Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Højeffektiv generation af antigen-specifikke primære mus cytotoksiske T-celler til funktionel testning i en autoimmun diabetes model

doi: 10.3791/59985 Published: August 16, 2019

Summary

I denne artikel beskrives en protokol for generering af antigen specifikke CD8 T-celler og deres ekspansion in vitro med det formål at fremsætte et stort antal funktionelle T-celler til brug in vitro og in vivo.

Abstract

Type 1 diabetes (T1D) er karakteriseret ved ø-specifik autoimmunitet fører til beta celle ødelæggelse og absolut tab af insulinproduktion. I den spontane ikke-fede diabetes (NOD) musemodel, insulin er det primære mål, og genetisk manipulation af disse dyr til at fjerne en enkelt nøgle insulin epitop forebygger sygdom. Således selektiv eliminering af professionelle antigen præsentere celler (APCS) bærer denne patogene epitop er en tilgang til at hæmme de uønskede insulin-specifikke autoimmune reaktioner, og sandsynligvis har større translationel potentiale.

Chimeriske antigen receptorer (biler) kan omdirigere T-celler til selektivt at målrette sygdomsfremkaldende antigener. Denne teknik er grundlæggende for nylige forsøg på at bruge cellulære teknik til adoptiv celleterapi til behandling af flere kræftformer. I denne protokol beskriver vi en optimeret T-Cell retrovirus (RV) transduktion og in vitro-udvidelsesprotokol, der genererer et stort antal funktionelle antigen-specifikke CD8 Car-T-celler startende fra et lavt antal naive celler. Tidligere er flere bil-T-celle protokoller blevet beskrevet, men typisk med relativt lav transduktionseffektivitet og cellelevedygtighed efter transduktion. I modsætning hertil giver vores protokol op til 90% transduktionseffektivitet, og de genererede celler kan overleve mere end to uger in vivo og signifikant forsinke sygdommens indtræden efter en enkelt infusion. Vi giver en detaljeret beskrivelse af cellen vedligeholdelse og transduktionsprotokol, således at de kritiske trin let kan følges. Hele proceduren fra primær celle isolation til bil udtryk kan udføres inden for 14 dage. Den generelle metode kan anvendes på enhver muse sygdomsmodel, hvor målet er kendt. Tilsvarende gælder den specifikke applikation (som er rettet mod et patogen peptid/MHC klasse II-kompleks) for enhver anden autoimmun sygdomsmodel, for hvilken der er identificeret et nøgle kompleks.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I betragtning af den sandsynlige reducerede risiko for uønskede off-Target effekter, antigen-specifikke immunterapi (ASI) er lovende behandlinger for autoimmune sygdomme som T1D. Akkumulerende evidens tyder på, at immunresponset på (prepro) insulin kan være særlig vigtigt i T1D1. I det seneste årti, undersøgelser fra flere grupper, herunder vores egen, kraftigt tyder på, at præsentationen af en epitop indeholdende insulin B kæde aminosyrer 9 til 23 ved specifikke MHC klasse II molekyler (B: 9-23/mhcii), spiller en vigtig rolle i udviklingen af T1D i mus og mennesker2,3,4,5. For selektivt at målrette B: 9-23/MHCII-komplekset genererede vi et monoklonalt antistof, der hedder mAb287, der ikke har nogen krydsreaktivitet til hormonet insulin eller komplekser, der indeholder andre peptider6. MAb287 blokke antigen præsentation in vitro, og ugentlig administration af mAb287 til præ-diabetisk NOD mus forsinket udviklingen af T1D i 35% af de behandlede mus6. For at blokere antigen præsentationen in vivo er hyppige injektioner typisk påkrævet for at opretholde en høj cirkulerende koncentration. Vi hypotese, at vi kunne overvinde dette problem ved at drage fordel af den høje specificitet af Ab287 at omprogrammere T-celler, hvilket giver en forbedret antigen-specifik T celleterapi for T1D7.

Cytotoksiske T-celler er rapporteret at være i stand til at dræbe deres mål, hvis selv en enkelt kopi af deres cognate ligand udtrykkes8,9,10. Således, B: 9-23/MHCII specifikke CD8 T celler forventes at have højere effektivitet i at eliminere uønsket antigen præsentation end det overordnede antistof, som sandsynligvis vil være nødvendigt at binde sig til flere komplekser på samme APC til at udøve sin virkning. Bil T celler har været anvendt til behandling af flere menneskelige kræftformer11,12,13, og kan også være effektiv i autoimmunitet14. Men, bil-T-celler med specificitet for patogene peptid-MHC komplekser er ikke hidtil blevet brugt til at ændre progression af T1D. Ved at bruge den optimerede CD8 T Cell transduktionsteknik, der er beskrevet nedenfor, demonstrerede vi for nylig princippet om, at dette faktisk repræsenterer en holdbar tilgang7.

