Summary
Этот протокол демонстрирует, как использовать программное обеспечение Auto-CHO для иерархического и программируемого синтеза олигосахаридов. В нем также описывается общая процедура экспериментов по определению RRV и гликозилирование SSEA-4.
Abstract
В этой статье представлен общий экспериментальный протокол для программируемого синтеза олигосахарида одного горшка и показано, как использовать программное обеспечение Auto-CHO для генерации потенциальных синтетических решений. Программируемый один горшок олигосахарида синтез подход предназначен для расширения возможностей быстрого синтеза олигосахарида больших количествах с использованием тиогликозидных строительных блоков (BBLs) с соответствующим последовательным порядком относительных значений реактивности (RRVs). Auto-CHO является кросс-платформенным программным обеспечением с графическим пользовательским интерфейсом, который обеспечивает возможные синтетические решения для программируемого синтеза олигосахарида одного горшка путем поиска в библиотеке BBL (содержащей около 150 проверенных и точно предсказал RRV поддержки вектор регрессии. Алгоритм иерархического синтеза одного горшка реализован в Auto-CHO и использует фрагменты, генерируемые реакцией одного горшка, в качестве новых BBL. Кроме того, Auto-CHO позволяет пользователям давать обратную связь для виртуальных BBLs, чтобы сохранить ценные для дальнейшего использования. В этой работе показан одногоршоксинтез апогена 4 (SSEA-4), который является плюрипотентным маркером эмбриональных стволовых клеток человека.
Introduction
Углеводы вездесущи в природе1,2, но их наличие и способ действия остаются неизведанной территории, в основном из-за трудного доступа к этому классу молекул3. В отличие от автоматизированного синтеза олигопептидов и олигонуклеотидов, развитие автоматизированного синтеза олигосахаридов остается огромной задачей, и прогресс идет относительно медленно.
Для решения этой проблемы, Вонг и др. разработали первый автоматизированный метод синтеза олигосахаридов с помощью программного обеспечения под названием Optimer4, которая направляет выбор BBLs из библиотеки 50 BBLs для последовательного одного горшка Реакции. Каждый BBL был разработан и синтезирован с четко определенной реактивностью, настроенной различными группами защиты. Используя этот подход, сложности защиты манипуляций и промежуточной очистки могут быть сведены к минимуму при синтезе, которые считаются наиболее сложными вопросами, которые необходимо преодолеть при разработке автоматизированного синтеза. Несмотря на это заранее, метод по-прежнему довольно ограничен, так как количество BBLs слишком мала, и программа Optimer может обрабатывать только некоторые небольшие олигосахариды. Для более сложных олигосахаридов, которые требуют больше BBLs и несколько проходов одного горшка реакций и фрагмент конденсации, модернизированная версия программного обеспечения, Auto-CHO5, была разработана.
В Auto-CHO, больше чем 50.000 BBLs с определенной реактивностью к архиву BBL были добавлены, включая 154 синтетические и 50.000 фактически одни. Эти BBLs были разработаны машинного обучения на основе основных свойств, рассчитанные ЯМР химических сдвигов6,7,и молекулярные дескрипторы8, которые влияют на структуру и реактивность BBLs. С этой обновленной программой и новым набором доступных BBL, потенциал синтеза расширяется, и, как показано, несколько олигосахаридов интерес может быть быстро подготовлен. Считается, что это новое развитие будет способствовать синтезу олигосахаридов для изучения их роли в различных биологических процессах и их воздействия на структуры и функции гликопротеинов и гликолипидов. Считается также, что эта работа принесет значительную пользу гликонаучному сообществу, учитывая, что этот метод доступен научному сообществу бесплатно. Синтез основных человеческих эмбриональных маркер стволовых клеток, SSEA-45, демонстрируется в этой работе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Манипуляция программным обеспечением Auto-CHO
- Установка среды Java Runtime: убедитесь, что в устройстве установлена среда Java Runtime Environment (JRE). Если JRE был установлен, перейдите к следующему шагу, "программной инициализации"; в противном случае, скачать и установить JRE в соответствии с операционной системой пользователя найти по адресу: lt;https:/www.oracle.com/technetwork/java/javase/downloads/index.html.gt;
- Программное обеспечение инициализации: перейдите на веб-сайт Auto-CHO на lt;https://sites.google.com/view/auto-cho/home'gt; и скачать программное обеспечение в соответствии с операционной системой. В настоящее время Auto-CHO поддерживает Windows, macOS и Ubuntu. Последнее руководство пользователя PDF представлено на веб-сайте Auto-CHO.
- Для пользователей Windows, распаковать Auto-CHO-Windows.zip и дважды нажмите на Auto-CHO.jar в папке Auto-CHO-Windows, чтобы начать программу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователь должен установить unzip программное обеспечение, например, 7-Зип, найденный на lt;https://www.7-zip.org.gt;, для распаковки почтовый файл. Пользователь может также использовать команду Java-jar Auto-CHO.jar для запуска программы командным запросом Windows. - Для пользователей macOS, право езду на Auto-CHO.jar и выбрать Открыть для запуска программы.
- Для пользователей Ubuntu:
- Установите libcanberra-gtk с помощью следующей команды:
$ sudo apt-получить установить libcanberra-gtk - Измените разрешение на доступ авто-CHO-Ubuntu.sh:
$ chmod 755 Авто-ЧО-Убукту.ш - Выполнить программу Auto-CHO:
$ ./Авто-ЧО-Убунту.sh
- Установите libcanberra-gtk с помощью следующей команды:
- Для пользователей Windows, распаковать Auto-CHO-Windows.zip и дважды нажмите на Auto-CHO.jar в папке Auto-CHO-Windows, чтобы начать программу.
- Ввечу желаемую структуру гликанов. Выберите нарисовать структуру гликанов или прочитать существующий файл структуры.
- Вход путем рисования:
- Нажмите на Edit Glycan от GlycanBuilder9,10 (Рисунок 1, btn1; Рисунок 2А) или область Нажмите здесь, чтобы отобразить синтетическую цель, чтобы нарисовать и отсеивать структуру запроса от GlycanBuilder. Информация о связи и хиральности не должна игнорироваться. Нажмите на globo-H, SSEA-4, или OligoLacNAc кнопки(рисунок 1, примеры), чтобы отобразить примеры.
- Выберите файл Экспорт в форматы последовательности Экспорт на GlycoCT, сжатый для сохранения отредактированной структуры (по желанию).
- Закройте диалог GlycanBuilder для завершения редактирования.
- Вход, читая файл:
- Нажмите на Edit Glycan от GlycanBuilder (Рисунок 1, btn1; Рисунок 2А) или область Нажмите здесь, чтобы отобразить синтетическую цель для отправления структуры запроса.
- Выберите файл Импорт из форматов последовательности для выбора файла структуры запроса с соответствующим форматом.
- Вход путем рисования:
- Параметры параметров поиска (необязательно).
- Определите параметры поиска в вкладке"Параметры настройки"(рисунок 1, вкладка 2), чтобы получить разумные результаты поиска.
Примечание:
Порог RRV высокого класса должен быть реальным числом и No0.
Порог RRV среднего класса должен быть реальным числом и No0.
Порог высокого класса RRV должен быть
Номер Фрагмента Макса должен быть целым и No1.
Мин BBL номер в фрагмент должен быть целым числаи и между 1 и 3.
Номер Max BBL в фрагменте должен быть целым числам и между 1 и 3.
Номер Max BBL в фрагменте должен бытьномером Мин BBL в фрагменте.
Мин Донор / Принимая RRV Разница должна быть положительным реальным числом.
Мин Донор / Принимая RRV Соотношение должно быть положительным реальным числом.
Макс Донор / Принимая RRV Коэффициент должен быть положительным реальным числом.
Макс Донор / Принимая RRV Коэффициентдолжен быть - Нажмите на кнопку OK, чтобы включить новые настройки.
- Определите параметры поиска в вкладке"Параметры настройки"(рисунок 1, вкладка 2), чтобы получить разумные результаты поиска.
- Выберите библиотеку строительного блока(рисунок 1,вкладка5). Настройка по умолчанию предназначена только для поиска в экспериментальной библиотеке. Если желательно искать как экспериментальные, так и виртуальные библиотеки, проверьте следующие шаги.
- Выберите вкладку Библиотеки виртуального блока зданий (рисунок 2C, вкладка5). Экспериментальные и виртуальные строительные блоки могут работать вместе, чтобы повысить способность к поиску Auto-CHO. В настоящее время Auto-CHO предоставляет более 50 000 виртуальных строительных блоков с прогнозируемыми RRV в библиотеке.
- Выберите Использование экспериментальных и виртуальных библиотек и применяйте фильтрацию для отображения виртуальных строительных блоков с определенными критериями. Нажмите на кнопку Show Выбранный виртуальный BBL (s) кнопку(Рисунок 2C, btn5), чтобы показать только выбранный виртуальный строительный блок (ы).
- Нажмите на кнопку Show Filtered Virtual BBL (рисунок 2C,btn6), чтобы показать только виртуальные строительные блоки с определенными критериями, определенными пользователем.
- Нажмите на кнопку Показать все виртуальные BBL (s) кнопку(Рисунок 2C, btn7), чтобы показать все доступные виртуальные строительные блоки и сбросить фильтр.
- Проверьте один или несколько желаемых виртуальных строительных блоков, которые пользователь хотел бы использовать для поиска.
- Выберите вкладку «Структура запроса» (рисунок 1,tab1) и нажмите на кнопку Библиотеки поиска здания (рисунок 1, btn2), чтобы найти синтетические решения для структуры запроса. Затем подтвердите параметры параметров.
- Поиск результата просмотра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Результат поиска отображается во вкладке Визуализация результата (рисунок 1, tab6). Уменьшающие конечные приемы различных номеров остатков отображаются в столбце Уменьшенного конечного приемного (рисунок 1,зритель1).- Выберите приемора редуктора, и решения отображаются в списке синтетических решений (рисунок 1, зритель2). Фрагменты отображаются в списке фрагментов (рисунок 1, зритель3), чтобы предложить, сколько фрагментов должно быть использовано в синтезе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Система предоставляет подробную информацию о каждом фрагменте, включая RRV фрагмента, вычислительную доходность, а также о том, какая группа защиты должна быть дезащищена для последующего использования фрагмента в реакции одного горшка. Строительные блоки, используемые для сборки выбранного фрагмента, отображаются в viewer4 на рисунке 1. Зритель5 на рисунке 1 также отображает информацию о подключении фрагмента. - Просмотр и проверка химических структур и подробная информация о выбранных строительных блоков в регионах химической структуры строительного блока и строительного блока браузера, соответственно, для экспериментальных строительных блоков (Рисунок 1,табу4).
- Выберите приемора редуктора, и решения отображаются в списке синтетических решений (рисунок 1, зритель2). Фрагменты отображаются в списке фрагментов (рисунок 1, зритель3), чтобы предложить, сколько фрагментов должно быть использовано в синтезе.
- Вывод результата поиска в текст (необязательно).
- Выберите вкладку «Текст результата» (рисунок 1,табу7).
- Нажмите на Текст Сохранить результат (рисунок 2B,btn4) и выберите пункт назначения текстового файла.
- Обратная связь для виртуальных строительных блоков (необязательно).
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратная связь может быть предоставлена на виртуальных строительных блоков через онлайн-вопросник. Обратная связь может помочь сообществу сохранить полезные виртуальные строительные блоки и удалить неэффективные.- Выберите вкладку Virtual Building Block (рисунок 1,табу5).
- Нажмите на ссылку To rate виртуального строительного блока, которую желательно оценить или прокомментировать в колонке Отзывы.
- Заполните форму обратной связи после того, как система откроет веб-страницу и отправьте ее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не меняйте виртуальный идентификатор BBL.
2. Эксперименты определения RRV
- В 10 мл круглого дна колбу, объединить два тиогликозида доноров (0,02 ммоль каждого: Dr4 является эталонным донором с известными RRV; Dx1 является донорской молекулой неизвестного RRV, абсолютного метанола (0,10 ммоль) и дририта в дихлорметане (DCM, 1,0 мл), затем перемешать при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
- Возьмите аликвот этой смеси (30 л) и введите смесь в высокопроизводительную жидкую хроматографию (HPLC) в трех отдельных инъекциях (10 л для каждой инъекции). Измерьте коэффициент (а) между поглощением(A)и концентрацией донорской молекулыDв условиях разделения исходных линий (эфир ацетат/ n-Hexane 20/80).
- Добавить раствор 0,5 М N-Iodosuccinimide (NIS) в ацетонитриле (40 л, 0,02 ммоль) в реакционную смесь, а затем добавить 0,1 М трифторметанесульфоновой кислоты (TfOH) раствор (20 qL, 0,002 ммоль), и перемешать смесь на RT для 2 ч.
- Разбавить реакционную смесь DCM (4,0 мл), фильтровать и мыть насыщенным ваковым тиосульфатом натрия, содержащим 10% карбоната водорода натрия (2x с объемом 5 мл каждый). Извлекайте свочный слой с DCM (3x с 5 мл). Смешайте весь органический слой, промойте его 5 мл рассола и высушите примерно 200 мг сульфата ангидроусового магния.
- Встряхните смесь мягко в течение 30 с, фильтровать его через воронку с рифленой фильтровальной бумагой для того, чтобы удалить сульфат магния, а затем собрать фильтрвать в 25 мл круглого дна колбу. Удалите растворитель с помощью вращающегося испарителя.
- Растворите остатки в DCM (1,0 мл). Возьмите аликвот этой смеси (30 л) и введите ее в HPLC в трех отдельных инъекциях (10 л для каждой инъекции). Измерьте концентрации остальных доноров(Dxиdref)по HPLC в тех же условиях разделения (эфир ацетат/н-Гексан а 20/80) (Aref)t 24417.0, (Ax)t 23546.3.
- Измерьте относительную реактивность между Dx1 против Dr4, kx1/kr4 0.0932. На основе относительного значения реактивности Dr4,относительное значение реактивности Dx1 составляет 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: a : A /D, (Aref)0 - 74530.1, (Ax)0 и 26143.0. k х/крефюр (ln'Dхх t - ln'Dxх0)/(Ln'Dreft - ln'Dref0) хх t - ln'A xq0)/(Ln'Areft - ln'Aref0) 0.0932.
3. Одногоршковая гликозилация SSEA-4
- Поместите 10 мл кругло-дно колбу под вакуумом, пламя сухой его, и позволяют колба остыть до RT в то же время под вакуумом. Удалите резиновую перегородку, чтобы добавить смесь дисахарида 1 донора (38 мг, 1,1 экв., 0,057 ммоль), первый прием2 (40 мг, 1,0 экв., 0,053 ммоль) и столбик магнитного перемешивания в колбу.
- Перенесите 100 мг порошкообразного молекулярного сито 4 кв. м в колбу с круглым дном 5 мл. Держите эту колбу под вакуумом, пламя сухой его, и позволяют колба остыть до RT в то время как еще под вакуумом. Перенесите свежевысушенные молекулярные сито в первую колбу, содержащую исходный материал.
- Передача 1 мл свежевысушенного DCM в колбу. Перемешать реакционную смесь в течение 1 ч на РТ, а затем поместить ее при температуре -40 градусов по Цельсию. Перенесите NIS (13 мг, 1,1 экв., 0,057 ммоль) в колбу.
- Впрысните TfOH (34 зЛ, 0,3 экв., 0,017 ммоль, 0,5 М в эфире) в колбу через перегородку с помощью микрообъемного шприца при -40 градусов по Цельсию. Держите перемешивания при -40 градусах по Цельсию в течение 3 ч.
- После первого приемного 2 почти потребляется, вводить раствор приемного 3 в DCM в колбу через перегородку.
- Разогрейте реакционную смесь до -20 градусов и перенесите В колбу NIS (19 мг, 1,6 эк., 0,083 ммоль). Введите TfOH (34 л, 0,3 экв., 0,017 ммоль, 0,5 М в эфире) в колбу через перегородку при -20 градусов по Цельсию. Держите перемешивания при -20 градусах по Цельсию в течение 3 ч.
- После того, как продукт первой реакции шага потребляется, утолить реакцию путем введения двух эквивалентов триэтил амина. Удалите молекулярное сито через воронку фильтра, упакованную с Celite, соберите фильтр в колбу с круглым дном 25 мл и промойте фильтр 10 мл DCM.
- Перенесите фильтррат в сепараторную воронку и промойте его насыщенным водным тиосульфатом натрия, содержащим 10% NaHCO3 (2x с 10 мл каждый). Извлекайте свочный слой с DCM (3x с 10 мл). Смешайте органические слои и промойте смесь рассолом (10 мл) и высушите ее, добавив ангидроус MgSO4. Фильтр его и собирать фильтрвать в 100 мл кругло-дно колбы.
- Удалите растворитель с помощью вращающегося испарителя. Растворите сырую смесь примерно с 1 мл DCM и загрузите ее на верхней части кремнеземной кровати. Вылейте продукт со смесью этилового ацетата и толуола (EtOAc/toluene, 1/4 до 1/2) и соберите фракции.
- Удалите растворитель с помощью вращающегося испарителя. Сухие остатки под пониженным давлением, чтобы дать полностью защищены SSEA-4 производных 4 (74 мг, 50% на основе приемного 2) в качестве белой пены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результат поиска Auto-CHO, основанный на параметрах по умолчанию, указывает на то, что SSEA-4 может быть синтезирован реакцией на один горшок. На рисунке 3 показан скриншот программного обеспечения результата поиска SSEA-4. При выборе трисахарида, уменьшающего конечный прием(рисунок 3,метка 1), программа показывает четыре потенциальных решения для запроса. Первое решение имеет один фрагмент(рисунок 3,метка 2), а его расчетная доходность составляет около 94%. Фрагмент может быть синтезирован двумя BBL(рисунок 3,этикетка 3). RRV первого дисахарида BBL составляет 1462, а RRV второго моносахарида составляет 32,0. На этикетке 4 рисунка 3 показана химическая структура первой предложенной BBL, используемой в реакции одного горшка. Эксперимент с одним горшком показывает, что SSEA-4 может быть синтезирован в 43% урожайности этим предложением успешно(рисунок 4),и это также было продемонстрировано в предыдущей работе5. Подробные экспериментальные процедуры и характеристика упомянутых соединений, в частности SSEA-4, можно найти в приведенном справочнике5.
Рисунок 1: Скриншот авто-ЧО. Пользователи могут отоживать структуру гликанов запроса, просматривать экспериментальную и виртуальную информацию о блоке здания и просматривать синтетические решения, предоставляемые программным обеспечением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Частичные скриншоты программного обеспечения Auto-CHO. (A) Нажмите кнопку "Edit Glycan by GlycanBuilder" (btn1) во вкладке "Структура запроса" (tab1) и система всплывает в диалоге GlycanBuilder. (B) Выберите "Результат Текст" (tab7) и нажмите кнопку "Сохранить результат текста" (btn4), чтобы сохранить результаты поиска текста. (C) Выберите "Виртуальная библиотека блока здания" (tab5) и проверьте желаемые виртуальные строительные блоки для поиска путем фильтрации вариантов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Один горшок синтетический план, предоставленный программой Auto-CHO. Этикетка 1: Уменьшение конечных приемов. Этикетка 2: Фрагмент. Этикетка 3: Строительный блок фрагмента. Этикетка 4: Химическая структура выбранного строительного блока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Синтетическая стратегия SSEA-4. SSEA-4 может быть синтезирован тремя единицами, предложенными Auto-CHO: сиаил дисахаридный строительный блок 1 (RRV-1,462), моносахаридный строительный блок 2 (RRV-32.0), и уменьшение конечным приемом 3 (RRV-0). Эта цифра была изменена из нашей предыдущей публикации5 с разрешения (в соответствии с Creative Commons Атрибуция 4.0 Международная лицензия: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Программное обеспечение Auto-CHO было разработано для оказания помощи химикам в продолжении иерархического и программируемого синтеза олигосахаридов5. Auto-CHO был построен на языке программирования Java. Это программное обеспечение GUI и кросс-платформенный, который в настоящее время поддерживает Windows, macOS и Ubuntu. Программное обеспечение можно скачать бесплатно для веб-сайта Auto-CHO по адресу://sites.google.com/view/auto-cho/home-gt; и его исходный код с лицензией MIT можно получить из GitHub по адресу zlt;https://github.com/CW-Wayne/Auto-CHO.gt.
BBL библиотека Auto-CHO содержит 154 экспериментальных BBLs и более 50000 виртуальных BBLs с точно предсказал RRVs. В настоящее время, сахар типов виртуальных BBLs включают Гал, Glc, Человек, GalNAc, GlcNAc, GlcN, GlcN, и GlcA. Все поиски библиотекобрабатываются в локальной машине, и мы не собираем структуру запроса от пользователей. Поскольку Auto-CHO не может гарантировать успех высокодоходного синтеза среди виртуальных BBL, предоставленных программой (из-за многих структурных ограничений или неизвестных факторов в химических реакциях), Auto-CHO предоставляет онлайн-вопросник обратной связи для виртуальных BBLs. Считается, что отзывы пользователей от научного сообщества могут помочь сохранить ценные виртуальные BBLs и устранить неподходящие. Адрес электронной почты предоставляется для технической помощи в руководстве пользователя программного обеспечения. Пользователи могут связаться с этим адресом, если у них возникли технические вопросы или проблемы.
Здесь представлены две стратегии поиска. Для параметров (раздел 1.4) предлагается установить параметры с более строгими критериями в начале. Если Auto-CHO не возвращает удовлетворенные синтетические решения, рекомендуется использовать более гибкие параметры в следующем поисковом запуске. Для выбора библиотеки BBL (раздел 1.5) предлагается искать в экспериментальной библиотеке только на первый взгляд. Если программное обеспечение не возвращает подходящее решение, рекомендуется искать экспериментальные и виртуальные библиотеки в следующих итерациях.
Таким образом, этот протокол демонстрирует работу программного обеспечения Auto-CHO и использование Auto-CHO для синтеза одного горшка молекулы SSEA-4. Кроме того, описан программируемый протокол одного горшка. Auto-CHO является графическим интерфейсом и с открытым исходным кодом программного обеспечения с библиотекой включает в себя проверенные и виртуальные BBLs, и он поддерживает иерархический один горшок синтез алигосахаридов. Считается, что это программное обеспечение может принести пользу научному сообществу и более важные олигосахариды могут быть синтезированы одним горшок реакции через Auto-CHO для дальнейших исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Академией Sinica в том числе Программы Встречи на высшем уровне, Министерство науки и техники "MOST 104-0210-01-09-02, MOST 105-0210-01-13-01, MOST 106-0210-01-15-02" и NSF (1664283).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 75-05-8 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 75-09-2 | |
| Drierite | Sigma-Aldrich | 7778-18-9 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 141-78-6 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 67-56-1 | |
| Molecular sieves 4 Å | Sigma-Aldrich | ||
| n-Hexane | Sigma-Aldrich | 110-54-3 | |
| N-Iodosuccinimide | Sigma-Aldrich | 516-12-1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich | 10102-17-7 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 108-88-3 | |
| Trifluoromethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | 1493-13-6 |
References
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochimica Et Biophysica Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Sears, P., Wong, C. -H. Toward Automated Synthesis of Oligosaccharides and Glycoproteins. Science. 291 (5512), 2344-2350 (2001).
- Kulkarni, S. S., et al. “One-Pot” Protection, Glycosylation, and Protection-Glycosylation Strategies of Carbohydrates. Chemical Reviews. 118 (17), 8025-8104 (2018).
- Zhang, Z., et al. Programmable One-Pot Oligosaccharide Synthesis. Journal of the American Chemical Society. 121 (4), 734-753 (1999).
- Cheng, C. -W., et al. Hierarchical and programmable one-pot synthesis of oligosaccharides. Nature Communications. 9 (1), 5202 (2018).
- ChemDraw. , PerkinElmer Informatics. (2019).
- Cheeseman, J. R., Frisch, Æ Predicting magnetic properties with chemdraw and gaussian. , (2000).
- Yap, C. W. PaDEL-descriptor: An open source software to calculate molecular descriptors and fingerprints. Journal of Computational Chemistry. 32 (7), 1466-1474 (2011).
- Ceroni, A., Dell, A., Haslam, S. M. The GlycanBuilder: a fast, intuitive and flexible software tool for building and displaying glycan structures. Source Code for Biology and Medicine. 2, 3 (2007).
- Damerell, D., et al. The GlycanBuilder and GlycoWorkbench glycoinformatics tools: updates and new developments. Biological Chemistry. 393 (11), 1357-1362 (2012).
