolerings sats enligt tillverkarens protokoll (se tabell över material) med smärre ändringar. Kvantifiera det isolerade DNA genom att lasta 1 μL av DNA på en Fluorimeter eller på hög känslighet elektrofores chip (se tabell över material).
Anmärkning: Den förväntade avkastningen av DNA kan variera från 500 – 2500 ng när du börjar med 200 mg fekal provet. - Justera DNA-koncentrationen till 4 – 20 ng/μL med hjälp av elueringbuffert. Requantify DNA (som gjort i steg 2,5) innan du fortsätter till 16S rRNA genamplifiering (PCR1), om PCR1 inte utförs på samma dag.
3.16S rRNA genamplifiering (PCR1)
- Ställ in 16S rRNA genamplifiering (PCR1) i en 96 väl PCR-platta med en 25 μL reaktions volym.
- Med hjälp av en multikanalpipett, tillsätt 12,5 μl av 2x High Fidelity-polymeras-Enzymblandning inklusive buffert, förutom dNTPs (se tabell över material): 40 ng av DNA i upp till 10,5 μl total volym (justera den totala volymen med PCR-gradvatten): 1 μl (vardera) framåt och omvänd primers vid koncentration av 1 μM.
Anmärkning: Sekvenser av primers är följande:
framåt primer = 5 '-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3 ' omvänd primer = 5 '-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC C-3 '. Inkludera ett kit tomt från steg 2,3 (kit reagens-kontroll) i PCR-plattan. - Försegla PCR-plattan och centrifugera vid 1 000 x g vid 20 ° c i 1 min i en bordsskiva centrifug (se tabell över material) och utför PCR i en termisk apparat programmerad för: 95 ° c i 3 min; 25 cykler av 1) 95 ° c för 30 s, 2) 55 ° c för 30 s, 3) 72 ° c för 30 s; slutlig förlängning vid 72 ° c i 5 min; och håll vid 4 ° c.
Anmärkning: Även om detta 16S rRNA genamplifiering metod bör arbeta med olika typer av biospecimen, det rekommenderas att standardisera antalet amplifiering cykler när du startar ett nytt projekt. - Bekräfta storleken på PCR1 produkt genom att ladda 1 μL av DNA på en hög känslighet elektrofores chip. Alternativt, kör 5 μL av 16S rRNA-Amplified produkt på en 1,5% aguppstod gel för att bekräfta 550 BP av PCR1 produkten.
Anmärkning: Sanering av 16s rRNA förstärks produkt är frivilligt och beror på DNA-isolering kit/metod som används. Om du använder en egen DNA-isoleringsmetod, PCR1 produkten kan rengöras med hjälp av en mikrobiomet DNA rening kit enligt tillverkarens protokoll (se tabell över material). DNA isolerings satsen som används här ger en ultrarent DNA och kräver inte sanering av PCR1 produkten.
4. uppbyggnad av DNA-bibliotek med indexerad PCR (PCR2)
-
Placera index 1 och index 2 barkodade primers i en särskild rack (se tabell över material) för 96 bibliotek.
- Ordna index 1 primer i kolumnerna 1 – 12 och index 2 primer i rader A – H i specialhyllan.
- Tillsätt 2,5 μL av index 1 i kolumnerna 1 – 12 och index 2 i rad A – H med multikanalpipetter. Placera den nya locket (se tabell över material) på index 1 och index 2 förstagångstillämpare primers och förvara den i a-20 ° c frys.
- Med hjälp av en multikanalpipett, tillsätt 12,5 μl av 2x High Fidelity polymeras enzym mix som innehåller en buffert, förutom dNTPs (se tabell över material); 5 μL PCR-gradvatten och 2,5 μL 16S rRNA-amplifierad produkt.