I denne protokol skitserer vi en effektiv og strømlinet transduktions-og udvidelsesmetode. Vores protokol gælder for andre undersøgelser, der kræver generering af mus CD8 bil T-celler med høj effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mus blev opretholdt under specifikke patogenfri forhold på en transgene muse facilitet, og alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af Baylor College of Medicine Animal Care og brug udvalg.

Bemærk: eksperimentet kræver, at virussen og T-cellerne forberedes parallelt. Tabel 1 opsummerer protokollen. De vigtigste reagenser og buffere er opført i tabellen over materialer. Vi fokuserer på generering og udvidelse af bil-T-celler rettet mod specifikke populationer af APCs i denne protokol.

1. generering og validering af enkelt kæde Fab antistof (scFab)-biler.

Bemærk: biler indeholder typisk 3 kritiske domæner – et antigen målende domæne, et spacer/transmembrane-domæne og et cytoplasmisk signalering-domæne. Den nøjagtige udformning af hver bil afhænger af det tilsigtede mål, og så, bortset fra de vigtigste elementer i den konstruktion, der er relevante for genereringen af retrovirus, vil ikke blive beskrevet i detaljer i denne protokol. Det samlede design af de biler, der anvendes til de nedenfor beskrevne undersøgelser, er vist i figur 1. Kort fortalt omfatter målretningen domænet hele lyskæde og variablen og CH1-domænet for den tunge kæde fra det overordnede monoklonale antistof, der er forbundet med en halvstiv linker. Spacer/transmembrane domænet er fra Mouse CD28, og signalering domænet er en fusion, der indeholder elementer fra Mouse CD28, CD137 (4-1BB) og CD247 (CD3ζ). Disse elementer samles ved standard molekylær biologi procedurer såsom Splice overlap polymerase kædereaktion (PCR), eller syntesen af en passende "gen blok". Nærmere oplysninger om genereringen af mAB287-bilen findes i Zhang et al.7. CDNA-sekvenserne kan fås ved henvendelse til forfatterne efter anmodning.

  1. Montering af bilens konstruktion
    1. Syntetisere målretningen enkelt kæde Fab antistof (scfab) og kombinerede spacer/Signaling domæner separat, og bruge en "3 point" ligering teknik15 til at samle den endelige konstruktion (figur 1).
      Bemærk: det vigtigste krav til bilens skær er, at det skal indeholde ledsage restriktions-endonukleasesteder, der tillader ligering i det retrovirale udtryk Vector pmscv-IRES-gfp II (pmig II), eller en beslægtet afledt15 er også Passende.
  2. Validering af bilens overflade udtryk
    1. Overføre hybridom celle-cellerne ved hjælp af pmig II-afledte retrovirale partikler genereret af en standardprotokol (f. eks. Holst et al.16).
    2. Kør flow flowcytometri analyse for at detektere ekspression af gfp fra bilens vektor17.
    3. Plet overflade ekspression af bilen af de transducerede hybridomer ved hjælp af mærkede antistoffer mod musens κ-kæde (f. eks. klon RMK-45)17.
      Bemærk: 18.
  3. Validering af bilens specificitet
    1. Stimulerer de transducerede hybridom celle-celler med passende plade bundne eller cellulære antigener. Efter overnight Co-kultur indsamle supernatanter og udskillet cytokiner, og analyseret af enzym-linked immunsorbent assay (ELISA)7.
      Bemærk: ideelt set skal hver bil valideres uafhængigt, før den anvendes til transduktion. På dette trin kan eksperimentet sættes på pause og genstartes senere.

2. transfection af virale producent celler (dag-4 til dag 3)

Bemærk: retrovirus produceres ved hjælp af Phoenix-Eco-celler (Se tabellen over materialer)19,20. Anvend passende forholdsregler ved generering af potentielt smitsomme agenser (fortrinsvis med et udpeget BSL-2 kabinet og separat inkubator til dyrkning af transfected/transducerede celler).

  1. Optøning af Phoenix-celler (dag-4)
    1. Tø 2 x 106 Phoenix-Eco-celler. Opskalere antallet af Phoenix-celler, hvis der er planlagt flere transducinger.
    2. Plade dem i en 10 cm vævskultur skål med 10 mL medium (Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) indeholdende 10% føtal kalveserum (FCS)).
  2. Passage Phoenix celler (dag-3)
    1. Fjern mediet, og vask med 5 mL Dulbecco's fosfat-bufferet saltvand (DPBS).
    2. Tilsæt 3 mL 0,25% trypsin og Inkuber ved 37 °C under 10% CO2 -atmosfære i 3 min.
    3. Høst cellerne derefter pellet ved centrifugering i 3 min ved 200 x g. Re-Plate celler med 10 mL frisk medium og inkubere ved 37 °C.
  3. Bestråling af Phoenix-celler (dag-1 eftermiddag)
    1. For at minimere yderligere celledeling, indsamle Phoenix celler som beskrevet i trin 2,2, resuspension i 5 ml medium, og gamma bestråle celler på is (1000 rad).
      Bemærk: der bør udvises forsigtighed ved stråle arbejde for at undgå personale eksponering.
    2. De bestrålede celler centrifugeres, resuspenderes i frisk medium, plade ved 2 x 106 celler (i 10 ml medium)/plate/CAR, og Inkuber.
  4. Transfection (dag 0-morgen)
    1. Opsug supernatanten fra Phoenix-cellerne, vask med 5 ml fosfat-bufferet saltvand (PBS), og tilsæt forsigtigt 7 ml reduceret serum medium (f. eks. afti-MEM) dråbevis til pladens sidevæg for at undgå at forstyrre monolayer. Overfør cellerne tilbage til inkubator.
    2. Tag 2 14 mL runde bund polypropylenrør, og tilsæt 1,5 mL reduceret serum medium til hver. Til et rør tilsættes 40 μl transfektering reagens (Se tabellen over materialer).
    3. Til det andet rør tilsættes 15 μg AB-CAR-plasmid (genereret i trin 1) og 5 μg kuvert og emballage plasmid (5 μg pCL-Eco). Inkubér rørene ved stuetemperatur i 5 minutter.
    4. Tilsæt transfektering reagens blandingen fra trin 2.4.2 dråbevis til det andet rør uden at kontakte rørsiderne, og bland ved at pipettere opløsningen op og ned forsigtigt 3 gange. Inkuber ved stuetemperatur i mindst 20 minutter.
    5. Tilsæt 3 ml af blandingen dråbevis til Phoenix cellerne, og Placer i en vævskultur inkubator.
    6. Efter 4 – 5 h tilsættes 1 mL FCS. Kultur celler natten over ved 37 °C.
  5. Medium ændring (dag 1)
    1. Supernatanten, der indeholder plasmid/transfection reagens komplekser, fjernes og bortskaffes i overensstemmelse med de institutionelle procedurer for håndtering af infektiøs materiale. Tilsæt 4 mL frisk, forvarmet kulturmedium til cellerne.
  6. Høst virus til transduktion (dag 2)
    1. Saml det virus holdige medium fra Phoenix-cellerne med en steril sprøjte, filter (0,45 μm) for at fjerne rest cellerester, og saml i et nyt rør.
    2. Der tilsættes rhIL-2-lager til en endelig koncentration på 200 IE/mL. Brug straks virussen til transduktion (trin 5,3). Tilsæt 4 mL frisk medium til Phoenix cellerne og Placer den i inkubator.
  7. Gentagelse af virus samling (dag 3)
    1. Gentag trin 2,6, men kassér Phoenix-cellerne som smittefarligt affald i stedet for at tilføje fersk medium. Denne supernatanten anvendes i trin 5,4.

3. primær CD8 T celle isolation og aktivering (dag-1 til dag 0)

Bemærk: tidligere, indsamle CD8 T celler fra kvindelige NOD mus på 4 – 5 uger, et tidspunkt før ø betændelse starter21,22. Håndtér alle musene efter godkendte protokoller fra IACUC. CD8 T-celler er beriget med splenocytter ved hjælp af et kommercielt negativt selektions kit.

  1. Belægning plader med CD3/CD28 antistoffer (dag-1)
    1. Der tilsættes 1 mL af en blanding af anti-Mouse CD3 og CD28 antistoffer (begge ved 1 μg/mL i PBS) til hver brønd af en 24-brønd plade og inkubates ved 4 °C natten over.
    2. Den næste dag vaskes pladerne med 1 mL steril PBS 3 gange, før du tilføjer murine CD8 T-cellerne (trin 4,1).
      Bemærk: antallet af brønde, der skal overføres, vil variere for hvert eksperiment, afhængigt af det samlede antal aktiverede CD8 T-celler, der kræves.
  2. Samling af splenocytter (dag 0)
    1. Euthanize to NOD hunmus i alderen 4 – 5 uger ved hjælp af CO2 indånding efterfulgt af decapitation. Høst deres og sætte dem på en celle si iblødsætning i 10 ml PBS i en cellekultur skål på isen.
    2. I en cellekultur hætte, skær hver milt i 3 – 5 stykker, presse væv med et sterilt stempel af en 3 eller 5 mL sprøjte til at tvinge milt fragmenter fra hinanden og tillade celler at passere gennem trådnet.
    3. Fjern forsigtigt røde blodlegemer ved at resuspendere splenocytter i 1:4 fortyndet rød cellelyse buffer (1 mL lysis-buffer i 3 mL PBS for en milt) og inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur.
    4. Derefter fortyndes 10 μL af cellesuspensionen med trypan og et Blue Dye Solution for at tælle celler med et hemocytometer, og pille resten af cellerne ved centrifugering ved 350 x g i 7 min.
  3. Tilsætning af CD8 T-celler (dag 0)
    1. Berige CD8 T celler ved negativt valg ved hjælp af en mus CD8 T celle isolation kit, efter producentens anvisninger.
      Bemærk: for at sikre høj renhed skal du altid afrunde celle numrene ved beregning af mængden af biotinyleret-antistof, der skal tilsættes (f. eks. anvendes det foreslåede volumen af reagenser til 108 celler til en beregnet 9,1 x 107 celler).
    2. Stop celle pellets i 400 μL buffer og 100 μL biotin-antistof cocktail pr. 1 x 108 celler, bland godt og Inkuber i 5 minutter i køleskabet (4 °c) for at tillade antistof binding.
    3. Tilsæt 300 μL mærknings buffer og 200 μL anti-biotin mikro-perler pr. 1 x 108 celler, bland godt og Inkuber i 10 min ved 4 °c.
    4. Mens du venter på binding af mikro-perler, indstilles separations kolonnen på separatoren. Vask kolonnen ved skylning med 3 mL mærknings buffer.
    5. Passere 1000 μL perle/celle blanding gennem en 40 μm celle si før lastning på separations søjlen for at fjerne celle aggregater. Saml kolonne gennemstrømningen i et forkølet 15 mL rør.
    6. Kolonnen vaskes som anvist af producenten, og hele spildevandet opsamles i samme rør. Bestem celle nummeret (samme som trin 3.2.4) og saml ved centrifugering ved 350 x g i 5 min. vask cellerne ved at resuspendere i 2 ml komplet T-celle medium (rpmi-1640 indeholdende FCS, 2-mercaptoethanol, rhil-2 (200 U/ml), mIL-7 (0,5 ng/ml), , HEPES og penicillin-streptomycin) og centrifuger ved 350 x g i 5 min.
    7. Resuspension cellerne i præ-varmet (37 °C) komplet T celle medium i en koncentration på 0,25 – 0,5 x 106/ml.

4. T-celle aktivering (dag 0 til 2)

  1. Tilsæt 2 mL af cellesuspensionen (0,25 – 0,5 x 106/ml) til hver belagt BRØND af CD3/CD28 antistof belagt 24-brønd plade fra trin 3.1.2. Brug en hvirvlende bevægelse til at dispensere cellerne jævnt.
    Noter: Tilføj cellerne ved hjælp af en hvirvlende bevægelse for at distribuere dem jævnt og minimere kanteffekter. Hvis cellerne klynge langs kanten af brøndene, både transduktionsgraden og cellens levedygtighed vil blive reduceret.
  2. Som en kontrol, plade det samme antal CD8 T celler i en enkelt ikke-belagt brønd af pladen. Cellerne inkubates ved 37 °C ved hjælp af en 10% CO2 gasinkubator til 48 h.
    Bemærk: efter 48 h, aktivering kan bekræftes ved hjælp af et mikroskop; de aktiverede celler vil være større end de celler, der ikke støder på anti-CD3/CD28 antistoffer.

[Placer figur 2 her]

5. transduktion af aktiverede CD8 T-celler (dag 1 til 3)

Bemærk: denne protokol bruger en spin-transduktionsmetode. En centrifuge med en Swing-out rotor og vævskultur plade adaptere, der er i stand til at opretholde en indre temperatur på 37 °C er påkrævet. For at sikre maksimal effektivitet, på dagen for transduktion præ-varme centrifugen til 37 °C før opsamling af virus.

  1. Tilberedning af humane fibronektin fragment belagte plader (dag 1 til dag 2)
    1. På dag 1 tilsættes 0,5 ml fibronektin (50 μg/ml i PBS) til brøndene på en 24-brønd plade, og der inkubates natten over ved 4 °c.
      Bemærk: der kræves typisk to fibronectin-coatede brønde pr. plade af transficeret Phoenix-celler.
    2. På dag 2 fjernes fibronektin-opløsningen og erstattes med 1 ml 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min. til "Bloker" for ikke-specifikke bindingssteder.
    3. De behandlede brønde vaskes med 1 mL steril PBS. Når Vaskeopløsningen er fjernet, er pladen klar til brug. eller kan forsegles og opbevares ved 4 °C i op til en uge.
  2. Samling af aktiverede CD8 T-celler (dag 2)
    1. Høst de aktiverede CD8 T-celler, Tæl og Beregn cellernes levedygtighed ved hjælp af trypan og et Blue eller et egnet automatiseret instrument.
    2. Saml cellerne ved centrifugering og resuspension ved 5 x 106 levedygtige celler/ml til transduktion. Oprethold en lille prøve af celler i kulturen i det komplette T-celle medium i CO2 -inkubator for at give en kontrol for efterfølgende fluorescens aktiverede celle sortering af de transducerede celler (trin 6).
      Bemærk: efter aktivering for 48 h, det samlede antal celler bør være steget med ca 1,5 fold, og har en levedygtighed større end 95%.
  3. Transduktion (dag 2)
    1. Tilsæt 100 μl aktiveret CD8 cellesuspension per brønd (0,5 x 106 celler) til fibronektin coated plade. Tilsæt derefter 1,5 – 2 mL virus indeholdende medium (fra trin 2,6) til hver brønd. Bland med en hvirvlende bevægelse for at dispensere cellerne jævnt (figur 2).
    2. Anbring pladen i en plasticpose med lynlås og forsegling (for at give sekundær indeslutning). Centrifuge ved 2000 x g for 90 min ved 37 °c.
    3. Tag pladen ud af centrifugen. I den biologiske sikkerhed, kabinettet forsigtigt fjerne plastikpose og sikre, at yder pladen ikke er forurenet med nogen medium.
    4. Derefter overføres pladen til den dedikerede 37 °C CO2 -inkubator. Efter 4 timer fjernes 1 mL af mediet fra hver brønd og udskiftes med 1 mL forvarmet komplet T-celle medium. Udskift pladen i CO2 -inkubator.
      Bemærk: Håndtér alle medier fra de transducerede celler som smittefarligt affald.
  4. Anden transduktion (dag 3)
    1. I det dedikerede biologiske sikkerhedskabinet, hældning pladen, der indeholder de transducerede celler ved at hvile på låget og forsigtigt fjerne det meste af mediet (forlader 100 – 200 μL) at sørge for ikke at kontakte cellerne i bunden af brønden.
    2. Tilsæt det virus holdige medium, der er indsamlet i trin 2,7, og Gentag trin 5.3.2 – 5.3.4.
      Bemærk: i vores erfaring forbedrer en tredje transduktion sjældent den samlede effektivitet. Desuden vil cellens levedygtighed sandsynligvis falde betydeligt, hvis der anvendes en tredje transduktion. Hvis cellerne er belagt med en højere koncentration end 0,5 x 106/brønd, kan T-cellerne nå sammenløbet efter natten inkubation efter det andet transduktionstrin. I dette tilfælde, split celler efter 4 h inkubation på dag 3.
  5. Vask celler (dag 4)
    1. Fjern 1 mL medium fra hver brønd, resuspender cellerne i det resterende medium og overfør dem til et 15 mL rør. Brøndene vaskes med 1 mL komplet T-celle medium og tilsættes til røret, der indeholder de poolede celler fra hver transduktion.
    2. Centrifugeres ved 350 x g i 7 min., derefter vaskes to gange ved opsuspension i 2 mL komplet T-celle medium og pelleting. Endelig resuspension i 2 mL medium og bestemme celle nummeret.
      Bemærk: Hvis 1 x 106 celler oprindeligt blev transduceret, skal udbyttet på dette stadie være ~ 3 x 106.
  6. Overføre
    1. Der overføres aliquoter på 0,5 – 1 x 106 celler i 2 ml komplet T-celle medium til brøndene på en ny 24-brønd plade, og der inkubates ved 37 °c. Ca. 48 – 72 timer efter transduktion cellerne er klar til bil ekspression analyse og celle sortering.
      Bemærk: antallet af bil-T-celler fordobler normalt hver 24 h på dette stadie. Det er afgørende at aldrig lade dem over vokse. Opdel cellerne med det samme, hvis tætheden er højere end 2 x 106/ml (eller hvis mediet nogensinde bliver lysegult). I vores erfaring de bil-T-celler formere sig mere robust i 24-brønd og 12-brønd plader end hvis overføres til en større fartøj.

6. rensning af transducerede celler ved fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) (dag 5 eller dag 6)

  1. Saml cellerne.
    1. Resuspender cellerne ved pipettering op og ned flere gange (pas på ikke at forårsage skumning), Overfør til 15 mL rør og centrifugeres ved 350 x g i 5 min.
    2. Resuspension i sorterings buffer (2% BSA i steril PBS indeholdende gentamicin) ved 1 x 106 celler/ml. Også høste kontrol (un-transduced) CD8 T celler fra trin 5,2).
      Bemærk: fra 1 x 106 celler på dag 2 forventes et afkast på ~ 2 x 107 transducerede celler på dette tidspunkt.
  2. Vask cellerne én gang med sorterings buffer ved at centrifuge ved 350 x g i 5 min, og resuspendere ved 1 x 107 celler/ml i sorterings buffer. Fjern en lille alikvot for Foxp3gfp -kompensations kontrol (der skal anvendes i trin 6.4.1), og plette resten med mærket anti-muse CD8 (klon 53-6.7; 0,2 μg antistof/5 x 106 celler) ved at inkube i 20 min ved 4 °c.
    1. På samme måde plette en alikvot af de ikke-transducerede CD8 tceller for at give en kompensations kontrol for fluoroforet-mærkningen af anti-CD8-antistoffer.
      Bemærk: undgå at tilføje natriumazid til enhver buffer, da dette er giftigt for cellerne.
  3. Vask de mærkede celler to gange med sorterings buffer, resuspension i kold sorterings buffer ved 1 x 107 celler/ml.
  4. Sortere cellerne.
    1. Sorter CD8 GFP+ positive celler i præ-kølet komplet T celle medium (figur 3b). Tag en lille alikvot for efter sortering analyse til at bestemme renhed.
      Bemærk: for at maksimere renheden af de sorterede celler bør der anvendes stramme porte. Brug en 100 μm dyse for at sikre høj cellelevedygtighed. Minimer mængden af tid, som de sorteres celler holdes på is. T-celler, der har været holdt på is i mere end 3 h tage meget længere tid at inddrive end celler kølet for mindre end 2 h. Således, hvis 3 transducerede cellelinjer skal sortere, indsamle og mærke den anden linje, mens den første bliver sorteret og så videre i stedet for at have den anden og tredje linjer tilbringe en forlænget tid ved 0 °C. Ekspression af andre T-celle markører såsom CD28 og CD3 kan også overvåges (figur 3c), men er ikke afgørende for sorterings formål.
    2. (Alternativ sorterings strategi) Før farvning masse populationen, analysere CD8 ekspression af en lille population af de transducerede T-celler. Hvis renheden er > 99%, kan bulkpopulationen sorteres sikkert udelukkende på grundlag af GFP-udtryk.

7. udvidelse af sorteret bil-T-celler (dag 5 til 10)

  1. BIL-T-celle udvidelse
    1. Vask de sorteres bil-T-celler én gang, derefter resuspension i præ-varmet komplet T-celle medium på 2.5-5 x 105 celler/ml, og plade 2 ml aliquoter i 24-brønd plader.
    2. Tæl og Opdel cellerne hver 1 – 2 dage. Normalt celle nummeret fordobler hver dag indtil ~ dag 10, med levedygtighed resterende over 95%.
      Bemærk: uden re-stimulation, vil bilen-T celler stoppe prolifererende omkring dag 10 og til sidst dø. Således bør T-celle funktionelle assays og adoptivforældre overførsler planlægges i overensstemmelse hermed.
  2. Alternativ udvidelsesstrategi
    1. Efter sortering, kultur bil-T celler i komplet T celle medium indeholdende rhIL-2 på 100 U/mL i stedet for 200 U/mL.
      Bemærk: bil-T-cellerne formere sig ved en lidt langsommere hastighed i dette medium. Men, de vil ofte fortsætte med at formere sig indtil dag 11 til 13 uden re-stimulation. Selv om denne alternative udvidelsesstrategi ikke genererer et højere antal celler, giver den således et lidt længere tidsvindue for downstream-analyser, der skal udføres.

8. verifikation af antigen specificiteten og funktionaliteten af bil-T-cellerne.

Bemærk: den bindende specificitet af bil T celler målretning peptid/MHC komplekser kan verificeres ved transthyretin farvning7,23. Tilsvarende kan deres funktionalitet bekræftes ved at måle cytokinsekretion eller cytotoksicitet efter stimulation af deres cognate ligands. NIH tetramer Core Facility (TCF) på Emory University er en anbefalet kilde til "tetramers" og relevante farvningsprotokoller.

  1. Peptid-MHC Tetramer farvning.
    1. Etiket aliquoter af 2 x 105 TRANSDUCEREDE bil-T-celler i 100 μl sorterings buffer ved inkube ring med ~ 0,6 μg fluorescently mærket antigen-specifikke og kontrol tetramers ved 37 °c i 2 timer.
    2. Pellet cellerne ved centrifugering i 5 min ved 350 x g, derefter vaskes to gange ved at resuspendere i 0,5 ml sorterings buffer og re-centrifuger. Endelig resuspension cellerne i 300 μl sorterings buffer og analysere ved flow flowcytometri (figur 4).
      Bemærk: til disse studier bruger vi typisk BV421-mærket IAG7-B:9-23 (re) (test) og IAG7-hel (Control) tetramers. Dog kan enhver fluorophore/tetramer kombination, der er passende for den (de) bil (er), der er omfattet af undersøgelsen, anvendes i stedet. I dette tilfælde skal koncentrationen og farvnings tiden optimeres for hver anvendt transthyretin. Både sorteret og un-sorteret bil-T-celler kan anvendes til transthyretin farvning.
  2. Specificitet måling af ligand stimulation.
    1. Incubate 2 x 105 SORTEREDE bil-T-celler i 200 μl cytokinfri T-celle medium med passende plade bundne eller cellulære ligands.
    2. Efter 6 – 24 timer måles cytokinproduktion med ELISA eller intracellulær farvning ved hjælp af fabrikantens protokoller.
      Bemærk: for vores studier af IAG7-b:9-23 omdirigeret T-celler, vi kultur cellerne natten over med M12C3 murine B-celle lymfomer celler udtrykkerIA G7-b:R3 eller "Tom"IA G724,25, derefter opsamles Supernatanterne og måles udskillet mus interferon gamma (IFN-γ) af ELISA26 (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Typisk er transduktiviteten ved hjælp af denne protokol ~ 60-90%. I forsøget vist i figur 3, før sortering ca., 70% af de CD8 T-celler Co-udtrykte gfp. De medgav også CD28 og CD3 (figur 3c). Det er vigtigt, at alle de "test" gfp+ -celler også er co-farvede med IAG7-b:R3 tetramers, men ikke med kontrol transthyretin (figur 4). Tilsvarende, de sorteret test og kontrol bil-T celler hver udskilt høje niveauer af IFN-γ kun efter Co-kultur med mål celler udtrykker deres cognate ligander (figur 5). Dette bekræfter, at de transducerede celler har en CD8 Effector T-celle fænotype, der er rettet mod målet for de overordnede antistoffer.

Figure 1
Figur 1: skematisk af den retrovirale konstruktion af bilen. BILEN består af en målretning domæne afledt af Fab fragment af et egnet mus monoklonalt antistof, og en spacer/membran anker/signalering domæne fra Mouse CD28, CD137 og CD247. Den syntetiske cDNA indsættes i pMIG-II antiretroviral Expression vektor. Begrænsning endonuklease sites anvendes til generering af mAb287-bil er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: effekten af forskellige plating metoder på celle fordeling. Venstre Celler, der pipetteres ved hjælp af en hvirvlende bevægelse, viser en jævn fordeling. Midlertidigt Cellerne blev pipetteret direkte ind i midten af brønden. Billeder blev fanget efter spinding ved 350 x g i 5 min. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: flow cytometrisk analyse af transducerede T-celler. Celler blev co-plettet med PE-Cy7 konjugeret anti-CD8, AF647 konjugeret anti-CD3, og BV421 konjugeret anti-CD28, som beskrevet i trin 6,4. Profiler gated på enkelte levedygtige celler vises. (A) ikke-farvede forældre CD8 T-celler. (B) PE-CY7/gfp profil af transducerede celler. Den bil ekspression celler er identificeret af GFP reporter. (C) farvede transducerede celler blev GATED på PE-CY7/gfp dobbelt positivitet. Profilen AF647/BV421 vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: tetramer farvning af un-sorteret bil-T-celler. Cellerne blev plettet med BV421 konjugeret tetramers som beskrevet i trin 8,1. Profiler gated på enkelte levedygtige celler vises. A) test IAG7-insulin tetramer. B) kontrol I-AG7-hel tetramer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: antigen specifik cytokinsekretion i bil-T-celler. Sorteret CD8 T-celler, der udtrykker testen mAb287 eller kontrol mAb 24.1 bil blev co-dyrket med M12C3 celler, der udtrykker IAG7-b:R3, "Tom" IAG7, eller TFR-MBP-DTRL (ligand for Mab 24.1) som beskrevet i trin 8,2. Efter 24 timer blev den udskilt IFN-γ ELISA kvantificeret ved ELISA. Specifik stimulering af begge T-cellelinjer blev observeret. Data repræsenterer gennemsnit ± SD af 3 gentagne eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tid Virus forberedelse T celle præparat
DAG-4 (Fre) Thaw Phoenix cells (PM)
Dag-3 (sat) Re-Plate Phoenix
Dag-2 (søn) Ferie
Dag-1 (Mon) Irradiate Phoenix-celler (PM) Coat ikke-behandlet plade med CD3/CD28 AB
Dag 0 (Tue) Transfficerende Phoenix-celler (AM) Forbered splenocytter og Isoler CD8 T-celler.
T-celle aktivering.
Dag 1 (Wed) Skift Phoenix cells medium til 4 ml (AM). Frakke RetroNectin
Dag 2 (Thu) Saml virus og refill. Transduktion, CD8 T-celler
Dag 3 (Fre) Indsamle virus. Transduktion, CD8 T-celler
Dag 4 (sat) Vask cellerne, og Udvid cellerne.
Dag 5 (søn) Celle udvidelse, hvis det er nødvendigt.
Dag 6 (Mon) BIL-T celle sortering.
Dag 7 -10 (Tue til fre) Udvidelse af T-BILCELLER. Eksperimenter.

Tabel 1: Resumé af CAR-T generation protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol beskriver en effektiv metode til fremstilling af antigen specifikke CD8-T-celler ved antiretroviral transduktion. Transduktiviteten af vores protokol er typisk høj, og robust ekspression af bilen er generelt observeret. De udvidede bil-T-celler bevarer de vigtigste egenskaber ved de forældre aktiverede T-celler og antistof specificitet og er velegnede til både in vitro og in vivo brug. Vi har anvendt AB-bil CD8 T celler i reprograming type 1 diabetes i NOD mus7.

Vores protokol indeholder flere kritiske modifikationer til tidligere beskrevne metoder. Først bruger vi en optimeret T-celledyrkning medium, der tillader en forlænget aktiveringstidspunkt. Det komplette medium, der er beskrevet, indeholder optimale niveauer af flere vigtige kosttilskud, og forbedrer både T-cellens levedygtighed og omfanget af spredning efter aktivering. Det skal bemærkes, at mus IL-2 kan erstattes af det menneskelige protein med tilsvarende resultater, selv om på nuværende tidspunkt, Human IL-2 er mere overkommelige. Bemærk, en signifikant højere transduktionseffektivitet opnås ved hjælp af T-celler aktiveret for 40-48 h, end hvis et 24 h aktiverings trin anvendes.

For det andet bruger vi en forbedret transduktionsprocedure, der eliminerer polybrene B (som er giftigt for T-cellerne) og bruger fibronektin i stedet. Dette forbedrer yderligere cellernes levedygtighed. Det skal bemærkes, at for at sikre god transduktionseffektivitet er det afgørende at opretholde T-cellerne i et optimeret medium ved en passende celletæthed og at bruge friske High-titer viral supernatanter snarere end tidligere frosset virus. Ved hjælp af vores modificerede procedure, en tredje transduktionstrin er unødvendig og faktisk er uønsket som levedygtighed typisk falder, hvis en tredje spin infektion trin er inkluderet. Det skal også understreges, at det er afgørende at aldrig lade cellerne over vokse under ekspansionsfasen. Når cellerne er overgroet, de har tendens til hurtigt at miste deres fænotype og dø.

Ud over de parametre, der er beskrevet ovenfor, skal to andre potentielle årsager til lav transduktionseffektivitet/levedygtighed undgås. For det første, da antibiotika ikke bør være til stede under transfektering trin er det vigtigt at sikre, at plasmider er forberedt ved hjælp af en endotoxin-fri kit, og opløst i sterilt vand, og at god steril teknik anvendes på alle tidspunkter. For det andet skal tilstedeværelsen af høje niveauer af døde eller døende T-celler undgås. Hvis den aktiverede Parental CD8 T-cellesuspension indeholder høje niveauer af døde celler eller cellerester, bør dette fjernes før transduktion ved hjælp af kommercielle kits.

Vi har bevidst ikke inkluderet en bil-T-celle frysning trin i denne protokol, som i vores erfaring en betydelig del af de transducerede celler dør under Kryopreservation og optøning. På samme måde, selv om de ekspanderede bil-T-celler kan re-stimuleres in vitro, de har en øget tendens til at miste ekspression af transgenet. I betragtning af den høje grad af spredning vi observere ved hjælp af frisk sorteret bil-T-celler, anbefaler vi stærkt, at kun frisk genererede bil-T-celler bruges til funktionelle assays og adoptiv overførsel.

Sammenfattende er betydningen af denne protokol, at den beskriver en procedure, der giver høj transduktionseffektivitet og genererer et stort antal sunde antigen specifikke mus CD8 T-celler til brug in vitro og in vivo. Vores protokol giver således et nyttigt værktøj for forskere, der udfører bil-T celle undersøgelser i musemodeller af sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MAb287 og dets derivater er beskyttet af et amerikansk patent udstedt i 2014.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, og SRA-2-S-2018-648-S-B, en diabetes Education and action Award, og Caroline Wiess Law Fund for forskning i Molekylær medicin på Baylor College of Medicine. Celle sortering blev understøttet af cytometri og Cell sortering Core på Baylor College of Medicine med støtte fra NIH (S10RR024574 og P30CA125123). Alle peptid-MHC-tetramerne blev hentet fra NIH Tetramers kerneanlæg.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 μM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
  2. Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40, (14-15), 1033-1039 (2004).
  3. Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
  4. Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 16729-16734 (2011).
  5. Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10978-10983 (2010).
  6. Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
  7. Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
  8. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
  9. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
  10. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
  11. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  12. Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
  13. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
  14. Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25, (2), 456-464 (2017).
  15. Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).
  16. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1, (1), 406-417 (2006).
  17. Johnstone, A., Thorpe, R. Immunochemistry in practice. 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).
  18. Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. Lymphocytes: a practical approach. 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).
  19. Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, (18), 8392-8396 (1993).
  20. Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73, (12), 10426-10439 (1999).
  21. Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8, (3), e59701 (2013).
  22. Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43, (5), 667-675 (1994).
  23. Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509, (7500), 361-365 (2014).
  24. Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167, (2), 541-555 (1988).
  25. Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369, (6476), 151-154 (1994).
  26. Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24, (4), 345-358 (2003).
Højeffektiv generation af antigen-specifikke primære mus cytotoksiske T-celler til funktionel testning i en autoimmun diabetes model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).More

Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter