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Chemistry

Síntese de Oligosacárido de um pote programável e hierárquica

Published: September 6, 2019 doi: 10.3791/59987
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 4, 1,3
1Genomics Research Center, Academia Sinica, 2Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, 3Department of Chemistry, Scripps Research Institute, 4Institute of Information Science, Academia Sinica

Summary

Este protocolo demonstra como usar o software auto-CHO para a síntese hierárquica e programável de um pote de oligossacarídeos. Descreve também o procedimento geral para experimentos de determinação de RRV e glicosilação de um pote de SSEA-4.

Abstract

Este artigo apresenta um protocolo experimental geral para a síntese programável do oligosaccharide do um-potenciômetro e demonstra como usar o software de auto-CHO para gerar soluções sintéticas potenciais. A aproximação programável do oligosaccharide do um-potenciômetro da síntese é projetada capacitar a síntese rápida do Oligosaccharide das grandes quantidades usando blocos de edifício do thioglycoside (BBLs) com a ordem sequencial apropriada de valores relativos da reactividade (RRVs). O auto-CHO é um software multi-plataforma com uma interface gráfica de usuário que fornece possíveis soluções sintéticas para síntese de oligosacárido de um pote programável, pesquisando uma biblioteca BBL (contendo cerca de 150 validadas e > 50000 BBLs virtuais) com com precisão previu RRVs por regressão vetorial de suporte. O algoritmo para síntese de um pote hierárquico foi implementado em auto-CHO e usa fragmentos gerados por reações de um pote como novos BBLs. Além disso, o auto-CHO permite aos usuários dar feedback para BBLs virtuais para manter os valiosos para uso posterior. A síntese do um-potenciômetro do antígeno embrionário estágio-específico 4 (ssea-4), que é um marcador embrionário humano pluripotente da pilha de haste, é demonstrada neste trabalho.

Introduction

Os carboidratos são onipresentes na natureza1,2, massua presença e modo de ação permanecem um territóriodesconhecido, principalmentedevido ao difícil acesso a essa classe de moléculas3. Diferentemente da síntese automatizada de oligopeptídeos e oligonucleotídeos, o desenvolvimento da síntese automatizada de oligossacarídeos continua sendo uma tarefa formidável, e o progresso tem sido relativamente lento.

Para resolver este problema, Wong et al. desenvolveram o primeiro método automatizado para a síntese de oligossacarídeos usando um programa de software programável chamado Optimer4, que orienta a seleção de bbls de uma biblioteca de ~ 50 bbls para seqüencial de um pote Reações. Cada BBL foi projetado e sintetizado com reatividade bem definida sintonizada por vários grupos de proteção. Usando essa abordagem, as complexidades de proteger a manipulação e a purificação intermediária podem ser minimizadas durante a síntese, que foram consideradas as questões mais difíceis de superar no desenvolvimento da síntese automatizada. Apesar deste avanço, o método ainda é bastante restrito, pois o número de BBLs é muito pequeno e o programa Optimer só pode lidar com certos oligossacarídeos pequenos. Para oligossacarídeos mais complexos que exigem mais BBLs e vários passes de reações de um pote e condensação de fragmento, uma versão atualizada do programa de software, auto-CHO5, foi desenvolvida.

Em auto-CHO, mais de 50.000 BBLs com reatividade definida para a biblioteca BBL foram adicionados, incluindo 154 sintético e 50.000 virtual ones. Estes bbls foram projetados pelo aprendizado de máquina baseado em propriedades básicas, os deslocamentos químicos calculados de NMR6,7, e os descritores moleculares8, que afetam a estrutura e a reactividade dos bbls. Com este programa atualizado e novo conjunto de BBLs disponíveis, a capacidade de síntese é expandida, e como demonstrado, vários oligossacarídeos de interesse podem ser rapidamente preparados. Acredita-se que este novo desenvolvimento facilitará a síntese de oligossacarídeos para o estudo de seus papéis em vários processos biológicos e seus impactos sobre as estruturas e funções das glicoproteínas e glicolipídeos. Pensa-se também que este trabalho beneficiará significativamente a comunidade de glicociência, uma vez que este método está disponível para a comunidade de pesquisa de forma gratuita. A síntese do marcador embrionário humano essencial da pilha de haste, SSEA-45, é demonstrada neste trabalho.

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Protocol

1. auto-CHO manipulação de software

  1. Instalação do Java Runtime Environment: Certifique-se de que o Java Runtime Environment (JRE) foi instalado no dispositivo. Se o JRE tiver sido instalado, vá para a próxima etapa, "inicialização do software"; caso contrário, baixe e instale o JRE de acordo com o sistema operacional do usuário encontrado em: < https://www.Oracle.com/technetwork/Java/javase/downloads/index.html >.
  2. Inicialização do software: acesse o site do auto-CHO em < https://sites.google.com/View/auto-Cho/Home > e baixe o software de acordo com o sistema operacional. Atualmente, o auto-CHO suporta Windows, macOS e Ubuntu. O mais recente guia do usuário em PDF é fornecido no site da auto-CHO.
    1. Para usuários do Windows, descompacte o auto-CHO_Windows. zip e clique duas vezes em auto-Cho. jar na pasta CHO_Windows automática para iniciar o programa.
      Observação: o usuário precisa instalar o software unzip, como 7-zip, encontrado em < https://www.7-zip.org >, para desempacotar o arquivo zip. O usuário também pode usar o comando Java-jar auto-Cho. jar para iniciar o programa pelo prompt de comando do Windows.
    2. Para usuários do macOS, clique com o botão direito em auto-Cho. jar e escolha abrir para iniciar o programa.
    3. Para usuários do Ubuntu:
      1. Instale o libcanberra-GTK usando o seguinte comando:
        $ sudo apt-get install libcanberra-GTK *
      2. Altere a permissão de acesso de auto-CHO_Ubuntu. sh:
        $ chmod 755 auto-CHO_Ubuntu. sh
      3. Execute o programa auto-CHO:
        $./Auto-CHO_Ubuntu.sh
  3. Introduza a estrutura de glicana desejada. Escolha desenhar uma estrutura de glicana ou ler um arquivo de estrutura existente.
    1. Entrada por desenho:
      1. Clique em Editar glycan por GlycanBuilder9,10 (Figura 1, Btn1; Figura 2a) ou a área de clique aqui para editar o destino sintético para desenhar e editar a estrutura de consulta por GlycanBuilder. A informação da ligação e do quiralidade não deve ser ignorada. Clique nos botões globo-H, ssea-4ou oligolacnac (Figura 1, exemplos) para exibir os exemplos.
      2. Selecione arquivo | Exportar para formatos de sequência | Exporte para GlycoCT condensado para salvar a estrutura editada (opcional).
      3. Feche a caixa de diálogo GlycanBuilder para concluir a edição.
    2. Entrada lendo um arquivo:
      1. Clique em Editar glycan por GlycanBuilder (Figura 1, Btn1; Figura 2a) ou a área de clique aqui para editar o destino sintético para editar a estrutura de consulta.
      2. Selecione arquivo | Importe de formatos de sequência para escolher o arquivo de estrutura de consulta com o formato correspondente.
  4. Configurações do parâmetro de pesquisa (opcional).
    1. Defina os parâmetros de pesquisa na guia "Parameter Settings" (Figura 1, a) para obter resultados de pesquisa razoáveis.
      Nota:
      O limiar de RRV de alta classe deve ser um número real e ≥ 0.
      O limiar da classe média RRV deve ser um número real e ≥ 0.
      Limiar de alta classe RRV deve ser >limiar de classe média RRV.
      Número máximo de fragmento deve ser um inteiro e ≥ 1.
      Min BBL número em um fragmento deve ser um inteiro e entre 1 e 3.
      Max BBL número em um fragmento deve ser um inteiro e entre 1 e 3.
      Max bbl número em um fragmento deve ser ≥min bbl número em um fragmento.
      Min doador/Acceptor RRV diferença deve ser um número positivo real.
      A relação do doador/aceitador mínimo RRV deve ser um número real positivo.
      A relação máxima do doador/Acceptor RRV deve ser um número real positivo.
      A relação máxima do doador/ACCEPTOR RRV deve ser >relação do doador/ACCEPTOR min RRV.
    2. Clique no botão OK para ativar as novas configurações.
  5. Selecione a biblioteca de blocos de construção (Figura 1, separador5). A configuração padrão é pesquisar somente a biblioteca experimental. Se desejar pesquisar as bibliotecas experimentais e virtuais, verifique as etapas a seguir.
    1. Selecione a guia biblioteca de blocos de construção virtual (Figura 2C, separador5). Blocos de construção experimentais e virtuais podem trabalhar juntos para melhorar a capacidade de busca de auto-CHO. Atualmente, o auto-CHO fornece mais de 50.000 blocos de construção virtuais com RRVs previstos na biblioteca.
    2. Selecione usar bibliotecas experimentais e virtuais e aplique filtragem para exibir blocos de construção virtuais com determinados critérios. Clique no botão Mostrar selecionado virtual BBL (s) (Figura 2C, btn5) para mostrar apenas o bloco de construção virtual selecionado (s).
    3. Clique no botão Mostrar filtrado virtual BBL (s) (Figura 2C, btn6) para mostrar apenas blocos de construção virtuais com determinados critérios definidos pelo usuário.
    4. Clique no botão Mostrar todos os BBL (s) virtual (Figura 2C, btn7) para mostrar todos os blocos de construção virtuais disponíveis e redefinir o filtro.
    5. Verifique um ou vários blocos de construção virtual desejados que o usuário gostaria de usar para pesquisa.
  6. Selecione a guia estrutura de consulta (Figura 1, Tab1) e clique no botão biblioteca de blocos de construção de pesquisa (Figura 1, btn2) para encontrar as soluções sintéticas de um pote para a estrutura de consulta. Em seguida, confirme as configurações do parâmetro.
  7. Pesquisar o Visualizador de resultados.
    Observação: o resultado da pesquisa é mostrado na guia visualização de resultados (Figura 1, tab6). Os aceitadores finais de redução de diferentes números de resíduo são exibidos na coluna de redução do Acceptor final (Figura 1, viewer1).
    1. Selecione um aceitador de extremidade de redução e as soluções são exibidas na lista de solução sintética (Figura 1, viewer2). Os fragmentos são mostrados na lista de fragmento (Figura 1, viewer3) para sugerir quantos fragmentos devem ser usados na síntese.
      Nota: o sistema fornece informações detalhadas de cada fragmento, incluindo o RRV do fragmento, o rendimento computacional, bem como que o grupo de proteção deve ser desprotegido para o uso subsequente do fragmento na reação de um pote. Os blocos de construção usados para montar o fragmento selecionado são mostrados no viewer4 da Figura 1. O viewer5 da Figura 1 também exibe as informações de conexão do fragmento.
    2. Visualizar e verificar estruturas químicas e informações detalhadas dos blocos de construção selecionados nas regiões de estrutura química do bloco de construção e do bloco de construção, respectivamente, para blocos de construção experimentais (Figura 1, tab4).
  8. Saída do resultado da pesquisa para o texto (opcional).
    1. Selecione a guia texto do resultado (Figura 1, tab7).
    2. Clique em salvar texto do resultado (Figura 2b, btn4) e escolha o destino do arquivo de texto.
  9. Feedback para blocos de construção virtuais (opcional).
    Nota: o gabarito pode ser dado em blocos de construção virtuais através do questionário em linha. O feedback pode ajudar a Comunidade a manter blocos de construção virtuais úteis e remover os ineficazes.
    1. Selecione a guia bloco de construção virtual (Figura 1, separador5).
    2. Clique no link para taxa do bloco de construção virtual do qual é desejado para classificar ou comentar na coluna de comentários .
    3. Preencha o formulário de feedback depois que o sistema abrir uma página da Web e enviá-la.
      Nota: não altere a ID de BBL virtual.

2. experimentos de determinação de RRV

  1. Em um balão de fundo redondo de 10 mL, combine os dois doadores de thioglycoside (0, 2 mmol de cada um: Dr4 é o doador de referência com RRV conhecido; Dx1 é a molécula fornecedora de RRV desconhecido), o metanol absoluto (0,10 mmol), e o drierite no diclorometano (DCM, 1,0 ml), a seguir agitam na temperatura ambiente (RT) para 1 h.
  2. Tome uma alíquota desta mistura (30 μL) e injete a mistura em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) em três injeções separadas (10 μL para cada injeção). Meça o coeficiente (a) entre a absorção (a) e a concentração da molécula doadora [D] as condições de separação basal (acetato de éter/n-hexano = 20/80).
  3. Adicionar uma solução de 0,5 m N-iodosuccinimida (NIS) em acetonitrila (40 μl, 0, 2 mmol) na mistura de reacção, seguida de adição de uma solução de ácido ácido de 0,1 m (TFOH) (20 μl, 0, 2 mmol), e agitar a mistura em RT para 2 h.
  4. Diluir a mistura de reacção com DCM (4,0 mL), filtrar e lavar com tiossulfato de sódio aquoso saturado contendo 10% de carbonato de hidrogénio de sódio (2x com 5 mL de volume cada). Extraia a camada aquosa com DCM (3x com 5 mL). Combine toda a camada orgânica, lave-a com 5 mL de salmoura, e seque-a com aproximadamente 200 mgs de sulfato de magnésio anidro.
  5. Agitar suavemente a mistura por 30 s, filtrá-lo através de um funil com um papel de filtro canelada, a fim de remover o sulfato de magnésio, em seguida, recolher o filtrado em um balão de fundo redondo de 25 mL. Retire o solvente utilizando um evaporador rotativo.
  6. Dissolver o resíduo em DCM (1,0 mL). Tome uma alíquota desta mistura (30 μL) e injete-a em HPLC em três injeções separadas (10 μL para cada injeção). Medir as concentrações dos restantes doadores ([dx] e [dref]) por HPLC as mesmas condições de separação (acetato de éter/n-hexano = 20/80) (Aref)t = 24417,0, (ax)t = 23546,3.
  7. Meça a reactividade relativa entred X1 vs. dR4, kX1/kR4 = 0, 932. Com base no valor de reatividade relativa de DR4, o valor de reatividade relativa de dX1 é 3.
    Nota: a = a/[D], (aref)0 = 74530,1, (ax)0 = 26143,0. k x/kref = (ln [dx]t -ln [dx]0)/(ln [dref]t -ln [dref]0) = (ln [A x]t -ln [ax]0)/(ln [aref]t -ln [aref]0) = 0, 932.

3. glicosilação de um pote de SSEA-4

  1. Coloque um balão de fundo redondo de 10 mL vácuo, seque-o e deixe o balão arrefecer para RT enquanto ainda está vácuo. Retire o septo de borracha para adicionar uma mistura de dissacarde 1 doador (38 mg, 1,1 EQ., 0, 57 mmol), o primeiro aceitador 2 (40 mg, 1,0 EQ., 0, 53 mmol) e uma barra de agitação magnética revestida com Teflon no balão.
  2. Transferir 100 mg de peneiras moleculares em pó 4 Å para um balão de 5 mL de fundo redondo. Mantenha este balão vácuo, seque-o e deixe o balão arrefecer ao RT enquanto ainda está vácuo. Transfira as peneiras moleculares recém-secas de 4 Å para o primeiro frasco que contém o material de partida.
  3. Transfira 1 mL de DCM recém-secos para o balão. Mexa a mistura de reacção durante 1 h na RT e, em seguida, coloque-a uma temperatura de-40 ° c. Transfira o NIS (13 mg, 1,1 EQ., 0, 57 mmol) para o balão.
  4. Injete TfOH (34 μL, 0,3 eq., 0, 17 mmol, 0,5 M em éter) no balão através do septo utilizando uma seringa de microvolume a-40 ° c. Continue mexendo a-40 ° c por 3 h.
  5. Após o primeiro aceitador 2 é quase consumido, injetar a solução de aceitador 3 em DCM no balão através do septo.
  6. Aqueça a mistura de reacção até-20 ° c e transfira NIS (19 mg, 1,6 EQ., 0, 83 mmol) para o balão. Injetar TfOH (34 μL, 0,3 eq., 0, 17 mmol, 0,5 M em éter) no balão através do septo a-20 ° c. Continue mexendo a-20 ° c por 3 h.
  7. Depois que o produto da primeira reação da etapa é consumido, saciar a reação injetando dois equivalentes de trietilo Amine. Retire as peneiras moleculares através de um funil de filtro embalado com celite, colete o filtrado em um balão de fundo redondo de 25 mL e lave ainda mais o filtro com 10 mL de DCM.
  8. Transfira o filtrado para um funil separatório e lave-o com tiossulfato de sódio aquoso saturado contendo 10% de NaHCO3 (2x com 10 ml cada). Extraia a camada aquosa com DCM (3x com 10 mL). Combine as camadas orgânicas e lave a mistura com a salmoura (10 mL) e seque-a adicionando o MgSO anidro4. Filtre-o e colete o filtrado em um balão de fundo redondo de 100 mL.
  9. Retire o solvente utilizando um evaporador rotativo. Dissolver a mistura bruta com aproximadamente 1 mL de DCM e carregá-la em cima do leito de sílica. Elute o produto com uma mistura de acetato de etila e tolueno (EtOAc/tolueno, 1/4 a 1/2) e recolher as frações.
  10. Retire o solvente utilizando um evaporador rotativo. Seque o resíduo pressão reduzida para dar totalmente protegidos SSEA-4 derivado 4 (74 mg, 50% com base no aceitador 2) como espuma branca.

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Representative Results

O resultado da pesquisa de CHO automático com base nas configurações de parâmetro padrão indica que SSEA-4 pode ser sintetizado por uma reação de um pote [2 + 1 + 3]. A Figura 3 mostra a captura de tela do software do resultado da pesquisa ssea-4. Quando um trisacárido reduzindo o Acceptor final é selecionado (Figura 3, rótulo 1), o programa mostra quatro soluções potenciais para a consulta. A primeira solução tem um fragmento (Figura 3, rótulo 2), e seu rendimento calculado é de cerca de 94%. O fragmento pode ser sintetizado por dois BBLs (Figura 3, rótulo 3). O RRV do primeiro bbl do dissacarídeo é 1462 e o RRV do segundo monossacarídeos é 32,0. O rótulo 4 da Figura 3 mostra a estrutura química do primeiro bbl sugerido usado na reação de um pote. O experimento de um pote mostra que SSEA-4 pode ser sintetizado em 43% de rendimento por esta sugestão com sucesso (Figura 4) e também tem sido demonstrado no trabalho anterior5. Os procedimentos experimentais do detalhe e a caracterização de compostos mencionados, particular SSEA-4 podem ser encontrados na referência citada5.

Figure 1
Figura 1: captura de tela do auto-Cho. Os usuários podem editar a estrutura de glican de consulta, procurar informações de bloco de construção experimental e virtual e Visualizar soluções sintéticas de um pote fornecidas pelo software. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: capturas de tela parciais do software auto-Cho. (A) clique no botão "Editar glycan by GlycanBuilder" (Btn1) na guia "estrutura de consulta" (Tab1) e o sistema aparece na caixa de diálogo do glycanbuilder. (B) selecione "texto do resultado" (tab7) e clique em "salvar texto do resultado" (btn4) para salvar os resultados da pesquisa de texto. (C) selecione "biblioteca de blocos de construção virtual" (separador5) e verifique os blocos de construção virtuais desejáveis para pesquisar por opções de filtragem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: modelo sintético de um pote dado pelo programa auto-Cho. Rótulo 1: reduzindo Acceptor final. Rótulo 2: fragmento. Rótulo 3: bloco de construção do fragmento. Rótulo 4: estrutura química do bloco de construção selecionado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: a estratégia sintética de um pote [2 + 1 + 3] para SSEA-4. Ssea-4 pode ser sintetizado por três unidades sugeridas por auto-Cho: bloco de construção do dissacarídeo do sialyl 1 (RRV = 1462), bloco de edifício 2 do monossacarídeos (RRV = 32.0), e reduzindo o Acceptor 3 da extremidade (RRV = 0). Este número foi modificado da nossa publicação anterior5 com permissão (sob uma licença Creative Commons Attribution 4,0 International License: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O software auto-CHO foi desenvolvido para auxiliar os químicos a prosseguir a síntese hierárquica e programável de um pote de oligossacarídeos5. Auto-CHO foi construído pela linguagem de programação Java. É um software GUI e multi-plataforma, que atualmente suporta Windows, macOS e Ubuntu. O software pode ser baixado gratuitamente para o site da auto-CHO em < https://sites.google.com/View/auto-Cho/Home >, e seu código-fonte com licença MIT pode ser acessado a partir do GitHub em < https:/github.com/CW-Wayne/auto-Cho >.

A biblioteca BBL de auto-CHO contém 154 BBLs experimentais e mais de 50.000 BBLs virtuais com RRVs com precisão prevista. atualmente, os tipos de açúcar de BBLs virtuais incluem GAL, GLC, Man, GalNAc, GlcNAc, GlcN e GlcA. Todas as pesquisas de biblioteca são processadas na máquina local e não coletamos nenhuma estrutura de consulta dos usuários. Desde auto-CHO não pode garantir o sucesso da síntese de alto rendimento entre BBLs virtual dado pelo programa (devido a muitas restrições estruturais ou fatores desconhecidos nas reações químicas), auto-CHO fornece questionário de feedback on-line para BBLs virtual. Acredita-se que o feedback do usuário da comunidade de pesquisa pode ajudar a manter BBLs virtuais valiosos e eliminar os inadequados. Um endereço de e-mail é fornecido para assistência técnica no guia do usuário do software. Os usuários podem contatar este endereço se encontrarem perguntas ou problemas técnicos.

Duas estratégias de pesquisa são fornecidas aqui. Para configurações de parâmetro (seção 1,4), sugere-se definir parâmetros com critérios mais rigorosos no início. Se o auto-CHO não retornar soluções sintéticas satisfeitas, é aconselhável usar parâmetros mais flexíveis na próxima execução de pesquisa. Para a seleção da biblioteca de BBL (seção 1,5), sugere-se para procurarar a biblioteca experimental somente no início. Se o software não devolver qualquer solução adequada, é aconselhável procurar bibliotecas experimentais e virtuais nas seguintes iterações.

Em resumo, este protocolo demonstra a operação de auto-CHO software e uso de auto-CHO para síntese de um pote da molécula SSEA-4. Além, o protocolo programável do um-potenciômetro é descrito. O auto-CHO é o GUI e o software de código aberto com a biblioteca inclui BBLs validados e virtuais, e suporta a síntese hierárquica de um pote de oligossacarídeos. Acredita-se que este software pode beneficiar a comunidade de pesquisa e oligossacarídeos mais essenciais podem ser sintetizados por reações de um pote através de auto-CHO para mais pesquisas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Academia Sinica, incluindo o programa Summit, Ministério da ciência e tecnologia [MOST 104-0210-01-09-02, MOST 105-0210-01-13-01, MOST 106-0210-01-15-02], e NSF (1664283).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Sigma-Aldrich 75-05-8
Anhydrous magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Dichloromethane Sigma-Aldrich 75-09-2
Drierite Sigma-Aldrich 7778-18-9
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 141-78-6
Methanol Sigma-Aldrich 67-56-1
Molecular sieves 4 Å Sigma-Aldrich
n-Hexane Sigma-Aldrich 110-54-3
N-Iodosuccinimide Sigma-Aldrich 516-12-1
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 144-55-8
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 10102-17-7
Toluene Sigma-Aldrich 108-88-3
Trifluoromethanesulfonic acid Sigma-Aldrich 1493-13-6

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References

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