Anmärkning: Lägg till unika index till varje prov för multiplexering av mer än 96 bibliotek i en enda körning, som beskrivs i Kiernan et al.27. I detta protokoll används adaptrar från en kommersiell sats (t. ex. NextEra XT index Kit) enligt tillverkarens anvisningar i 16s metagenomik sekvenseringsmetod (t. ex. Illumina). - Försegla och centrifugera den indexerade PCR-plattan vid 1 000 x g vid 20 ° c i 1 min och utför PCR i en termisk apparat programmerad för: 95 ° c i 3 min; 8 cykler av 1) 95 ° c för 30 s, 2) 55 ° c för 30 s, 3) 72 ° c för 30 s; och slutlig förlängning vid 72 ° c i 5 min.
- Bekräfta 630 basstorleken för den indexerade PCR-produkten genom att fylla på 1 μL DNA på ett elektrofores-chip med hög känslighet. Alternativt kan du köra 5 μL indexerad PCR-produkt på en 1,5% agaros gel för att bekräfta produktens storlek och intensitet.
5. sanering av indexerad PCR (PCR2) och kvantifiering
- Pool 5 μl av PCR2 amplikon med multikanalpipetter från varje brunn in i en Multichannel reservoarbricka fri från detekterbar DNase, RNase, humant DNA, och pyrogena bakterier (se tabell över material).
- Överför den poolade produkten från det flerkanaliga reservoarfacket till ett tomt, förmärkt 1,5 mL microcentrifugerör och Vortexblanda.
- Purify PCR2 produkt med hjälp av standard magnetiska pärlor Kit (se tabell över material) enligt tillverkarens instruktion. Försegla och förvara resterande 20 μL PCR2 i samma platta vid-80 ° c för vidare användning, vid behov.
- Bered färsk 80% etanol genom tillsats av 4 mL 100% etanol till 1 mL PCR-gradvatten.
- Equilibrate den magnetiska pärlan till RT och Vortex för 30 s för att skingra pärlorna jämnt.
- Kort virvel och snurra ner poolade PCR2 amplikon prover.
- Tillsätt 80 μL av de magnetiska pärlorna i ett förmärkt, sterilt 1,5 mL microcentrifugerör med 80 μL av poolade PCR-produkter, och snurra sedan en kort stund för att jämnt Omsuspendera de magnetiska pärlorna.
- Inkubera innehållet vid RT utan att störa rören i 15 min.
- Placera röret med DNA och magnetiska pärlor på ett magnetiskt stativ (se tabell över material) för 5 min.
- Ta försiktigt bort och kassera 150 μL av supernatanten.
- Tillsätt 200 μL nyberedd 80% etanol utan att störa pärlorna och inkubera i 30 s.
- Ta försiktigt bort och kassera alla supernatanten.
- Upprepa steg 5.11 – 5.12. Ta bort den återstående volymen med en P10-pipett. Låt pärlorna lufttorka i 15 min, med index PCR-röret kvar på magnet stativet.
- Ta bort från magnet stativet. Tillsätt 33 μL elueringbuffert (elutionsbuffert för DNA-kit är acceptabelt). Vortex well, och utför en snabb dragning för att ta bort eventuell kvarvarande vätska på sidan. Inkubera i 2 min och placera på magnet stativet i 5 min.
- Överför 30 μL av supernatanten (rena PCR-produkter) till ett förmärkt 1,5 mL microcentrifugerör.
- Kvantifiera den renade poolen genom att lasta 1 μL av den renade poolen på en Fluorimeter eller hög känslighet elektrofores chip, eftersom detta kommer att krävas under sekvensering. Utför MiSeq som beskrivs nedan.
6. MiSeq-sekvensering
- Skapa ett exempel blad som innehåller exempel-specifik streckkodsinformation för arbetsflödet i metagenomik och demultiplexering på MiSeq-instrumentet (se tabell över material). Ladda upp detta prov blad till programvaran (t. ex. Illumina experiment Manager).
- Späd de poolade biblioteken från steg 5,15 till 4 nM.
- Denature poolade bibliotek genom att kombinera 5 μL av 4 nM bibliotekspool med 5 μL nyberedd 0,2 M NaOH i en 1,5 mL microcentrifug tub. Vortex kort för att blanda, Centrifugera kort och inkubera i 5 minuter vid Ambient RT.
- Tillsätt 990 μL iskall hybridiseringsbuffert (HB-buffert) och Pipettera försiktigt för att blanda. Detta kommer att ge ett 20 pM-bibliotek.
- Kombinera 2 μL av 10 nM kontroll bibliotek med 3 μL EBT-buffert (10 mM Tris-HCl, pH = 8,5, med 0,1% Tween 20) för att ge ett 4 nM kontroll bibliotek. Tillsätt 5 μL nypreparerade 0,2 N NaOH och skaka en kort stund för att blanda. Inkubera i 5 minuter vid RT.
-
Tillsätt 990 μL iskall hybridiseringsbuffert (HB-buffert) och Pipettera försiktigt för att blanda. Detta kommer att ge 20 pM kontroll bibliotek.
Obs: denaturerade 20 pM kontroll bibliotek kan lagras vid-20 ° c upp till för 4 veckor. Efter 4 veckor, kluster nummer tenderar att minska.- Kombinera 210 μL av 20 pM-biblioteket med 40 μL av 20 pM kontroll bibliotek (slutlig koncentration = ~ 18%), och tillsätt 350 μL av HB buffert. Ladda biblioteket vid en slutlig koncentration av 7 pM.
Anmärkning: Ingångsinformation ska justeras enligt körningsprestanda.
- Kombinera 210 μL av 20 pM-biblioteket med 40 μL av 20 pM kontroll bibliotek (slutlig koncentration = ~ 18%), och tillsätt 350 μL av HB buffert. Ladda biblioteket vid en slutlig koncentration av 7 pM.
- Inkubera prover i 2 min vid 96 ° c. Sätt på is i 5 min. Ladda 600 μL av den slutliga poolen i lämplig brunn av MiSeq patroner.
Anmärkning: Avsnitt 6 ovan kan utföras vid en genomisk/DNA-kärnanläggning.
7. data behandling och sekvensanalys
- Använd R programvara (version 3,5) för DADA2 databehandling och analyser. För steg 7.1 – 7.4, Använd Open-Access-programvaran enligt beskrivningen i den tidigare utvecklade DADA2 online tutorial finns på < https://benjjneb.GitHub.io/dada2/tutorial.html >.
Anmärkning: En lätt användbar R-skript har bifogats som en kompletterande fil 2, och användare måste ändra namn och källa för sekvensering filer (t. ex. SAMPLENAME_R1_001. fastq och SAMPLENAME_R2_001. fastq). - Visualisera kvalitets profilerna för framåt-och bakåtläsningar med hjälp av kommandot Plotqualityprofile .
- Trimma nukleotider från framåt och bakåt läsningar baserat på kvaliteten tomt. Dessa parametrar anges av den truncLen parametern i DADA2.
Anmärkning: Här används 280 som den längd tröskel för vilken den framåt läsningar skulle kasseras och 260 används som längd tröskelvärdet som omvänd läsningar skulle kasseras. - Bearbeta rå 16s data som fastq filer av DADA2 pipeline som beskrivs i online-självstudierna (finns på < https://benjjneb.GitHub.io/dada2/tutorial.html >) att sammanfoga R1 och R2 läser och bildar amplikon sekvens varianter (asvs), som sedan används för att tilldela taxa med referensdatabasen Silva23.
En exempelvariant av amplikon Sequence som genererats från DADA2-pipelinen inkluderas som tilläggsfil 3. Antingen en Greengene eller Silva referensdatabas kan användas, eftersom inga skillnader i bakteriell klassificering hittades med någon av dessa databaser. - Generera en användardefinierad mappningsfil som innehåller metadata (t. ex., genotyp, kön, behandling, etc.) för varje exempel. En exempel-metadatafil har inkluderats som kompletterande fil 4.
- Beräkna alfa mångfald (Shannon index) och beta mångfald med hjälp av Principal koordinater analys (PCA) baserat på förtunnade OTU räknas med hjälp av phyloseq28 som beskrivs i online tutorial, finns på < https://benjjneb.GitHub.io/dada2/tutorial.html >.
