Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Høy-effektivitet generasjon av antigen-spesifikke primær mus cytotoksisk T celler for funksjonell testing i en autoimmun diabetes modell

doi: 10.3791/59985 Published: August 16, 2019

Summary

Denne artikkelen beskriver en protokoll for generering av antigen-spesifikke CD8 T-celler, og deres ekspansjon in vitro, med sikte på å gir et høyt antall funksjonelle T-celler for bruk in vitro og in vivo.

Abstract

Type 1 diabetes (T1D) er preget av Holme-spesifikke autoimmunitet fører til beta celle ødeleggelse og absolutt tap av insulin produksjon. I den spontane ikke-overvektige diabetes (NOD) mus modell, er insulin det primære målet, og genetisk manipulering av disse dyrene for å fjerne en enkelt nøkkel insulin epitope forebygger sykdom. Dermed selektiv eliminering av profesjonelle antigen presentere celler (APCs) som bærer denne patogene epitope er en tilnærming for å hemme uønskede insulin-spesifikke autoimmune responser, og sannsynligvis har større translational potensial.

Chimeric antigen reseptorer (CARs) kan omdirigere T celler å selektivt målrette sykdomsfremkallende antigener. Denne teknikken er grunnleggende for nylige forsøk på å bruke mobilnettet engineering for adoptiv cellen terapi for å behandle flere kreft. I denne protokollen, beskriver vi en optimalisert T-Cell retrovirus (RV) Transduction og in vitro ekspansjon protokollen som genererer et høyt antall funksjonelle antigen-spesifikke CD8 CAR-T-celler som starter fra et lavt antall naive celler. Tidligere flere CAR-T celle protokoller har blitt beskrevet, men vanligvis med relativt lav Transduction effektivitet og celle levedyktighet etter Transduction. I kontrast gir vår protokoll opptil 90% Transduction effektivitet, og cellene som genereres kan overleve mer enn to uker in vivo og signifikant forsinke sykdomsutbruddet etter en enkelt infusjon. Vi gir en detaljert beskrivelse av cellen vedlikehold og Transduction protokoll, slik at de kritiske trinnene kan lett følges. Hele prosedyren fra primær celle isolasjon til CAR-uttrykk kan utføres innen 14 dager. Den generelle metoden kan brukes på en hvilken som helst mus sykdom modell der målet er kjent. Tilsvarende er det spesifikke programmet (målretting en patogene peptid/MHC klasse II-kompleks) gjelder for alle andre autoimmune sykdommer modell som et viktig kompleks har blitt identifisert.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gitt den sannsynlige redusert risiko for uønskede off-målet effekter, antigen-spesifikke immun behandling (ASI) er lovende behandlinger for autoimmune sykdommer som T1D. Akkumulere bevis tyder på at immunresponser til (prepro) insulin kan være spesielt viktig i T1D1. I det siste tiåret, studier fra flere grupper, inkludert vår egen, sterkt tyder på at presentasjonen av en epitope inneholder insulin B kjede aminosyrer 9 til 23 av spesifikke MHC klasse II molekyler (B: 9-23/MHCII), spiller en viktig rolle i utviklingen av T1D i mus og mennesker2,3,4,5. Å selektivt målrette B: 9-23/MHCII kompleks, genererte vi et monoklonale antistoff, kalt mAb287, som har ingen kryss reaktivitet til hormonet insulin eller komplekser som inneholder andre peptider6. MAb287 blokkerer antigenpresentasjon in vitro, og ukentlig administrering av mAb287 til pre-diabetiker NOD mus forsinket utviklingen av T1D i 35% av den behandlede mus6. Å blokkere antigenpresentasjon in vivo, hyppige injeksjoner er vanligvis nødvendig for å opprettholde en høy sirkulerende konsentrasjon. Vi hypotetisk gjennomsnitt at vi kunne overvinne denne vanskeligheten ved å utnytte den høye spesifisitet av Ab287 å programmere T-celler, og dermed gi en forbedret antigen-spesifikke T celle terapi for T1D7.

Cytotoksisk T celler rapporteres å være i stand til å drepe sine mål hvis selv en enkelt kopi av deres beslektet ligand uttrykkes8,9,10. Således, B: 9-23/MHCII spesifikk CD8 T celler forventes å ha høyere effektivitet i å eliminere uønsket antigen presentasjonen enn forelder antistoff, som sannsynligvis må binde til flere komplekser på samme APC til å utøve sin effekt. Bil T celler har blitt brukt for behandling av flere menneskelige kreft11,12,13, og kan også være effektiv i autoimmunitet14. Men, CAR-T-celler med spesifisitet for patogene peptid-MHC komplekser har ikke så langt blitt brukt til å endre progresjon av T1D. Ved å bruke optimalisert CD8 T celle Transduction teknikk beskrevet nedenfor, har vi nylig demonstrert bevis på prinsippet om at dette faktisk representerer en levedyktig tilnærming7.

I denne protokollen skisserer vi en effektiv og strømlinjeformet Transduction og Utvidelses metode. Vår protokoll gjelder for andre studier som krever generering av mus CD8 CAR T-celler med høy effektivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mus ble opprettholdt under spesifikke patogen-frie forhold ved en transgene Mouse anlegget, og alle dyr eksperimenter ble utført i samsvar med protokoller godkjent av Baylor College of Medicine dyr omsorg og bruk komiteen.

Merk: eksperimentet krever forberede viruset og T-cellene parallelt. Tabell 1 oppsummerer protokollen. Nøkkel reagensene og-buffere er oppført i materialfortegnelsen. Vi fokuserer på generering og utvidelse av CAR-T-celler rettet mot bestemte populasjoner av APCs i denne protokollen.

1. generering og validering av single Chain fab antistoff (scFab)-biler.

Merk: biler inneholder vanligvis tre kritiske domener – et antigen som målrettes mot domene, et spacer/transmembrane-domene og et cytoplasmatiske signal domene. Den presise utformingen av hver bil avhenger av det tiltenkte målet, og så, bortsett fra de viktigste funksjonene i konstruksjonen som er relevant for generering av retrovirus, vil ikke bli beskrevet i detalj i denne protokollen. Den generelle utformingen av bilene som brukes for studiene beskrevet nedenfor er vist i figur 1. Kort sagt, omfatter målretting domenet hele lys kjeden og variable og CH1 domene av den tunge kjeden fra den overordnede monoklonale antistoff koblet av en semi-rigid linker. Den spacer/transmembrane domenet er fra mus CD28, og signalering domenet er en fusjon som inneholder elementer fra mus CD28, CD137 (4-1BB), og CD247 (CD3ζ). Disse elementene er satt sammen av standard molekylærbiologi prosedyrer som skjøte overlapping polymerase kjedere reaksjon (PCR), eller syntesen av en passende "gen blokk". Detaljer om generering av mAB287 CAR finnes i Zhang et al.7. Den cDNA sekvenser kan fås fra forfatterne på forespørsel.

  1. Montering av bil konstruksjonen
    1. Syntetisere målrettingen enkelt kjede fab antistoff (scFab) og kombinerte spacer/signalering domener separat, og bruke en "3 punkt" ligation teknikk15 for å montere den endelige konstruere (figur 1).
      Merk: nøkkelen kravet for bilen setter inn er at den skal inneholde flankerer restriksjon endonuclease nettsteder tillater ligation inn i retroviral uttrykk vektor PMSCV-IRES-GFP II (pMIG II), eller et beslektet derivat15 er også Riktig.
  2. Validering av bilens overflate uttrykk
    1. Overfører de hybridoma cellene ved hjelp av pMIG II avledet retroviral partikler generert av en standard protokoll (for eksempel Holst et al.16).
    2. Kjør Flow flowcytometri analyse for å oppdage uttrykk for GFP fra bilen vektoren17.
    3. Stain overflate uttrykk for bilen av transduced hybridomas bruker merket antistoffer mot musen ĸ kjeden (for eksempel klone RMK-45)17.
      Merk: 18.
  3. Validering av CAR spesifisitet
    1. Stimulere transduced hybridoma celler med riktig plate-bundet eller cellulær antigener. Etter over natten co-kultur samle supernatanter og skilles ut cytokiner, og analyseres av enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (ELISA)7.
      Merk: ideelt sett bør hver bil være uavhengig validert før den brukes til Transduction. I dette trinnet kan eksperimentet stoppes midlertidig og startes på nytt senere.

2. transfeksjoner av viral produsent celler (dag-4 til dag 3)

Merk: retrovirus produseres ved hjelp av Phoenix-Eco celler (se tabell over materialer)19,20. Bruk egnede forholdsregler for generering av potensielt smittsomme midler (fortrinnsvis inkludert en utpekt BSL-2 kabinett og egen inkubator for dyrking transfekterte/transduced celler).

  1. Tine Phoenix celler (dag-4)
    1. Tin 2 x 106 Phoenix-Eco celler. Skaler opp antall Phoenix-celler hvis flere transductions er planlagt.
    2. Plate dem i en 10 cm vev kultur parabol med 10 mL medium (Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) inneholder 10% fosterets kalv serum (FCS)).
  2. Passage Phoenix celler (dag-3)
    1. Fjern medium, og vask med 5 mL Dulbecco ' s fosfat-bufret saltvann (DPBS).
    2. Tilsett 3 mL 0,25% Trypsin og ruge ved 37 ° c under 10% CO2 atmosfære i 3 min.
    3. Høste cellene deretter pellet av sentrifugering for 3 min på 200 x g. Re-plate celler med 10 mL friskt medium og ruge ved 37 ° c.
  3. Bestråling av Phoenix celler (dag-1 ettermiddag)
    1. For å minimere ytterligere celledeling, samle Phoenix-celler som beskrevet i trinn 2,2, resuspend i 5 mL medium, og gamma irradiate celler på is (1000 rad).
      Merk: forsiktighet bør brukes for stråling arbeid for å unngå personell eksponering.
    2. Sentrifuger de bestrålt cellene, resuspend i friskt medium, plate ved 2 x 106 celler (i 10 ml medium)/plate/Car, og ruge.
  4. Transfeksjoner (dag 0-morgen)
    1. Aspirer supernatanten fra Phoenix cellene, vask med 5 mL fosfat-bufret saltvann (PBS), og Legg forsiktig til 7 mL redusert serum medium (f. eks OPTi-MEM) dråpevis til sideveggen av platen for å unngå å forstyrre monolag. Overfør celler tilbake til inkubator.
    2. Ta 2 14 mL runde bunn polypropylen rør, og tilsett 1,5 mL redusert serum medium til hver. Til ett rør, tilsett 40 μL av transfeksjoner reagens (se tabell over materialer).
    3. Til det andre røret legger du til 15 μg AB-CAR-plasmider (generert i trinn 1) og 5 mikrogram konvolutt-og emballasje plasmider (5 μg pCL-Eco). Ruge rør ved romtemperatur i 5 min.
    4. Tilsett transfeksjoner reagens blandingen fra trinn 2.4.2 dråpevis til det andre røret uten å kontakte rør sidene, og bland ved å pipettering løsningen opp og ned forsiktig 3 ganger. Ruge ved romtemperatur i minst 20 min.
    5. Tilsett 3 mL av blandingen dråpevis til Phoenix cellene, og plasser i en vev kultur inkubator.
    6. Etter 4 – 5 h Tilsett 1 mL av FCS. Kultur celler overnatter ved 37 ° c.
  5. Middels endring (dag 1)
    1. Fjern supernatanten som inneholder plasmider/transfeksjoner reagens komplekser og kast dem i samsvar med institusjonelle prosedyrer for håndtering av smittsomme materialer. Tilsett 4 mL friskt, forvarmet kultur medium til cellene.
  6. Harvest virus for Transduction (dag 2)
    1. Samle viruset som inneholder medium fra Phoenix cellene med en steril sprøyte, filter (0,45 μm) for å fjerne rester av celle rusk, og samle inn et nytt rør.
    2. Legg rhIL-2 lager til en endelig konsentrasjon av 200 IU/mL. Bruk viruset umiddelbart for Transduction (trinn 5,3). Tilsett 4 mL friskt medium til Phoenix cellene og plasser i inkubator.
  7. Gjenta virus samling (dag 3)
    1. Gjenta trinn 2,6, men Forkast Phoenix-celler som smittsomme avfall i stedet for å legge til friskt medium. Denne supernatanten brukes i trinn 5,4.

3. primær CD8 T celle isolering og aktivering (dag-1 til dag 0)

Merk: tidligere, samle CD8 T-celler fra kvinnelige nikk mus på 4 – 5 uker, et tidspunkt før Holme betennelse starter21,22. Håndter alle musene etter IACUC godkjente protokoller. CD8 T-celler er beriket fra splenocytes ved hjelp av et kommersielt negativt utvalgs sett.

