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Immunology and Infection

Hocheffiziente Generierung von Antigen-spezifischen primären Maus-Zytotoxischen T-Zellen für Funktionstests in einem Autoimmun-Diabetes-Modell

Published: August 16, 2019 doi: 10.3791/59985
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 1, 2
1Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Endocrinology, Diabetes & Metabolism, Baylor College of Medicine, 3Scientific Center, Shandong Provincial Hospital affiliated to Shandong University

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von antigenspezifischen CD8-T-Zellen und deren Ausdehnung in vitro mit dem Ziel, eine hohe Anzahl funktioneller T-Zellen für den Einsatz in vitro und in vivo zu liefern.

Abstract

Typ-1-Diabetes (T1D) zeichnet sich durch eine isletspezifische Autoimmunität aus, die zur Betazellzerstörung und zum absoluten Verlust der Insulinproduktion führt. Im spontanen nicht-fettleibigen Diabetes -Mausmodell ist Insulin das primäre Ziel, und die genetische Manipulation dieser Tiere zur Entfernung eines einzigen Schlüsselinsulinepitops verhindert Krankheiten. Daher ist die selektive Eliminierung professioneller Antigen-präsentierender Zellen (APCs), die dieses pathogene Epitop tragen, ein Ansatz, um die unerwünschten insulinspezifischen Autoimmunreaktionen zu hemmen, und hat wahrscheinlich ein größeres translationales Potenzial.

Chimäre Antigenrezeptoren (CARs) können T-Zellen selektiv auf krankheitserregende Antigene umleiten. Diese Technik ist von grundlegender Bedeutung für die jüngsten Versuche, Zelltechnik für die Adoptivzelltherapie zur Behandlung mehrerer Krebsarten zu verwenden. In diesem Protokoll beschreiben wir ein optimiertes T-Zell-Retrovirus (RV)-Transduktions- und In-vitro-Erweiterungsprotokoll, das eine hohe Anzahl funktioneller antigenspezifischer CD8-CAR-T-Zellen aus einer geringen Anzahl naiver Zellen erzeugt. Zuvor wurden mehrere CAR-T-Zellprotokolle beschrieben, in der Regel jedoch mit relativ geringer Transduktionseffizienz und Zelllebensfähigkeit nach Derduktion. Im Gegensatz dazu bietet unser Protokoll eine Transduktionseffizienz von bis zu 90 %, und die erzeugten Zellen können mehr als zwei Wochen in vivo überleben und den Krankheitsbeginn nach einer einzigen Infusion erheblich verzögern. Wir bieten eine detaillierte Beschreibung des Zellwartungs- und Transduktionsprotokolls, so dass die kritischen Schritte leicht befolgt werden können. Die gesamte Prozedur von der primären Zellisolation bis zum CAR-Ausdruck kann innerhalb von 14 Tagen durchgeführt werden. Die allgemeine Methode kann auf jedes Mauskrankheitsmodell angewendet werden, in dem das Ziel bekannt ist. In ähnlicher Weise ist die spezifische Anwendung (die auf einen pathogenen Peptid/MHC-Klasse-II-Komplex abzielt) auf jedes andere Modell von Autoimmunerkrankungen anwendbar, für das ein Schlüsselkomplex identifiziert wurde.

Introduction

Angesichts des wahrscheinlich reduzierten Risikos unerwünschter Off-Target-Effekte sind antigenspezifische Immuntherapien (ASI) vielversprechende Behandlungen für Autoimmunerkrankungen wie T1D. Anhäufende Hinweise deuten darauf hin, dass Immunantworten auf (Prepro)Insulin bei T1D1besonders wichtig sein können. In den letzten zehn Jahren deuten Studien aus mehreren Gruppen, einschließlich unserer eigenen, stark darauf hin, dass die Darstellung eines Epitops, das Insulin-B-Kettenaminosäuren 9 bis 23 durch spezifische MHC-Klasse-II-Moleküle (B:9-23/MHCII) enthält, eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von T1D bei Mäuse und Menschen2,3,4,5. Um den B:9-23/MHCII-Komplex gezielt ins Visier zu nehmen, haben wir einen monoklonalen Antikörper namens mAb287 entwickelt, der keine Kreuzreaktivität gegenüber dem Hormon Insulin oder Komplexen hat, die andere Peptide enthalten6. MAb287 blockiert die Antigen-Präsentation in vitro und die wöchentliche Verabreichung von mAb287 an prädiabetische NOD-Mäuse verzögerte die Entwicklung von T1D bei 35% der behandelten Mäuse6. Um die Antigen-Präsentation in vivo zu blockieren, sind in der Regel häufige Injektionen erforderlich, um eine hohe zirkulierende Konzentration aufrechtzuerhalten. Wir vermuteten, dass wir diese Schwierigkeit überwinden könnten, indem wir die hohe Spezifität von Ab287 nutzen, um T-Zellen neu zu programmieren, wodurch eine verbesserte antigenspezifische T-Zell-Therapie für T1D7zur Verfügung gestellt wird.

Zytotoxische T-Zellen sollen ihr Ziel töten können, wenn sogar eine einzigeKopie ihres Cognate-Ligands 8,9,10ausgedrückt wird. Daher wird erwartet, dass B:9-23/MHCII-spezifische CD8-T-Zellen eine höhere Effizienz bei der Beseitigung der unerwünschten Antigen-Präsentation aufweisen als der mutterliche Antikörper, der wahrscheinlich an mehrere Komplexe auf demselben APC binden muss, um seine Wirkung auszuüben. CAR T-Zellen wurden zur Behandlung mehrerer menschlicher Krebsarten11,12,13, und kann auch wirksam in Autoimmunität14sein. Car-T-Zellen mit Spezifität für pathogene Peptid-MHC-Komplexe wurden jedoch bisher nicht verwendet, um das Fortschreiten von T1D zu verändern. Mit der unten beschriebenen optimierten CD8 T-Zelltransduktionstechnik haben wir vor kurzem den Grundsatz beweisnachweis erbracht, dass dies tatsächlich einen praktikablen Ansatz darstellt7.

In diesem Protokoll skizzieren wir eine effiziente und schlanke Transduktions- und Expansionsmethode. Unser Protokoll gilt für andere Studien, die die Erzeugung von Maus-CD8 CAR T-Zellen mit hoher Effizienz erfordern.

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Protocol

Mäuse wurden in einer Transgenen-Maus-Anlage unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten, und alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den vom Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen durchgeführt.

HINWEIS: Das Experiment erfordert die parallele Vorbereitung des Virus und der T-Zellen. Tabelle 1 fasst das Protokoll zusammen. Die wichtigsten Reagenzien und Puffer sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Wir konzentrieren uns auf die Erzeugung und Erweiterung von CAR-T-Zellen, die auf bestimmte APCs-Populationen in diesem Protokoll abzielen.

1. Erzeugung und Validierung von einkettigen Fab-Antikörpern (scFab)-CARs.

HINWEIS:CARs enthalten in der Regel 3 kritische Domänen – eine Antigen-Targeting-Domäne, eine Spacer/Transmembrane-Domäne und eine zytoplasmatische Signaldomäne. Die genaue Auslegung jedes CAR hängt vom beabsichtigten Ziel ab und wird daher, abgesehen von den Schlüsselmerkmalen des Konstrukts, die für die Entstehung des Retrovirus relevant sind, in diesem Protokoll nicht im Detail beschrieben. Das Gesamtdesign der CARs, die für die unten beschriebenen Studien verwendet werden, ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, die Targeting-Domain umfasst die gesamte Lichtkette und variable und CH1-Domäne der schweren Kette aus dem übergeordneten monoklonalen Antikörper, der durch einen halbstarren Linker verbunden ist. Die Spacer/Transmembrane-Domäne stammt von Maus-CD28, und die Signaldomäne ist eine Fusion, die Elemente aus Maus-CD28, CD137 (4-1BB) und CD247 (CD3) enthält. Diese Elemente werden durch molekularbiologische Standardverfahren wie Spleißüberlappungspolymerase-Kettenreaktion (PCR) oder die Synthese eines geeigneten "Genblocks" zusammengesetzt. Details zur Erzeugung des mAB287 CAR sind in Zhang et al.7enthalten. Die cDNA-Sequenzen sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich.

  1. Montage des CAR-Konstrukts
    1. Synthetisieren Sie den zielgerichteten Fab-Antikörper (scFab) und die kombinierten Spacer/Signaling-Domänen separat, und verwenden Sie eine "3-Punkt"-Ligationstechnik15, um das endgültige Konstrukt zusammenzustellen (Abbildung 1).
      ANMERKUNG: Die wichtigste Anforderung für die CAR-Einfügung ist, dass sie flankierende Restriktionsendonuklease-Standorte enthalten sollte, die eine Ligation in den retroviralen Expressionsvektor pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II)ermöglichen, oder angemessen.
  2. Validierung des CAR-Oberflächenausdrucks
    1. Transduce die Hybridomzellen mit pMIG II abgeleiteten retroviralen Partikeln, die durch ein Standardprotokoll erzeugt werden (z.B. Holst et al.16).
    2. Führen Sie eine Flow-Zytometrie-Analyse durch, um die Expression von GFP aus dem CAR-Vektor17zu erkennen.
    3. Fleckenoberflächenexpression der CAR der transducierten Hybridome unter Verwendung von beschrifteten Antikörpern gegen die Mauskette (z. B. Klon RMK-45)17.
      ANMERKUNG: 18.
  3. Validierung der Car-Spezifität
    1. Stimulieren Sie die transducierten Hybridomzellen mit geeigneten plattengebundenen oder zellulären Antigenen. Nach über Nacht Co-Kultur sammeln Überstand und sezernierte Zytokine, und assayed durch Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA)7.
      ANMERKUNG: Idealerweise sollte jedes CAR unabhängig validiert werden, bevor es für die Transduktion verwendet wird. In diesem Schritt kann das Experiment angehalten und später neu gestartet werden.

2. Transfektion viraler Erzeugerzellen (Tag -4 bis Tag 3)

HINWEIS: Retrovirus wird mit Phoenix-ECO-Zellen hergestellt (siehe Materialtabelle)19,20. Verwenden Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen für die Erzeugung potenziell infektiöser Erreger (vorzugsweise einschließlich eines ausgewiesenen BSL-2-Gehäuses und eines separaten Inkubators zur Kultivierung transfizierter/transduzierter Zellen).

  1. Phoenix-Zellen auftauen (Tag -4)
    1. Tauen 2 x 106 Phoenix-Eco Zellen. Skalieren Sie die Anzahl der Phoenix-Zellen, wenn mehrere Transduktionen geplant sind.
    2. Platten Sie sie in einer 10 cm Gewebekulturschale mit 10 ml Medium (Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Kalbserum (FCS)).
  2. Passage Phoenix Zellen (Tag -3)
    1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es mit 5 ml Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) von Dulbecco.
    2. 3 ml 0,25% Trypsin hinzufügen und bei 37 °C unter 10% CO2-Atmosphäre für 3 min inkubieren.
    3. Ernte der Zellen dann Pellet durch Zentrifugation für 3 min bei 200 x g. Neuplattenzellen mit 10 ml frischem Medium und inkubieren bei 37 °C.
  3. Bestrahlung von Phoenix-Zellen (Tag -1 Nachmittag)
    1. Um die weitere Zellteilung zu minimieren, sammeln Sie Phoenix-Zellen, wie in Schritt 2.2 beschrieben, resuspendieren in 5 ml Medium, und Gamma-Bestrahlungszellen auf Eis (1000 rad).
      HINWEIS: Bei Strahlenarbeiten ist Vorsicht geboten, um eine Exposition des Personals zu vermeiden.
    2. Zentrifugieren Sie die bestrahlten Zellen, setzen Sie in frischem Medium auf, Platte bei 2 x 106 Zellen (in 10 ml Medium)/Platte/CAR, und inkubieren.
  4. Transfektion (Tag 0 - Morgen)
    1. Den Überstand aus den Phoenix-Zellen ansaugen, mit 5 ml Phosphat-gepufferter Kochsaline (PBS) waschen und 7 ml reduziertes Serummedium (z. B. Opti-MEM) vorsichtig tropfenweise an die Seitenwand der Platte geben, um eine Störung der Monoschicht zu vermeiden. Übertragen Sie Zellen zurück in den Inkubator.
    2. Nehmen Sie zwei 14 ml runde Polypropylen-Rohre und fügen Sie jeweils 1,5 ml reduziertes Serummedium hinzu. Zu einem Rohr 40 L Transfektionsreagenz hinzufügen (siehe Materialtabelle).
    3. Zur anderen Röhre fügen Sie 15 g Ab-CAR-Plasmid (erzeugt in Schritt 1) und 5 g Umschlag- und Verpackungsplasmid (5 g pCL-Eco) hinzu. Röhren bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren.
    4. Fügen Sie das Transfektionsreagenz-Gemisch von Schritt 2.4.2 tropfenweise in das zweite Rohr, ohne die Rohrseiten zu berühren, und mischen Sie die Lösung vorsichtig 3 Mal nach oben und unten. Bei Raumtemperatur mindestens 20 min inkubieren.
    5. Fügen Sie 3 ml der Mischung tropfenweise zu den Phoenix-Zellen hinzu und legen Sie sie in einen Inkubator der Gewebekultur.
    6. Nach 4:5 h 1 ml FCS hinzufügen. Kulturzellen über Nacht bei 37 °C.
  5. Mittlerer Wandel (Tag 1)
    1. Entfernen Sie den Überstand, der die Plasmid-/Transfektionsreagenzkomplexe enthält, und entsorgen Sie ihn nach institutionellen Verfahren für den Umgang mit infektiösem Material. Fügen Sie 4 ml frisches, vorgewärmtes Kulturmedium zu den Zellen hinzu.
  6. Erntevirus für Transduktion (Tag 2)
    1. Sammeln Sie das virushaltige Medium aus den Phoenix-Zellen mit einer sterilen Spritze, filtern Sie (0,45 m), um Restzellablagerungen zu entfernen, und sammeln Sie es in einem neuen Rohr.
    2. RhIL-2-Bestand zu einer Endkonzentration von 200 I.E./ml hinzufügen. Verwenden Sie das Virus sofort zur Transduktion (Schritt 5.3). Fügen Sie 4 ml frisches Medium in die Phoenix-Zellen und legen Sie in den Inkubator.
  7. Virussammlung wiederholen (Tag 3)
    1. Wiederholen Sie Schritt 2.6, aber entsorgen Sie Phoenix-Zellen als infektiösen Abfall, anstatt frisches Medium hinzuzufügen. Dieser Überstand wird in Schritt 5.4 verwendet.

3. Primäre CD8 T Zellisolierung und Aktivierung (Tag -1 bis Tag 0)

ANMERKUNG: Zuvor sammeln CD8-T-Zellen von weiblichen NOD-Mäusen nach 4–5 Wochen, einem Zeitpunkt, bevor die Islet-Entzündung beginnt21,22. Behandeln Sie alle Mäuse nach IACUC-zugelassenen Protokollen. CD8-T-Zellen werden mit einem kommerziellen Negativauswahlkit aus Splenozyten angereichert.