- Utför följande analys i METAGENassist29.
Anmärkning: utför differential överflöd analys med Wilcoxon Rank-sum test på släktet nivå. Värmekartor och Differentiellt riklig taxa markeras med METAGENassist29, en offentligt tillgänglig och webbaserad analyspipeline.- Ladda upp taxonomiska överflöd tabell (CSV-format) och välj prover i kolumnen.
- Ladda upp mappningsfilen (CSV-format) och välj exempel i en rad.
- Välj alternativ för att ta bort variabler med över 50% nollor och exkludera ej tilldelade och omappade läsningar.
- Välj alternativ för att normalisera rader efter summa och logga normalisera kolumner.
- Gör en vulkan, PCA, eller plsda Plot genom att klicka på samma i den vänstra kolumnen och klicka på ta bort exempel namn för att göra grafen.
- Utför ett t-test (om bara två grupper) eller ANOVA (om större än två grupper) för att visualisera de funktioner (bakterier) som skiljer sig mellan grupperna. Klicka på valda funktioner för att visualisera specifika bakterier som skiljer sig mellan grupperna.
- Klicka på Dendrogram eller Värm kartan för att skapa respektive tomter. Ytterligare analys, som exempel visualisering av grupper eller t-test/ANOVA-baserade topp 25 funktioner, kan utföras.
- Klicka på randomforest att skapa grafer som visar funktioner som kan användas för klassificering. Klicka på fliken avvikelse överst om du vill skapa diagram för de översta funktionerna som skiljer sig mellan/mellan grupper. Klicka på funktionsdetaljer för att se en lista över bakterier som skiljer sig mellan grupperna och klicka på varje bakterie för att skapa en grafisk Sammanfattning av densamma.
- Klicka på fliken outlier överst för att visualisera exempel som är extremvärden.
- Slutligen, klicka på Ladda ner och välj antingen 1) en zip-fil som innehåller alla de analyser som utförs eller 2) de önskade funktionerna för att ladda ner. Denna fil ska sparas som ett unikt namn och kommer att behöva packas upp innan användning.
Anmärkning: För detaljerade statistiska tester som utförs under mikrobiomet analys, hänvisa till verk av Chen et al. och hugerth et al.14,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som MHC klass II molekyler (HLA hos människor) är centrala aktörer i den adaptiva immunförsvaret och Visa starka associationer med en anlag till MS24,25,26, det var en hypotes om att HLA klass II-molekylen skulle påverka tarmens mikrobiella sammansättning. Därför har möss som saknar genen MHC class II (AE. KO) eller uttryckt humant HLA-DQ8-genen (HLA-DQ8) utnyttjats för att förstå betydelsen av HLA-klass II-molekyler vid utformningen av den mikrobiella gruppen.
Fekal prover samlades in från AE. KO (n = 16) och HLA-DQ8 (n = 12) transgena möss, bakterie-DNA extraherades, och v3-v4 regionen av 16S rRNA genen förstärkallades. Amplikon storlek (550 BP) bekräftades genom att köra proverna på en 1,5% aguppstod gel (figur 2A, körfält 1–6). Ytterligare bekräftelse av 16s rRNA amplikon storlek (550 BP) utfördes genom lastning 1 μl av PCR1 produkten på en hög känslighet elektrofores chip (figur 2b, körfält 1–7).
En elektroferogram genererades från 16s rRNA PCR produkt, som visade toppregioner med fragment storlek ~ 550 BP (figur 2C). Dubbla index och sekvenseringsadaptrar bifogats med indexerad PCR (PCR2) som tilldelade en unik identitet till varje prov och tillät multiplexering av många exempel i en enda MiSeq-sekvensering. En bekräftelse av indexerad PCR utfördes av agaros gel elektrofores (figur 2A, körfält 7–12) och ett högkänsligt elektrofores-chip (figur 2b, körfält 8–12), figur 2D]. Alla prover från PCR2 poolades, renas och lastas på en nästa generations Sequencer som gav framåt R1 och omvänd R2 läsningar av god kvalitet (figur 3). Medianvärdet som erhålls läsningar efter kvalitets filtrering och trimning var 88 125 (intervall 9597 – 111848).
