Summary
Эта статья описывает протокол для поколения антиген-специфических CD8 T-клеток, и их расширение в пробирке, с целью приносить большое количество функциональных Т-клеток для использования in vitro и in vivo.
Abstract
Диабет типа 1 (T1D) характеризуется аутоиммунным газолетами, ведущим к разрушению бета-клеток и абсолютной потере производства инсулина. В спонтанной не-ожирения диабета (NOD) мыши модели, инсулин является основной целью, и генетические манипуляции этих животных, чтобы удалить один ключевой эпитоп инсулина предотвращает болезнь. Таким образом, селективная ликвидация профессиональных антигенов, представляющих клетки (АПК), несущие этот патогенный эпитоп является подход омрачать нежелательные инсулин-специфические аутоиммунные реакции, и, вероятно, имеет больший трансляционный потенциал.
Химерные рецепторы антигена (ЦАР) могут перенаправлять Т-клетки на выборочно еле-причиняемые болезни антигены. Этот метод имеет основополагающее значение для недавних попыток использовать клеточной инженерии для приемной клеточной терапии для лечения нескольких видов рака. В этом протоколе мы описываем оптимизированный ретровирус Т-клеток (РВ) трансдукции и протокол расширения in vitro, который генерирует большое количество функциональных антиген-специфических клеток CD8 CAR-T, начиная с низкого числа наивных клеток. Ранее было описано несколько протоколов CAR-T-клеток, но, как правило, с относительно низкой эффективностью трансдукции и жизнеспособностью клеток после трансдукции. В отличие от этого, наш протокол обеспечивает до 90% эффективности трансдукции, и клетки могут выжить более двух недель in vivo и значительно задержать начало болезни после одного вливания. Мы предоставляем подробное описание протокола обслуживания клеток и трансдукции, так что критические шаги могут быть легко выполнены. Вся процедура от первичной изоляции клеток до экспрессии ЦАР может быть выполнена в течение 14 дней. Общий метод может быть применен к любой модели болезни мыши, в которой цель известна. Аналогичным образом, конкретное применение (таргетинг патогенного пептида/MHC класса II комплекса) применимо к любой другой модели аутоиммунных заболеваний, для которых был определен ключевой комплекс.
Introduction
Учитывая вероятный снижение риска нежелательных вне цели эффекты, антиген-специфические иммунные терапии (АСИ) являются перспективными лечения аутоиммунных заболеваний, таких как T1D. Накопление доказательств свидетельствует о том, что иммунные реакции на (препро) инсулин может быть особенно важно в T1D1. В последнее десятилетие, исследования из нескольких групп, в том числе наших собственных, настоятельно рекомендуем, что представление эпитопа, содержащего аминокислоты цепи инсулина B 9 до 23 конкретными молекулами класса MHC II (B:9-23/MHCII), играет важную роль в развитии T1D в мышейи людей 2,3,4,5. Чтобы избирательно нацелиться на комплекс B:9-23/MHCII, мы создали моноклонированное антитело, названное mAb287, которое не имеет перекрестной реактивности гормона инсулина или комплексов, содержащих другие пептиды6. MAb287 блокирует антиген презентации в пробирке, и еженедельное введение mAb287 до диабетических НОД мышей задержали развитие T1D в 35% обработанных мышей6. Чтобы блокировать антиген презентации in vivo, частые инъекции, как правило, требуется для того, чтобы поддерживать высокую концентрацию циркулирующих. Мы предположили, что мы могли бы преодолеть эту трудность, воспользовавшись высокой специфичностью Ab287 перепрограммировать Т-клетки, тем самым обеспечивая улучшенную антиген-специфическую Т-клеточную терапию для T1D7.
Цитотоксические Т-клетки, как сообщается, быть в состоянии убить своюцель, если даже одна копия их коньяк лиганд выражается 8,9,10. Таким образом, B:9-23/MHCII конкретных CD8 Т-клеток, как ожидается, имеют более высокую эффективность в устранении нежелательных антигена презентации, чем родительское антитело, которое, вероятно, необходимо привязать к нескольким комплексам на том же APC, чтобы оказать его эффект. CAR Т-клетки были использованы для лечения нескольких раковых заболеваний человека11,12,13, а также может быть эффективным в аутоиммунных14. Однако, CAR-T-клетки со специфичностью для патогенных пептид-MHC комплексов до сих пор не были использованы для изменения прогрессирования T1D. С помощью оптимизированной cd8 T-клеточной техники трансдукции, описанной ниже, мы недавно продемонстрировали доказательство принципа, что это действительно представляет собой жизнеспособный подход7.