  1. Belegg plater med CD3/CD28 antistoffer (dag-1)
    1. Tilsett 1 mL av en blanding av anti-mus CD3 og CD28 antistoffer (både ved 1 μg/mL i PBS) til hver brønn av en 24-brønn plate, og ruge ved 4 ° c over natten.
    2. Neste dag, vask platene med 1 mL steril PBS 3 ganger før du legger til murine CD8 T-celler (trinn 4,1).
      Merk: antall brønner som skal smøres vil variere for hvert eksperiment, avhengig av det totale antallet aktiverte CD8 T-celler som kreves.
  2. Innsamling av splenocytes (dag 0)
    1. Euthanize to NOD kvinnelige mus i alderen 4-5 uker ved hjelp av CO2 inhalasjon etterfulgt av halshogging. Høste spleens og legg dem på en celle sil soaking i 10 mL PBS i en cellekultur parabolen på isen.
    2. I en cellekultur hette, Skjær hver milt i 3 – 5 stykker, trykk vev med et sterilt stempel av en 3 eller 5 mL sprøyte for å tvinge milt fragmenter fra hverandre og la cellene passere gjennom netting.
    3. Fjern forsiktig røde blodceller ved blanding splenocytes i 1:4 fortynnet rød cellelyse buffer (1 mL lyseringsbuffer i 3 mL PBS for en milt), og incubating i 5 min ved romtemperatur.
    4. Deretter fortynne 10 μL av celle suspensjonen med trypan blå fargestoff løsning for telling av celler med en hemocytometer, og pellet resten av cellene ved sentrifugering ved 350 x g i 7 min.
  3. Berikelse av CD8 T-celler (dag 0)
    1. Berike CD8 T-celler ved negative valg ved hjelp av en mus CD8 T celle isolasjons sett, etter produsentens instruksjoner.
      Merk: for å sikre høy renhet må du alltid runde opp celle tallene ved beregning av volumet av biotinylated som skal tilsettes (f.eks. Bruk reagens volumet som foreslås for 108 celler for en beregnet 9,1 x 107 celler).
    2. Suspendere celle pellets i 400 μL av buffer og 100 μL av biotin-antistoff cocktail per 1 x 108 celler, bland godt og ruge i 5 minutter i kjøleskapet (4 ° c) for å tillate antistoff binding.
    3. Tilsett 300 μL av merkings buffer og 200 μL av anti-biotin mikro-perler per 1 x 108 celler, bland godt og ruge i 10 min ved 4 ° c.
    4. Mens du venter på mikro-perlen binding, sette opp separasjon kolonnen på separatoren. Vask søylen ved å skylle med 3 mL merkings buffer.
    5. Pass 1000 μL av perle-/celle blanding gjennom en celle sil på 40 μm før du legger den på skille søylen for å fjerne celle aggregater. Samle kolonnen Flow-through i en pre-kjølt 15 mL tube.
    6. Vask kolonnen som instruert av produsenten, samle alle avløpsvann i samme tube. Bestem celle nummer (samme som trinn 3.2.4) og samle inn ved sentrifugering ved 350 x g i 5 min. vaske cellene ved blanding i 2 ml komplett T celle medium (RPMI-1640 inneholder FCS, 2-Mercaptoethanol, rhIL-2 (200 U/ml), mIL-7 (0,5 ng/ml), Its , HEPES og penicillin-Streptomycin) og sentrifugering ved 350 x g i 5 min.
    7. Resuspend cellene i forvarmet (37 ° c) komplett T celle medium ved en konsentrasjon på 0,25 – 0,5 x 106/ml.

4. T celle aktivering (dag 0 til 2)

  1. Tilsett 2 mL av celle fjæringen (0,25 – 0,5 x 106/ml) til hver belagt BRØNN av CD3/CD28 antistoff belagt 24-brønn plate fra trinn 3.1.2. Bruk en virvlende bevegelse for å kvitte cellene jevnt.
    Merk: Legg til cellene ved hjelp av en virvlende bevegelse for å fordele dem jevnt og minimere kanteffekter. Hvis cellene klynger seg langs kanten av brønnene, vil både Transduction rate og celle levedyktighet reduseres.
  2. Som en kontroll, plate det samme antall CD8 T-celler i en enkelt ikke-belagt brønn av platen. Ruge cellene ved 37 ° c med en 10% CO2 gasset inkubator for 48 h.
    Merk: etter 48 h kan aktiveringen bekreftes ved hjelp av et mikroskop. de aktiverte cellene vil være større enn cellene som ikke møter anti-CD3/CD28 antistoffer.

[sted skikkelsen 2 her over]

5. Transduction av aktiverte CD8 T-celler (dag 1 til 3)

Merk: denne protokollen bruker en spin-Transduction metode. En sentrifuge med en swing-out rotor og vev kultur plate adaptere som er i stand til å opprettholde en intern temperatur på 37 ° c er nødvendig. For å sikre maksimal effektivitet, på dagen for Transduction pre-varme sentrifuger til 37 ° c før du samler viruset.

