Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Hiyerarşik ve Programlanabilir Tek Pot Oligosakkarit Sentezi

Published: September 6, 2019 doi: 10.3791/59987

Summary

Bu protokol, oligosakkaritlerin hiyerarşik ve programlanabilir tek pot sentezi için Auto-CHO yazılımının nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca RRV tayini deneyleri ve SSEA-4'ün tek potlu glikozilasyonunun genel prosedürünü açıklar.

Abstract

Bu makalede, programlanabilir tek pot oligosakkarit sentezi için genel bir deneysel protokol sunar ve potansiyel sentetik çözümler üretmek için Auto-CHO yazılımının nasıl kullanılacağını göstermektedir. Programlanabilir tek-pot oligosakkarit sentezi yaklaşımı, nispi reaktivite değerlerinin (RRV) uygun sıralı sıralı sıralı tiyoglikozid yapı taşları (BBLs) kullanarak büyük miktarlarda hızlı oligosakkarit sentezini güçlendirmek için tasarlanmıştır. Auto-CHO bir BBL kütüphane (yaklaşık 150 doğrulanmış ve >50.000 sanal BBLs içeren) arayarak programlanabilir tek pot oligosakkarit sentezi için olası sentetik çözümler sağlayan bir grafik kullanıcı arayüzü ile çapraz platform yazılımıdır destek vektör regresyonu ile DOĞRU tahmin RRVs. Hiyerarşik tek pot sentezi algoritması Auto-CHO'da uygulanmıştır ve yeni BBL'ler olarak tek pot reaksiyonları tarafından oluşturulan parçaları kullanır. Buna ek olarak, Auto-CHO kullanıcıların daha fazla kullanım için değerli olanları tutmak için sanal BBLs için geribildirim vermek için izin verir. Bu çalışmada, pluripotent bir insan embriyonik kök hücre belirteci olan evrespesifik embriyonik antijen 4'ün (SSEA-4) tek pot sentezi gösterilmiştir.

Introduction

Karbonhidratlardoğadaher yerde 1,2, ama onların varlığı ve eylem modu keşfedilmemiş bir bölge kalır, moleküllerin bu sınıfa zor erişim esas nedeniyle3. Oligopeptidler ve oligonükleotidlerin otomatik sentezinden farklı olarak, oligosakkaritlerin otomatik sentezinin gelişimi zorlu bir görev olmaya devam etmektedir ve ilerleme nispeten yavaş olmuştur.

Bu sorunu çözmek için, Wong ve ark optimer4adlı programlanabilir bir yazılım programı kullanarak oligosakkaritlerin sentezi için ilk otomatik yöntemi geliştirdi , sıralı bir pot için ~ 50 BBLs bir kütüphaneden BBLs seçimi kılavuzları Reaksiyon. Her BBL, çeşitli koruma grupları tarafından ayarlanmış iyi tanımlanmış reaktivite ile tasarlanmış ve sentezlenmiştir. Bu yaklaşım la, otomatik sentez gelişiminde aşılması en zor sorunlar olarak kabul edilen sentez sırasında manipülasyon ve ara saflaştırmayı korumanın karmaşıklığı en aza indirilebilir. Bu ilerlemeye rağmen, yöntem hala oldukça sınırlıdır, BBLs sayısı çok küçük ve Optimer programı sadece bazı küçük oligosakkaritler işleyebilir gibi. Daha fazla BBLs ve tek pot reaksiyonları ve parça yoğuşma birden fazla geçer gerektiren daha karmaşık oligosakkaritler için, yazılım programının yükseltilmiş bir sürümü, Auto-CHO5, geliştirilmiştir.

