Summary

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Published: August 02, 2019
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Summary

Questo articolo presenta un metodo per studiare il recettore del glutammato (GluR) nel traffico di cellule ippocampali primarie dissociate. Utilizzando un approccio anticorpale-alimentazione per etichettare i recettori endogeni o sovraespressi in combinazione con approcci farmacologici, questo metodo consente l’identificazione di meccanismi molecolari che regolano l’espressione della superficie di GluR modulando processi di internalizzazione o riciclaggio.

Abstract

Le risposte cellulari agli stimoli esterni si basano fortemente sull’insieme di recettori espressi sulla superficie cellulare in un dato momento. Di conseguenza, la popolazione di recettori espressi in superficie è costantemente adattandosi e soggetta a rigidi meccanismi di regolazione. L’esempio paradigmatico e uno degli eventi di traffico più studiati in biologia è il controllo regolato dell’espressione sinaptica dei recettori del glutammato (GluRs). I GluR mediano la stragrande maggioranza della neurotrasmissione eccitatoria nel sistema nervoso centrale e controllano i cambiamenti funzionali e strutturali dipendenti dall’attività fisiologica a livello sinaptico e neuronale (ad esempio, plasticità sinaptica). Le modifiche nel numero, posizione, e la composizione delle sottounità di superficie espressi GluRs influenzano profondamente la funzione neuronale e, infatti, le alterazioni in questi fattori sono associate a diverse neuropatie. Presentato qui è un metodo per studiare il traffico di GluR nei neuroni primari ippocampali dissociati. Un approccio di “alimentazione anticorpale” viene utilizzato per visualizzare in modo differenziale le popolazioni di GluR espresse nelle membrane superficiali e interne. Etichettando i recettori di superficie sulle cellule vive e fissandoli in momenti diversi per consentire l’endocitosi e/o il riciclaggio dei recettori, questi processi di traffico possono essere valutati e studiati in modo selettivo. Questo è un protocollo versatile che può essere utilizzato in combinazione con approcci farmacologici o sovraespressione di recettori alterati per ottenere informazioni preziose sugli stimoli e sui meccanismi molecolari che influenzano il traffico di GluR. Allo stesso modo, può essere facilmente adattato per studiare altri recettori o proteine espresse dalla superficie.

Introduction

Le cellule utilizzano il processo attivo di traffico per mobilitare le proteine a specifiche localizzazioni subcellulari ed esercitare una rigorosa regolazione spatiotemporale sulla loro funzione1. Questo processo è particolarmente importante per i recettori transmembrani, poiché le risposte cellulari a diversi stimoli ambientali si basano su cascate intracellulari innescate dall’attivazione del recettore. Le cellule sono in grado di modificare queste risposte alterando la densità, la localizzazione e la composizione delle sottounità dei recettori espressi sulla superficie cellulare tramite il regolamento del traffico subcellulare del recettore2 . L’inserimento di nuovi recettori sintetizzati nella membrana plasmatica, insieme all’endocitosi e al riciclaggio dei recettori esistenti sono esempi di processi di traffico che determinano il pool netto di recettori espressi in superficie2. Molti meccanismi molecolari cooperano per regolare il traffico di proteine, comprese le interazioni proteina-proteina e le modifiche post-traduzionali come il fosforo, l’ubiquitinazione o il palmitoylation2.

La regolazione del traffico dei recettori è particolarmente necessaria in cellule fortemente polarizzate con strutture altamente specializzate. L’esempio paradigmatico è il controllo della funzione neuronale mediante traffico regolato di recettori del glutammato (GluR)3,4. Glutamate, il principale neurotrasmettitore eccitatorio, lega e attiva GluR espressi in superficie per controllare le funzioni neuronali fisiologiche fondamentali come la neurotrasmissione sinaptica e la plasticità sinaptica. Il fatto che il traffico alterato di GluR sia stato osservato in un ampio spettro di neuropatie, che vanno dai disturbi del neurosviluppo alle malattie neurodegenerative, evidenzia l’importanza di questo processo5. Pertanto, comprendere gli eventi molecolari che controllano il traffico di GluR è di interesse in molte aree di ricerca.

In questo protocollo, viene utilizzato un metodo basato sull’alimentazione degli anticorpi per quantificare il livello di GluR espressi in superficie nei neuroni ippocampali primari, nonché per valutare come i cambiamenti nell’internalizzazione e nel riciclo si traducano nell’espressione della superficie netta osservata. L’uso di farmacologia e/o sovraespressione di recettori esogeni che ospitano mutazioni specifiche rende questo protocollo un approccio particolarmente potente per studiare i meccanismi molecolari alla base dell’adattamento neuronale a diversi stimoli ambientali. Un ultimo esempio dell’utilità di questo protocollo è lo studio di come i cambiamenti multifattoriali nell’ambiente (come in un modello di malattia) influenzino il traffico di GluR attraverso l’esame dell’espressione superficiale in tali modelli.