В этом протоколе мы излагаем эффективный и рационализированный метод трансдукции и расширения. Наш протокол применим к другим исследованиям, требующим генерации мыши CD8 CAR T-ячеек с высокой эффективностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мыши были сохранены в конкретных патогенных условиях в Transgenic Mouse Facility, и все эксперименты на животных были проведены в соответствии с протоколами, утвержденными Бейлорским колледжем медицины по уходу за животными и использованием комитета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент требует подготовки вируса и Т-клеток параллельно. В таблице 1 кратко излагается протокол. Ключевые реагенты и буферы перечислены в таблицематериалов. Мы фокусируемся на генерации и расширении car-T-клеток, ориентированных на конкретные популяции БТР в этом протоколе.
1. Поколение и проверка одной цепи Fab антитела (scFab)-CARs.
ПРИМЕЧАНИЕ: CARs обычно содержат 3 критических домена – антиген, ориентированный на домен, домен spacer/transmembrane и цитоплазмический сигнальный домен. Точная конструкция каждого ЦАР зависит от намеченной цели, и поэтому, кроме ключевых особенностей конструкции, относящейся к генерации ретровируса, не будет подробно описана в этом протоколе. Общий дизайн ЦАРов, используемых для исследований, описанных ниже, показан на рисунке 1. Короче говоря, целевой домен включает в себя всю световую цепь и область CH1 тяжелой цепи от родительского моноклонального антитела, связанного полужестким связующим звеном. Домен spacer/transmembrane от мыши CD28, а сигнальный домен представляет собой слияние, содержащее элементы мыши CD28, CD137 (4-1BB) и CD247 (CD3). Эти элементы собираются стандартными процедурами молекулярной биологии, такими как перекрывая полимеразу цепную реакцию (ПЦР) или синтез соответствующего "генного блока". Подробная информация о поколении mAB287 CAR содержится в Чжан и др.7. Последовательности cDNA могут быть получены от авторов по запросу.
-
Сборка конструкции ЦАР
- Синтезируйте таргетинг одной цепи Fab антитела (scFab) и комбинированных spacer / сигнализации доменов отдельно, и использовать "3 точки" перевязки техники15, чтобы собрать окончательную конструкцию (Рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевым требованием для вставки CAR является то, что она должна содержать фланговые ограничения эндонуклеазы сайтов, позволяющих перевязки в ретровирусное выражение вектор pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II), или связанных производных15 также являются Соответствующие.
- Синтезируйте таргетинг одной цепи Fab антитела (scFab) и комбинированных spacer / сигнализации доменов отдельно, и использовать "3 точки" перевязки техники15, чтобы собрать окончательную конструкцию (Рисунок 1).
-
Проверка выражения поверхности CAR
- Преобразуем клетки гибридомы с помощью pMIG II, полученных ретровирусными частицами, генерируемыми стандартным протоколом (например, Holst et al.16).
- Выполнить анализ цитометрии потока для обнаружения выраженияGFP из векторного 17 CAR.
- Выражение поверхности пятна ЦАР трансиндуцированных гибридомы с использованием помеченных антител против цепи мыши и (например, клон RMK-45)17.
ПРИМЕЧАНИЕ: 18.
-
Проверка специфики ЦАР
- Стимулировать трансиндуцированные клетки гибридомы с соответствующими пластинами связанных или клеточных антигенов. После ночи со-культура собирает супернацианты и выделять цитокины, а также анализируется фермент-связанных иммуносорбентных анализ (ELISA)7.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, каждый CAR должен быть независимо проверены перед тем, как использовать для трансдукции. На этом этапе эксперимент может быть приостановлен и перезапущен позже.
- Стимулировать трансиндуцированные клетки гибридомы с соответствующими пластинами связанных или клеточных антигенов. После ночи со-культура собирает супернацианты и выделять цитокины, а также анализируется фермент-связанных иммуносорбентных анализ (ELISA)7.
2. Трансфекция вирусных клеток производителя (день -4 к дню 3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Ретровирус производится с использованием клеток Phoenix-ECO (см. Таблицу Материалов)19,20. Используйте соответствующие меры предосторожности для генерации потенциально инфекционных агентов (желательно, включая назначенный шкаф BSL-2 и отдельный инкубатор для культивирования транс-инфицированных/трансиндуцированных клеток).
-
Таяние клеток Феникса (День -4)
- Оттепель 2 х 106 Phoenix-Eco клеток. Увеличите количество ячеек Феникса, если планируется несколько трансдукций.
- Плита их в 10 см ткани культуры блюдо с 10 мл среднего (Dulbecco в модифицированных Eagle среды (DMEM), содержащий 10% плода икроножной сыворотки (FCS)).
-
Проходные ячейки Феникса (День -3)
- Удалить средний, и мыть с 5 мл фосфат-буферного сольников Dulbecco (DPBS).
- Добавьте 3 мл 0,25% трипсина и инкубировать при 37 градусах Цельсия под 10% CO2 атмосферу в течение 3 мин.
- Урожай клетки затем гранулы центрифугации в течение 3 мин при 200 х г. Повторно пластины клеток с 10 мл свежей среды и инкубировать при 37 градусов по Цельсию.
-
Облучение клеток Феникса (День -1 деньдня)
- Чтобы свести к минимуму дальнейшее деление клеток, соберите клетки Феникса, как описано в шаге 2.2, повторно применяйте в 5 мл средних и гамма-облученных клеток на льду (1000 рад).
ПРИМЕЧАНИЕ: Предостережение должно быть использовано для радиационной работы, чтобы избежать воздействия персонала. - Центрифуги облученных клеток, повторно в свежей среде, пластины на 2 х 106 клеток (в 10 мл среднего) / пластины / ЦАР, и инкубировать.
- Чтобы свести к минимуму дальнейшее деление клеток, соберите клетки Феникса, как описано в шаге 2.2, повторно применяйте в 5 мл средних и гамма-облученных клеток на льду (1000 рад).
-
Трансфекция (День 0 - утро)
- Аспирировать супернатант из клеток Феникса, мыть с 5 мл фосфат-буферного солей (PBS), и осторожно добавить 7 мл уменьшенной среды сыворотки (например, Opti-MEM) dropwise к боковой стенке пластины, чтобы избежать нарушения монослой. Перенесите клетки обратно в инкубатор.
- Возьмите два 14 мл круглых нижних полипропиленовых труб оков и добавьте 1,5 мл пониженной среды сыворотки к каждому. К одной трубке добавьте 40 qL трансфекционного реагента (см. таблицу материалов).
- К другой трубке добавьте 15 мкг Ab-CAR-плазмида (порожденный в шаге 1) и 5 мкг конверта и упаковочной плазмиды (5 мкг pCL-Eco). Инкубировать трубки при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавить смесь реагента трансфекции от шага 2.4.2 dropwise к второй трубке, не связываясь с трубами сторон, и смешать путем pipetting решение вверх и вниз мягко 3 раза. Инкубировать при комнатной температуре не менее 20 мин.
- Добавьте 3 мл смеси dropwise к клеткам Phoenix, и поместите в инкубатор культуры ткани.
- После 4-5 ч добавить 1 мл FCS. Культурные ячейки на ночь при 37 градусах Цельсия.
-
Среднее изменение (День 1)
- Удалите супернатант, содержащий плазмидные/трансфекционные реагентные комплексы, и утилизируйте их в соответствии с институциональными процедурами обращения с инфекционными материалами. Добавьте 4 мл свежей, предварительно разогретой культуры среды в клетки.
-
Урожай ный вирус для трансдукции (День 2)
- Соберите вирус-содержащую среду из клеток Феникса со стерильным шприцем, процедите (0,45 мкм) для удаления остатков клеточного мусора и соберите в новую трубку.
- Добавьте запас rhIL-2 к окончательной концентрации 200 МЕ/мл. Используйте вирус немедленно для трансдукции (шаг 5.3). Добавьте 4 мл свежей среды в клетки Феникса и поместите в инкубатор.
-
Повторный сбор вирусов (День 3)
- Повторите шаг 2.6, но отбросьте клетки Феникса в качестве инфекционных отходов вместо добавления свежей среды. Этот супернатант используется в шаге 5.4.
3. Первичная изоляция и активация клеток CD8 T (день -1 к дню 0)
ПРИМЕЧАНИЕ: Ранее, собирать CD8 Т-клеток из самок NOD мышей на 4-5 недель, время до воспаления на кишки начинается21,22. со всеми мышами после утвержденных протоколов IACUC. Клетки CD8 T обогащаются из спленоцитов с помощью коммерческого отрицательного комплекта отбора.
-
Покрытие пластин с антителами CD3/CD28 (День -1)
- Добавьте 1 мл смеси антимышечных антител CD3 и CD28 (как на 1 мкг/мл в PBS) к каждой скважине из 24-колодца пластины, и инкубировать при 4 градусах Цельсия в одночасье.
- На следующий день промойте пластины 1 мл стерильных PBS 3 раза, прежде чем добавить murine CD8 T-клетки (шаг 4.1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество скважин, которые будут покрыты будет варьироваться для каждого эксперимента, в зависимости от общего числа активированных CD8 Т-клеток требуется.
-
Коллекция спленоцитов (День 0)
- Эвтаназия двух самок самок мышей NOD в возрасте 4-5 недель с использованием вдохов CO2 с последующим обезглавливанием. Урожай селезенки и положить их на ячейку ситечко замачивания в 10 мл PBS в тарелке клеточной культуры на льду.
- В капюшоне клеточной культуры, разрезать каждую селезенку на 3-5 частей, нажмите ткани с стерильным поршень 3 или 5 мл шприца, чтобы заставить фрагменты селезенки друг от друга и позволить клеткам пройти через проволочную сетку.
- Аккуратно удалите эритроциты, приостановив спленоциты в 1:4 разбавленного буфера лиза красных клеток (1 мл буфера лисиса в 3 мл PBS на одну селезенку) и инкубируя 5 мин при комнатной температуре.
- Затем разбавить 10 л клеточной подвески с трипансиний раствор красителя для подсчета клеток с гемоситометром, и гранулы остальные клетки центрифугации на 350 х г в течение 7 мин.
-
Обогащение КЛЕТОк CD8 T (День 0)
- Обогащайте клетки CD8 T негативным отбором с помощью комплекта изоляции клеток CD8 T, следуя инструкциям производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения высокой чистоты всегда округлить номера клеток при расчете объема биоинтинилафтированных антител, которые будут добавлены (например, использовать объем реагентов, предлагаемых для 108 клеток для расчета 9,1 х 107 клеток). - Приостановить клеточные гранулы в 400 л буфера и 100 л биотино-антитела коктейль на 1 х 108 клеток, хорошо перемешать и инкубировать в течение 5 минут в холодильнике (4 кВ), чтобы антитела связывания.
- Добавьте 300 qL буфера маркировки и 200 qL анти-биотина микро-бусы на 1 х 108 клеток, хорошо перемешать и инкубировать в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
- В ожидании связывания микро-биса установите колонку разделения на сепаратор. Вымойте столбец путем полоскания с 3 мл буфера маркировки.
- Пройдите 1000 л бисовой/клеточной смеси через 40 мкм-ситечко перед загрузкой на столбец разделения для удаления клеточных агрегатов. Соберите колонну, протекаемую в предварительно охлажденный 15 мл трубки.
- Вымойте колонку по указанию производителя, собирая все стоки в ту же трубку. Определите номер ячейки (то же самое, что шаг 3.2.4) и соберите при центрифугации при 350 х г в течение 5 мин. Вымойте клетки путем повторного приостановки в 2 мл полной Т-клеточной среды (RPMI-1640, содержащей FCS, 2-mercaptoethanol, rhIL-2 (200 U/mL), mIL-7 (0.5 нгм/л), ITS , HEPES и пенициллина-стрептомицина) и центрифуги на 350 х г в течение 5 мин.
- Resuspend клетки в предварительно разогретых (37 градусов по Цельсию) полной Т-клеточной среде в концентрации 0,25-0,5 х 106/мл.
- Обогащайте клетки CD8 T негативным отбором с помощью комплекта изоляции клеток CD8 T, следуя инструкциям производителя.
4. Активация Т-клеток (день от 0 до 2)
- Добавьте 2 мл клеточной подвески (0,25-0,5 х 10 6/мл) к каждому покрытому колодец антитела cd3/CD28, покрытым 24-хорошо пластиной от шага 3.1.2. Используйте закрученного движения, чтобы равномерно распределить клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить клетки с помощью закрученного движения, чтобы распределить их равномерно и свести к минимуму эффекты края. Если клетки сгруппируются вдоль края скважин, скорость трансдукции и жизнеспособность клеток будут снижены. - В качестве элемента управления, пластины же количество CD8 Т-клеток в один не-покрытие хорошо пластины. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с помощью 10% CO2 газированного инкубатора для 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 48 ч активация может быть подтверждена с помощью микроскопа; активированные клетки будут больше, чем клетки, которые не сталкивались с антителами против CD3/CD28.
(место цифра 2 здесь)
5. Трансдукция активированных Клеток CD8 T (дни от 1 до 3)
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует метод спин-трансдукции. Требуется центрифуга с качелями из ротора и адаптеров культуры тканей, которая способна поддерживать внутреннюю температуру 37 градусов по Цельсию. Для обеспечения максимальной эффективности, в день трансдукции предгреть центрифугу до 37 градусов по Цельсию перед сбором вируса.
- Подготовка человека фибронектина фрагмент покрытием пластин (День 1 на день 2)
- На 1-й день добавьте 0,5 мл фибронектина (50 мкг/мл в PBS) в колодцы 24-хорошей пластины и инкубируют на ночь при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, два фибронектина покрытием скважины необходимы на тарелку транс-инфицированных клеток Феникс. - На 2-й день удалить раствор фибронектина, и заменить 1 мл 2% бычьего сыворотки альбумина (BSA) в PBS. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы "заблокировать" неспецифические привязки.
- Вымойте обработанные скважины 1 мл стерильных PBS. После удаления раствора для мытья пластина готова к использованию; или, могут быть запечатаны и хранятся при 4 градусах Цельсия в течение одной недели.
- На 1-й день добавьте 0,5 мл фибронектина (50 мкг/мл в PBS) в колодцы 24-хорошей пластины и инкубируют на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Сбор активированных Cd8 T-клеток (День 2)
- Урожай активированных CD8 Т-клеток, подсчитать и рассчитать жизнеспособность клеток с помощью trypan синий или подходящий автоматизированный инструмент.
- Сбор клеток центрифугации и повторно приостанавливается на 5 х 106 жизнеспособных клеток / мл для трансдукции. Поддержание небольшого аликвота клеток в культуре в полной Т-клеточной среде в инкубаторе CO 2, чтобы обеспечить контроль для последующего флуоресценции активированной сортировки клеток трансиндуцированных клеток (шаг 6).
ПРИМЕЧАНИЕ: После активации в течение 48 ч, общее количество клеток должно было увеличиться примерно в 1,5 раза, и жизнеспособность превышает 95%.
- Трансдукция (День 2)
- Добавьте 100 кЛ активированной суспензии клетки CD8 на скважину (0,5 х 106 клеток) к фибронектиновой пластине. Затем добавьте 1,5-2 мл вирусосодержащей среды (от шага 2,6) к каждой скважине. Смешайте с помощью закрученного движения, чтобы равномерно распределить клетки(рисунок2).
- Поместите тарелку в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией и уплотнение (для обеспечения вторичного сдерживания). Центрифуга при 2000 х г в течение 90 мин при 37 градусах Цельсия.
- Снимите тарелку с центрифуги. В биологической безопасности, шкаф тщательно удалить полиэтиленовый пакет и убедитесь, что за пределами пластины не загрязнены какой-либо среды.
- Затем перенесите пластину в выделенный инкубатор 37 c CO 2. После 4 ч удалите 1 мл среды с каждой скважины и замените 1 мл предварительно разогретой полной Т-клеточной среды. Замените пластину в инкубаторе CO 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработай все носители из трансиндуцированных клеток как инфекционные отходы.
- Вторая трансдукция (День 3)
- В специальном шкафу биологической безопасности наклоните пластину, содержащую трансиндуцированные клетки, опираясь на крышку, и тщательно удалите большую часть среды (оставляя 100-200 л), убедившись, что не контактируют с клетками в нижней части колодца.
- Добавьте вирусосодержащую среду, собранную в шаге 2.7, и повторите шаги 5.3.2-5.3.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, третья трансдукция редко повышает общую эффективность. Кроме того, жизнеспособность клеток, скорее всего, значительно упадет, если будет использована третья трансдукция. Если клетки покрыты более высокой концентрацией, чем 0,5 х 106/ ну, Т-клетки могут достичь слияния после ночного инкубации после второго шага трансдукции. В этом случае, разделить клетки после 4 ч инкубации на 3-й день.
- Клетки для мытья (День 4)
- Удалить 1 мл среды из каждой скважины, resuspend клетки в оставшейся среде и передачи на 15 мл трубки. Вымойте скважины с 1 мл полной Среде Т-клеток и добавить в трубку, содержащую объединенные клетки от каждого трансдукции.
- Центрифуга на 350 х г в течение 7 мин, затем мыть дважды, resuspending в 2 мл полной среде Т-клеток и гранулы. Окончательно resuspend в 2 mL средства и обусловите номер клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если 1 х 106 клеток были первоначально трансумированных, выход на данном этапе должен быть 3 х 106.
- Передачи
- Передача aliquots 0,5-1 х 106 клеток в 2 мл полной Т-клеточной среды в скважины новой 24-хорошо пластины и инкубировать при 37 градусов по Цельсию. Приблизительно 48–72 ч после трансдукции клетки готовы к анализу экспрессии ЦАР и сортировке клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество CAR-T клеток обычно удваивается каждый 24 ч на данном этапе. Очень важно никогда не позволять им перерастать. Разделите клетки немедленно, если плотность выше, чем 2 х 106/мл (или если среда когда-либо становится ярко-желтым). По нашему опыту, клетки CAR-T размножаются более надежно в 24-ну и 12-ну хорошо пластин, чем если бы переданы в более крупном сосуде.
- Передача aliquots 0,5-1 х 106 клеток в 2 мл полной Т-клеточной среды в скважины новой 24-хорошо пластины и инкубировать при 37 градусов по Цельсию. Приблизительно 48–72 ч после трансдукции клетки готовы к анализу экспрессии ЦАР и сортировке клеток.
6. Очистка трансиндуцированных клеток с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) (день 5 или день 6)
- Соберите клетки.
- Resuspend клетки трубчатые вверх и вниз несколько раз (заботясь, чтобы не вызвать вспенивание), передача на 15 мл труб и центрифуги на 350 х г в течение 5 мин.
- Приостановить в сортировке буфера (2% BSA в стерильных PBS, содержащих гентамицин) на 1 х 106 клеток / мл. Также собирайте контрольные (нетрансиндуированные) КЛЕТКи CD8 T со ступени 5.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: От 1 х 106 ячеек на второй день, выход 2 х 107 транс-индуцированных клеток, как ожидается, в этот момент времени.
- Вымойте ячейки один раз с сортировожением буфера центрифугирование на 350 х г в течение 5 минут, и повторно на 1 х 107 ячеек / мл в сортировке буфера. Удалите небольшой аликвот для управления компенсацией Foxp3GFP (который будет использоваться в шаге 6.4.1), и испачкайте остаток с помеченными анти-мышью CD8 (клон 53-6,7; 0,2 мкг антител/5 х 106 клеток) путем инкубации в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия.
- Аналогичным образом, пятно aliquot не-трансумированных CD8 Т-клеток, чтобы обеспечить контроль компенсации для флюорофора маркировки анти-CD8 антитела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте добавления азида натрия в любой буфер, так как это токсично для клеток.
- Аналогичным образом, пятно aliquot не-трансумированных CD8 Т-клеток, чтобы обеспечить контроль компенсации для флюорофора маркировки анти-CD8 антитела.
- Дважды вымойте помеченные ячейки ссортировоцой буфером, приостановите в холодном буфере сортировки 1 x 107 ячеек/мл.
- Сортировать клетки.
- Сортировать CD8 GFP- положительные клетки в предварительно охлажденной полной Т-клеточной среде (рисунок3B). Возьмите небольшой aliquot для послесортировки анализа, чтобы определить чистоту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимизации чистоты отсортированных клеток жесткие ворота должны быть использованы. Используйте сопло 100 мкм для обеспечения высокой жизнеспособности клеток. Свести к минимуму время, в течение которого отсортированные клетки хранятся на льду. Т-клетки, которые были сохранены на льду более 3 ч занять гораздо больше времени, чтобы восстановить, чем клетки охлажденной менее 2 ч. Таким образом, если 3 трансумированные линии клеток должны быть сортированы, собирать и маркировать вторую линию, в то время как первая сортируется и так далее, вместо того, чтобы иметь вторую и третью линии, проводят длительное время при 0 градусах Цельсия. Выражение других маркеров Т-клеток, таких как CD28 и CD3, также может контролироваться(рисунок 3C),но не является необходимым для целей сортировки. - (Альтернативная стратегия сортировки) Прежде чем окрашивать основную популяцию, проанализируйте выражение CD8 небольшой популяции трансиндуцированных Т-клеток. Если чистота составляет 99%, то основная популяция может быть безопасно отсортирована исключительно на основе выражения GFP.
- Сортировать CD8 GFP- положительные клетки в предварительно охлажденной полной Т-клеточной среде (рисунок3B). Возьмите небольшой aliquot для послесортировки анализа, чтобы определить чистоту.
7. Расширение отсортированных клеток CAR-T (День с 5 по 10)
-
Расширение ячейки CAR-T
- Вымойте отсортированные клетки CAR-T один раз, затем resuspend в предварительно разогретой полной Т-клеточной среде на 2,5-5 х 105 клеток / мл, и пластины 2 мл aliquots в 24-колодцев.
- Считайте и расщепйте ячейки каждые 1-2 дня. Обычно число клеток удваивается каждый день до 10-го дня, при этом жизнеспособность остается выше 95%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Без повторной стимуляции, CAR-T клетки перестанут размножаться вокруг дня 10 и в конечном итоге умирают. Таким образом, функциональная анализы Т-клеток и приемные переводы должны быть запланированы соответствующим образом.
-
Альтернативная стратегия расширения
- После сортировки, культура CAR-T-клеток в полной Т-клеточной среде, содержащей rhIL-2 на 100 U/mL, а не 200 U/mL.
ПРИМЕЧАНИЕ: КЛЕТКи CAR-T размножаться несколько медленнее в этой среде. Тем не менее, они часто продолжают размножаться до дней 11 до 13 без повторной стимуляции. Таким образом, хотя эта альтернативная стратегия расширения не генерирует большее количество ячеек, она обеспечивает немного более длинное временное окно для выполнения анализов ниже по течению.
- После сортировки, культура CAR-T-клеток в полной Т-клеточной среде, содержащей rhIL-2 на 100 U/mL, а не 200 U/mL.
8. Проверка специфики и функциональности антигена Т-клеток ЦАР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Связывание специфики CAR Т-клеток, направленных на пептид / MHC комплексов могут быть проверены тетрамер окрашивания7,23. Аналогичным образом, их функциональность может быть подтверждена путем измерения секреции цитокинов или цитотоксичности после стимуляции их cognate лиганды. NIH Tetramer Core Facility (TCF) в Университете Эмори является рекомендуемым источником "тетрамеров" и соответствующих протоколов окрашивания.
-
Пептид-МХК Тетрамер окрашивания.
- Этикетка aliquots 2 х 105 transduced CAR-T клеток в 100 л сортировки буфера путем инкубации с 0,6 мкг флуоресцентно помечены антиген-специфических и контроля тетрамеры на 37 градусов по Цельсию на 2 ч.
- Пеллет клетки центрифугации в течение 5 мин на 350 х г, затем мыть дважды, resuspending в 0,5 мл сортировки буфера и повторно центрифугирования. Наконец, повторное присоединение клеток в 300 qL сортировки буфера и анализировать по потоку цитометрии(рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих исследований, мы обычно используем BV421 помечены IA g7-B:9-23 (RE) (тест) и IAg7-HEL(контроль) тетрамеры. Тем не менее, любая комбинация фторофора/тетрамер, которая подходит для исследуемого ЦАР( может быть использована вместо этого. В этом случае, концентрация и время окрашивания должны быть оптимизированы для каждого тетрамер используется. Оба отсортированных и не-отсортированных CAR-T клетки могут быть использованы для тетрамер окрашивания.
-
Измерение специфичности по стимуляции лиганд.
- Инкубировать 2 x 105 отсортированные клетки CAR-T в 200 Л цитокинов,свободных Т-клеточной среде с соответствующими пластинными или клеточными лигандами.
- После 6-24 ч измеряют производство цитокинов ELISA или внутриклеточного окрашивания с использованием протоколов производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для наших исследований IA g7-B:9-23 перенаправлены Т-клеток, мы культуры клеток на ночь с M12C3 murine B-клеточных лимфомы клеток, выражающих IAg7-B:R3 или "пустой" IAg724,25, затем соберите супернатанты и измерьте секретированный гамма-интерферон мыши (IFN-) от ELISA26 (рисунок 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как правило, эффективность трансдукции с помощью этого протокола составляет 60-90%. В эксперименте показано на рисунке 3, до сортировки примерно, 70% CD8 Т-клеток совместно выражены GFP. Они также совместно выразили CD28 и CD3(Рисунок 3C). Важно отметить, что все "тест" GFP- клетки также совместно окрашенные с IA g7-B:R3 тетрамеры, но не с контролем тетрамер (Рисунок 4). Аналогичным образом, отсортированный тест и контроль CAR-T-клеток каждый выделяется высокий уровень IFN-я только после совместной культуры с целями клетки, выражающие их cognate лиганды (Рисунок 5). Это подтверждает, что трансумированные клетки имеют эффектор CD8 Т-клеток фенотип, направленный на цель родительских антител.
Рисунок 1: Схема ретровирусной конструкции ЦАР. CAR включает в себя целевой домен, полученный из фрагмента Fab подходящего мыши моноклонального антитела, и аблифер / мембранный якорь / сигнальный домен от мыши CD28, CD137 и CD247. Синтетическая кДНК вставляется в вектор ретровирусного выражения pMIG-II. Отображаются сайты об ограничении эндонуклеаза, используемые для генерации mAb287-CAR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Влияние различных методов покрытия на распределение клеток. (Слева) Клетки пипетки с помощью закрученного движения показывают равномерное распределение. (Справа) Клетки были пипсированы непосредственно в центр ею. Изображения были захвачены после вращения на 350 х г в течение 5 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Циклометрический анализ потока трансиндуцированных Т-клеток. Клетки были совместно окрашены с PE-Cy7 конъюгированных анти-CD8, AF647 конъюгированных анти-CD3, и BV421 конъюгированных анти-CD28, как описано в шаге 6.4. Показаны профили, закрытые на одиночные жизнеспособные ячейки. (A) Un-окрашенные родительские CD8 T клетки. (B) PE-Cy7/GFP профиль трансиндуцированных клеток. Царь-выражение клетки идентифицируются репортером GFP. (C) Окрашенные трансиндуцированные клетки были закрыты на PE-Cy7/GFP двойной положительности. Отображается профиль AF647/BV421. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Тетрамер окрашивание неотсортированных клеток CAR-T. Клетки были окрашены BV421 конъюгированных тетрамеров, как описано в шаге 8.1. Показаны профили, закрытые на одиночные жизнеспособные ячейки. (A) Тест IAg7-инсулин тетрамер. (B) Управление I-Ag7-HEL тетрамер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Антиген-специфические цитокины секреции CAR Т-клеток. Сортированные CD8 T-клетки, выражающие тест mAb287 или control mAb24.1 CAR,были совместно культивированы с клетками M12C3, выражающими IA g7-B:R3, "пустые" IAg7, или TFR-MBP-DTRL (лиганд для mAb24.1), как описано в шаге 8.2. После 24 ч, секретированный IFN-я ELISA был количественно ELISA. Наблюдалась специфическая стимуляция обеих Т-клеточных линий. Данные представляют собой среднее sD 3 повторных экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Время | Препарат от вируса | Подготовка Т-клеток |
| ДНЯ -4 (пт) | Оттепель Феникс клетки (PM) | |
| День -3 (Сп) | Повторная пластина Феникс | |
| День -2 (солнце) | Праздник | |
| День-1 (пн) | Облучение клеток Феникса (PM) | Пальто необработанные пластины с CD3/CD28 Ab |
| День 0 (Вт) | Трансфектирование клеток Феникса (AM) | Приготовьте спленоциты и изолировать клетки CD8 T. |
| Активация Т-клеток. | ||
| День 1 (ср) | Изменение клеток Феникс асредняя до 4 мл (AM). | Пальто РетроНектин |
| День 2 (Чт) | Соберите вирус и пополнить. | Трансдукция, CD8 Т-клетки |
| День 3 (пт) | Собирайте вирус. | Трансдукция, CD8 Т-клетки |
| День 4 (св) | Вымойте клетки и расширьте клетки. | |
| День 5 (солнце) | Расширение ячейки при необходимости. | |
| День 6 (пн) | Сортировка ячейки CAR-T. | |
| День 7 -10 (Вт к Пт) | Расширение Т ЦАР-клеток. Эксперименты. |
Таблица 1: Резюме протокола генерации CAR-T.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает эффективный метод для производства антиген-специфических клеток CD8 CAR-T путем ретровирусной трансдукции. Эффективность трансдукции нашего протокола, как правило, высока, и надежное выражение ЦАР, как правило, наблюдается. Расширенные Т-клетки CAR сохраняют основные характеристики активированных родителями Т-клеток и специфичность антител, и подходят как для использования in vitro, так и для in vivo. Мы применили Ab-CAR CD8 T-клеток в перепрограммировании диабета типа 1 в NOD мышей7.
Наш протокол включает в себя несколько критических изменений в ранее описанных методах. Во-первых, мы используем оптимизированную т-клеточную среду культивирования, которая позволяет продлить время активации. Полная описанная среда содержит оптимальные уровни нескольких ключевых добавок и значительно повышает жизнеспособность Т-клеток и степень пролиферации после активации. Следует отметить, что мышь ИЛ-2 может быть заменена на человеческий белок с эквивалентными результатами, хотя в настоящее время, человек IL-2 является более доступным. Следует отметить, что значительно более высокая эффективность трансдукции повышается с помощью Т-клеток, активированных в течение 40-48 ч, чем при использовании шага активации 24 ч.
Во-вторых, мы используем улучшенную процедуру трансдукции, которая устраняет полибрен В (который токсичен для Т-клеток) и использует вместо этого фибронектин. Это еще больше повышает жизнеспособность клеток. Следует отметить, что для обеспечения хорошей эффективности трансдукции крайне важно поддерживать Т-клетки в оптимизированной среде при соответствующей плотности клеток и использовать свежие высокотиянные вирусные супернатанты, а не ранее замороженный вирус. Используя нашу модифицированную процедуру, третий шаг трансдукции является ненужным и действительно нежелателен, как жизнеспособность, как правило, падает, если третий шаг инфекции спина включен. Следует также подчеркнуть, что очень важно, чтобы никогда не позволять клеткам перерастать во время фазы расширения. Как только клетки зарастали, они, как правило, быстро теряют свой фенотип и умирают.
В дополнение к описанным выше параметрам следует избегать двух других потенциальных причин низкой эффективности/жизнеспособности трансдукции. Во-первых, поскольку антибиотики не должны присутствовать во время трансфекционных шагов, важно убедиться, что плазмиды готовятся с помощью комплекта без эндотоксинов и растворяются в стерильной воде, и что хорошая стерильная техника используется во все времена. Во-вторых, следует избегать наличия высоких уровней мертвых или умирающих Т-клеток. Если активированная суспензия CD8 T-клеток содержит высокий уровень мертвых клеток или клеточного мусора, это должно быть удалено до перевода с использованием коммерческих комплектов.
Мы намеренно не включили в этот протокол шаг замораживания клеток CAR-T, поскольку, по нашему опыту, значительная часть трансиндуцированных клеток умирает во время криоконсервации и оттаивания. Аналогичным образом, хотя расширенные клетки CAR-T могут быть повторно стимулированы в пробирке, они имеют повышенную тенденцию терять экспрессию трансгена. Соответственно, учитывая высокую степень пролиферации, которую мы наблюдаем с помощью свежесортированных клеток CAR-T, мы настоятельно рекомендуем использовать только свежегенерированные клетки CAR-T для функциональных анализов и приемной передачи.
Таким образом, значение этого протокола является то, что он описывает процедуру, которая обеспечивает высокую эффективность трансдукции и генерирует большое количество здоровых антигенконкретных клеток CD8 T мыши для использования в пробирке и in vivo. Таким образом, наш протокол является полезным инструментом для исследователей, проводяющих исследования клеток CAR-T в моделях заболеваний мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MAb287 и его производные защищены патентом США, выданным в 2014 году.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано JDRF гранты 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, и SRA-2-S-2018-648-S-B, Диабет образования и действий премии, и Каролин Wiess юридический фонд для исследований в молекулярной медицине в Baylor колледж медицины. Сортировка клеток была поддержана Цитометрией и ядром сортировки клеток в Медицинском колледже Бейлора с финансированием из NIH (S10RR024574 и P30CA125123). Все тетрамеры пептида-MHC были получены из основного фонда NIH Tetramer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 μM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
- Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
- Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
- Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).
- Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).
- Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
- Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
- Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
- Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
- Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).
- Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).
- Johnstone, A., Thorpe, R. Immunochemistry in practice. , 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).
- Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. Lymphocytes: a practical approach. , 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).
- Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).
- Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).
- Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).
- Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).
- Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).
- Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).
- Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).
