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Immunology and Infection

Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune

doi: 10.3791/59985 Published: August 16, 2019

Summary

Este artículo describe un protocolo para la generación de células T CD8 específicas de antígenos, y su expansión in vitro, con el objetivo de producir un alto número de células T funcionales para su uso in vitro e in vivo.

Abstract

La diabetes tipo 1 (T1D) se caracteriza por una autoinmunidad específica de los islos que conduce a la destrucción de células beta y a la pérdida absoluta de la producción de insulina. En el modelo de ratón espontáneo de diabetes no obesa (NOD), la insulina es el objetivo principal, y la manipulación genética de estos animales para eliminar un único epítopo de insulina clave previene la enfermedad. Por lo tanto, la eliminación selectiva de células que presentan antígenos profesionales (AAP) que llevan este epítopo patógeno es un enfoque para inhibir las respuestas autoinmunes no deseadas específicas de insulina, y probablemente tiene un mayor potencial traslacional.

Los receptores de antígeno quimérico (CAR) pueden redirigir las células T a diana selectivamente los antígenos causantes de la enfermedad. Esta técnica es fundamental para los recientes intentos de utilizar la ingeniería celular para la terapia celular adoptiva para tratar múltiples cánceres. En este protocolo, describimos una transducción optimizada del retrovirus de células T (RV) y un protocolo de expansión in vitro que genera un alto número de células CD8 CAR-T específicas del antígeno funcional a partir de un bajo número de células ingenuas. Anteriormente se han descrito múltiples protocolos de células CAR-T, pero típicamente con una eficiencia de transducción relativamente baja y viabilidad celular después de la transducción. Por el contrario, nuestro protocolo proporciona hasta un 90% de eficiencia de transducción, y las células generadas pueden sobrevivir más de dos semanas in vivo y retrasar significativamente la aparición de la enfermedad después de una sola perfusión. Proporcionamos una descripción detallada del mantenimiento celular y el protocolo de transducción, para que los pasos críticos se puedan seguir fácilmente. Todo el procedimiento desde el aislamiento de células primarias hasta la expresión CAR se puede realizar en un plazo de 14 días. El método general se puede aplicar a cualquier modelo de enfermedad del ratón en el que se conozca el objetivo. Del mismo modo, la aplicación específica (dirigida a un complejo patógeno de péptido/clase II de MHC) es aplicable a cualquier otro modelo de enfermedad autoinmune para el que se haya identificado un complejo clave.

Introduction

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Dado el riesgo probablemente reducido de efectos fuera del objetivo no deseados, las terapias inmunitarias específicas de antígenos (ASI) son tratamientos prometedores para enfermedades autoinmunes como la T1D. La acumulación de evidencia sugiere que las respuestas inmunitarias a (prepro)insulina pueden ser particularmente importantes en T1D1. En la última década, estudios de múltiples grupos, incluido el nuestro, sugieren fuertemente que la presentación de un epítopo que contiene aminoácidos de cadena De insulina 9 a 23 por moléculas específicas de Clase II de MHC (B:9-23/MHCII), juega un papel importante en el desarrollo de T1D en ratones y humanos2,3,4,5. Para atacar selectivamente el complejo B:9-23/MHCII, generamos un anticuerpo monoclonal, llamado mAb287, que no tiene reactividad cruzada a la hormona insulina o complejos que contienen otros péptidos6. MAb287 bloquea la presentación de antígenos in vitro, y la administración semanal de mAb287 a ratones NOD prediabéticos retrasó el desarrollo de T1D en el 35% de los ratones tratados6. Para bloquear la presentación de antígeno in vivo, normalmente se requieren inyecciones frecuentes para mantener una alta concentración circulante. Hemos planteado la hipótesis de que podríamos superar esta dificultad aprovechando la alta especificidad de Ab287 para reprogramarlas células T, proporcionando así una terapia mejorada de células T específicas de antígenos para T1D 7.

Se ha informado que las células T citotóxicas son capaces de matar a su objetivo si incluso una sola copia de su ligando cognado se expresa8,9,10. Por lo tanto, se espera que las células T CD8 específicas B:9-23/MHCII tengan una mayor eficiencia en la eliminación de la presentación de antígenono no deseado que el anticuerpo principal, que probablemente tendrá que unirse a múltiples complejos en el mismo APC para ejercer su efecto. Las células T CAR se han utilizado para el tratamiento de múltiples cánceres humanos11,12,13, y también pueden ser eficaces en la autoinmunidad14. Sin embargo, las células CAR-T con especificidad para complejos patógenos de péptido-MHC no se han utilizado hasta ahora para modificar la progresión de la T1D. Mediante el uso de la técnica optimizada de transducción de células T CD8 que se describe a continuación, recientemente demostramos una prueba de principio de que esto realmente representa un enfoque viable7.

En este protocolo, delineamos un método de transducción y expansión eficiente y simplificado. Nuestro protocolo es aplicable a otros estudios que requieren la generación de células CD8 CAR T de ratón con alta eficiencia.

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Protocol

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Los ratones se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos en una instalación transgénica de ratones, y todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de cuidado y uso de animales del Baylor College of Medicine.

NOTA: El experimento requiere preparar el virus y las células T en paralelo. La Tabla 1 resume el protocolo. Los reactivos y búferes clave se enumeran en la Tabla de materiales. Nos centramos en la generación y expansión de células CAR-T dirigidas a poblaciones específicas de AAP en este protocolo.

1. Generación y validación de anticuerpos Fab de cadena única (scFab)-CARs.

NOTA: Los RCA suelen contener 3 dominios críticos: un dominio de orientación de antígenos, un dominio espaciador/transmembrana y un dominio de señalización citoplasmática. El diseño preciso de cada CAR depende del objetivo previsto, por lo que, aparte de las características clave de la construcción relevantepara la generación del retrovirus, no se describirá en detalle en este protocolo. El diseño general de los RCA utilizados para los estudios descritos a continuación se muestra en la Figura1. En resumen, el dominio de segmentación comprende toda la cadena ligera y el dominio variable y CH1 de la cadena pesada a partir del anticuerpo monoclonal principal vinculado por un vinculador semirrígido. El dominio espaciador/transmembrana es del ratón CD28, y el dominio de señalización es una fusión que contiene elementos del ratón CD28, CD137 (4-1BB) y CD247 (CD3). Estos elementos se ensamblan mediante procedimientos de biología molecular estándar, como la reacción en cadena de la polimerasa superpuesta al empalme (PCR), o la síntesis de un "bloque genético" apropiado. Los detalles de la generación del mAB287 CAR están contenidos en Zhang et al.7. Las secuencias de ADNc se pueden obtener de los autores a petición.

  1. Montaje de la construcción de la CAR
    1. Sintetizar el anticuerpo Fab de cadena única de destino (scFab) y los dominios combinados de espaciador/señalización por separado, y utilizar una técnica de ligadura de "3 puntos"15 para ensamblar la construcción final (Figura1).
      NOTA: El requisito clave para el inserto CAR es que contenga sitios de endonucleasa de restricción de flanqueo que permitan la ligadura en el vector de expresión retroviral pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II), o un derivado relacionado15 también son Apropiado.
  2. Validación de la expresión de superficie CAR
    1. Transducir las células de hibrioma utilizando partículas retrovirales derivadas de pMIG II generadas por un protocolo estándar (por ejemplo, Holst et al.16).
    2. Ejecute el análisis de citometría de flujo para detectar la expresión de GFP desde el vector CAR17.
    3. Expresión de la superficie de la mancha del CAR de los hibritos transducidos utilizando anticuerpos etiquetados contra la cadena del ratón (por ejemplo, clon RMK-45)17.
      NOTA: 18.
  3. Validación de la especificidad de la CAR
    1. Estimular las células de hibrioma transducido con antígenos celulares o ligados a placas apropiados. Después de la cocultura durante la noche recoger supernatantes y citoquinas secretadas, y ensayados por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)7.
      NOTA: Idealmente, cada CAR debe ser validado de forma independiente antes de ser utilizado para la transducción. En este paso, el experimento se puede pausar y reiniciar más tarde.

2. Transfección de células productoras virales (día -4 a día 3)

NOTA: El retrovirus se produce utilizando células Phoenix-ECO (ver la Tabla de Materiales)19,20. Utilizar las precauciones adecuadas para la generación de agentes potencialmente infecciosos (preferiblemente incluyendo un gabinete BSL-2 designado e incubadora separada para el cultivo de células transocidas/transducedas).

  1. Células Phoenix de descongelación (Día -4)
    1. Descongelar 2 x 106 células Phoenix-Eco. Amplíe el número de celdas de Phoenix si se planifican varias transducciones.
    2. Placarlos en un plato de cultivo de tejido de 10 cm con 10 ml de medio (medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS)).
  2. Paso de células Phoenix (Día -3)
    1. Retire el medio y lave con 5 ml de solución salina con fosfato de Dulbecco (DPBS).
    2. Añadir 3 ml de 0,25% de trippsina e incubar a 37oC bajo 10% de CO2 ambiente durante 3 min.
    3. Cosecha las células y luego pellet por centrifugación durante 3 min a 200 x g. Células replacada con medio fresco de 10 ml e incubar a 37oC.
  3. Irradiación de células Phoenix (Día -1tarde)
    1. Para minimizar la división celular adicional, recoja las células de Phoenix como se describe en el paso 2.2, resuspende en 5 ml de células medianas e irradiar gamma las células sobre hielo (1000 rad).
      NOTA: Se debe tener precaución para el trabajo de radiación para evitar la exposición del personal.
    2. Centrifugar las células irradiadas, resuspender en medio fresco, placa a 2 x 106 células (en 10 ml de medio)/placa/CAR, e incubar.
  4. Transfección (Día 0 - mañana)
    1. Aspirar el sobrenadante de las células de Phoenix, lavar con 5 ml de solución salina con fosfato (PBS) y añadir cuidadosamente 7 ml de medio sérico reducido (por ejemplo, Opti-MEM) en sentido de gota a la pared lateral de la placa para evitar molestar a la monocapa. Transfiera las células de vuelta a la incubadora.
    2. Tome dos tubos de polipropileno de fondo redondo de 14 ml y agregue 1,5 ml de medio sérico reducido a cada uno. A un tubo, añada 40 ml de reactivo de transfección (véase la Tabla de materiales).
    3. Al otro tubo, añadir 15 g de Ab-CAR-plásmido (generado en el paso 1) y 5 g de sobre y plásmido de embalaje (5 g pCL-Eco). Incubar tubos a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Agregue la mezcla del reactivo de transfección del paso 2.4.2 en sentido de gota al segundo tubo sin entrar en contacto con los lados del tubo, y mezcle pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo suavemente 3 veces. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 20 min.
    5. Añadir 3 ml de la mezcla en sentido gota a las células de Phoenix, y colocar en una incubadora de cultivo de tejido.
    6. Después de 4-5 h añadir 1 mL de FCS. Células de cultivo durante la noche a 37oC.
  5. Cambio medio (Día 1)
    1. Retire el sobrenadante que contenga los complejos de reactivos de plásmido/transfección y deséchelos de acuerdo con los procedimientos institucionales para el manejo de material infeccioso. Añadir 4 ml de medio de cultivo fresco y precalentado a las células.
  6. Virus de la cosecha para la transducción (Día 2)
    1. Recoger el medio que contiene virus de las células de Phoenix con una jeringa estéril, filtrar (0,45 m) para eliminar los desechos de células residuales y recogerlo en un tubo nuevo.
    2. Añadir stock de rhIL-2 a una concentración final de 200 UI/ml. Utilice el virus inmediatamente para la transducción (paso 5.3). Añadir 4 ml de medio fresco a las células de Phoenix y colocar en la incubadora.
  7. Repetir la recopilación de virus (Día 3)
    1. Repita el paso 2.6, pero deseche las células de Phoenix como desechos infecciosos en lugar de agregar un medio fresco. Este sobrenadante se utiliza en el paso 5.4.

3. Aislamiento y activación de la célula T CD8 primaria (día -1 al día 0)

NOTA: Anteriormente, recoger células T CD8 de ratones hembra NOD a las 4-5 semanas, un punto de tiempo antes de que la inflamación del islet comience21,22. Maneje todos los ratones siguiendo los protocolos aprobados por iACUC. Las células T CD8 se enriquecen a partir de esplenocitos utilizando un kit de selección negativa comercial.

  1. Placas de recubrimiento con anticuerpos CD3/CD28 (Día -1)
    1. Añadir 1 ml de una mezcla de anticuerpos antiratón CD3 y CD28 (ambos a 1 g/ml en PBS) a cada pocal de una placa de 24 pocillos, e incubar a 4oC durante la noche.
    2. Al día siguiente, lave las placas con 1 ml de PBS estéril 3 veces antes de añadir las células Murine CD8 T (paso 4.1).
      NOTA: El número de pozos a recubrir variará para cada experimento, dependiendo del número total de células T CD8 activadas requeridas.
  2. Colección de esplenocitos (Día 0)
    1. Euthanizar dos ratones hembra NOD de 4 a 5 semanas de edad utilizando la inhalación de CO2 seguida de la decapitación. Cosecha los bazos y colócalos en un colador de células en PBS de 10 ml en un plato de cultivo celular en el hielo.
    2. En una capucha de cultivo celular, corte cada bazo en 3-5 piezas, presione los tejidos con un émbolo estéril de una jeringa de 3 o 5 ml para forzar la separación de fragmentos del bazo y permitir que las células pasen a través de la malla de alambre.
    3. Retire suavemente los glóbulos rojos resuperando los esplenocitos en 1:4 tampón de lisis de glóbulos rojos diluido (1 ml de tampón de lisis en 3 ml de PBS para un bazo), e incubando durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    4. Luego, diluir 10 l de la suspensión celular con solución de tinte azul trypan para contar las células con un hemocitómetro, y peletizar el resto de las células por centrifugación a 350 x g durante 7 min.
  3. Enriquecimiento de células T CD8 (Día 0)
    1. Enriquecer las células T CD8 por selección negativa utilizando un kit de aislamiento de celda T CD8 de ratón, siguiendo las instrucciones del fabricante.
      NOTA: Para garantizar una alta pureza, redondee siempre los números de celda al calcular el volumen de anticuerpos biotinylados que se va a añadir (por ejemplo, utilice el volumen de reactivos sugerido para 108 celdas para una celda calculada de 9,1 x 107).
    2. Suspenda los gránulos celulares en 400 ml de tampón y 100 l de cóctel de biotina y anticuerpos por cada 1 x 108 células, mezcle bien e incuba durante 5 minutos en el frigorífico (4 oC) para permitir la unión de anticuerpos.
    3. Añadir 300 l de tampón de etiquetado y 200 l de microperlas antibiotina por cada 1 x 108 células, mezclar bien e incubar durante 10 min a 4 oC.
    4. Mientras espera el enlace de microperlas, configure la columna de separación en el separador. Lavar la columna encerrando con 3 ml de tampón de etiquetado.
    5. Pasar 1000 l de mezcla de perlas/células a través de un colador de celdas de 40 m antes de cargarlo en la columna de separación para eliminar los agregados de celda. Recoja el flujo de la columna en un tubo de 15 ml pre-enfriado.
    6. Lave la columna según las instrucciones del fabricante, recogiendo todo el efluente en el mismo tubo. Determinar el número de celda (igual que el paso 3.2.4) y recoger por centrifugación a 350 x g durante 5 min. Lavar las células mediante la resuspensión en 2 ml de medio de célulata T completo (RPMI-1640 que contiene FCS, 2-mercaptoetanol, rhIL-2 (200 U/mL), mIL-7 (0,5 ng/mL), ITS , HEPES y penicilina-estreptomicina) y centrifugación a 350 x g durante 5 min.
    7. Resuspenda las células en un medio de célulatta T completo precalentado (37 oC) a una concentración de 0,25–0,5 x 106/ml.

4. Activación de la célula T (Día 0 a 2)

  1. Añadir 2 ml de la suspensión celular (0,25–0,5 x 106/mL) a cada pozo recubierto del anticuerpo CD3/CD28 recubierto de placa de 24 pocillos del paso 3.1.2. Utilice un movimiento de remolino para dispensar las células uniformemente.
    NOTA: Agregue las celdas usando un movimiento de remolino para distribuirlas uniformemente y minimizar los efectos de borde. Si las celdas se agrupan a lo largo del borde de los pozos, tanto la tasa de transducción como la viabilidad celular disminuirán.
  2. Como control, placa el mismo número de células T CD8 en un solo pozo no recubierto de la placa. Incubar las células a 37 oC utilizando una incubadora de gases de CO2 al 10% durante 48 h.
    NOTA: Después de 48 h, la activación se puede confirmar con un microscopio; las células activadas serán más grandes que las células que no encontraron anticuerpos anti-CD3/CD28.

[figura de lugar 2 aquí]

5. Transducción de células T CD8 activadas (días 1 a 3)

NOTA: Este protocolo utiliza un método de transducción de giros. Se requiere una centrífuga con un rotor oscilante y adaptadores de placa de cultivo de tejido que sea capaz de mantener una temperatura interna de 37 oC. Para garantizar la máxima eficiencia, el día de la transducción precalienta la centrífuga a 37oC antes de recoger el virus.

  1. Preparación de placas recubiertas de fragmento de fibronectina humana (día 1 al día 2)
    1. En el día 1, añadir 0,5 ml de fibronectina (50 g/ml en PBS) a los pozos de una placa de 24 pocillos, e incubar durante la noche a 4oC.
      NOTA: Por lo general, se requieren dos pozos recubiertos con fibronectina por placa de células transvestidas de Phoenix.
    2. En el día 2 eliminar la solución de fibronectina, y reemplazar con 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% en PBS. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos para "bloquear" sitios de unión no específicos.
    3. Lavar los pozos tratados con 1 ml de PBS estéril. Después de retirar la solución de lavado, la placa está lista para su uso; o, puede ser sellado y almacenado a 4 oC durante un máximo de una semana.
  2. Colección de células T CD8 activadas (Día 2)
    1. Cosecha las células T CD8 activadas, cuenta y calcula la viabilidad celular usando el trypan azul o un instrumento automatizado adecuado.
    2. Recoger las células por centrifugación y resuspender a 5 x 106 células viables /ml para la transducción. Mantener una pequeña alícuota de células en cultivo en el medio de células T completo en la incubadora de CO2 para proporcionar un control para la posterior clasificación celular activada por fluorescencia de las células transducidas (paso 6).
      NOTA: Después de la activación durante 48 h, el número total de celdas debería haber aumentado aproximadamente 1,5 veces y tener una viabilidad superior al 95%.
  3. Transducción (Día 2)
    1. Añadir 100 l de suspensión de células CD8 activada por poca (0,5 x 106 células) a la placa recubierta de fibronectina. A continuación, agregue 1,5–2 ml de medio que contiene virus (del paso 2.6) a cada pocto. Mezclar usando un movimiento de remolino para dispensar las células uniformemente (Figura 2).
    2. Coloque la placa en una bolsa de plástico con cremallera y cierre (para proporcionar contención secundaria). Centrífuga a 2000 x g durante 90 min a 37oC.
    3. Retire la placa de la centrífuga. En la seguridad biológica, el armario retire cuidadosamente la bolsa de plástico y asegúrese de que el exterior de la placa no esté contaminado con ningún medio.
    4. A continuación, transfiera la placa a la incubadora de CO2 de 37oC dedicada. Después de 4 h, retire 1 ml del medio de cada poca y sustitúyalo por 1 ml de medio de célula T completo precalentado. Vuelva a colocar la placa en la incubadora de CO 2.
      NOTA: Manipule todos los medios de las células transducidas como residuos infecciosos.
  4. Segunda transducción (Día 3)
    1. En el gabinete de seguridad biológica dedicado, incline la placa que contiene las células transducidas apoyando en la tapa y retire cuidadosamente la mayor parte del medio (dejando 100–200 l) asegurándose de no entrar en contacto con las células en la parte inferior del pozo.
    2. Agregue el medio que contiene virus recogido en el paso 2.7 y repita los pasos 5.3.2–5.3.4.
      NOTA: En nuestra experiencia, una tercera transducción rara vez mejora la eficiencia general. Además, la viabilidad celular probablemente disminuirá significativamente si se utiliza una tercera transducción. Si las células se chapan a una concentración mayor que 0,5 x 106/bien, las células T pueden alcanzar la confluencia después de la incubación durante la noche después del segundo paso de transducción. En este caso, divida las células después de la incubación de 4 h en el día 3.
  5. Células lavadas (Día 4)
    1. Retire 1 ml de medio de cada pocal, resuspenda las células en el medio restante y transfiera a un tubo de 15 ml. Lavar los pozos con 1 ml de medio de célula t completo y añadir al tubo que contiene las células agrupadas de cada transducción.
    2. Centrifugar a 350 x g durante 7 min, luego lavar dos veces resuponiendo en 2 ml de medio de célulata T completo y peletización. Finalmente resuspende en 2 ml de medio y determina el número de celda.
      NOTA: Si se transdujeron originalmente 1 x 106 celdas, el rendimiento en esta etapa debe ser de 3 x 106.
  6. Transferencia
    1. Transfiera alícuotas de 0.5–1 x 106 células en 2 ml de medio de célulata T completo a los pocillos de una nueva placa de 24 pocillos e incubar a 37oC. Aproximadamente 48–72 h después de la transducción, las células están listas para el análisis de la expresión CAR y la clasificación celular.
      NOTA: El número de células CAR-T generalmente se duplica cada 24 h en esta etapa. Es fundamental nunca dejarlos crecer en exceso. Divida las celdas inmediatamente si la densidad es superior a 2 x 106/ml (o si el medio se vuelve amarillo brillante). En nuestra experiencia, las células CAR-T proliferan más robustamente en placas de 24 y 12 pocillos que si se transfieren a un recipiente más grande.

6. Purificación de células transducidas por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (día 5 o día 6)

  1. Recoge las celdas.
    1. Resuspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces (teniendo cuidado de no causar espuma), transferir a tubos de 15 ml y centrifugar a 350 x g durante 5 min.
    2. Resuspender en tampón de clasificación (2% BSA en PBS estéril que contiene gentamicina) a 1 x 106 células/ml. También cosecha las células T CD8 de control (no transducidas) del paso 5.2).
      NOTA: A partir de 1 x 106 células en el día 2, se espera un rendimiento de 2 x 107 células transducidas en este momento.
  2. Lave las células una vez con el tampón de clasificación centrifugando a 350 x g durante 5 min, y resuspenda a 1 x 107 celdas/ml en el búfer de clasificación. Retire una pequeña alícuota para el control de compensación Foxp3GFP (que se utilizará en el paso 6.4.1) y manchar el resto con CD8 antiratón etiquetado (clon 53-6.7; 0,2 g de anticuerpos/5 x 106 células) incubando durante 20 minutos a 4 oC.
    1. Del mismo modo, mancha una alícuota de las células T CD8 no transducidas para proporcionar un control de compensación para el fluoróforo que etiqueta el anticuerpo anti-CD8.
      NOTA: Evite añadir azida sódica a cualquier tampón, ya que esto es tóxico para las células.
  3. Lave las celdas etiquetadas dos veces con el tampón de clasificación, resuspenda en el tampón de clasificación en frío a 1 x 107 celdas/ml.
  4. Ordene las celdas.
    1. Ordene CD8 GFP+ células positivas en un medio de célulattcompleto preenfriado (Figura3B). Tome una pequeña alícuota para el análisis posterior a la clasificación para determinar la pureza.
      NOTA: Para maximizar la pureza de las celdas ordenadas se deben utilizar puertas estrechas. Utilice una boquilla de 100 m para garantizar una alta viabilidad celular. Minimice la cantidad de tiempo que las células clasificadas se mantienen en hielo. Las células T que se han mantenido en hielo durante más de 3 h tardan mucho más en recuperarse que las células enfriadas durante menos de 2 h. Por lo tanto, si es necesario ordenar 3 líneas de celda transducidas, recopile y etiquete la segunda línea mientras la primera se está ordenando y así sucesivamente en lugar de tener la segunda y tercera líneas pasar un tiempo extendido a 0 oC. La expresión de otros marcadores de celda T como CD28 y CD3 también se puede supervisar (Figura3C),pero no es esencial para fines de ordenación.
    2. (Estrategia de clasificación alternativa) Antes de manchar la población a granel, analice la expresión CD8 de una pequeña población de las células T transducidas. Si la pureza es >99%, la población a granel se puede clasificar de forma segura únicamente sobre la base de la expresión GFP.

7. Expansión de células CAR-T ordenadas (Día 5 a 10)

  1. Expansión de células CAR-T
    1. Lave las células CAR-T ordenadas una vez, luego resuspenda en un medio de célulatt completo precalentado a 2.5–5 x 105 células/ml, y alícuotas de placa 2 ml en placas de 24 pocillos.
    2. Cuente y divida las celdas cada 1–2 días. Por lo general, el número de celda se duplica cada día hasta el día 10, con una viabilidad que permanece por encima del 95%.
      NOTA: Sin re-estimulación, las células CAR-T dejarán de proliferar alrededor del día 10 y eventualmente morirán. Por lo tanto, los ensayos funcionales de células T y las transferencias adoptivas deben programarse en consecuencia.
  2. Estrategia de expansión alternativa
    1. Después de la clasificación, el cultivo de las células CAR-T en el medio de células T completo que contiene rhIL-2 a 100 U/ml en lugar de 200 U/ml.
      NOTA: Las células CAR-T proliferan a un ritmo ligeramente más lento en este medio. Sin embargo, a menudo continuarán proliferando hasta los días 11 a 13 sin re-estimulación. Por lo tanto, aunque esta estrategia de expansión alternativa no genera un mayor número de celdas, proporciona una ventana de tiempo ligeramente más larga para que se realicen ensayos posteriores.

8. Verificación de la especificidad y funcionalidad del antígeno de las células T CAR.

NOTA: La especificidad de unión de las células T CAR dirigidas a los complejos de péptidos/MHC se puede verificar mediante la tinción de tetramer7,23. Del mismo modo, su funcionalidad se puede confirmar midiendo la secreción de citoquinas o citotoxicidad después de la estimulación por sus ligandos cognados. El NIH Tetramer Core Facility (TCF) de la Universidad emory es una fuente recomendada de "tetramers" y protocolos de tinción pertinentes.

  1. Péptido-MHC Tinción de tetramer.
    1. Etiquetar alícuotas de 2 x 105 células CAR-T transducidas en 100 ml de tampón de clasificación mediante la incubación con 0,6 g de antígenos etiquetados fluorescentemente específicos y tetramers de control a 37 oC durante 2 h.
    2. Peletlas por centrifugación durante 5 min a 350 x g, luego lave dos veces por resuponer en 0,5 ml de tampón de clasificación y re-centrifugación. Por último, resuspenda las celdas en 300 s de búfer de clasificación y analice por citometría de flujo (Figura4).
      NOTA: Para estos estudios, normalmente utilizamos tetrámeros con etiqueta IAg7-B:9-23(RE) (prueba) e IAg7-HEL (control). Sin embargo, cualquier combinación de fluoróforo/tetramer que sea apropiada para las CAR bajo investigación se puede utilizar en su lugar. En este caso, se debe optimizar la concentración y el tiempo de tinción para cada tetrámero utilizado. Las células CAR-T ordenadas y no ordenadas se pueden utilizar para la tinción de tetramer.
  2. Medición de la especificidad por estimulación de ligandos.
    1. Incubar 2 x 105 células CAR-T ordenadas en 200 l de medio de célulata T libre de citoquinas con ligandos celulares o ligandos celulares o ligandos apropiados.
    2. Después de 6–24 h medir la producción de citoquinas por ELISA o tinción intracelular utilizando los protocolos del fabricante.
      NOTA: Para nuestros estudios de Células T redirigidas IAg7-B:9-23, cultivamos las células durante la noche con células de linfoma muria M12C3 de células B que expresan IAg7-B:R3 o "vacío" IAg724,25, a continuación, recoger los supernatantes y medir el interferón gamma del ratón secretado (IFN-o) por ELISA26 (Figura 5).

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Representative Results

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Por lo general, la eficiencia de transducción mediante este protocolo es de 60-90 %. En el experimento mostrado en la Figura3, antes de ordenar aproximadamente, el 70% de las células T CD8 co-expresaron GFP. También expresaron CD28 y CD3 (Figura3C). Es importante destacar que todas las células GFP+ de "prueba" también co-teñidas con los tetrámeros IAg7-B:R3, pero no con el tetrámero de control (Figura4). Del mismo modo, la prueba ordenada y el control de las células CAR-T secretaron niveles altos de IFN sólo después del cocultivo con las células diana que expresan sus ligandos cognados (Figura5). Esto confirma que las células transducidas tienen un fenotipo de célulata t efector CD8 dirigido hacia el objetivo de los anticuerpos primarios.

Figure 1
Figura 1: Esquema de la construcción retroviral CAR. El CAR comprende un dominio de segmentación derivado del fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal de ratón adecuado, y un dominio de espaciador/ancla/señalización de ratón CD28, CD137 y CD247. El ADNC sintético se inserta en el vector de expresión retroviral pMIG-II. Se muestran los sitios de endonucleasa de restricción utilizados para generar el mAb287-CAR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Efecto de los diferentes métodos de chapado en la distribución de celdas. (Izquierda) Las celdas canalizadas mediante un movimiento de remolino muestran una distribución uniforme. (Derecha) Las células se canalizaron directamente en el centro del pozo. Las imágenes se capturaron después de girar a 350 x g durante 5 min. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis citométrico de flujo de células T transducidas. Las células se co-tiñó con PE-Cy7 conjugado anti-CD8, AF647 conjugado anti-CD3, y BV421 conjugado anti-CD28, como se describe en el paso 6.4. Se muestran perfiles cerrados en celdas viables individuales. (A) Células T CD8 parentales no manchadas. (B) Perfil PE-Cy7/GFP de células transducidas. Las células de expresión de la CAR son identificadas por el reportero de la GFP. (C) Las células transducidas manchadas se encerradon en la doble positividad PE-Cy7/GFP. Se muestra el perfil AF647/BV421. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Tinción de tetramer de células CAR-T no ordenadas. Las células se tiñeron con tetrámeros conjugados BV421 como se describe en el paso 8.1. Se muestran perfiles cerrados en celdas viables individuales. (A) Prueba IAg7-insulin tetramer. (B) Control I-Ag7-HEL tetramémero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Secreción de citoquinas específicas del antígeno por células T CAR. Las células T CD8 ordenadas que expresan la prueba mAb287 o el control mAb24.1 CAR se cocultivaron con células M12C3 que expresan IAg7-B:R3, IA "vacío"g7o TFR-MBP-DTRL (el ligando para mAb24.1) como se describe en el paso 8.2. Después de las 24 h, ELISA cuantificó el IFN-a ELISA. Se observó estimulación específica de ambas líneas de células T. Los datos representan la media: SD de 3 experimentos repetidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

hora Preparación del virus Preparación de células T
DIA -4 (Vie) Células de descongelación de Phoenix (PM)
Día -3 (sáb) Re-placa Phoenix
Día -2 (Sol) día festivo
Día-1 (Lun) Células irradiar Phoenix (PM) Placa no tratada con CD3/CD28 Ab
Día 0 (mar) Transfectar células Phoenix (AM) Preparar los esplenocitos y aislar las células T CD8.
Activación de células T.
Día 1 (mie) Cambiar las células de Phoenix de medio a 4 ml (AM). Abrigo RetroNectin
Día 2 (jue) Recoger virus y rellenar. Transducción, células T CD8
Día 3 (vie) Recoger virus. Transducción, células T CD8
Día 4 (sáb) Lave las células y amplíe las células.
Día 5 (Sol) Expansión celular si es necesario.
Día 6 (Lun) Clasificación de células CAR-T.
Día 7 -10 (Mar a Viernes) Expansión de células T CAR. Experimentos.

Tabla 1: Resumen del protocolo de generación CAR-T.

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Discussion

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Este protocolo describe un método eficiente para producir células CD8 CAR-T específicas para antígenos por transducción retroviral. La eficiencia de transducción de nuestro protocolo es típicamente alta, y la expresión robusta de la CAR se observa generalmente. Las células T CAR expandidas conservan las características esenciales de las células T activadas por los padres, y la especificidad de los anticuerpos, y son adecuadas tanto para el uso in vitro como in vivo. Hemos aplicado células T Ab-CAR CD8 en la reprogramación de la diabetes tipo 1 en ratones NOD7.

Nuestro protocolo incorpora varias modificaciones críticas a los métodos descritos anteriormente. En primer lugar, utilizamos un medio de cultivo de células T optimizado que permite un tiempo de activación prolongado. El medio completo descrito contiene niveles óptimos de varios suplementos clave, y mejora significativamente la viabilidad de los células T y el grado de proliferación después de la activación. Cabe señalar que el ratón IL-2 puede ser sustituido por la proteína humana con resultados equivalentes, aunque en la actualidad, IL-2 humano es más asequible. Cabe destacar que se obtiene una eficiencia de transducción significativamente mayor utilizando células T activadas durante 40-48 h que si se utiliza un paso de activación de 24 h.

En segundo lugar, utilizamos un procedimiento de transducción mejorado que elimina el polibrino B (que es tóxico para las células T) y utiliza fibronectina en su lugar. Esto mejora aún más la viabilidad celular. Cabe señalar que para garantizar una buena eficiencia de transducción es fundamental mantener las células T en un medio optimizado a una densidad celular adecuada y utilizar sobrenatantes virales frescos de alta titulación en lugar de virus previamente congelados. Usando nuestro procedimiento modificado, un tercer paso de transducción es innecesario y de hecho es indeseable ya que la viabilidad normalmente disminuye si se incluye un tercer paso de infección de giro. También hay que destacar que es fundamental nunca dejar que las células crezcan en exceso durante la fase de expansión. Una vez que las células están cubiertas, tienden a perder rápidamente su fenotipo y mueren.

Además de los parámetros descritos anteriormente, deben evitarse otras dos causas potenciales de baja eficiencia/viabilidad de transducción. En primer lugar, como los antibióticos no deben estar presentes durante los pasos de transfección, es importante asegurarse de que los plásmidos se preparan utilizando un kit libre de endotoxinas, y disueltos en agua estéril, y que se utiliza una buena técnica estéril en todo momento. En segundo lugar, debe evitarse la presencia de altos niveles de células T muertas o moribundas. Si la suspensión parental CD8 T cell activada contiene altos niveles de células muertas o desechos celulares, esto debe eliminarse antes de la transducción utilizando kits comerciales.

No hemos incluido deliberadamente un paso de congelación de células CAR-T en este protocolo, ya que en nuestra experiencia una proporción significativa de las células transducidas mueren durante la criopreservación y descongelación. Del mismo modo, aunque las células CAR-T expandidas pueden ser reestimuladas in vitro, tienen una mayor tendencia a perder la expresión del transgén. En consecuencia, dado el alto grado de proliferación que observamos utilizando células CAR-T recién ordenadas, recomendamos encarecidamente que sólo se utilicen células CAR-T recién generadas para ensayos funcionales y transferencia adoptiva.

En resumen, la importancia de este protocolo es que describe un procedimiento que proporciona una alta eficiencia de transducción y genera un gran número de células CD8 T de ratón específicas de antígeno sano para su uso in vitro e in vivo. Por lo tanto, nuestro protocolo proporciona una herramienta útil para los investigadores que realizan estudios de células CAR-T en modelos de ratón de enfermedad.

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Disclosures

MAb287 y sus derivados están protegidos por una patente estadounidense emitida en 2014.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por las becas JDRF 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, y SRA-2-S-2018-648-S-B, un Premio a la Educación y Acción para la Diabetes, y el Fondo de Derecho Caroline Wiess para la Investigación en Medicina Molecular en Baylor College of Medicine. La clasificación celular fue apoyada por el Núcleo de Citometría y Clasificación Celular de Baylor College of Medicine con fondos del NIH (S10RR024574 y P30CA125123). Todos los tetrámeros péptidos-MHC se obtuvieron de la Instalación De Núcleo de Tetramer niH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50mM) Gibco 21985-023 50 μM
5’ RACE PCR Clontech 634859
anti-mouse CD28 antibodies eBioscience 14-0281-86 final concentration at 1µg/ml
anti-mouse CD3e antibody eBioscience 145-2C11 final concentration at 1µg/ml
Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 554410 Working concentration at 0.5 µg/ml
BSA Sigma A7030
Endo-free Maxi-Prep kit Qiagen 12362
Gentamicin Gibco 15750-060 Final 50 µg/ml.
Heat inactivated FCS Hyclone SH30087.03 Final 10% FCS
HEPES (100X) Gibco 15630-080 1X
IAg7-CLIP tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 NIH tetramer Facility at Emory per approval Working concentration at 6 µg/ml
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) ThermoFisher 51500056 Final concentraion is 1x
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS Separation Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miletenyi Biotec Inc 130-104-075
Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-104-075
Opti-MEM medium ThermoFisher 31985070
Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) ThermoFisher 15070063 50 U/ml
Phoenix-ECO cells ATCC CRL-3214
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
pMIG II Addgene 52107
pMSCV-IRES-GFP II Addgene 52107
Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ BD Biosciences 551216 Working concentration at 3 µg/ml
Red cell lysis buffer Sigma R7767
RetroNectin Takara T100A Working concentration at 50 µg/ml in PBS
rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) Peprotech 200-02 Final concentration at 200 IU/ml
rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) R&D 407-ML-005 Final concentration at 0.5ng/ml
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sterile Cell Strainers Fisher Scientific 22-363-548
Tryple Gibco 12605-028

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References

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Generación de alta eficiencia de células T citotóxicas de ratón primario específicas de antígenos para pruebas funcionales en un modelo de diabetes autoinmune
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Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).More

Davidson, H. W., Cepeda, J. R., Sekhar, N. S., Han, J., Gao, L., Sosinowski, T., Zhang, L. High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model. J. Vis. Exp. (150), e59985, doi:10.3791/59985 (2019).

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