Gemenskapens ekologi analys utfördes med hjälp av DADA2 analys pipeline och visualiseras med Phyloseq och METAGENassist att demonstrera skillnader i alfa mångfald (figur 4) och beta mångfald (figur 5), samt skillnader vid Släkte och artnivåer mellan grupperna. DADA2 analys genererade ett överflöd tabell med kommaseparerade värden i CSV-format, som användes för ytterligare nedströms analys med hjälp av en webbaserad plattform (dvs, Phyloseq och/eller METAGENassist). Alfa-och beta mångfalds analyserna utfördes baserat på användardefinierade kategorier som listas i en mappningsfil.
Shannon mångfalds analys avslöjade en övergripande lägre alfa mångfald för AE. KO möss jämfört med HLA-DQ8 transgena möss (figur 3). Koordinering med huvudsaklig koordinatanalys visade en distinkt rumslig klustring mellan AE. KO möss och HLA-DQ8 transgena möss (figur 5). Ett överflöd tabell från DADA2 användes också för att utföra en omfattande potenta analys med hjälp av Open-Access-programvara metagenassist29. Värmekartbaserad klustring av bakterie överflöd (Genus nivå) (figur 6a) och en lådplot för specifika bakterier som visar skillnaderna mellan två grupper (figur 6b) genererades med hjälp av en metagenassist-pipeline.
Värme kart analys visade att vissa bakterier som Allobacullum, Desufovibrio och rikenella var vanligare i HLA-DQ8 transgena möss. Biolophila var däremot mer rikligt förekommande i AE. KO-möss (figur 6b). Relativ abundans av enskilda bakterier (bilophila och rikenella) visas i en representativ lådplot (figur 6b). Sammantaget visar data att AE. KO möss har en distinkt mikrobiell gemenskap jämfört med HLA-DQ8 transgena möss, med en avsaknad av specifika bakterier i AE. KO möss. Uppgifterna tyder också på att MHC klass II molekyler spelar en viktig roll i överflödet av vissa bakterier. Sammanfattnings, detta enkla och detaljerade protokoll kommer att hjälpa forskare som är nya på mikrobiomet fältet samt de som behöver uppdateringar om metoder för att uppnå högre taxonomisk upplösning.
Figur 1: flödesdiagram över sekvenseringen av tarmmikrobiomen. Alla steg i mikrobiomet sekvensering (provinsamling till mikrobiomet dataanalys) visas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:16S rRNA genamplifiering och kvalitetskontroll analys av v3 – v4 regionen. (A) representativ agaros gel elektrofores bild av 16s amplikon (PCR1, storlek 550 BP) och indexerad PCR (PCR2, storlek = 630 BP) från AE. KO möss (körfält 1 – 3 och 7 – 9) och HLA-DQ8 transgena möss (körfält 4 – 6 och 10 – 12). B) representativ gel bild av 16s AMPLIKON (PCR1, storlek = 550 BP) och INDEXERAD PCR (PCR2, storlek = 630 BP) av AE. KO möss (körfält 1 – 3 och 8 – 10) och HLA-DQ8 transgena möss (körfält 4 – 7 och 11 – 12) som löses genom elektrofores. (C) representativa elektrofoniogram av 16s amplikon (PCR1) visade en topp region med fragment som var dimensionerade ~ 550 BP.D) representativt elektroferogram av indexerad PCR (PCR2) visade en topp region bestående av fragment storlek ~ 630 BP. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kvalitetsprofil för framåt läsningar (R1, Top) för två representativa prover och motsvarande omvända läsningar (R2, botten) för samma prover. Analysen utfördes med en DADA2 pipeline, där x-axeln visar Läs längd (0 – 300 baser) och y-axeln visar kvaliteten på läsningar. Den gröna linjen representerar median resultatet, medan den orangefärgade linjen representerar kvartil av kvalitetsresultat fördelningen vid varje bas position. Framåt läsningar (R1) visade alltid bättre kvalitet än omvänd läsningar (R2). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: alfa mångfalds åtgärder (Shannon Diversity) av AE. KO möss och HLA-DQ8 transgena möss. Varje prick representerar α-mångfald (Shannon Diversity) i ett prov från en enda mus. Shannon mångfald var överlag lägre för AE. KO möss jämfört med HLA-DQ8 transgena möss. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: samordning med partiellt minst kvadrat-baserade dimensionen analys tomt. Handlingen visar en tydlig separation mellan AE. KO möss och HLA-DQ8 transgena möss. Varje prick representerar bakterie sammansättningen i ett prov, och prickade solförmörkelser indikerar 80% konfidensintervall. PLS-DA tomter genererades med hjälp av METAGENassist. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: AE. KO-möss som uppvisar en distinkt mikrobiell gemenskap jämfört med HLA-DQ8 transgena möss, med frånvaro av specifika bakterier i AE. KO-möss. (A) värmekarta kombinerat med agglomerativ hierarkisk klustring som visar det relativa överflödet av bakterier (Genus nivå). B) fält som visar ett normaliserat relativt överflöd av två representativa bakterier (Bilophila och RIKENELLA) i AE. ko och HLA-DQ8 transgena möss. Båda tomterna genererades med METAGENassist. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: representativ bild av avdelare boxen för insamling av fekal prover från flera möss i taget. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil 2: DADA2 R-script för att generera överflöd tabell från RAW-sekvenser. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande fil 3: Representativt släkte överflöd tabell (CSV-format). Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Kompletterande fil 4: Representativ mappningsfil (CSV-format). Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det beskrivna protokollet är enkelt, med lätt att följa steg för att utföra mikrobiomet profilering med 16s rRNA potenta sekvensering från ett stort antal biospecimen av intresse. Nästa generations sekvensering har förändrat mikrobiella ekologi studier, särskilt i humana och prekliniska sjukdomsmodeller31,32. Den största fördelen med denna teknik är dess förmåga att framgångsrikt analysera komplexa mikrobiella kompositioner (culturable och icke-culturable mikrober) i ett givet biospecimen på en hög genomströmning nivå och till en låg kostnad32. Men flera faktorer (dvs. batcheffekter, val av primers för 16S rRNA gen, och sekvens dataanalys) förblir ett stort hinder i den utbredda användningen av denna teknik.
Avancerad 16S rRNA-baserade MiSeq sekvenseringstekniker (2x300bp)33 tillåter sekvensering av ~ 600 nukleotider av de 1 500 nukleo-långa 16s rRNA genen av bakterier, som övervann den tidigare flaskhalsen av kort sekvensering läsningar. Primers specifika för en annan region av rRNA såsom v1-v2, v3-V5, eller V6-v9 kan användas med varje regionspecifika primers visar vissa bias för över-eller under-detektering av särskilda taxa34,35. Vissa grupper föredrar v1-v2 region21, som visar en ökad bias för Clostridium men Underdetection för vissa Bacteroidetes arter. Andra grupper föredrar däremot v4-, v3-v4-och v3-V5-regionerna, som visar den minst partiska klassifikationen av bakterie taxa15,20,36,37.
Det nuvarande protokollet använder primers specifika för v3-v4 regioner i 16s rRNA genen, eftersom den omfattar den längre regionen 16s rRNA med två hypervariabel regioner (v3 och v4) jämfört med v4 ensam. Dessutom kan v3-v4 specifika amplikon sammanslagning av både framåt (R1) och omvänd (R2) läsningar, vilket leder till bättre upplösning av bakteriell klassificering. Även om v3 – V5-regionen ger längre läsningar och täcker mer hypervariabla regioner (v3, v4 och V5), är det svårt att sammanfoga R1 och R2 läsningar på grund av inga/små överlappande områden mellan R1 och R2 läser. Därför har ett antal studier använt data endast från R1 läsningar för bakteriell klassificering när du utför 16s rRNA potenta sekvensering med v3-V5 region14.
Korrekt biospecimen lagring och hantering är avgörande för mikrobiomet analys för att förhindra nedbrytning av bakteriell DNA eller miljöförorening38. Långtidsförvaring av biospecimen vid RT eller 4 ° c kan leda till överväxt av vissa bakterier eller svampar. Proverna kan antingen frysas omedelbart eller transporteras vid 4 ° c (under 1 – 3 dagar) och sedan frysas. Biospecimen kan också lagras direkt i konserveringsmedel såsom nukleinsyras stabiliserings lösning (t. ex. RNA-senare), 95% etanol eller en kommersiell lagrings sats. Den allmänna uppfattningen är att någon av dessa lagringsmetoder inte orsakar betydande skillnader i bakteriella community-profiler39,40. Även om en lösning med konserveringsmedel möjliggör lagring och transport vid RT, kan dessa prover inte användas för RNA-baserade analyser, metaboliteanalyser eller fekala transplantations experiment. Dessa frågor har diskuterats i detalj någon annanstans39,40.
Ett av de kritiska stegen i detta protokoll är användning av en pärlsvävningsbaserad metod för mekaniska störningar av grampositiva bakterier och Archaea. En tidigare studie visade den högsta bakteriella mångfalden med hjälp av den pärlsvävningsbaserade metoden jämfört med andra metoder för cell lysis41. En ofullständig bakteriell lysis eller förorening under DNA-extraktion kan införa bias i Gut mikrobiomet data42. En annan viktig punkt att tänka på är kontaminering på grund av laboratoriereagens som ingår i kit kallas kitome43,44,45. Prover med stor biomassa och rik bakteriell mångfald såsom jord eller avföring visar mindre av dessa problem jämfört med prover med lägre biomassa som hud. Därför bör en kontroll av vattenutvinning ingå i varje extraktion och bearbetas med andra prover för att identifiera införandet av potentiell förorening på grund av DNA-extraktion43,44,45.
I mikrobiomet analys, mångfald i ett prov kan mätas med alfa mångfald, ett mått på rikedomen av arter, eller beta mångfald, som uppskattar olikheter mellan prover/grupper. Populära metoder för att mäta α-mångfald inkluderar UniFrac (viktat och oviktat) tillsammans med multivariat statistiska tekniker som Principal koordinat Analysis (PCoA) eller Brey-Curtis dissimilarity. Medan unifrac är baserad på fylogenetiska avstånd, BREY-Curtis olikhet analys utnyttjar bakteriell överflöd för att generera tomter. Djupgående beskrivningar om α-och β-mångfald iare diskuteras någon annanstans30,46,47. Ett antal statistiska metoder kan utnyttjas för att jämföra skillnader i mikrobiella samhällen mellan grupperna14,48. Det rekommenderas att använda justerade p-värden i stället för RAW p-värden för att korrigera för flera tester14.
Det finns en mängd olika bioinformatik programvara för att analysera riktade sekvenserings data självständigt49. Det föreslagna protokollet använder R-baserade programvarupaket med öppen källkod, vilket möjliggör användarvänlig och snabb profilering av bakterie taxa genom R-baserade DADA2 pipelines. Den överflöd tabell som genereras från DADA2 kan användas för nedströms analys med hjälp av phyloseq och METAGENassist. DADA2 pipeline är fördelaktigt över QIIME eftersom det inte kräver särskilda funktioner (d.v.s. installation av virtuella datorer eller Docker-containrar), som behöver relativt stora beräkningsresurser och särskild teknisk expertis. Speciellt för nybörjare till 16S analys, R är tilltalande, eftersom det är gratis och tillåter användare att dra nytta av tillgängliga online tutorials och analys skript som är lätta att utföra. Viktigt är att dessa analysverktyg kräver relativt små beräkningsresurser och kan köras på en PC, Macintosh eller Linux-baserad plattform. Dessutom kan METAGENassist använda överflöd tabeller genereras från DADA2 pipelines samt biologisk observation Matrix (BIOM) filer som genereras från QIIME/MG-RAST för att utföra analyser såsom PCA, partiell minsta kvadrat diskriminantanalys (PLS-DA), Volcano tomter, t-tester (jämföra två grupper), ANOVA (jämföra tre eller flera grupper), värmekarta tomter, slumpmässig skogs analys, etc. METAGENassist hittades vara mycket användarvänlig.
Sammanfattnings, detta protokoll beskriver en enkel 16s rRNA potenta profilering pipeline, med en detaljerad guide om provinsamling, DNA-extraktion, potenta bibliotek förberedelse, sekvensering på Illumina MiSeq, och användarvänlig dataanalys med hjälp av fritt tillgängliga plattformar (d.v.s. DADA2, phyloseq och METAGENassist). Även om 16s rRNA potenta-baserade taxonomiska profilering är tillförlitlig för karakterisering av bakterier som finns i synnerhet biospecimen, kan Shotgun potenta sekvensering vara en bättre metod för detaljerad metabolisk väg analys och stam-specifika bakteriell identifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A. M. fick royalties från Mayo Clinic (betalas av Evelo Biosciences) som en av uppfinnarna av en teknik som hävdar användningen av Prevotella histicola för behandling av autoimmuna sjukdomar.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiering från NIAID/NIH (1R01AI137075-01), den Carver Trust medicinsk forskning initiativ Grant, och University of Iowa Environmental Health Sciences Research Center, NIEHS/NIH (P30 ES005605).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Natural Microcentriguge Tube | USA, Scientific | 1615-5500 | Fecal collection |
| 3M hand applicator squeegee PA1-G | 3M, MN, US | 7100038651 | Squeeger for proper sealing of PCR Plate |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter, IN, USA | A63880 | PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up |
| Agilent DNA 1000 REAGENT | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Bioanalyzer DNA 1000 chip | Agilent Technologies, CA, USA | 5067-1504 | DNA quantification and quality control |
| Index Adopter Replacement Caps | Illumina, Inc., CA, USA | 15026762 | New cap for Index 1 and 2 adopter primer |
| DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit | MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA | 12855-100 | DNA isolation |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x) | Kapa Biosystem, MA, USA | KK2602 | PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2 |
| Lewis Divider Boxes | Lewis Bins, WI, US | ND03080 | Fecal collection |
| Magnetic stand | New England BioLabs, MA, USA | S1509S | For PCR clean-up |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4346906 | PCR Plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 4311971 | PCR Plate Sealer |
| Microfuge 20 Centrifuge | Beckman Coulter, IN, USA | B30154 | Centrifuge used for DNA isolation |
| MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3 | Illumina, Inc., CA, USA | MS-102-3003 | For MiSeq Sequencing |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina, Inc., CA, USA | FC-131-1001 | 16S rRNA DNA Library Preparation |
| Reagent Reservoirs Multichannel Trays | ASI, FL,USA | RS71-1 | For Pooling of PCR2 Product |
| Plate Cetrifuge | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | 75004393 | For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate |
| PhiX Control | Illumina, Inc., CA, USA | FC-110-3001 | For MiSeq Sequencing control |
| Microbiome DNA Purification Kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | A29789 | For purification of PCR1 product |
| PowerLyzer 24 Homogenizer | Omni International, GA, USA | 19-001 | Bead beater for DNA Isolation |
| Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit | Thermo Fisher Scientific, CA, USA | Q32854 | DNA quantification |
| TruSeq Index Plate Fixture | Illumina, Inc., CA, USA | FC-130-1005 | For Arranging of the index primers |
| Vertical Dividers (large) | Lewis Bins, WI, US | DV-2280 | Fecal collection |
| Vertical Dividers (small) | Lewis Bins, WI, US | DV-1780 | Fecal collection |
References
- Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
- Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
- Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
- Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
- Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
- Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
- Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
- Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
- Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
- Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
- Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
- Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
- Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
- Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
- Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).
- Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
- Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, Suppl 1 23-28 (2010).
- Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
- Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
- Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
- Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
- Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
- Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
- Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
- Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
- Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
- Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
- Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
- Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
- Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
- Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
- Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
- Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
- Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
- Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
- Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
- Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
- Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).