  1. Forberedelser av humant fibronektin fragment belagt plater (dag 1 til dag 2)
    1. På dag 1 legges 0,5 mL fibronektin (50 μg/mL i PBS) til brønnene til en 24-brønn plate, og ruge over natten ved 4 ° c.
      Merk: vanligvis kreves to fibronektin brønner per tallerken med transfekterte Phoenix-celler.
    2. På dag 2 fjerne fibronektin løsning, og erstatte med 1 mL av 2% storfe serum albumin (BSA) i PBS. Ruge ved romtemperatur i 30 min til "Block" ikke-spesifikke bindende nettsteder.
    3. Vask de behandlede brønnene med 1 mL sterilt PBS. Etter å ha fjernet vaskeløsningen, er platen klar til bruk; eller, kan tettes og oppbevares ved 4 ° c i opptil en uke.
  2. Samling av aktiverte CD8 T-celler (dag 2)
    1. Høste de aktiverte CD8 T-cellene, Tell og Beregn celle levedyktighet ved hjelp av trypan blå eller et egnet automatisert instrument.
    2. Samle celler ved sentrifugering og resuspend ved 5 x 106 levedyktige celler/ml for Transduction. Opprettholde en liten alikvot av celler i kultur i hele T-celle medium i CO2 inkubator for å gi en kontroll for påfølgende fluorescens aktivert celle sortering av transduced celler (trinn 6).
      Merk: etter aktivering for 48 h, bør det totale antallet celler har økt med ca 1,5 fold, og har en levedyktighet større enn 95%.
  3. Transduction (dag 2)
    1. Tilsett 100 μL av aktivert CD8 celle fjæring per brønn (0,5 x 106 celler) til fibronektin belagt plate. Deretter legger 1.5-2 mL av virus som inneholder medium (fra trinn 2,6) til hver brønn. Bland ved hjelp av en virvlende bevegelse for å dispensere cellene jevnt (figur 2).
    2. Plasser plate i en zip-lock plastpose og tetning (for å gi sekundær forvaring). Sentrifuger ved 2000 x g for 90 min ved 37 ° c.
    3. Fjern platen fra sentrifuge. I den biologiske sikkerheten, kabinettet forsiktig fjerne plastposen og sikre at utsiden av platen er ikke forurenset med noe medium.
    4. Deretter overfører du platen til den dedikerte 37 ° c CO2 inkubator. Etter 4 h, fjerne 1 mL av mediet fra hver brønn og erstatte med 1 mL pre-varmet komplett T celle medium. Bytt ut platen i CO2 inkubator.
      Merk: Håndter alle medier fra de transduced cellene som smittsomme avfall.
  4. Andre Transduction (dag 3)
    1. I den dedikerte biologiske sikkerhetskabinett, stigning platen som inneholder de transduced cellene ved å hvile på lokket og forsiktig fjerne det meste av mediet (som går 100 – 200 μL) og pass på at du ikke kontakter cellene i bunnen av brønnen.
    2. Legg til viruset som inneholder mediet som ble samlet i trinn 2,7, og gjenta trinn 5.3.2 – 5.3.4.
      Merk: i vår erfaring, en tredje Transduction sjelden forbedrer generell effektivitet. I tillegg vil cellen levedyktighet trolig falle betydelig hvis en tredje Transduction brukes. Hvis cellene er belagt med en høyere konsentrasjon enn 0,5 x 106/well, kan T-cellene nå samløpet etter natten inkubasjons etter det andre Transduction trinnet. I dette tilfellet deles celler etter 4 h inkubasjons på dag 3.
  5. Vask celler (dag 4)
    1. Fjern 1 mL medium fra hver brønn, resuspend cellene i det resterende medium og Overfør til en 15 mL tube. Vask brønnene med 1 mL komplett T celle medium og Legg til røret som inneholder de grupperte cellene fra hver Transduction.
    2. Sentrifuger på 350 x g i 7 min, vask deretter to ganger ved blanding i 2 mL komplett T celle medium og pelleting. Endelig resuspend i 2 mL medium og bestemme celle nummer.
      Merk: Hvis 1 x 106 celler ble opprinnelig transduced, bør avkastningen på dette stadiet være ~ 3 x 106.
  6. Overføre
    1. Overfør alikvoter på 0,5 – 1 x 106 celler i 2 ml komplett T-celle medium til brønnene til en ny 24-brønn plate og ruge ved 37 ° c. Omtrent 48 – 72 h post-Transduction er cellene klare for bil uttrykks analyse og celle sortering.
      Merk: antall bil-T-celler dobler vanligvis hver 24 h på dette stadiet. Det er viktig å aldri la dem overgrow. Split cellene umiddelbart hvis tettheten er høyere enn 2 x 106/ml (eller hvis mediet noen gang blir lys gul). I vår erfaring bil-T cellene sprer mer robust i 24-brønn og 12-brønn plater enn hvis overført til et større fartøy.

6. rensing av transduced celler ved fluorescens celle sortering (FACS) (dag 5 eller dag 6)

  1. Samle cellene.
    1. Resuspend cellene ved pipettering opp og ned flere ganger (ta vare ikke å forårsake skumme), overføring til 15 mL rør og sentrifuger på 350 x g i 5 min.
    2. Resuspend i sorterings buffer (2% BSA i steril PBS som inneholder Gentamicin) ved 1 x 106 celler/ml. Også høste kontrollen (un-transduced) CD8 T-celler fra trinn 5,2).
      Merk: fra 1 x 106 -celler ved dag 2, en yield på ~ 2 x 107 transduced celler er forventet på dette tidspunktet punkt.
  2. Vask cellene en gang med sortering buffer ved sentrifugering på 350 x g i 5 min, og resuspend ved 1 x 107 celler/ml i sortering buffer. Fjern en liten alikvot for Foxp3GFP kompensasjon kontroll (som skal brukes i trinn 6.4.1), og beis resten med merket anti-mus CD8 (klone 53-6.7; 0,2 μg av antistoff/5 x 106 celler) ved incubating i 20 min ved 4 ° c.
    1. På samme måte, beis en alikvot av de ikke-transduced CD8 T-cellene for å gi en kompensasjon kontroll for fluoroforen merking anti-CD8 antistoff.
      Merk: unngå å legge til natrium Natriumazid til en hvilken som helst buffer, da dette er giftig for cellene.
  3. Vask de merkede cellene to ganger med sorterings buffer, resuspend i kald sorterings buffer ved 1 x 107 -celler/ml.
  4. Sortere cellene.
    1. Sorter CD8 GFP+ positive celler i pre-kjølt komplett T celle medium (figur 3b). Ta en liten alikvot for post-sortering analyse for å bestemme renheten.
      Merk: for å maksimere renheten av de sorterte cellene stramme porter bør brukes. Bruk et 100 μm munnstykke for å sikre høy celle levedyktighet. Minimer hvor lenge de sorterte cellene oppbevares på is. T-celler som har blitt holdt på isen for mer enn 3 h ta mye lengre tid å gjenopprette enn celler kjølt for mindre enn 2 t. Således, hvis 3 transduced cellelinjer må sortere, samle og merke den andre linjen mens den første blir sortert og så videre i stedet for å ha den andre og tredje linjene tilbringer en lengre tid ved 0 ° c. Uttrykk for andre T celle markører som CD28 og CD3 kan også overvåkes (figur 3c), men er ikke avgjørende for sortering formål.
    2. (Alternativ sortering strategi) Før farging av bulk befolkningen, analysere CD8 uttrykk for en liten populasjon av transduced T-celler. Hvis renheten er > 99% da bulk befolkningen kan trygt sorteres utelukkende på grunnlag av GFP uttrykk.

7. utvidelse av sorterte CAR-T-celler (dag 5 til 10)

  1. BIL-T celle ekspansjon
    1. Vask sorterte CAR-T-celler én gang, og resuspend deretter i forvarmet komplett T-celle medium ved 2,5 – 5 x 105 celler/ml, og plate 2 ml alikvoter i 24-brønn plater.
    2. Count og splitte cellene hver 1-2 dager. Vanligvis celle nummer dobles hver dag til ~ dag 10, med levedyktighet resterende over 95%.
      Merk: uten re-stimulering, vil Car-T-cellene stoppe voksende rundt dag 10 og til slutt dø. Dermed bør T celle funksjonell analyser og adoptiv overføringer planlegges tilsvarende.
  2. Alternativ Utvidelses strategi
    1. Etter sortering, kultur i CAR-T-celler i komplett T-celle medium som inneholder rhIL-2 ved 100 U/mL i stedet for 200 U/mL.
      Merk: bilen-T celler sprer på en litt langsommere i dette mediet. Men de vil ofte fortsette å spre seg til dag 11 til 13 uten re-stimulering. Selv om denne alternative Utvidelses strategien ikke genererer et høyere antall celler, gir den et litt lengre tidsvindu for nedstrøms analyser som skal utføres.

8. verifisering av antigen spesifisitet og funksjonaliteten til CAR T-cellene.

Merk: bindingen spesifisitet av bil T celler målretting peptid/MHC komplekser kan verifiseres ved tetramer farging7,23. På samme måte kan deres funksjonalitet bekreftes ved å måle cytokin sekresjon eller cytotoksisitet etter stimulering av deres beslektet ligander. Det NIH Tetramer kjernen Letter (TCF) for Emory universitet er en anbefalt kilde av "tetramers" og relevant flekk protokoller.

  1. Peptid-MHC Tetramer farging.
    1. Label alikvoter av 2 x 105 transduced Car-T-celler i 100 til μL av sorterings buffer ved incubating med ~ 0,6 mikrogram fluorescensmerkete merket antigen-spesifikke og kontroll tetramers ved 37 ° c for 2 t.
    2. Pellet cellene ved sentrifugering i 5 min ved 350 x g, vask deretter to ganger ved å blanding i 0,5 ml sortering buffer og re-sentrifugering. Til slutt, resuspend cellene i 300 μL av sortering buffer og analysere ved Flow flowcytometri (Figur 4).
      Merk: for disse studiene bruker vi vanligvis BV421-merket IAG7-B:9-23 (re) (test) og IAG7-hel (kontroll) tetramers. Enhver fluoroforen/tetramer kombinasjon som passer for bilen (e) under etterforskning, kan imidlertid brukes i stedet. I dette tilfellet bør konsentrasjonen og farge tiden optimaliseres for hver tetramer som brukes. Både sortert og un-sorterte CAR-T-celler kan brukes til tetramer farging.
  2. Spesifisitet måling av ligand stimulering.
    1. Ruge 2 x 105 sorterte bil-t-celler i 200 μL av cytokin T celle medium med passende plate-bundet eller mobil ligander.
    2. Etter 6-24 h måle cytokin produksjon av ELISA eller intracellulære flekker ved hjelp av produsentens protokoller.
      Merk: for våre studier av IAG7-B:9-23 Omdirigert T celler, vi kultur cellene over natten med M12C3 murine B-celle lymfom celler uttrykker IAG7-B:R3 eller "Tom" IAG724,25, deretter samle supernatanter og måle utskilles musen interferon gamma (IFN-γ) av ELISA26 (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vanligvis er Transduction effektivitet ved hjelp av denne protokollen ~ 60-90%. I eksperimentet vist i Figur 3, før sortering ca, 70% av CD8 T-celler co-uttrykt GFP. De har også co-uttrykt CD28 og CD3 (figur 3c). Viktigere, alle de "test" GFP+ celler også co-BEISET med IAG7-B:R3 tetramers, men ikke med kontroll tetramer (Figur 4). Tilsvarende den sorterte test og kontroll CAR-T celler hver skilles ut høye nivåer av IFN-γ bare etter co-kultur med målceller uttrykker sine beslektet ligander (figur 5). Dette bekrefter at de transduced cellene har en CD8 effektor T-celle fenotype rettet mot målet for den overordnede antistoffer.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av bilen retroviral konstruere. BILEN består av et målrettings domene avledet fra den fab fragment av en passende mus monoklonale antistoff, og en spacer/membran anker/signalering domene fra mus CD28, CD137 og CD247. Den syntetiske cDNA er satt inn i pMIG-II retroviral uttrykk vektor. Begrensnings endonuclease nettsteder som brukes til generering av mAb287-bilen, vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: effekt av forskjellige plating metoder på celle distribusjon. Venstre Celler Pipet tert ved hjelp av en virvlende bevegelse viser en jevn fordeling. Retten Celler ble Pipet tert direkte inn i midten av brønnen. Bildene ble tatt etter spinning på 350 x g i 5 min. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Flow analytiske analyse av Transduced T-celler. Celler ble co-farget med PE-Cy7 bøyd anti-CD8, AF647 bøyd anti-CD3, og BV421 bøyd anti-CD28, som beskrevet i trinn 6,4. Profiler inngjerdet på enkelt levedyktige celler vises. (A) un-farget foreldrenes CD8 T-celler. (B) PE-CY7/GFP profil av transduced celler. BILEN uttrykker cellene er identifisert av GFP reporter. (C) farget transduced celler ble GATED på PE-CY7/GFP dobbel positivitet. AF647/BV421-profilen vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Tetramer farging av un-SORTERTE Car-T-celler. Celler ble farget med BV421 bøyd tetramers som beskrevet i trinn 8,1. Profiler inngjerdet på enkelt levedyktige celler vises. (A) test IAG7-insulin tetramer. (B) styre I-AG7-hel tetramer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: antigen-spesifikke cytokin sekresjon av Car T-celler. Sortert CD8 T-celler uttrykker testen mAb287 eller kontroll mAb 24.1 CAR var co-kultivert med M12C3 celler uttrykker IAG7-B:R3, "tomme" IAG7, eller TFR-MBP-DTRL (den ligand for Mab 24.1) som beskrevet i trinn 8,2. Etter 24 h, utskilles IFN-γ ELISA ble kvantifisert av ELISA. Spesifikke stimulering av begge T cellelinjer ble observert. Data representerer gjennomsnittlig ± SD av tre gjentatte eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tid Forberedelse av virus T celle forberedelse
DAG-4 (fr) Tine Phoenix celler (PM)
Dag-3 (Lør) Re-plate Phoenix
Dag-2 (Søn) Ferie
Dag-1 (man) Irradiate Phoenix celler (PM) Frakk ikke-behandlet tallerken med CD3/CD28 AB
Dag 0 (tue) Transfecting Phoenix celler (AM) Forbered splenocytes og Isoler CD8 T-celler.
T celle aktivering.
Dag 1 (ons) Endre Phoenix celler medium til 4 ml (AM). Pels RetroNectin
Dag 2 (Thu) Samle inn virus og påfyll. Transduction, CD8 T-celler
Dag 3 (fr) Samle virus. Transduction, CD8 T-celler
Dag 4 (Lør) Vask celler og utvide celler.
Dag 5 (søndag) Cell ekspansjon om nødvendig.
Dag 6 (man) BIL-T celle sortering.
Dag 7 -10 (tue til fre) Utvidelse av T CAR-celler. Eksperimenter.

Tabell 1: oppsummering av protokoll for bil-T-generering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for produksjon av antigen-spesifikke CD8 CAR-T-celler ved retroviral Transduction. Den Transduction effektiviteten av vår protokoll er vanligvis høy, og robust uttrykk for bilen er generelt observert. Den utvidede CAR T-cellene beholder de essensielle funksjonene til de overordnede aktiverte T-cellene og de spesielle antistoff-og bruks egenskapene, og egner seg både for in vitro og in vivo. Vi har søkt AB-CAR CD8 T-celler i REPROGRAMING type 1 diabetes i NOD mus7.

Vår protokoll omfatter flere kritiske modifikasjoner på tidligere beskrevne metoder. Først bruker vi en optimalisert T-celle dyrking medium som tillater en utvidet aktiveringstid. Den komplette medium beskrevet inneholder optimale nivåer av flere viktige kosttilskudd, og betydelig forbedrer både T celle levedyktighet og omfanget av spredning etter aktivering. Det bør bemerkes at musen IL-2 kan erstattes av menneskelig protein med tilsvarende resultater, men i dag, menneskelige IL-2 er rimeligere. Av notatet, en betydelig høyere Transduction effektivitet oppnås ved hjelp av T-celler aktivert for 40-48 h enn om en 24 h aktiverings trinn brukes.

For det andre bruker vi en forbedret Transduction prosedyre som eliminerer polybrene B (som er giftig for T-cellene) og bruker fibronektin i stedet. Dette forbedrer celle levedyktighet ytterligere. Det bør bemerkes at for å garantere god Transduction effektivitet er det avgjørende å opprettholde T-cellene i et optimalisert medium på en passende celle tetthet og å bruke friske høy-titer viral supernatanter snarere enn tidligere frosset virus. Ved hjelp av vår modifisert prosedyre, en tredje Transduction trinn er unødvendig og faktisk er uønsket som levedyktighet vanligvis synker hvis en tredje spin smitte trinn er inkludert. Det må også understrekes at det er viktig å aldri la cellene overgrow i utvidelsesfasen. Når cellene er overgrodd, har de en tendens til å raskt miste sin fenotype og dø.

I tillegg til parametrene beskrevet ovenfor, må to andre potensielle årsaker til lav Transduction effektivitet/levedyktighet unngås. For det første, idet antibiotika burde ikke være gave under transfeksjoner skritt det er en betydelig for sikre det det plasmider er ferdig tilberedt benytter en endotoksin-ledig utstyr, og oppløst inne sterilt vann, og det fint steril teknikk er anvendt til alle tider. For det andre må tilstedeværelsen av høye nivåer av døde eller døende T celler unngås. Hvis den aktiverte foreldre CD8 T-celle suspensjonen inneholder høye nivåer av døde celler eller celle rusk dette bør fjernes før Transduction ved hjelp av kommersielle kits.

Vi har bevisst ikke inkludert en CAR-T celle frysing trinn i denne protokollen, som i vår erfaring en betydelig andel av de transduced cellene dør under kryonisk bevaring og tine. På samme måte, selv om de utvidede CAR-T-cellene kan bli re-stimulert in vitro, har de en økt tendens til å miste uttrykk for transgene. Følgelig, gitt den høye graden av spredning vi observerer ved hjelp av nylig sorterte CAR-T-celler, anbefaler vi sterkt at bare ferske genererte CAR-T-celler brukes til funksjonelle analyser og adoptiv overføringer.

Oppsummert er betydningen av denne protokollen at den beskriver en prosedyre som gir høy Transduction effektivitet og genererer et stort antall sunne antigen spesifikke mus CD8 T-celler for bruk in vitro og in vivo. Vår protokoll gir dermed et nyttig verktøy for forskere foretaket CAR-T celle studier i musen modeller av sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

MAb287 og dets derivater er beskyttet av et amerikansk patent utstedt i 2014.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av JDRF Grants 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, og SRA-2-S-2018-648-S-B, en diabetes utdanning og action Award, og Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine ved Baylor College of Medicine. Cell-sortering ble støttet av flowcytometri og Cell sortering Core ved Baylor College of Medicine med finansiering fra NIH (S10RR024574 og P30CA125123). Alle peptid-MHC-tetramers ble innhentet fra NIH Tetramer Core Facility.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 μM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
  2. Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40, (14-15), 1033-1039 (2004).
  3. Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
  4. Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 16729-16734 (2011).
  5. Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10978-10983 (2010).
  6. Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
  7. Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
  8. Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
  9. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
  10. Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
  11. Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
  12. Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
  13. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
  14. Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25, (2), 456-464 (2017).
  15. Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).
  16. Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1, (1), 406-417 (2006).
  17. Johnstone, A., Thorpe, R. Immunochemistry in practice. 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).
  18. Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. Lymphocytes: a practical approach. 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).
  19. Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, (18), 8392-8396 (1993).
  20. Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73, (12), 10426-10439 (1999).
  21. Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8, (3), e59701 (2013).
  22. Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43, (5), 667-675 (1994).
  23. Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509, (7500), 361-365 (2014).
  24. Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167, (2), 541-555 (1988).
  25. Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369, (6476), 151-154 (1994).
  26. Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24, (4), 345-358 (2003).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).More

Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter