Summary
본 호는 시험관 내 및 생체 내에서 사용하기 위해 많은 수의 기능성 T 세포를 산출하는 것을 목표로 항원 특이적 CD8 T 세포의 생성및 시험관 내 확장에 대한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
타입-1 당뇨병 (T1D)는 베타 세포 파괴 및 인슐린 생산의 절대 손실로 이끌어 내는 아일레 특정 자기 면역에 의해 특징입니다. 자발적인 비비만 당뇨병(NOD) 마우스 모델에서, 인슐린은 1차 표적이며, 이들 동물의 유전자 조작은 단일 키 인슐린 에피토프를 제거하여 질병을 예방한다. 따라서, 이러한 병원성 에피토프를 베어링하는 전문 항원 제시 세포(APC)의 선택적 제거는 원치 않는 인슐린 특이적 자가면역 반응을 억제하는 접근법이며, 가능성이 더 큰 번역 잠재력을 갖는다.
키메라 항원 수용체 (CA)는 선택적으로 질병을 일으키는 항원을 표적으로 하는 T 세포를 리디렉션할 수 있습니다. 이 기술은 다중 암을 취급하기 위하여 입양 세포 치료를 위한 세포 공학을 사용하는 최근 시도에 근본적입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 낮은 수의 순진한 세포로부터 시작하여 기능성 항원 특이적 CD8 CAR-T 세포의 높은 숫자를 생성하는 최적화된 T 세포 레트로바이러스(RV) 형질 전환 및 시험관 내 확장 프로토콜을 설명합니다. 이전에 는 다중 CAR-T 세포 프로토콜이 기술되었지만, 전형적으로 는 상대적으로 낮은 전송 효율 및 세포 생존능후의 트랜스덕션을 가지고 있다. 대조적으로, 우리의 프로토콜은 최대 90%의 환전 효율을 제공하며, 생성된 세포는 생체 내에서 2주 이상 생존하고 단일 주입 후 질병 발병을 현저히 지연시킬 수 있습니다. 당사는 중요한 단계를 쉽게 따를 수 있도록 셀 유지 관리 및 트랜스덕션 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 1차 세포 격리로부터 CAR 발현에 이르는 전체 절차는 14일 이내에 수행될 수 있다. 일반적인 방법은 표적이 공지된 임의의 마우스 질환 모델에 적용될 수 있다. 유사하게, 특정 적용 (병원성 펩티드/MHC 클래스 II 복합체를 표적으로 하는)은 주요 복합체가 확인된 임의의 다른 자가면역 질환 모델에 적용 가능하다.
Introduction
원치 않는 오프 타겟 효과의 가능성이 감소 된 위험을 감안할 때, 항원 특정 면역 치료 (ASI)는 T1D와 같은 자가 면역 질환에 대한 유망한 치료법입니다. 축적 된 증거는 (prepro) 인슐린에 대한 면역 반응이 T1D1에서특히 중요 할 수 있음을 시사합니다. 지난 10 년 동안, 우리 자신을 포함한 여러 그룹의 연구는 특정 MHC 클래스 II 분자 (B : 9-23 / MHCII)에 의해 인슐린 B 사슬 아미노산9 ~23을 함유하는 에피토프의 프리젠 테이션이 T1D의 개발에 중요한 역할을한다는 것을 강력하게 제안합니다. 마우스와인간 2,3,4,5. B:9-23/MHCII 복합체를 선택적으로 표적화하기 위해, 우리는 다른 펩티드를 함유하는 호르몬 인슐린 또는 복합체에 교차 반응성을 가지지 않는 mAb287이라는 단일클론 항체를 생성하였다6. MAb287 블록 항원 프리젠테이션 시험관에서, 및 전 당뇨병 NOD 마우스에 대한 mAb287의 주간 투여는 처리된마우스6의35%에서 T1D의 발달을 지연시켰다. 생체 내에서 항원 프리젠 테이션을 차단하기 위해, 빈번한 주사는 일반적으로 높은 순환 농도를 유지하기 위해 요구된다. 우리는 T 세포를 재프로그래밍하기 위해 Ab287의 높은 특이성을 활용하여 이러한 어려움을 극복할 수 있다고 가설을 세우고 T1D7에 대한 개선된 항원 특이적 T 세포 요법을 제공하였다.
세포독성 T 세포는 그들의 동종 리간드의 단일 사본조차도 8,9,10으로발현되는 경우에도 그들의 표적을 죽일 수 있는 것으로 보고된다. 따라서, B:9-23/MHCII 특이적 CD8 T 세포는 모항체보다 원치 않는 항원 프리젠테이션을 제거하는 데 있어 더 높은 효율을 가질 것으로 예상되며, 이는 그 효과를 발휘하기 위해 동일한 APC상에 여러 복합체에 결합할 필요가 있을 것이다. CAR T 세포는 다중 인간암(11,12,13)치료에 사용되어 왔으며, 또한 자가면역(14)에서 효과적일 수 있다. 그러나, 병원성 펩티드-MHC 복합체에 대한 특이성을 가진 CAR-T 세포는 지금까지 T1D의 진행을 수정하는 데 사용되지 않았다. 아래에 설명된 최적화된 CD8 T 세포 전착 기술을 사용하여, 우리는 최근에 이것이실제로 실행 가능한 접근법 7을 나타낸다는 원리의 증거를 입증했다.
이 프로토콜에서는 효율적이고 능률적인 변환 및 확장 방법을 간략하게 설명합니다. 당사의 프로토콜은 고효율의 마우스 CD8 CAR T 세포의 생성을 요구하는 다른 연구에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
마우스는 트랜스제닉 마우스 시설에서 특정 병원균이 없는 조건하에서 유지되었고, 모든 동물 실험은 베일러 의과 대학 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다.
참고: 실험에서는 바이러스와 T 세포를 병렬로 준비해야 합니다. 표 1은 프로토콜을 요약합니다. 키 시약 및 버퍼는 재료표에 나열됩니다. 우리는 이 프로토콜에 있는 APC의 특정 인구를 표적으로 하는 CAR-T 세포의 생성 그리고 확장에 집중합니다.
1. 단일 사슬 Fab 항체(scFab)-CA의 생성 및 검증.
참고: CA는 일반적으로 항원 표적화 도메인, 스페이서 / 트랜스 멤브레인 도메인 및 세포질 신호 도메인과 같은 3 가지 중요한 도메인을 포함합니다. 각 CAR의 정밀한 설계는 의도된 대상에 따라 달라지므로, 레트로바이러스의 생성과 관련된 구문의 주요 특징을 제외하고는 이 프로토콜에 상세히 설명되지 않을 것이다. 아래에 설명된 연구에 사용되는 CA의 전체 설계는 그림1에 나와 있습니다. 간단히 말해서, 표적화 도메인은 반강성 링커에 의해 연결된 모 단클론 항체로부터 의 중쇄의 전체 광쇄 및 가변 및 CH1 도메인을 포함한다. 상기 스페이서/트랜스멤브레인 도메인은 마우스 CD28로부터, 신호 도메인은 마우스 CD28, CD137(4-1BB) 및 CD247(CD3θ)로부터의 요소를 포함하는 융합이다. 이 요소는 스플라이스 중첩 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 적절한 "유전자 블록"의 합성과 같은 표준 분자 생물학 절차에 의해 조립됩니다. mAB287 CAR의 생성에 대한 자세한 내용은 장외 7에 포함되어 있습니다. cDNA 서열은 요청에 따라 저자로부터 얻을 수 있다.
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CAR 구문 조립
- 표적화 단일 사슬 Fab 항체(scFab) 및 결합된 스페이서/시그널링 도메인을 별도로 합성하고, 최종 구체를 조립하기 위해 "3점" 결찰기술(15)을 사용한다(도 1).
참고: CAR 삽입에 대한 주요 요구 사항은 레트로 바이러스 발현 벡터 pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II) 또는 관련 유도체15에 결찰을 허용하는 측면 제한 엔도뉴얼 사이트를 포함해야한다는 것입니다. 해당.
- 표적화 단일 사슬 Fab 항체(scFab) 및 결합된 스페이서/시그널링 도메인을 별도로 합성하고, 최종 구체를 조립하기 위해 "3점" 결찰기술(15)을 사용한다(도 1).
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CAR 표면 표현의 검증
- 표준 프로토콜에 의해 생성된 pMIG II 유래 레트로바이러스 입자를 사용하여 하이브리도마 세포를트랜스듀싱한다(예를 들어, Holst et al. 16).
- CAR벡터(17)로부터GFP의 발현을 검출하기 위한 유동 세포분석 분석.
- 마우스 θ 사슬에 대하여 표지된 항체를 사용하여 형질전환된 하이브리도마의 CAR의 얼룩 표면 발현(예를들어, RMK-45 복제)17.
참고: 18.
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자동차 특이성 검증
- 적절한 판 결합 또는 세포 항원으로 형질 전환 된 하이브리도마 세포를 자극하십시오. 하룻밤 후 공동 배양후 는 초나토카인 및 분비된 사이토카인을 수집하고, 효소 연계면역흡착제 분석(ELISA)에 의해 분석된다 7.
참고: 이상적으로, 각 자동차는 전이에 사용되기 전에 독립적으로 검증되어야한다. 이 단계에서 실험을 일시 중지하고 나중에 다시 시작할 수 있습니다.
- 적절한 판 결합 또는 세포 항원으로 형질 전환 된 하이브리도마 세포를 자극하십시오. 하룻밤 후 공동 배양후 는 초나토카인 및 분비된 사이토카인을 수집하고, 효소 연계면역흡착제 분석(ELISA)에 의해 분석된다 7.
2. 바이러스 성 생산자 세포의 형질 감염 (4 일째에서 3 일째까지)
참고: 레트로바이러스는 피닉스 에코 세포를 사용하여 생산됩니다 (재료 표참조)19,20. 잠재적으로 전염성이 있는 제제의 생성을 위한 적절한 예방 조치를 사용하십시오(바람직하게는 형질전환/형질 전환 된 세포를 배양하기 위한 지정된 BSL-2 캐비닛 및 별도의 인큐베이터를 포함).
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해동 피닉스 세포 (일 -4)
- 2 x 106 피닉스 에코 세포를 해동하십시오. 여러 변환이 계획된 경우 Phoenix 셀 수를 늘입니다.
- 10 mL의 배지 (DMEM)의 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS)을 함유 한 10cm 조직 배양 접시에 접시.
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통로 피닉스 세포 (일 -3)
- 배지를 제거하고 덜베코의 인산완식염수(DPBS) 5mL로 세척합니다.
- 3 mL의 0.25% 트립신을 넣고 3분 동안 10%CO2 대기하에서 37°C에서 배양합니다.
- 세포를 수확 한 다음 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리하여 펠릿을 수확하십시오. 10 mL의 신선한 배지로 세포를 재 플레이트하고 37 °C에서 배양합니다.
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피닉스 세포 조사 (1 일오후)
- 추가적인 세포 분열을 최소화하기 위해, 2.2단계에서 설명한 바와 같이 피닉스 세포를 수집하고, 배지의 5 mL에서 재중단하고, 감마 세포를 얼음 상에 조사한다(1000 rad).
참고: 인력 노출을 피하기 위해 방사선 작업에주의를 기울여야합니다. - 조사 된 세포를 원심 분리하고, 신선한 배지에서 재중단하고, 2 x 106 세포 (중간 크기의 10 mL)/플레이트 / CAR에서 접시를 다시 중단하고 배양합니다.
- 추가적인 세포 분열을 최소화하기 위해, 2.2단계에서 설명한 바와 같이 피닉스 세포를 수집하고, 배지의 5 mL에서 재중단하고, 감마 세포를 얼음 상에 조사한다(1000 rad).
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형질감염(0일~ 아침)
- 피닉스 세포에서 상류층을 흡인하고, 인산염 완충 식염수 (PBS)의 5 mL로 씻어 내고, 단층을 방해하지 않도록 플레이트의 측측벽에 7 mL의 감소 된 혈청 배지 (예를 들어, Opti-MEM)를 조심스럽게 추가하십시오. 세포를 인큐베이터로 다시 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 되돌려 보도록 한다.
- 14 mL 둥근 바닥 폴리 프로필렌 튜브 2 개를 가지고 각각 1.5 mL의 감소 된 혈청 배지를 추가하십시오. 한 튜브에 40 μL의 형질감염 시약을 추가합니다(재료 표참조).
- 다른 튜브에 Ab-CAR-plasmid 15 μg(1단계에서 생성)과 5 μg의 봉투 및 포장 플라스미드(5 μg pCL-Eco)를 추가합니다. 실온에서 튜브를 5 분 동안 배양하십시오.
- 2.4.2 단계에서 트랜스펙시약 혼합물을 튜브 측면에 접촉하지 않고 두 번째 튜브에 떨어뜨리고 용액을 3회 부드럽게 파이펫팅하여 혼합합니다. 적어도 20 분 동안 실온에서 배양하십시오.
- 혼합물의 3 mL를 피닉스 세포에 드롭와이즈로 첨가하고, 조직 배양 인큐베이터에 놓는다.
- 후 4-5 시간 FCS의 1 mL를 추가합니다. 배양 세포는 37°C에서 하룻밤 동안.
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중간 변화(1일차)
- 플라스미드/형질감염 시약 복합체를 함유한 상급물질을 제거하고 감염성 물질을 취급하기 위한 제도적 절차에 따라 폐기한다. 세포에 신선하고 미리 데운 배양 배지 4 mL를 추가합니다.
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전착을 위한 수확 바이러스 (일 2)
- 멸균 주사기로 피닉스 세포로부터 바이러스 함유 배지를 수집하고, 필터(0.45 μm)를 제거하여 잔류 세포 찌꺼기를 제거하고, 새로운 튜브에 수집한다.
- 200 IU/mL의 최종 농도에 rhIL-2 스톡을 추가합니다. 즉시 바이러스를 사용하여 변환(5.3단계). 피닉스 세포에 신선한 배지 4 mL를 넣고 인큐베이터에 넣습니다.
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바이러스 수집 반복(3일째)
- 2.6단계를 반복하되, 신선한 배지를 첨가하는 대신에 피닉스 세포를 전염성 폐기물로 버린다. 이 상급은 5.4 단계에서 사용됩니다.
3. 기본 CD8 T 세포 격리 및 활성화 (일 -1 ~ 0 일)
참고: 이전에는 4-5 주에 암컷 NOD 마우스로부터 CD8 T 세포를 수집하고, 췌도 염증이 시작되기 전의 시점은21,22. IACUC 승인 프로토콜을 따르는 모든 마우스를 처리합니다. CD8 T 세포는 상업적인 음성 선택 키트를 사용하여 비장세포로부터 농축된다.
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CD3/CD28 항체가 있는 코팅 플레이트 (1일차)
- 항 마우스 CD3 및 CD28 항체(PBS에서 1 μg/mL)의 혼합물 1 mL을 24웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 밤새 4°C에서 배양합니다.
- 다음날, 무린 CD8 T 세포를 첨가하기 전에 멸균 PBS 1 mL로 플레이트를 3회 세척한다(단계 4.1).
참고: 코팅 될 우물의 수는 필요한 활성화 된 CD8 T 세포의 총 수에 따라 각 실험에 따라 달라집니다.
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비장 세포 의 컬렉션 (일 0)
- CO2 흡입을 이용한 4-5주 령 NOD 암컷 마우스 2마리를 안락사시키고 참수하였다. 비장을 수확하고 얼음에 세포 배양 접시에 10 mL PBS에 담가 세포 여과기에 넣어.
- 세포 배양 후드에서 각 비장을 3-5 개로 자르고 3 또는 5 mL 주사기의 멸균 플런저로 조직을 눌러 비장 조각을 강제로 분리하고 세포가 와이어 메쉬를 통과 할 수 있도록합니다.
- 1:4 희석된 적혈구 용해 완충액(1개의 비장에 대해 PBS 3 mL에서 용해 완충액 1mL)에 비장을 재중단하고 실온에서 5분 동안 인큐베이팅하여 적혈구를 부드럽게 제거합니다.
- 이어서, 혈세포계로 세포를 세기위한 트리판 블루 염료 용액으로 세포 현탁액의 10 μL을 희석하고, 7 분 동안 350 x g에서 원심분리에 의해 세포의 나머지 부분을 펠렛.
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CD8 T 세포의 농축 (일 0)
- 제조업체의 지시에 따라 마우스 CD8 T 셀 절연 키트를 사용하여 음수 선택으로 CD8 T 셀을 풍부하게 합니다.
참고: 고순도를 보장하기 위해 항상 첨가 할 생체 항체의 부피를 계산 할 때 세포 수를 반올림하십시오 (예를 들어 계산 된 9.1 x 107 셀에 대해 108 셀에 대해 제안 된 시약의 부피를 사용하십시오). - 1 x 108 세포 당 400 μL의 버퍼 및 100 μL의 비오틴 항체 칵테일에서 세포 펠릿을 중단하고, 잘 혼합하고 냉장고 (4 °C)에서 5 분 동안 배양하여 항체 결합을 허용합니다.
- 라벨링 버퍼 300 μL과 1 x 108 세포 당 200 μL의 항 비오틴 마이크로 비드를 넣고 잘 섞어서 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 마이크로 비드 바인딩을 기다리는 동안 분리 열을 구분 기호에 설정합니다. 라벨링 버퍼의 3 mL로 헹급시켜 컬럼을 세척합니다.
- 비드/셀 혼합물 1000 μL을 40 μm 셀 스트레이너를 통과한 후 분리 컬럼에 로드하여 세포 응집체를 제거합니다. 컬럼 흐름을 미리 냉각된 15 mL 튜브로 수집합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 컬럼을 세척하고 모든 유출물을 동일한 튜브에 수집합니다. 세포 번호(3.2.4단계와 동일)를 결정하고 350 x g에서 원심분리하여 5분간 수집합니다. , HEPES 및 페니실린 - 스트렙 토마이신) 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리.
- 0.25-0.5 x 10 6/mL의 농도로 미리 온열(37°C)완전한 T 세포 배지에서 세포를 재중단시켰다.
- 제조업체의 지시에 따라 마우스 CD8 T 셀 절연 키트를 사용하여 음수 선택으로 CD8 T 셀을 풍부하게 합니다.
4. T 세포 활성화 (일 0 에서 2)
- 3.1.2단계에서 CD3/CD28 항체 코팅 된 24 웰 플레이트의 각 코팅 웰에 세포 현탁액 (0.25-0.5 x 106/mL)의 2 mL를 추가합니다. 소용돌이 운동을 사용하여 세포를 고르게 분배합니다.
참고: 소용돌이 운동을 사용하여 셀을 추가하여 균등하게 분포하고 가장자리 효과를 최소화합니다. 세포가 웰의 가장자리를 따라 클러스터되면 전달 속도와 셀 생존율이 모두 감소합니다. - 대조군으로서, 동일한 수의 CD8 T 세포를 플레이트의 단일 비코팅 웰내로 플레이트한다. 48시간 동안 10%CO2 가스 인큐베이터를 사용하여 37°C에서 세포를 배양하였다.
참고: 48 시간 후, 활성화는 현미경을 사용하여 확인할 수 있습니다; 활성화된 세포는 항 CD3/CD28 항체를 접하지 않은 세포보다 더 클 것이다.
【장소 그림 2는 이쪽】
5. 활성화 된 CD8 T 세포의 전이 (일 1 ~ 3)
참고:이 프로토콜은 스핀 변환 방법을 사용합니다. 37°C의 내부 온도를 유지할 수 있는 스윙아웃 로터 및 조직 배양 플레이트 어댑터가 있는 원심분리기가 필요합니다. 최대의 효율을 보장하기 위해, 트랜스덕션 당일에 바이러스를 수집하기 전에 원심분리기를 37°C로 미리 따뜻하게 한다.
- 준비 중 인간 섬유넥틴 조각 코팅 플레이트의 (1 일째에서 2 일째까지)
- 1일째에, 24웰 플레이트의 우물에 0.5 mL의 피브로넥틴(PBS에서 50 μg/mL)을 넣고 4°C에서 밤새 배양합니다.
참고: 일반적으로 형질 감염된 피닉스 세포의 플레이트 당 2 개의 섬유넥틴 코팅 웰이 필요합니다. - 2일째에 피브로넥틴 용액을 제거하고, PBS에서 2% 소 혈청 알부민(BSA)의 1 mL로 교체하였다. 비특이적 결합 부위를 "차단"하기 위해 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 처리된 우물을 멸균 PBS 1 mL로 씻으소서. 세척 용액을 제거 한 후, 플레이트는 사용할 준비가되었습니다; 또는 최대 1주일 동안 4°C에서 밀봉하여 보관할 수 있습니다.
- 1일째에, 24웰 플레이트의 우물에 0.5 mL의 피브로넥틴(PBS에서 50 μg/mL)을 넣고 4°C에서 밤새 배양합니다.
- 활성화 된 CD8 T 세포의 컬렉션 (2 일)
- 활성화된 CD8 T 세포를 수확하고, 트라이판 블루 또는 적합한 자동화 기기를 사용하여 세포 생존 가능성을 계산합니다.
- 원심분리에 의해 세포를 수집하고 트랜스덕션을 위해 5 x 106 가능한 세포 /mL에서 다시 일시 중단하십시오. CO2 인큐베이터에서 완전한 T 세포 배지에서 배양된 세포의 작은 aliquot를 유지하여 트랜스듀싱 된 세포의 후속 형광 활성화 세포 선별에 대한 대조군을 제공한다(단계 6).
참고: 48 h에 대한 활성화 후, 세포의 총 수는 약 1.5 배 증가하고, 95 % 이상 생존력을 가져야한다.
- 트랜스덕트 (2일차)
- 피브로넥틴 코팅 플레이트에 웰 당 활성화된 CD8 세포 현탁액 100 μL(0.5 x 106 세포)을 첨가합니다. 그런 다음 1.5-2 mL의 바이러스 함유 배지(단계 2.6)를 각 웰에 추가합니다. 소용돌이 운동을 사용하여 셀을 고르게 분배합니다(그림 2).
- 접시를 지퍼 잠금 비닐 봉투에 넣고 밀봉하십시오 (보조 봉쇄를 제공하기 위해). 2000 x g에서 37 °C에서 90 분 동안 원심 분리기.
- 원심분리기에서 플레이트를 제거합니다. 생물학적 안전성에서 캐비닛은 비닐 봉지를 조심스럽게 제거하고 플레이트 의 외부가 어떤 매체로 오염되지 않았는지 확인하십시오.
- 이어서 플레이트를 전용 37°CCO2 인큐베이터로 옮김을 전달한다. 4시간 후, 각 웰에서 배지의 1 mL을 제거하고 미리 온난한 완전한 T 세포 배지 1 mL로 대체합니다. CO2 인큐베이터의 플레이트를 교체합니다.
참고: 트랜스듀시 셀의 모든 매체를 전염성 폐기물로 처리하십시오.
- 두 번째 변환(3일차)
- 전용 생물학적 안전 캐비닛에서, 뚜껑에 휴식하여 형질전환 세포를 포함하는 판을 기울이고 조심스럽게 대부분의 배지를 제거 (100-200 μL을 남음) 우물의 바닥에있는 세포에 접촉하지 않도록.
- 2.7단계에서 수집된 바이러스 함유 배지를 추가하고 5.3.2-5.3.4단계를 반복한다.
참고: 우리의 경험에서, 세 번째 변환은 거의 전체 효율을 향상하지 않습니다. 또한, 세 번째 전차를 사용하는 경우 세포 생존가능성이 현저히 떨어질 것이다. 세포가 0.5 x 10 6/well보다높은 농도로 도금되는 경우, T 세포는 두 번째 트랜스덕션 단계 다음에 하룻밤 배양 후 합류에 도달할 수 있다. 이 경우, 3일째에 4시간 배양 후 세포를 분할한다.
- 워시 셀 (4일차)
- 각 우물에서 배지 1 mL을 제거하고 나머지 배지에 세포를 다시 일시 중단하고 15 mL 튜브로 옮김을 옮김을 제거합니다. 완전한 T 세포 배지의 1 mL로 우물을 세척하고 각 변환에서 풀링 된 세포를 포함하는 튜브에 추가합니다.
- 350 x g에서 7 분 동안 원심 분리기를 한 다음 완전한 T 세포 배지 및 펠릿의 2 mL에서 다시 중단하여 두 번 씻어 내십시오. 마지막으로 배지의 2 mL에서 다시 중단하고 셀 번호를 결정합니다.
참고: 1 x 106 셀이 원래 변환 된 경우이 단계의 수율은 ~ 3 x 10 6이어야합니다.
- 전송
- 완전한 T 세포 배지의 2 mL에서 0.5-1 x 106 세포의 양치를 새로운 24 웰 플레이트의 우물로 옮기고 37°C에서 배양한다. 대략 48-72 시간 후 환전 세포는 CAR 발현 분석 및 세포 분류를 위한 준비됩니다.
참고: CAR-T 세포의 수는 일반적으로이 단계에서 각 24 h를 두 배로 합니다. 그들이 자라지 못하게하는 것이 중요합니다. 밀도가 2 x 106/mL보다 높거나 (또는 매체가 밝은 노란색이되면) 즉시 셀을 분할합니다. 우리의 경험에서 CAR-T 세포는 더 큰 용기로 옮겨질 때보다 24 웰 및 12 웰 플레이트에서 더 강력하게 증식합니다.
- 완전한 T 세포 배지의 2 mL에서 0.5-1 x 106 세포의 양치를 새로운 24 웰 플레이트의 우물로 옮기고 37°C에서 배양한다. 대략 48-72 시간 후 환전 세포는 CAR 발현 분석 및 세포 분류를 위한 준비됩니다.
6. 형광 활성화 세포 선별 (FACS)에 의한 형질전환 세포의 정제 (5 일째 또는 6 일째)
- 셀을 수집합니다.
- 위아래로 여러 번 파이펫팅하여 세포를 다시 일시 중단하고 (거품을 일으키지 않도록주의), 15 mL 튜브및 원심 분리기를 350 x g에서 5 분 동안 옮니다.
- 1 x 106 세포 / mL에서 선별 버퍼 (젠타미신을 함유 한 멸균 PBS에서 2 % BSA)에서 다시 일시 중단하십시오. 또한 5.2단계에서 제어(비-트랜스듀시) CD8 T 세포를 수확한다.
참고: 2 일째에 1 x 106 셀에서 ~ 2 x 107 변환 된 셀의 수율이 이 시점에서 예상됩니다.
- 5 분 동안 350 x g에서 원심 분리하여 정렬 버퍼로 세포를 한 번 씻고 정렬 버퍼에서 1 x 107 셀 / mL에서 다시 일시 중단하십시오. Foxp3GFP 보상 대조군(6.4.1단계에서 사용됨)에 대한 작은 알리쿼트를 제거하고, 4°C에서 20분 동안 배양하여 표지된 안티 마우스 CD8(복제 53-6.7; 0.2 μg의 항체/5 x 106 세포)으로 나머지를 얼룩지게 한다.
- 유사하게, 비-CD8 항체를 표지하는 형광공에 대한 보상 제어를 제공하기 위해 비형질화 된 CD8 T 세포의 aliquot를 염색한다.
참고: 이 세포에 독성으로, 어떤 버퍼에 나트륨 아지드를 추가하지 마십시오.
- 유사하게, 비-CD8 항체를 표지하는 형광공에 대한 보상 제어를 제공하기 위해 비형질화 된 CD8 T 세포의 aliquot를 염색한다.
- 선별 버퍼로 레이블이 지정된 셀을 두 번 세척하고 1 x 107 셀/mL에서 콜드 정렬 버퍼에서 다시 일시 중단합니다.
- 셀을 정렬합니다.
- CD8 GFP+ 양성 세포를 미리 냉각된 완전한 T 세포 배지로 정렬합니다(그림3B). 순도를 결정하기 위해 분류 후 분석을 위해 작은 별칭을 가져 가라.
참고: 정렬 된 셀의 순도를 최대화하기 위해 단단한 게이트를 사용해야합니다. 100 μm 노즐을 사용하여 높은 세포 생존력을 보장하십시오. 정렬된 셀이 얼음 위에 보관되는 시간을 최소화합니다. 3시간 이상 얼음위에 보관된 T 세포는 2시간 미만으로 냉각된 세포보다 회복하는 데 훨씬 더 오래 걸린다. 따라서, 3개의 트랜스듀싱된 세포주를 정렬해야 하는 경우, 제2 및 제3 라인이 0°C에서 연장된 시간을 소비하는 대신, 제1 선이 정렬되는 동안 제2 라인을 수집하고 라벨을 지정한다. CD28 및 CD3와 같은 다른 T 세포 마커의 발현도 모니터링할 수 있지만(도3C)정렬 목적에는 필수적이지 않다. - (대체 정렬 전략) 벌크 집단을 염색하기 전에, 형질전환된 T 세포의 작은 집단의 CD8 발현을 분석한다. 순도가 >99%인 경우 대량 모집단은 GFP 발현에 기초하여 안전하게 정렬될 수 있다.
- CD8 GFP+ 양성 세포를 미리 냉각된 완전한 T 세포 배지로 정렬합니다(그림3B). 순도를 결정하기 위해 분류 후 분석을 위해 작은 별칭을 가져 가라.
7. 분류 된 CAR-T 세포의 확장 (5 일에서 10 일)
-
CAR-T 셀 확장
- 분류된 CAR-T 세포를 한 번 세척한 다음 2.5-5 x 105 세포/mL에서 미리 온난된 완전한 T 세포 배지에서 재중단하고 24웰 플레이트에 2 mL aliquots를 플레이트합니다.
- 세포를 1-2일마다 카운트하고 분할합니다. 일반적으로 세포 수는 ~ 10 일까지 매일 두 배로 증가하며 생존 가능성은 95 % 이상으로 남아 있습니다.
참고: 다시 자극하지 않고, CAR-T 세포는 10 일 주위에 증식을 멈추고 결국 죽을 것입니다. 따라서, T 세포 기능성 세포 및 입양 전달은 그에 따라 예약되어야 한다.
-
대체 확장 전략
- 분류 후, CAR-T 세포를 200 U/mL이 아닌 100 U/mL에서 rhIL-2를 함유하는 완전한 T 세포 배지에서 배양하였다.
참고: CAR-T 세포는이 매체에서 약간 느린 속도로 증식합니다. 그러나, 그(것)들은 수시로 재자극 없이 일 11 에서 13까지 증식하는 것을 계속할 것입니다. 따라서, 이러한 대체 확장 전략은 더 많은 수의 세포를 생성하지는 않지만 다운스트림 세포가 수행되는 약간 더 긴 시간 창을 제공한다.
- 분류 후, CAR-T 세포를 200 U/mL이 아닌 100 U/mL에서 rhIL-2를 함유하는 완전한 T 세포 배지에서 배양하였다.
8. CAR T 세포의 항원 특이성 및 기능 검증.
참고: 펩티드/MHC 복합체를 표적으로 하는 CAR T 세포의 결합 특이성은7,23염색에 의해 검증될 수 있다. 유사하게, 그들의 기능은 그들의 동족 리간드에 의한 자극 에 따른 사이토카인 분비 또는 세포 독성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 에모리 대학의 NIH Tetramer 핵심 시설 (TCF)은 "tetramers"및 관련 염색 프로토콜의 권장 소스입니다.
-
펩타이드-MHC 테트라머 염색.
- 2 x 10 5의 ALIQUS를 100 μL의 선별 버퍼에서 형광표지된 항원 특이적 및 제어 테트라머를 37°C에서 2시간 동안 배양하여 분류 완충제에 라벨을 붙였다.
- 350 x g에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛 한 다음 0.5 mL의 버퍼를 다시 중단하고 다시 원심 분리하여 두 번 씻습니다. 마지막으로, 300 μL의 선별 버퍼에서 세포를 재중단하고 유세포 분석으로 분석한다(그림 4).
참고: 이러한 연구의 경우, 우리는 일반적으로 BV421 라벨 IAg7-B : 9-23 (RE) (테스트) 및 IAg7-HEL (제어) tetramers를 사용합니다. 그러나 조사 중인 CAR에 적합한 플루오로폴레/테트라머 조합을 대신 사용할 수 있습니다. 이 경우, 사용되는 각 테트라머에 대해 농도 및 염색 시간을 최적화해야 한다. 분류되지 않은 CAR-T 셀은 모두 테트라머 염색에 사용할 수 있습니다.
-
리간드 자극에 의한 특이성측정.
- 적절한 플레이트 바운드 또는 세포 리간드를 사용하여 2 x 105 분류 된 CAR-T 세포를 200 μL의 사이토카인 프리 T 세포 배지에 인큐베이트합니다.
- 6-24 시간 후 제조업체의 프로토콜을 사용하여 ELISA 또는 세포 내 염색에 의한 사이토 카인 생산을 측정하십시오.
참고: IAg7-B:9-23 리디렉션 된 T 세포의 연구를 위해, 우리는 IA g7 -B :R3또는 "빈"IAg724,25를발현M12C3 뮤린 B 세포 림프종 세포와 밤새 세포를 배양 이어서 ELISA26에 의해 분비된 마우스 인터페론 감마(IFN-γ)를 측정한다(도 5).
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Representative Results
전형적으로, 이 프로토콜을 이용한 환전 효율은 ~60-90%이다. 도3에 도시된 실험에서, 약 선별하기 전에, CD8 T 세포의 70%가 GFP를 공동 발현하였다. 또한 CD28 및 CD3(그림3C)를 공동 표현하였다. 중요한 것은, 모든 "시험" GFP+ 세포는 또한 IA g7-B:R3 테트라머와 함께 염색되었지만, 대조군 테트라머와는 그렇지 않다(그림4). 유사하게, 분류된 시험 및 대조군 CAR-T 세포는 각각 그들의 동조 리간드를 발현하는 표적 세포와 공동 배양 후에만 IFN-γ의 높은 수준을 분비하였다(도 5). 이는 트랜스듀시된 세포가 모항체의 표적을 향하여 향하는 CD8 이펙터 T 세포 표현형을 갖는다는 것을 확인한다.
그림 1: CAR 레트로바이러스 구조의 개략적. 상기 CAR는 마우스 CD28, CD137 및 CD247로부터 적합한 마우스 단일클론 항체및 스페이서/멤브레인 앵커/시그널링 도메인의 팹 단편으로부터 유래된 표적화 도메인을 포함한다. 합성 cDNA는 pMIG-II 레트로바이러스 발현 벡터 내로 삽입된다. mAb287-CAR를 생성하는 데 사용되는 제한 엔도누슬리스 사이트가 도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 셀 분포에 대한 다양한 도금 방법의 효과. (왼쪽) 소용돌이 모션을 사용하여 파이펫팅된 셀은 균일한 분포를 보여줍니다. (오른쪽) 셀을 웰의 중심으로 직접 피펫하였다. 5분 동안 350 x g으로 회전한 후 이미지가 캡처되었습니다.
그림 3: 형질전환된 T 세포의 유동 세포 분석. 세포는 6.4단계에서 설명한 바와 같이 PE-Cy7 공액 안티 CD8, AF647 공액 안티 CD3 및 BV421 공액 된 안티 CD28로 공동 염색하였다. 단일 실행 가능한 셀에 게이트된 프로파일이 표시됩니다. (A) 얼룩이 없는 부모 CD8 T 세포. (B) 변환 된 세포의 PE-Cy7 / GFP 프로파일. CAR 발현 세포는 GFP 리포터에 의해 식별된다. (C) 스테인드 트랜스듀싱 셀을 PE-Cy7/GFP 이중 양성에 가문하였다. AF647/BV421 프로파일이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 분류되지 않은 CAR-T 세포의 테트라머 염색. 세포는 8.1단계에서 기재된 바와 같이 BV421 컨쥬게이드 테트라머로 염색하였다. 단일 실행 가능한 셀에 게이트된 프로파일이 표시됩니다. (A) 테스트 IAg7-인슐린 테트라머. (B) 제어 I-Ag7-HEL 테트라머. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: CAR T 세포에 의한 항원 특이적 사이토카인 분비. mAb287 또는 대조군 mAb24.1 CAR를 발현하는 정렬된 CD8 T 세포는 8.2단계에서기재된 바와 같이 IA g7-B:R3, "빈" IAg7또는 TFR-MBP-DTRL(mAb24.1에 대한 리간드)을 발현하는 M12C3 세포와 공동 배양하였다. 24시간 후, IFN-γ ELISA를 분비하여 ELISA에 의해 정량화되었다. 두 T 세포주의 특이적 자극이 관찰되었다. 데이터는 3회 반복된 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시간 | 바이러스 준비 | T 세포 준비 |
| 4일차(금) | 해동 피닉스 세포 (PM) | |
| 3일차((일) | 재플레이트 피닉스 | |
| 2일차(일) | 홀리데이 | |
| 1일차(월) | 조사 피닉스 세포 (PM) | CD3/CD28 Ab가 있는 비처리 플레이트 코팅 |
| 0일차(화요일) | 피닉스 세포 트랜스펙팅 (AM) | 비장세포를 준비하고 CD8 T 세포를 분리합니다. |
| T 세포 활성화. | ||
| 1일차 (수) | 피닉스 세포를 배지에서 4 ml(AM)로 변경합니다. | 코트 레트로넥틴 |
| 2일차 (수) | 바이러스를 수집하고 리필. | 감전, CD8 T 세포 |
| 3일차(금) | 바이러스를 수집합니다. | 감전, CD8 T 세포 |
| 4일차(주) | 세포를 세척하고 세포를 확장합니다. | |
| 5일차(일) | 필요한 경우 셀 확장. | |
| 6일차(월) | CAR-T 셀 정렬. | |
| 7일~10일(화~금) | T CAR-세포의 확장. 실험. |
표 1: CAR-T 생성 프로토콜의 요약.
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Discussion
이 프로토콜은 레트로바이러스 성전환에 의해 항원 특이적 CD8 CAR-T 세포를 제조하기 위한 효율적인 방법을 설명한다. 당사의 프로토콜의 전형적 감전 효율은 전형적으로 높으며, CAR의 강력한 발현이 일반적으로 관찰된다. 확장된 CAR T 세포는 부모 활성화 된 T 세포 및 항체 특이성의 필수 특징을 유지하고, 생체 외 및 생체 내 사용 모두에 적합하다. 우리는 NOD 마우스7에 있는 타입-1 당뇨병을 재프로그램하기에서 Ab-CAR CD8 T 세포를 적용했습니다.
당사의 프로토콜은 앞에서 설명한 메서드에 몇 가지 중요한 수정 사항을 통합합니다. 첫째, 우리는 연장 된 활성화 시간을 허용하는 최적화 된 T 세포 배양 매체를 사용합니다. 설명된 완전한 배지는 몇 가지 주요 보충제의 최적 수준을 포함하고, T 세포 생존력과 활성화 후 확산 정도를 크게 향상시킵니다. 마우스 IL-2는 동등한 결과를 가진 인간 단백질을 대체할 수 있다는 점에 유의해야 합니다, 비록 현재, 인간 IL-2는 더 저렴합니다. 참고로, 24시간 활성화 단계가 사용되는 경우보다 40-48시간 동안 활성화된 T 세포를 사용하여 훨씬 더 높은 형질전환 효율을 얻을 수 있다.
둘째, 우리는 폴리브렌 B (T 세포에 독성)를 제거하고 대신 피브로넥틴을 사용하는 향상된 트랜스덕션 절차를 사용합니다. 이것은 세포 생존을 더욱 향상시킵니다. 양호한 투과 효율을 보장하기 위해 적절한 세포 밀도에서 최적화된 배지에서 T 세포를 유지하고 이전에 동결된 바이러스가 아닌 신선한 고역바이러스 상피제를 사용하는 것이 중요하다는 점에 유의해야 한다. 우리의 수정된 절차를 사용하여, 제 3의 감전 단계는 불필요하고 세 번째 스핀 감염 단계가 포함된 경우에 생존가능성이 일반적으로 떨어지기 때문에 실제로 바람직하지 않습니다. 또한 확장 단계 동안 세포가 자라지 않도록하는 것이 중요하다는 것을 강조해야합니다. 일단 세포가 자라지면, 그(것)들은 급속하게 그들의 표현형을 분실하고 정지하는 경향이 있습니다.
위에서 설명한 매개 변수 외에도 낮은 트랜스덕션 효율/생존가능성의 두 가지 다른 잠재적 원인을 피해야 합니다. 첫째, 형질전환 단계 동안 항생제가 존재해서는 안되기 때문에 플라스미드가 내독소가 없는 키트를 사용하여 제조되고 멸균수에 용해되고, 좋은 멸균 기술이 항상 사용되도록 하는 것이 중요하다. 둘째, 죽거나 죽어가는 T 세포의 높은 수준의 존재를 피해야한다. 활성화된 부모 CD8 T 세포 현탁액이 높은 수준의 죽은 세포 또는 세포 파편을 포함하는 경우 상용 키트를 사용하여 전이하기 전에 제거해야합니다.
우리는 의도적으로 이 프로토콜에 CAR-T 세포 동결 단계를 포함하지 않았습니다, 우리의 경험에서와 같이 전이 세포의 상당 수는 동결 보존 및 해동 도중 정지합니다. 유사하게, 확장된 CAR-T 세포는 시험관 내에서 다시 자극될 수 있지만, 이들은 이식유전자의 발현을 잃는 증가된 경향을 갖는다. 따라서, 우리가 갓 분류된 CAR-T 세포를 사용하여 관찰하는 높은 수준의 증식을 감안할 때, 우리는 매우 기능적 검사 및 입양 전달을 위해 갓 생성된 CAR-T 세포만 이용되는 것이 좋습니다.
요약하면, 이 프로토콜의 중요성은 높은 형질전환 효율을 제공하고 생체외 및 생체 내에서 사용하기 위한 많은 수의 건강한 항원 특이적 마우스 CD8 T 세포를 생성하는 절차를 설명한다는 것이다. 따라서 당사의 프로토콜은 질병의 마우스 모델에서 CAR-T 세포 연구를 착수하는 연구자를 위한 유용한 도구를 제공합니다.
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Disclosures
MAb287 및 그 파생 상품은 2014년에 발행된 미국 특허에 의해 보호됩니다.
Acknowledgments
이 연구는 JDRF 교부금 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, SRA-2-S-2018-648-S-B, 당뇨병 교육 및 행동 상, 그리고 베일러 의학 대학에서 분자 의학 연구를 위한 캐롤라인 비스 법률 기금에 의해 지원되었습니다. 세포 분류는 NIH (S10RR024574 및 P30CA125123)의 자금으로 베일러 의과 대학의 세포 분석 및 세포 선별 코어에 의해 지원되었습니다. 모든 펩티드-MHC 테트라머는 NIH 테트라머 코어 시설에서 수득하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 μM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
References
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