  1. Beschichtungsplatten mit CD3/CD28 Antikörpern (Tag -1)
    1. Fügen Sie 1 ml einer Mischung aus Anti-Maus-CD3- und CD28-Antikörpern (beide bei 1 g/ml in PBS) zu jedem Brunnen einer 24-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C über Nacht.
    2. Am nächsten Tag die Platten mit 1 ml sterilem PBS 3 Mal waschen, bevor Sie die murinen CD8-T-Zellen hinzufügen (Schritt 4.1).
      ANMERKUNG: Die Anzahl der zu beschichtenden Brunnen variiert für jedes Experiment, abhängig von der Gesamtzahl der aktivierten CD8-T-Zellen, die benötigt werden.
  2. Sammlung von Splenozyten (Tag 0)
    1. Euthanisieren Sie zwei NOD-Mäuse im Alter von 4 bis 5 Wochen mit CO2-Inhalation, gefolgt von Enthauptung. Die Milz ernten und auf ein Zellsieb legen, das in 10 ml PBS in einer Zellkulturschale auf dem Eis einweicht.
    2. Schneiden Sie in einer Zellkulturhaube jede Milz in 3-5 Stücke, pressen Sie Gewebe mit einem sterilen Kolben einer 3 oder 5 ml Spritze, um Milzfragmente auseinander zu zwingen und Zellen durch das Drahtgeflecht passieren zu lassen.
    3. Entfernen Sie vorsichtig rote Blutkörperchen, indem Sie Splenozyten in 1:4 verdünnten Red-Zell-Lysepuffer (1 ml Lysepuffer in 3 ml PBS für eine Milz) wieder aufsetzen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Dann 10 l der Zellsuspension mit Trypan-Blaufarbstofflösung zum Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer verdünnen und den Rest der Zellen durch Zentrifugation bei 350 x g für 7 min pellet.
  3. Anreicherung von CD8-T-Zellen (Tag 0)
    1. Anreichern Sie CD8-T-Zellen durch negative Auswahl mit einem Maus-CD8 T-Zellisolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      ANMERKUNG: Um eine hohe Reinheit zu gewährleisten, runden Sie bei der Berechnung des Volumens des zu zu zu zusetzenden Biotinyl-Antikörpers immer die Zellzahlen auf (z. B. verwenden Sie das Volumen der Reagenzien, die für 108 Zellen für berechnete 9,1 x 107 Zellen vorgeschlagen werden).
    2. Zellpellets in 400 l Puffer und 100 l Biotin-Antikörper-Cocktail pro 1 x 108 Zellen aussetzen, gut mischen und 5 min im Kühlschrank (4 °C) inkubieren, um eine Antikörperbindung zu ermöglichen.
    3. Fügen Sie 300 l Etikettierpuffer und 200 l Antibiotin-Mikroperlen pro 1 x 108 Zellen hinzu, gut mischen und 10 min bei 4 °C inkubieren.
    4. Während Sie auf die Mikroperlenbindung warten, richten Sie die Trennsäule auf das Trennzeichen ein. Säule waschen, indem Sie mit 3 ml Etikettierpuffer spülen.
    5. Durch ein 40-m-Zellsieb 1000 l Perlen-Zell-Gemisch durchqueren, bevor Sie auf die Trennsäule geladen werden, um Zellaggregate zu entfernen. Sammeln Sie den Durchfluss der Säule in ein vorgekühltes 15 ml-Rohr.
    6. Waschen Sie die Säule nach Anweisung des Herstellers, und sammeln Sie alle Abwässer in ein und dasselbe Rohr. Bestimmen Sie die Zellzahl (wie Schritt 3.2.4) und sammeln Sie durch Zentrifugation bei 350 x g für 5 min. Waschen Sie die Zellen durch Erneutaussetzen in 2 ml vollständiges T-Zellmedium (RPMI-1640 mit FCS, 2-Mercaptoethanol, rhIL-2 (200 U/mL), mIL-7 (0,5 ng/ml), ITS , HEPES und Penicillin-Streptomycin) und Zentrifugieren bei 350 x g für 5 min.
    7. Die Zellen in vorgewärmtem (37 °C) komplettem T-Zellmedium mit einer Konzentration von 0,25–0,5 x 106/ml wieder aufsetzen.

4. T-Zell-Aktivierung (Tag 0 bis 2)

  1. Fügen Sie 2 ml der Zellsuspension (0,25–0,5 x 106/ml) zu jeder beschichteten Bohrung des CD3/CD28-Antikörpers hinzu, die ab Schritt 3.1.2 mit 24-Well-Platte beschichtet ist. Verwenden Sie eine wirbelnde Bewegung, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
    HINWEIS: Fügen Sie die Zellen mit einer wirbelnden Bewegung hinzu, um sie gleichmäßig zu verteilen und Kanteneffekte zu minimieren. Wenn sich die Zellen am Rand der Brunnen gruppieren, werden sowohl die Transduktionsrate als auch die Zelllebensfähigkeit verringert.
  2. Als Steuerung, Platte die gleiche Anzahl von CD8 T-Zellen in einem einzigen nicht beschichteten Brunnen der Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit einem 10% CO2-vergasten Inkubator für 48 h.
    ANMERKUNG: Nach 48 h kann die Aktivierung mit einem Mikroskop bestätigt werden; Die aktivierten Zellen sind größer als die Zellen, die nicht auf Anti-CD3/CD28-Antikörper gestoßen sind.

[Platz 2 hier]

5. Transduktion aktivierter CD8-T-Zellen (Tage 1 bis 3)

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet eine Spin-Transduktionsmethode. Erforderlich ist eine Zentrifuge mit einem ausschwenkbaren Rotor und Gewebekulturplattenadaptern, die eine Innentemperatur von 37 °C aufrechterhalten kann. Um maximale Effizienz zu gewährleisten, am Tag der Transduktion vorerwärmen die Zentrifuge auf 37 °C, bevor das Virus gesammelt wird.

  1. Vorbereitung von menschlichen Fibronectin-Fragment-beschichteten Platten (Tag 1 bis Tag 2)
    1. Am ersten Tag 0,5 ml Fibronectin (50 g/ml in PBS) in die Brunnen einer 24-Well-Platte geben und über Nacht bei 4 °C brüten.
      HINWEIS: In der Regel werden pro Platte transfizierter Phoenix-Zellen zwei fibronectinbeschichtete Brunnen benötigt.
    2. Entfernen Sie am 2. Tag die Fibronectin-Lösung und ersetzen Sie sie durch 1 ml 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. Inkubieren Bei Raumtemperatur für 30 min, um unspezifische Bindungsstellen zu "blockieren".
    3. Waschen Sie die behandelten Brunnen mit 1 ml sterilem PBS. Nach dem Entfernen der Waschlösung ist die Platte einsatzbereit; oder bis zu einer Woche bei 4 °C versiegelt und gelagert werden können.
  2. Sammlung aktivierter CD8-T-Zellen (Tag 2)
    1. Ernten Sie die aktivierten CD8-T-Zellen, zählen und berechnen Sie die Zelllebensfähigkeit mit Trypanblau oder einem geeigneten automatisierten Instrument.
    2. Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie bei 5 x 106 lebensfähigen Zellen/ml zur Transduktion. Bewahren Sie eine kleine Aliquot von Zellen in Kultur im gesamten T-Zellmedium im CO2-Inkubator auf, um eine Kontrolle für die nachfolgende fluoreszenzaktivierte Zellsortierung der transducierten Zellen zu ermöglichen (Schritt 6).
      ANMERKUNG: Nach der Aktivierung für 48 h hätte die Gesamtzahl der Zellen um etwa das 1,5-fache erhöht werden müssen und eine Lebensfähigkeit von mehr als 95 % aufweisen müssen.
  3. Transduktion (Tag 2)
    1. Fügen Sie der fibronectin beschichteten Platte 100 l aktivierte CD8-Zellsuspension pro Bohrkörper (0,5 x 106 Zellen) hinzu. Fügen Sie dann 1,5–2 ml virenhaltiges Medium (ab Schritt 2.6) zu jedem Brunnen hinzu. Mischen Sie mit einer wirbelnden Bewegung, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen (Abbildung 2).
    2. Legen Sie die Platte in eine Reißverschluss-Plastiktüte und Versiegelung (um eine sekundäre Einschließung zu gewährleisten). Zentrifuge bei 2000 x g für 90 min bei 37 °C.
    3. Entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge. In der biologischen Sicherheit, Schrank sorgfältig entfernen Sie die Plastiktüte und stellen Sie sicher, dass die Außenseite der Platte nicht mit einem Medium kontaminiert ist.
    4. Dann die Platte auf den dedizierten 37 °C CO2-Inkubator übertragen. Nach 4 h 1 ml des Mediums aus jedem Brunnen entfernen und durch 1 ml vorgewärmtes komplettes T-Zellmedium ersetzen. Ersetzen Sie die Platte im CO 2-Inkubator.
      ANMERKUNG: Behandeln Sie alle Medien aus den transduzierten Zellen als infektiöse Abfälle.
  4. Zweite Transduktion (Tag 3)
    1. Im speziellen biologischen Sicherheitsschrank die Platte, die die transduzierten Zellen enthält, durch Ausruhen auf dem Deckel zu neigen und den größten Teil des Mediums vorsichtig zu entfernen (wobei 100–200 l übrig bleiben), um sicherzustellen, dass die Zellen an der Unterseite des Brunnens nicht kontaktiert werden.
    2. Fügen Sie das virushaltige Medium hinzu, das in Schritt 2.7 gesammelt wurde, und wiederholen Sie die Schritte 5.3.2–5.3.4.
      ANMERKUNG: Nach unserer Erfahrung verbessert eine dritte Transduktion selten die Gesamteffizienz. Darüber hinaus wird die Zelllebensfähigkeit wahrscheinlich deutlich sinken, wenn eine dritte Transduktion verwendet wird. Wenn Zellen mit einer höheren Konzentration als 0,5 x 106/well plattiert werden, können die T-Zellen nach der nächtlichen Inkubation nach dem zweiten Transduktionsschritt den Zusammenfluss erreichen. In diesem Fall spalten Zellen nach der 4 h Inkubation am 3. Tag.
  5. Waschzellen (Tag 4)
    1. Entfernen Sie 1 ml Medium aus jedem Brunnen, setzen Sie die Zellen im verbleibenden Medium wieder auf und übertragen Sie sie in ein 15 ml-Rohr. Waschen Sie die Brunnen mit 1 ml komplettem T-Zellmedium und fügen Sie dem Rohr, das die gepoolten Zellen aus jeder Transduktion enthält, hinzu.
    2. Zentrifugieren bei 350 x g für 7 min, dann zweimal waschen, indem Sie in 2 ml komplettes T-Zellmedium und Pelletieren wieder aufhängen. Schließlich in 2 ml Medium wieder anhalten und die Zellzahl bestimmen.
      ANMERKUNG: Wenn 1 x 106 Zellen ursprünglich transduziert wurden, sollte die Ausbeute in diesem Stadium 3 x 106betragen.
  6. verlegen
    1. Aliquoten von 0,5–1 x 106 Zellen in 2 ml komplettem T-Zellmedium auf die Brunnen einer neuen 24-Well-Platte übertragen und bei 37 °C inkubieren. Ungefähr 48–72 h nach der Transduktion sind die Zellen für die Analyse der CAR-Expressionsanalyse und Zellsortierung bereit.
      ANMERKUNG: Die Anzahl der CAR-T-Zellen verdoppelt sich in der Regel in diesem Stadium jeweils um 24 h. Es ist wichtig, sie nie überwuchern zu lassen. Teilen Sie die Zellen sofort, wenn die Dichte größer als 2 x 106/ml ist (oder wenn das Medium jemals hellgelb wird). Nach unserer Erfahrung vermehren sich die CAR-T-Zellen in 24-Well- und 12-Well-Platten robuster als auf ein größeres Gefäß übertragen.

6. Reinigung von transduzierten Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) (Tag 5 oder Tag 6)

  1. Sammeln Sie die Zellen.
    1. Unterbrechen Sie die Zellen durch mehrmalses Auf- und Abpfeifen (wobei darauf geachtet wird, nicht zu schäumen), in 5 min in 15 ml-Rohre und Zentrifuge bei 350 x g übertragen.
    2. Im Sortierpuffer (2% BSA in sterilem PBS mit Gentamicin) bei 1 x 106 Zellen/ml resuspendieren. Ernten Sie auch die Steuern (un-transduced) CD8 T-Zellen aus Schritt 5.2).
      ANMERKUNG: Von 1 x 106 Zellen an Tag 2 wird zu diesem Zeitpunkt eine Ausbeute von 2 x 107 transduzierten Zellen erwartet.
  2. Waschen Sie die Zellen einmal mit Sortierpuffer durch Zentrifugieren bei 350 x g für 5 min, und setzen Sie bei 1 x 107 Zellen/ml im Sortierpuffer wieder auf. Entfernen Sie ein kleines Aliquot für die Foxp3 GFP-Kompensationskontrolle (in Schritt 6.4.1 zu verwenden), und färben Sie den Rest mit beschriftetem Anti-Maus-CD8 (Klon 53-6,7; 0,2 g Antikörper/5 x 106 Zellen) durch Inkubieren für 20 min bei 4 °C.
    1. In ähnlicher Weise färben Sie ein Aliquot der nicht transduced CD8 T-Zellen, um eine Kompensationskontrolle für das Fluorophor zu ermöglichen, das den Anti-CD8-Antikörper kennzeichnen.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, Natriumazid zu einem Puffer hinzuzufügen, da dies für die Zellen giftig ist.
  3. Waschen Sie die beschrifteten Zellen zweimal mit Sortierpuffer, setzen Sie sie im Kaltsortierungspuffer bei 1 x 107 Zellen/ml wieder auf.
  4. Sortieren Sie die Zellen.
    1. Sortieren Sie CD8 GFP+ positive Zellen in vorgekühltes komplettes T-Zellmedium (Abbildung 3B). Nehmen Sie ein kleines Aliquot für die Nachsortierungsanalyse, um die Reinheit zu bestimmen.
      HINWEIS: Um die Reinheit der sortierten Zellen zu maximieren, sollten enge Tore verwendet werden. Verwenden Sie eine Düse von 100 m, um eine hohe Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten. Minimieren Sie die Zeit, die die sortierten Zellen auf Eis gehalten werden. T-Zellen, die länger als 3 h auf Eis gehalten wurden, brauchen viel länger, um sich zu erholen, als Zellen, die für weniger als 2 h gekühlt wurden. Wenn also 3 transduzierte Zelllinien sortiert werden müssen, sammeln und beschriften Sie die zweite Zeile, während die erste sortiert wird und so weiter, anstatt dass die zweite und dritte Linie eine längere Zeit bei 0 °C verbringen. Die Expression anderer T-Zellmarker wie CD28 und CD3 kann ebenfalls überwacht werden (Abbildung 3C), ist aber für Sortierzwecke nicht unbedingt erforderlich.
    2. (Alternative Sortierstrategie) Bevor Sie die Massenpopulation färben, analysieren Sie die CD8-Expression einer kleinen Population der transduzierten T-Zellen. Wenn die Reinheit >99% beträgt, kann die Massenbevölkerung allein auf der Grundlage des GFP-Ausdrucks sicher sortiert werden.

7. Erweiterung der sortierten CAR-T-Zellen (Tag 5 bis 10)

  1. CAR-T Zellerweiterung
    1. Waschen Sie die sortierten CAR-T-Zellen einmal, dann in vorgewärmtem kompletten T-Zellmedium bei 2,5–5 x 105 Zellen/ml wieder aufsetzen und 2 ml Aliquots in 24-Well-Platten platten.
    2. Zählen und teilen Sie die Zellen alle 1 bis 2 Tage. In der Regel verdoppelt sich die Zellzahl jeden Tag bis zum Tag 10, wobei die Lebensfähigkeit über 95 % liegt.
      HINWEIS: Ohne Restimulation werden die CAR-T-Zellen um Tag 10 nicht mehr vermehren und schließlich sterben. Daher sollten T-Zell-Funktionstests und Adoptivtransfers entsprechend geplant werden.
  2. Alternative Expansionsstrategie
    1. Nach dem Sortieren die CAR-T-Zellen in einem vollständigen T-Zellmedium, das rhIL-2 enthält, mit 100 U/ml statt 200 U/ml.
      ANMERKUNG: Die CAR-T-Zellen vermehren sich in diesem Medium etwas langsamer. Sie werden sich jedoch oft bis zu den Tagen 11 bis 13 ohne Restimulation weiter ausbreiten. Obwohl diese alternative Expansionsstrategie keine höhere Anzahl von Zellen generiert, bietet sie jedoch ein etwas längeres Zeitfenster für nachgelagerte Assays.

8. Überprüfung der Antigenspezifität und Funktionalität der CAR-T-Zellen.

ANMERKUNG: Die Bindungsspezifität von CAR-T-Zellen, die auf Peptid-/MHC-Komplexe abzielen, kann durch Tetramerfärbung7,23überprüft werden. In ähnlicher Weise kann ihre Funktionalität durch Messung der Zytokinsekretion oder Zytotoxizität nach Stimulation durch ihre Cognate Liganden bestätigt werden. Die NIH Tetramer Core Facility (TCF) an der Emory University ist eine empfohlene Quelle für "Tetramere" und relevante Färbeprotokolle.

  1. Peptid-MHC Tetramer Färbung.
    1. Etikettieren Sie Aliquots von 2 x 105 transduzierten CAR-T-Zellen in 100 l Sortierpuffer, indem Sie mit fluoreszierend antigenspezifischen und kontrollspezifischen Tetrameren bei 37 °C für 2 h inkubieren.
    2. Pellet die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 350 x g, dann zweimal waschen, indem in 0,5 ml Sortierpuffer und Rezentrifugieren wieder ausgesetzt. Schließlich setzen Sie die Zellen in 300 L Sortierpuffer wieder auf und analysieren Sie sie durch Durchflusszytometrie (Abbildung 4).
      ANMERKUNG: Für diese Studien verwenden wir in der Regel BV421-markierte IAg7-B:9-23(RE) (Test) und IAg7-HEL (Control) Tetramere. Stattdessen kann stattdessen jede Fluorophor/Tetramer-Kombination verwendet werden, die für die untersuchten Car(s) geeignet ist. In diesem Fall sollte die Konzentration und Färbezeit für jeden verwendeten Tetramer optimiert werden. Sowohl sortierte als auch unsortierte CAR-T-Zellen können für die Tetramerfärbung verwendet werden.
  2. Spezifitätsmessung durch Ligandenstimulation.
    1. Inkubieren Sie 2 x 105 sortierte CAR-T-Zellen in 200 l zytokinfreiem T-Zellmedium mit entsprechenden plattengebundenen oder zellulären Liganden.
    2. Nach 6–24 h Messung der Zytokinproduktion durch ELISA oder intrazelluläre Färbung mit Denkprotokollen des Herstellers.
      ANMERKUNG: Für unsere Studien mit IAg7-B:9-23 umgeleiteten T-Zellen, kultivieren wir die Zellen über Nacht mit M12C3 murinen B-Zell-Lymphomzellen, die IAg7-B:R3 oder "leere" IAg724,25, dann die Überstande sammeln und abgesonderte Maus Interferon gamma (IFN-) von ELISA26 (Abbildung 5) messen.

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Representative Results

In der Regel beträgt die Transduktionseffizienz, die dieses Protokoll verwendet, 60-90 %. In dem in Abbildung 3gezeigten Experiment exprimierten vor der Sortierung etwa 70 % der CD8-T-Zellen gfP. Sie drückten auch CD28 und CD3 (Abbildung3C) aus. Wichtig ist, dass alle "Test" GFP+ Zellen auch mit IAg7-B:R3 Tetrameren ko-gefärbt werden, aber nicht mit dem Kontrolltetramer (Abbildung 4). In ähnlicher Weise sezernierten die sortierten TEST- und Kontroll-CAR-T-Zellen jeweils hohe IFN-A-Werte erst nach der Kokultur mit Zielzellen, die ihre Cognate-Ninentins exezieren (Abbildung 5). Dies bestätigt, dass die transduced Zellen einen CD8-Effektor T-Zell-Phänotyp haben, der auf das Ziel der übergeordneten Antikörper gerichtet ist.

Figure 1
Abbildung 1: Schemat des retroviralen CAR-Konstrukts. Die CAR besteht aus einer Targeting-Domäne, die aus dem Fab-Fragment eines geeigneten monoklonalen Mausantikörpers abgeleitet ist, und einer Spacer/Membrananker/Signalierdomäne von Maus-CD28, CD137 und CD247. Die synthetische cDNA wird in den retroviralen Expressionsvektor pMIG-II eingeführt. Restriktionsendonuklease-Standorte, die zur Erzeugung des mAb287-CAR verwendet werden, werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Auswirkungen verschiedener Beschichtungsmethoden auf die Zellverteilung. (Links) Zellen, die mit einer wirbelnden Bewegung pipetiert werden, zeigen eine gleichmäßige Verteilung. (Rechts) Die Zellen wurden direkt in die Mitte des Brunnens geleitet. Die Bilder wurden nach dem Drehen bei 350 x g für 5 min aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Zytometrische Flussanalyse von transduzierten T-Zellen. Die Zellen wurden mit PE-Cy7 konjugierten Anti-CD8, AF647 konjugierten Anti-CD3 und BV421 konjugierten Anti-CD28, wie in Schritt 6.4 beschrieben. Profile, die auf einzelnen lebensfähigen Zellen abgegrenzt sind, werden angezeigt. (A) Nicht befleckte elternförmige CD8 T-Zellen. (B) PE-Cy7/GFP-Profil der transduzierten Zellen. Die CAR-Exzesszellen werden vom GFP-Reporter identifiziert. (C) Gefärbte Transduced-Zellen wurden mit PE-Cy7/GFP-Doppelpositivität abgezäutt. Das Profil AF647/BV421 wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Tetramerfärbung unsortierter CAR-T-Zellen. Die Zellen wurden mit konjugierten Tetramern BV421 gefärbt, wie in Schritt 8.1 beschrieben. Profile, die auf einzelnen lebensfähigen Zellen abgegrenzt sind, werden angezeigt. (A) Test IAg7-Insulintetramer. (B) Steuerung I-Ag7-HEL Tetramer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Antigenspezifische Zytokinsekretion durch CAR-T-Zellen. Sortierte CD8-T-Zellen, die den Test mAb287 oder die Steuerung mAb24.1 CAR exprozierten, wurden mit M12C3-Zellen kokultiviert, die IAg7-B:R3, "leere" IAg7oder TFR-MBP-DTRL (der Liganden für mAb24.1) exprozessionen, wie in Schritt 8.2 beschrieben. Nach 24 h wurde der abgesonderte IFN-ELISA durch ELISA quantifiziert. Eine spezifische Stimulation beider T-Zelllinien wurde beobachtet. Die Daten stellen den Mittelwert von 3 wiederholten Experimenten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

zeit Virus-Vorbereitung T-Zell-Vorbereitung
TAG -4 (Fr) Thaw Phoenix Zellen (PM)
Tag -3 (Sa) Neuplatte Phoenix
Tag -2 (Sonne) ferien
Tag 1 (Mon) Strahlende Phoenix-Zellen (PM) Mantel unbehandelte Platte mit CD3/CD28 Ab
Tag 0 (Di) Transfizieren von Phoenix-Zellen (AM) Bereiten Sie Splenozyten vor und isolieren Sie CD8-T-Zellen.
T-Zellaktivierung.
Tag 1 (Mi) Ändern Sie Phoenix-Zellen mittel bis 4 ml (AM). Mantel RetroNectin
Tag 2 (Do) Sammeln Sie Viren und nachfüllen. Transduktion, CD8 T-Zellen
Tag 3 (Fr) Sammeln Sie Viren. Transduktion, CD8 T-Zellen
Tag 4 (Sa) Waschen Sie Zellen und erweitern Sie Zellen.
Tag 5 (Sonne) Zellerweiterung bei Bedarf.
Tag 6 (Mo) CAR-T-Zellsortierung.
Tag 7 -10 (Di bis Fr) Erweiterung von T CAR-Zellen. Experimente.

Tabelle 1: Zusammenfassung des CAR-T-Generierungsprotokolls.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zur Herstellung antigenspezifischer CD8 CAR-T-Zellen durch retrovirale Transduktion. Die Transduktionseffizienz unseres Protokolls ist in der Regel hoch, und eine robuste Expression der CAR wird im Allgemeinen beobachtet. Die erweiterten CAR-T-Zellen behalten die wesentlichen Merkmale der elternaktivierten T-Zellen und die Antikörperspezifität bei und sind sowohl für den In-vitro- als auch für den In-vivo-Einsatz geeignet. Wir haben Ab-CAR CD8 T-Zellen bei der Neuprogrammierung von Typ-1-Diabetes bei NOD-Mäusen7angewendet.

Unser Protokoll enthält mehrere wichtige Änderungen an zuvor beschriebenen Methoden. Zunächst verwenden wir ein optimiertes T-Zell-Kultivierungsmedium, das eine längere Aktivierungszeit ermöglicht. Das beschriebene gesamtbeschriebene Medium enthält optimale Mengen an mehreren wichtigen Ergänzungen und verbessert sowohl die T-Zell-Lebensfähigkeit als auch das Ausmaß der Proliferation nach aktivierung erheblich. Es sollte beachtet werden, dass Maus IL-2 kann für das menschliche Protein mit gleichwertigen Ergebnissen ersetzt werden, obwohl derzeit, menschliche IL-2 ist erschwinglicher. Bemerkenswert ist, dass mit T-Zellen, die für 40-48 h aktiviert sind, eine deutlich höhere Transduktionseffizienz erzielt wird, als wenn ein 24-h-Aktivierungsschritt verwendet wird.

Zweitens verwenden wir ein verbessertes Transduktionsverfahren, das Polybren B (das für die T-Zellen giftig ist) eliminiert und stattdessen Fibronectin verwendet. Dies verbessert die Zelllebensfähigkeit weiter. Es sollte beachtet werden, dass es für eine gute Transduktionseffizienz entscheidend ist, die T-Zellen in einem optimierten Medium bei einer angemessenen Zelldichte zu halten und frische hochtitervirale Überstände anstelle eines zuvor eingefrorenen Virus zu verwenden. Mit unserem modifizierten Verfahren ist ein dritter Transduktionsschritt unnötig und in der Tat unerwünscht, da die Lebensfähigkeit in der Regel sinkt, wenn ein dritter Spin-Infektionsschritt enthalten ist. Es muss auch betont werden, dass es wichtig ist, die Zellen während der Expansionsphase nie überwachsen zu lassen. Sobald Zellen überwuchert sind, neigen sie dazu, schnell ihren Phänotyp zu verlieren und zu sterben.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen Parametern müssen zwei weitere potenzielle Ursachen für eine geringe Transduktionseffizienz/-fähigkeit vermieden werden. Erstens, da Antibiotika während der Transfektionsschritte nicht vorhanden sein sollten, ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Plasmide mit einem Endotoxin-freien Kit hergestellt und in sterilem Wasser gelöst werden, und dass eine gute sterile Technik zu jeder Zeit verwendet wird. Zweitens muss das Vorhandensein hoher Mengen toter oder sterbender T-Zellen vermieden werden. Wenn die aktivierte elterliche CD8 T-Zellsuspension hohe Mengen an abgestorbenen Zellen oder Zellablagerungen enthält, sollte diese vor der Transduktion mit kommerziellen Kits entfernt werden.

Wir haben bewusst keinen CAR-T-Zellgefrierschritt in dieses Protokoll aufgenommen, da unserer Erfahrung nach ein erheblicher Teil der transduced Cells während der Kryokonservierung und des Auftauens abstirbt. Auch wenn die erweiterten CAR-T-Zellen in vitro restimuliert werden können, haben sie eine erhöhte Tendenz, die Expression des Transgens zu verlieren. Angesichts des hohen Proliferationsgrades, den wir mit frisch sortierten CAR-T-Zellen beobachten, empfehlen wir daher, nur frisch erzeugte CAR-T-Zellen für funktionelle Assays und Adoptivübertragungen zu verwenden.

Zusammenfassend ist die Bedeutung dieses Protokolls, dass es ein Verfahren beschreibt, das eine hohe Transduktionseffizienz bietet und eine große Anzahl von gesunden antigenspezifischen Maus-CD8-T-Zellen für den Einsatz in vitro und in vivo erzeugt. Unser Protokoll stellt somit ein nützliches Werkzeug für Forscher bereit, die CAR-T-Zellstudien in Mausmodellen von Krankheiten durchführen.

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Disclosures

MAb287 und seine Derivate sind durch ein 2014 ausgestelltes US-Patent geschützt.

Acknowledgments

Diese Studie wurde unterstützt durch JDRF-Stipendien 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B und SRA-2-S-2018-648-S-B, einen Diabetes Education and Action Award, und den Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine am Baylor College of Medicine. Die Zellsortierung wurde vom Cytometrie- und Zellsortierungskern am Baylor College of Medicine mit Mitteln des NIH (S10RR024574 und P30CA125123) unterstützt. Alle Peptid-MHC-Tetramere wurden aus der NIH Tetramer Core Facility gewonnen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 μM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

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References

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Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).

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