Utilizzando esempi specifici, è inizialmente dimostrato come una manipolazione farmacologica che imita la stimolazione sinaptica fisiologica [LTP chimico (cLTP)] aumenti l’espressione superficiale della sottounità endogena GluA1 del tipo AMPA dei GluR (AMPAR) 6.Il traffico di una forma fosforo-mimetica sovraespressa della sottounità GluN2B di NLUDA-tipo di GluRs (NMDAR) viene analizzato anche per esemplificare come questo protocollo può essere utilizzato per studiare la regolazione del traffico di GluR da parte di specifiche post-traslazionali Modifiche. Anche se questi esempi specifici sono utilizzati, questo protocollo può essere facilmente applicato ad altri GluR e altri recettori e proteine che possiedono domini extracellulari antigenici. Nel caso in cui non siano disponibili anticorpi per i domini extracellulari, la sovraespressione delle proteine con etichettatura epitope extracellulare (ad esempio, Flag-, Myc-, GFP-tagged, ecc.) può aiutare nell’etichettatura delle proteine.

L’attuale protocollo fornisce istruzioni per quantificare la densità e il traffico specifici di sottotipi di GluR utilizzando anticorpi specifici. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare 1) espressione di superficie GluR totale, 2) internalizzazione GluR e 3) riciclaggio di GluR. Per studiare ogni processo singolarmente, si consiglia di iniziare con le sezioni 1 e 2 e continuare con le sezioni 3, 4 o 5. In tutti i casi, terminare con le sezioni 6 e 8 (Figura 1).

Protocol

Il lavoro per la preparazione della cultura primaria dell’ippocampo è stato esaminato e approvato dal Northwestern University Animal Care and Use Committee (protocollo #IS00001151). 1. Preparazione prima dell’etichettatura Preparazione e manutenzione delle colture primarie dell’ippocampo Preparare colture primarie di ippocampali ad una densità di 150.000 cellule placcate su bicchieri di copertura rivestiti in poli-D-lysina (0,1 mg/mL). Eccellenti guide p…

Representative Results

Questo protocollo per studiare il traffico dei recettori del glutammato si basa sull’etichettatura differenziale dei recettori espressi sulla superficie cellulare e su quelli espressi nelle membrane interne. La segregazione si ottiene etichettando i recettori prima e dopo la permeabilizzazione della membrana, utilizzando lo stesso anticorpo primario ma un anticorpo secondario coniugato a un fluoroforo diverso. Come delineato dalle fasi facoltative incluse il protocollo, questo è un metod…

Discussion

L’interazione tra una cellula e il suo ambiente (ad esempio, la comunicazione con altre cellule, la risposta a diversi stimoli, ecc.), si basa fortemente sulla corretta espressione dei recettori sulla superficie cellulare. La regolazione rapida e messa a punto nel contenuto del recettore espresso in superficie consente una risposta cellulare adeguata a un ambiente in continua evoluzione. Nel caso particolare dei neuroni, le alterazioni del numero, la localizzazione e la composizione delle sottounità di recettori sinatic…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Northwestern Center for Advanced Scopy per l’uso del microscopio Nikon A1 Confocal e la loro assistenza nella pianificazione e nell’analisi degli esperimenti. Questa ricerca è stata supportata da NIGMS (T32GM008061) (A. M. C.), e NIA (R00AG041225) e da un NARSAD Young Investigator Grant della Brain & Behavior Research Foundation (#24133) (A. S. -C.).

Materials

18 mm dia. #1.5 thick coverglasses Neuvitro GG181.5
Alexa 555-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21424
Alexa 555-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21429
Alexa 647-conjugated goat anti-mouse secondary Life Technologies A21236
Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary Life Technologies A21245
B27 Gibco 17504044
CaCl2 Sigma C7902
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates Corning 3513
Dynasore Tocris 2897
Glucose Sigma G8270
Glycine Tocris 0219
Goat anti-rabbit Fab fragments Sigma SAB3700970
HEPES Sigma H7006
KCl Sigma P9541
L-Glutamine Sigma G7513
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Mouse anti-GluA1 antibody Millipore MAB2263
NaCl Sigma S6546
Neurobasal Media Gibco 21103049
NGS Abcam Ab7481
Parafilm Bemis PM999
PBS Gibco 10010023
Pelco BioWave Ted Pella 36500
PFA Alfa Aesar 43368
Picrotoxin Tocris 1128
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma P7280
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36934
Rabbit anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Rabbit anti-PSD-95 antibody Cell Signaling 2507
Strychnine Tocris 2785
Sucrose Sigma S0389
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-15
Triton X-100 Sigma X100
TTX Tocris 1078

References

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Cite This Article
Chiu, A. M., Barse, L., Hubalkova, P., Sanz-Clemente, A. An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures. J. Vis. Exp. (150), e59982, doi:10.3791/59982 (2019).

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