Auto-CHO'da, BBL kütüphanesine tanımlanmış reaktiviteye sahip 50.000'den fazla BBL eklendi, 154 sentetik ve 50.000 sanal kitap da dahil olmak üzere. Bu BBLs temel özelliklerine dayalı makine öğrenimi tarafından tasarlanmıştır, hesaplanan NMR kimyasal vardiya6,7, ve moleküler tanımlayıcılar8, BbLs yapısını ve reaktivitesini etkileyen. Bu yükseltilmiş program ve mevcut BBLs yeni set ile, sentez kapasitesi genişletilir, ve gösterildiği gibi, ilgi çeşitli oligosakkaritler hızla hazırlanabilir. Bu yeni gelişmenin çeşitli biyolojik süreçlerdeki rollerinin ve bunların glikoproteinler ve glikolipidlerin yapıları ve işlevleri üzerindeki etkilerinin incelenmesi için oligosakkaritsentezini kolaylaştıracağına inanılmaktadır. Ayrıca bu yöntemin araştırma topluluğuna ücretsiz olarak sunulduğu göz önüne alındığında, bu çalışmanın glikobilim topluluğuna önemli ölçüde fayda sağlayacağı düşünülmektedir. Temel insan embriyonik kök hücre belirteci sentezi, SSEA-45, Bu çalışmada gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Auto-CHO yazılım manipülasyonu

  1. Java Runtime Environment yükleme: Java Runtime Environment (JRE) aygıta yüklü olduğundan emin olun. JRE yüklendiyse, bir sonraki adıma geçin: "yazılım başlatma"; aksi takdirde JRE'yi kullanıcının işletim sistemine göre indirin ve kurun: .
  2. Yazılım başlatma: adresindeki Auto-CHO web sitesine gidin ve işletim sistemine göre yazılımı indirin. Şu anda, Auto-CHO Windows, macOS ve Ubuntu'ları destekler. En son PDF kullanım kılavuzu Auto-CHO web sitesinde sağlanmaktadır.
    1. Windows kullanıcıları için, Otomatik-CHO_Windows.zip'in zip'ini açın ve programı başlatmak için Otomatik CHO_Windows klasöründeki Auto-CHO.jar'a çift tıklayın.
      NOT: Kullanıcının zip dosyasını açmak için adresinde bulunan 7-Zip gibi zip olmayan yazılımlar yüklemesi gerekir. Kullanıcı ayrıca Programı Windows Komut Komut Ustem komutu yla başlatmak için java -jar Auto-CHO.jar komutunu da kullanabilir.
    2. macOS kullanıcıları için Auto-CHO.jar'a sağ tıklayın ve programı başlatmak için Aç'ı seçin.
    3. Ubuntu kullanıcıları için:
      1. Aşağıdaki komutu kullanarak libcanberra-gtk yükleyin:
        $ sudo apt-get yüklemek libcanberra-gtk*
      2. Auto-CHO_Ubuntu.sherişim iznini değiştirin:
        $ chmod 755 Otomatik CHO_Ubuntu.sh
      3. Auto-CHO programını çalıştırın:
        $ ./Otomatik-CHO_Ubuntu.sh
  3. İstediğiniz glikan yapısını girdi. Glikan yapısı çizmeyi veya varolan bir yapı dosyasını okumayı seçin.
    1. Çizim yaparak giriş:
      1. GlycanBuilder9,10 tarafından Glikan Edittıklayın (Şekil 1, btn1; Şekil 2A) veya GlycanBuilder tarafından sorgu yapısını çizmek ve düzenlemek için Sentetik Hedefi Düzenlemek için Buraya Tıklayın alanı. Bağlantı ve chirality bilgileri göz ardı edilmemelidir. Örnekleri görüntülemek için Globo-H, SSEA-4veya OligoLacNAc düğmelerine(Şekil 1, örnekler) tıklayın.
      2. Dosya Yı Seçin | Sıra biçimlerine dışa aktarma | Düzenlenen yapıyı kaydetmek için yoğunlaştırılmış GlikoCT'a export (isteğe bağlı).
      3. Düzenlemeyi tamamlamak için GlycanBuilder iletişim kutusunu kapatın.
    2. Bir dosyayı okuyarak giriş:
      1. GlycanBuilder tarafından Glikan Edit tıklayın (Şekil 1, btn1; Şekil 2A) veya sorgu yapısını yeniden yapılandırmak için Sentetik Hedefi Yeniden Yapılandırmak Için Buraya Tıklayın.
      2. Dosya Yı Seçin | Karşılık gelen biçime sahip sorgu yapısı dosyasını seçmek için sıra biçimlerinden içe aktarın.
  4. Arama parametresi ayarları (isteğe bağlı).
    1. Makul arama sonuçlarını almak için "Parametre Ayarları" sekmesinde(Şekil 1, sek2) arama parametrelerini tanımlayın.
      Not:
      Yüksek Sınıf RRV eşiği gerçek sayı ve ≥0 olmalıdır.
      Orta Sınıf RRV eşiği gerçek sayı ve ≥0 olmalıdır.
      Yüksek Sınıf RRV eşiği >Orta Sınıf RRV eşiğiolmalıdır.
      Max Parça Numarası bir tümseci ve ≥1 olmalıdır.
      Parçadaki Min BBL Numarası bir tamsayı ve 1 ile 3 arasında olmalıdır.
      Parçadaki Max BBL Numarası bir tamsayı ve 1 ile 3 arasında olmalıdır.
      Parçadaki Max BBL Numarası , Parçadaki ≥Min BBL Numarasıolmalıdır.
      Min Donör/Kabul örnebilen RRV Farkı pozitif bir gerçek sayı olmalıdır.
      Min Donör/Kabul ÖRer RRV Oranı pozitif bir gerçek sayı olmalıdır.
      Max Donör/Kabul Örnek RRV Oranı pozitif bir gerçek sayı olmalıdır.
      Max Donör/Kabul Etme RRV Oranı >Min Donör/Kabul Örnek RRV Oranıolmalıdır.
    2. Yeni ayarları etkinleştirmek için Tamam düğmesine tıklayın.
  5. Yapı taşı kitaplığını seçin(Şekil 1, sek5). Varsayılan ayar yalnızca deneme kitaplığı aramaktır. Hem deneysel hem de sanal kitaplıkları aramak isteniyorsa, aşağıdaki adımları kontrol edin.
    1. Sanal Yapı Bloğu Kitaplığı sekmesini seçin(Şekil 2C, sek5). Deneysel ve sanal yapı taşları Auto-CHO arama yeteneğini geliştirmek için birlikte çalışabilir. Şu anda, Auto-CHO kütüphanede tahmin RRVs ile 50.000'den fazla sanal yapı taşları sağlar.
    2. Deneysel ve Sanal Kitaplıkları Kullan'ı seçin ve belirli ölçütlerle sanal yapı taşlarını görüntülemek için Filtreleme uygulayın. Yalnızca seçilen sanal yapı taşı(lar) göstermek için Seçilen Sanal BBL(ler) düğmesini(Şekil 2C, btn5) tıklatın.
    3. Kullanıcı tarafından tanımlanan belirli kriterlere sahip sanal yapı taşlarını göstermek için Filtrelenmiş Sanal BBL(ler) düğmesini(Şekil 2C, btn6) tıklayın.
    4. Tüm sanal yapı taşlarını göstermek ve filtreyi sıfırlamak için Tüm Sanal BBL(ler) düğmesini(Şekil 2C, btn7) tıklatın.
    5. Kullanıcının arama yapmak için kullanmak istediği bir veya birden çok istenen sanal yapı taşLarını denetleyin.
  6. Sorgu yapısı için tek pot sentetik çözümleri bulmak için Sorgu Yapısı sekmesini(Şekil 1, sek1) seçin ve Arama Yapı Bloğu Kitaplığı düğmesine(Şekil 1, btn2) tıklayın. Ardından, parametre ayarlarını onaylayın.
  7. Sonuç görüntüleyicisini arayın.
    NOT: Arama sonucu Sonuç Görselleştirme sekmesinde gösterilir (Şekil 1, sek6). Farklı kalıntı numaralarının azaltıcı uç kabul leyicileri Azaltma Sonu Kabul Leyici sütununda görüntülenir(Şekil 1, görüntüleyici1).
    1. Bir azaltma sonu kabul leyici seçin ve çözümler Sentetik Çözüm Listesinde görüntülenir(Şekil 1, görüntüleyici2). Parçalar, sentezde kaç parça kullanılması gerektiğini önermek için Parça Listesi'nde (Şekil 1, görüntüleyici3) gösterilir.
      NOT: Sistem, parçanın RRV'si, hesaplamalı verim ve tek pot reaksiyonunda parçanın sonraki kullanımı için hangi koruma grubunun korunması gerektiği de dahil olmak üzere her parçahakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Seçilen parçayı birleştirmek için kullanılan yapı taşları Şekil 1'ingörüntüleyici4'ünde gösterilmiştir. Şekil 1'in görüntüleyici5'i de parça bağlantı bilgilerini görüntüler.
    2. Deneysel yapı taşları için sırasıyla Yapı Taşı ve Yapı Bloğu TarayıcısınınKimyasal Yapısı bölgelerinde seçilen yapı yapılarının ve seçilen yapı taşlarının görüntülenme ve kontrol 1, sekme4).
  8. Arama sonucunu metne (isteğe bağlı) çıktın.
    1. Sonuç Metni sekmesini seçin (Şekil 1, sek7).
    2. Sonuç Metnini Kaydet'e (Şekil 2B, btn4) tıklayın ve metin dosyası hedefini seçin.
  9. Sanal yapı taşları için geri bildirim (isteğe bağlı).
    NOT: Çevrimiçi anket aracılığıyla sanal yapı taşları hakkında geri bildirim verilebilir. Geri bildirim, topluluğun yararlı sanal yapı taşlarını saklamasına ve etkisiz yapı taşlarını kaldırmasına yardımcı olabilir.
    1. Sanal Yapı Bloğu sekmesini seçin(Şekil 1, sek5).
    2. Geri Bildirim sütununda derecelendirimi veya yorum yapmak istediği sanal yapı bloğunun To rate bağlantısını tıklayın.
    3. Sistem bir web sayfası açtıktan sonra geri bildirim formunu doldurun ve gönderin.
      NOT: Sanal BBL Kimliğini değiştirmeyin.

2. RRV tayini deneyleri

  1. 10 mL yuvarlak alt şişede, iki tiyoglikozid donörü (her biri 0,02 mmol) birleştirin: Dr4 bilinen RRV ile referans donördür; Dx1 bilinmeyen RRV donör molekülü, mutlak metanol (0.10 mmol) ve Drierite diklorotan (DCM, 1.0 mL), sonra oda sıcaklığında karıştırın (RT) için 1 saat.
  2. Bu karışımın bir aliquot alın (30 μL) ve yüksek performanslı sıvı kromatografi içine karışımı enjekte (HPLC) üç ayrı enjeksiyon (her enjeksiyon için 10 μL). Emilim(A)ile donör molekülün konsantrasyonu[D]arasındaki katsayıyı temel ayırma koşulları (eter asetat/n-Heksane = 20/80) altında ölçün.
  3. Reaksiyon karışımına asetonitile (40 μL, 0,02 mmol) 0,5 M N-Iyodosuccinimid (NIS) çözeltisi ekleyin ve ardından 0,1 M trifloromethanesulfonik asit (TfOH) çözeltisi (20 μL, 0,002 mmol) ekleyin ve karışımı RT'de 2 saat karıştırın.
  4. Reaksiyon karışımını DCM (4,0 mL), filtre ve %10 sodyum hidrojen karbonat içeren doymuş sulu sodyum tiyosülfat (her biri 5 mL hacimli 2 x) ile seyreltin. Sulu katmanı DCM (5 mL ile 3x) ayıklayın. Tüm organik tabakayı birleştirin, 5 mL salamura ile yıkayın ve yaklaşık 200 mg susuz magnezyum sülfat ile kurulayın.
  5. Karışımı 30 s'lik hafifçe çalkalayın, magnezyum sülfatı çıkarmak için yivli filtre kağıdı ile bir huniden geçirin, ardından 25 mL'lik yuvarlak alt şişede filtrat toplayın. Bir döner evaporatör kullanarak çözücü çıkarın.
  6. Kalıntıyı DCM'de (1,0 mL) çözün. Bu karışımın bir aliquot alın (30 ° L) ve üç ayrı enjeksiyon (her enjeksiyon için 10 ° L) HPLC içine enjekte. Aynı ayırma koşulları altında HPLC tarafından kalan donörlerin ([Dx] ve [Dref]) konsantrasyonlarını ölçün (eter asetat/n-Heksane = 20/80) (Aref)t = 24417.0, (Ax)t = 23546.3.
  7. Dx1 ile Dr4arasındaki göreli reaktiviteyi ölçün , kx1/kr4 = 0,0932. Dr4'üngöreli reaktivite değerine göre Dx1'in göreli reaktivite değeri 3'tür.
    NOT: a = A/[D], (Aref)0 = 74530.1, (Ax)0 = 26143.0. k x/kref = (ln[D]t - ln[Dx]0)/(ln[Dref]t - ln[Dref]0) = (ln[A] x]t - ln[Ax]0)/(ln[Aref]t - ln[Aref]0) = 0,0932.

3. SSEA-4 tek pot glikozilasyon

  1. Vakum un altına 10 mL yuvarlak alt şişe yerleştirin, alev leretinve vakum altındayken şişenin RT'ye soğumasını bekleyin. Disaccharide 1 donör (38 mg, 1.1 eq., 0.057 mmol), ilk kabul eden 2 (40 mg, 1.0 eq., 0.053 mmol) ve şişe içine teflon kaplı manyetik karıştırma çubuğu karışımı eklemek için kauçuk septum çıkarın.
  2. 100 mg toz moleküler elek 4 Å'ı 5 mL yuvarlak alt şişeye aktarın. Bu şişeyi vakum altında tutun, alev lekurutun ve vakum altındayken şişenin RT'ye soğumasını bekleyin. Taze kurutulmuş 4 Å moleküler elekleri başlangıç materyalini içeren ilk şişeye aktarın.
  3. 1 mL taze kurutulmuş DCM'yi şişeye aktarın. Reaksiyon karışımını RT'de 1 saat karıştırın ve -40 °C sıcaklık altına yerleştirin. NIS'yi (13 mg, 1.1 eq., 0.057 mmol) şişeye aktarın.
  4. -40 °C'de mikro hacimli bir şırınga kullanarak septumdan şişeye TfOH (34°L, 0,3 eq., 0,017 mmol, 0,5 M eter enjekte edin). -40 °C'de 3 saat karıştırmaya devam edin.
  5. İlk kabul eden 2 neredeyse tüketildikten sonra, DCM'deki acceptor 3 çözeltisini septum aracılığıyla şişeye enjekte edin.
  6. Reaksiyon karışımını -20 °C'ye kadar ısıtın ve NIS'yi (19 mg, 1.6 eq., 0.083 mmol) şişeye aktarın. -20 °C'deki septumdan şişeye TfOH (34°L, 0.3 eq., 0.017 mmol, eter içinde 0.5 M) enjekte edin. -20 °C'de 3 saat karıştırmaya devam edin.
  7. İlk adım reaksiyonunun ürünü tüketildikten sonra, iki eşdeğer trietil amin enjekte ederek reaksiyonu söndürün. Celite ile dolu bir filtre hunisi ile moleküler elek çıkarın, 25 mL yuvarlak alt şişe içine filtrat toplamak ve daha dcm 10 mL ile filtre yıkayın.
  8. Filtrasyonu ayırıcı bir huniye aktarın ve %10 NaHCO3 (her biri 10 mL ile 2 x) içeren doymuş sulu sodyum tiyosülfat ile yıkayın. Sulu katmanı DCM (10 mL ile 3x) ayıklayın. Organik katmanları birleştirin ve salamura (10 mL) ile karışımı yıkayın ve susuz MgSO4ekleyerek kurulayın. Filtre ve 100 mL yuvarlak alt şişede filtrat toplamak.
  9. Bir döner evaporatör kullanarak çözücü çıkarın. Ham karışımı yaklaşık 1 mL DCM ile eritin ve silika yatağının üzerine yükleyin. Etil asetat ve toluen (EtOAc/toluen, 1/4 ila 1/2) karışımı ile ürünü elute ve kesirleri toplamak.
  10. Bir döner evaporatör kullanarak çözücü çıkarın. Tam korumalı SSEA-4 türevi 4 (74 mg, %50 kabul eden 2'ye dayalı) beyaz köpük vermek için azaltılmış basınç altında kalıntıyı kurutun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Varsayılan parametre ayarlarına dayalı Otomatik CHO arama sonucu, SSEA-4'ün [2 + 1 + 3] tek pot reaksiyonu yla sentezlenebildiği anlamına getirir. Şekil 3, SSEA-4 arama sonucunun yazılım ekran görüntüsünü gösterir. Trisakkarit azaltıcı son alıcı seçildiğinde(Şekil 3, etiket 1), program sorgu için dört olası çözüm gösterir. İlk çözeltinin bir parçası vardır(Şekil 3, etiket 2), ve hesaplanan verimi yaklaşık %94'tür. Parça iki BBL sinder olabilir(Şekil 3, etiket 3). İlk disaccharide BBL'nin RRV'si 1462, ikinci monosakkaritin RRV'si 32.0'dır. Şekil 3'ün 4 numaralı etiketi, tek pot reaksiyonunda kullanılan ilk önerilen BBL'nin kimyasal yapısını göstermektedir. Tek pot deneysi, SSEA-4'ün bu öneri ile %43 verimde sentezlenebildiği(Şekil 4)ve önceki çalışmada da gösterilmiş olduğunu göstermektedir5. Detay deneysel prosedürler ve bahsedilen bileşiklerin karakterizasyonu, özellikle SSEA-4 atıf referans5bulunabilir .

Figure 1
Şekil 1: Auto-CHO ekran görüntüsü. Kullanıcılar glikan yapısını sorgulayabilir, deneysel ve sanal yapı taşı bilgilerine göz atabilir ve yazılım tarafından sağlanan tek potsentetik çözümleri görüntüleyebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Auto-CHO yazılımının kısmi ekran görüntüleri. (A) "Sorgu Yapısı" sekmesinde (sek1) "GlycanBuilder tarafından Glikan düzenle" düğmesine (btn1) tıklayın ve sistem GlycanBuilder iletişim kutusunu açar. (B) Metin arama sonuçlarını kaydetmek için "Sonuç Metni"ni (sek7) seçin ve "Sonuç Metnini Kaydet" (btn4) seçeneğini tıklayın. (C) "Sanal Yapı Bloğu Kitaplığı" (sek5) seçeneğini belirleyin ve filtreleme seçenekleriyle arama yapmak için istenen sanal yapı taşlarını kontrol edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Auto-CHO programı tarafından verilen tek pot sentetik plan. Etiket 1: Son kabul edileni azaltır. Etiket 2: Parça. Etiket 3: Parçanın yapı bloğu. Etiket 4: Seçilen yapı taşının kimyasal yapısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: SSEA-4 için [2 + 1 + 3] tek pot sentetik strateji. SSEA-4 Auto-CHO tarafından önerilen üç birim tarafından sentezlenebilir: sialyl disaccharide yapı bloğu 1 (RRV=1,462), monosakkarit yapı bloğu 2 (RRV=32.0) ve son kabul eden 3 (RRV=0) azaltArak. Bu rakam önceki yayınımız5'ten izinli olarak değiştirilmiştir (Creative Commons Attribution 4.0 International License: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ altında). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Auto-CHO yazılımı oligosakkaritler hiyerarşik ve programlanabilir bir pot sentezi devam etmek için kimyagerler yardımcı olmak için geliştirilmiştir5. Auto-CHO Java programlama dili tarafından inşa edilmiştir. Şu anda Windows, macOS ve Ubuntu'yı destekleyen bir GUI yazılımı ve çapraz platformudur. Yazılım Otomatik CHO web sitesi için ücretsiz olarak indirilebilir , ve MIT lisansı ile kaynak kodu github erişilebilir .

Auto-CHO BBL kütüphane içerir 154 deneysel BBLs ve doğru tahmin RRVs ile 50.000'den fazla sanal BBLs. Şu anda, sanal BBLs şeker türleri Gal, GlcNAc, GlcNAc, GlcN ve GlcA içerir. Tüm kitaplık aramaları yerel makinede işlenir ve kullanıcılardan herhangi bir sorgu yapısı toplamayız. Auto-CHO program tarafından verilen sanal BBLs arasında yüksek verim sentezinin başarısını garanti edemez beri (birçok yapısal kısıtlamalar veya kimyasal reaksiyonlar bilinmeyen faktörler nedeniyle), Auto-CHO sanal BBLs için online geri bildirim anketi sağlar. Bu araştırma topluluğundan kullanıcı geribildirim değerli sanal BBLs tutmak ve uygun olmayan olanları ortadan kaldırmak yardımcı olabilir inanılıyor. Yazılım kullanım kılavuzunda teknik yardım için bir e-posta adresi sağlanır. Kullanıcılar teknik sorular veya sorunlarla karşılaştıklarında bu adrese başvurabilirler.

Burada iki arama stratejileri sağlanmaktadır. Parametre ayarları (bölüm 1.4) için, başlangıçta daha katı ölçütlerle parametrelerin ayarlatınız önerilir. Auto-CHO memnun sentetik çözümler döndürmezse, bir sonraki arama çalışmasında daha esnek parametreler kullanılması önerilir. BBL kitaplığı seçimi (bölüm 1.5), yalnızca ilk başta deneysel kitaplığın aranması önerilir. Yazılım uygun bir çözüm döndürmezse, aşağıdaki yinelemelerde deneysel ve sanal kitaplıklarda arama yapmaları önerilir.

Özetle, bu protokol Auto-CHO yazılımının çalışmasını ve SSEA-4 molekülünün bir pot sentezi için Auto-CHO kullanımını göstermektedir. Buna ek olarak, programlanabilir tek pot protokolü açıklanmıştır. Auto-CHO GUI ve kütüphane ile açık kaynak yazılım doğrulanmış ve sanal BBLs içerir ve oligosakkaritlerin hiyerarşik bir-pot sentezini destekler. Bu yazılım araştırma topluluk ve daha temel oligosakkaritler daha fazla araştırma için Auto-CHO ile tek pot reaksiyonlar tarafından sentezlenebilir yararlanabilir inanılıyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Zirve Programı, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı [MOST 104-0210-01-09-02, MOST 105-0210-01-13-01, MOST 106-0210-01-15-02] ve NSF (1664283) dahil olmak üzere Akademi Sinica tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Sigma-Aldrich 75-05-8
Anhydrous magnesium sulfate Sigma-Aldrich 7487-88-9
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Dichloromethane Sigma-Aldrich 75-09-2
Drierite Sigma-Aldrich 7778-18-9
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 141-78-6
Methanol Sigma-Aldrich 67-56-1
Molecular sieves 4 Å Sigma-Aldrich
n-Hexane Sigma-Aldrich 110-54-3
N-Iodosuccinimide Sigma-Aldrich 516-12-1
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich 144-55-8
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 10102-17-7
Toluene Sigma-Aldrich 108-88-3
Trifluoromethanesulfonic acid Sigma-Aldrich 1493-13-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochimica Et Biophysica Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  2. Sears, P., Wong, C. -H. Toward Automated Synthesis of Oligosaccharides and Glycoproteins. Science. 291 (5512), 2344-2350 (2001).
  3. Kulkarni, S. S., et al. “One-Pot” Protection, Glycosylation, and Protection-Glycosylation Strategies of Carbohydrates. Chemical Reviews. 118 (17), 8025-8104 (2018).
  4. Zhang, Z., et al. Programmable One-Pot Oligosaccharide Synthesis. Journal of the American Chemical Society. 121 (4), 734-753 (1999).
  5. Cheng, C. -W., et al. Hierarchical and programmable one-pot synthesis of oligosaccharides. Nature Communications. 9 (1), 5202 (2018).
  6. ChemDraw. , PerkinElmer Informatics. (2019).
  7. Cheeseman, J. R., Frisch, Æ Predicting magnetic properties with chemdraw and gaussian. , (2000).
  8. Yap, C. W. PaDEL-descriptor: An open source software to calculate molecular descriptors and fingerprints. Journal of Computational Chemistry. 32 (7), 1466-1474 (2011).
  9. Ceroni, A., Dell, A., Haslam, S. M. The GlycanBuilder: a fast, intuitive and flexible software tool for building and displaying glycan structures. Source Code for Biology and Medicine. 2, 3 (2007).
  10. Damerell, D., et al. The GlycanBuilder and GlycoWorkbench glycoinformatics tools: updates and new developments. Biological Chemistry. 393 (11), 1357-1362 (2012).

Tags

Kimya Sayı 151
Hiyerarşik ve Programlanabilir Tek Pot Oligosakkarit Sentezi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. W., Zhou, Y., Pan, W. H.,More

Cheng, C. W., Zhou, Y., Pan, W. H., Dey, S., Wu, C. Y., Hsu, W. L., Wong, C. H. Hierarchical and Programmable One-Pot Oligosaccharide Synthesis. J. Vis. Exp. (151), e59987, doi:10.3791/59987 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter