Summary
この方法は、細胞接着の初期ダイナミクスを定量化し、アンカレッジ依存性細胞をフィブロネクチンに広めるのに有用である。さらに、このアッセイは、細胞拡散および/または細胞接着関連細胞内シグナル伝達経路に対する改変された酸化還元恒常性の影響を調製するために使用することができる。
Abstract
細胞外マトリックス(ECM)への細胞の接着と広がりは、組織の発達および成人組織の恒常性のために不可欠な細胞プロセスである。興味深いことに、酸化ストレスはこれらのプロセスを変え、転移性癌などの疾患の病態生理学に寄与する。したがって、レドックス状態の摂動中に細胞がECM上でどのように付着し、広がるかを理解することは、正常および疾患状態に関する洞察を提供することができる。以下に説明するステップワイズプロトコルは、免疫蛍光ベースのアッセイを利用して、インビトロでのフィブロネクチン(FN)上の不死化線維芽細胞の細胞接着および広がりを特異的に定量する。簡単に言えば、アンカレッジ依存細胞は懸濁液中に保持され、酸化ストレスを誘発するためにATMキナーゼ阻害剤Ku55933に曝露される。その後、細胞をFNコーティング面にめっきし、所定の期間付着させた。付着したままの細胞は、接着の蛍光ベースの抗体マーカー(例えば、パクシリン)および広がり(例えば、F-アクチン)で固定され、標識される。データの取得と分析は、エピ蛍光顕微鏡や自由に入手可能なフィジーソフトウェアを含む一般的に利用可能な実験装置を使用して行われます。この手順は非常に汎用性が高く、様々な細胞株、ECMタンパク質、または阻害剤に対して改変して、幅広い生物学的疑問を調べることができます。
Introduction
細胞マトリックス接着(すなわち、焦点接着)は、細胞の接着および広がりを媒通する大きく、動的な多分子タンパク質複合体である。これらのプロセスは、組織の発達、維持、および生理機能に不可欠です。焦点接着は、インテグリンなどの膜結合受容体と、細胞骨格アクチンを細胞外マトリックス(ECM)1にリンクする足場タンパク質で構成される。これらの複合体は、様々なシグナル伝達伝達経路の活性化を通じて細胞外環境に存在する生理学的手がかりに応答することができる。したがって、焦点接着は、指向性移行、細胞周期調節、分化、および生存1、2を含む多くの細胞プロセスに細胞外機械的手掛かりを伝播するシグナル伝達センターとして機能する。焦点接着を調節し、相互作用するシグナル伝達分子の1つのグループは、小さなGTPasesのRhoファミリーのメンバーを含みます。Rho GTPasesは、その特定の時空間活性化3を介して細胞移動および接着力力学を調節する主要なタンパク質である。当然のことながら、Rhoタンパク質機能の調節不全は、転移、血管新生、および他の人の病理学の数に関与している。特に興味深いのは、細胞還元状態が細胞移動および接着の調節において主な役割を果たす。活性酸素種(ROS)の増加などの酸化還元恒常性の変化は、Rhoタンパク質活性、ならびに接着性を調節することが実証されており、多くの細胞型およびヒト疾患4、5、6 、7、8.例えば、DNA損傷修復セリン/スレオニンキナーゼA-T変異(ATM)の変異によって引き起こされる神経障害運動失調性毛症-毛器形成症(A-T)に苦しむ個人は、転移性癌9のリスクが高い。 10.これらの患者および細胞株におけるATMキナーゼ活性の喪失は、遺伝的変異または化学阻害のいずれかを通じて、ペントースリン酸経路の機能不全による高レベルの酸化ストレスをもたらす7,11、 12.さらに、研究室からの最近の研究は、細胞骨格ダイナミクス(すなわち接着および広がり)をインビトロ5で活性化した直接的な結果として、A-TにおけるROSの病態生理学的役割を強調している。最終的に、Rhoファミリー活性化によって引き起こされる細胞骨格ダイナミクスのこれらの変化は、A-T患者5、13に記載された転移癌のリスクの増加につながる可能性がある。したがって、酸化ストレス中の細胞マトリックス相互作用の相互作用を理解することは、接着と広がりの調節に関する洞察を提供することができる。これらの研究はまた、これらのシグナル伝達プロセスにおけるRhoファミリーGTPasesの可能な役割に関するさらなる調査の段階を設定することができます。
ここに記載されているのは、ATMキナーゼ活性の阻害によって引き起こされる酸化ストレス中の接着アセンブリおよび広がりの初期細胞ダイナミクスを研究するためのプロトコルである。このアッセイは、ECMタンパク質フィブロネクチン(FN)へのアンカレッジ依存性細胞の接着の十分に特徴付けられたメカニズムに基づいている。懸濁液中で維持された細胞がFN上にメッキされると、いくつかのRho GTPasesは、アクチン細胞骨格リモデリング3、14の制御を調整する。形態学的変化は、細胞が円形と円形から平坦化および膨張にシフトするにつれて観察される。これらの観察と一致することは、ECMとの多数のマトリックス接着の開発である。これらの変化は、細胞が付着して15、16に広がるにつれて、最初の1時間の間にRac1を用いたRhoAの二葉性活性化に起因する。
細胞の拡散と同様に接着形態やダイナミクスを調べるために、様々な方法が利用されている。しかし、これらの方法は、高度な長期ライブイメージング全内部反射蛍光(TIRF)または共焦点顕微鏡システムに依存しています。したがって、ユーザーは、特殊な機器やソフトウェアへのアクセス権を持っている必要があります。さらに、これらのバイオイメージングシステムに必要なセットアップ時間は、特に複数の阻害剤または治療条件を同時にテストする場合に、早期接着イベントの捕捉を困難にします。
本明細通り、詳細な方法は、接着アセンブリおよびインビトロで広がるパラメータを評価する、簡単で経済的でありながら定量的な方法を提供する。このプロトコルは、エピ蛍光顕微鏡やCCDカメラなどの一般的に利用可能な実験装置を使用して行われます。このアッセイは、以前に実証されたATMキナーゼ活性の化学阻害によって引き起こされる酸化ストレスの期間後にFN被覆表面にアンカレッジ依存細胞を適用することを含む5。メッキに続いて、細胞は、指定された時間の長さのために付着し、付着することが可能です。未接続の細胞は洗い流され、付着した細胞は固定され、接着のマーカー(例えば、パクシリン)および広がる(例えば、F-アクチン)2、5に蛍光ベースの抗体で標識される。これらのタンパク質を視覚化し、エピ蛍光顕微鏡を使用して記録します。その後のデータ分析は、自由に利用可能なフィジーソフトウェアを使用して実行されます。さらに、この方法は、異なるECMタンパク質、様々な酸化剤/細胞培養条件による治療、または様々なアンカレッジ依存性細胞株を含む幅広い条件下で接着力を調べ、幅広い範囲に対応することができます。生物学的な質問。
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Protocol
1. 準備
注:以下に説明するプロトコルは、REF52細胞およびATM+/+またはATM-/----ヒト線維芽細胞での使用のために最適化されています。その他のセルの種類については、以下の「ノートおよびトラブルシューティング」のセクションで説明されているように、さらに最適化が必要になる場合があります。
- REF52細胞に対する完全な細胞培養培地の500mLを作る。ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)を含む高グルコースの500mLに10%FBS、2 mM L-グルタミン、および100単位/mLペニシリン連鎖筋ミンを加えます。
- フィブロネクチン(FN)の25 μg/mL溶液を、無菌1xリン酸緩衝生理食生(PBS)の12mLに1mg/mL FN溶液の300 μLを添加することにより、pH 7.4を調出す。よく混ぜる。
- 血清遊離DMEM細胞培地中に0.5%(w/v)脱脂(すなわち、脂肪酸フリー)ウシ血清アルブミン(dlBSA)溶液を調出す。100 mLの無血清DMEM培地に0.5gのdlBSAを加える。溶液をよく混ぜますが、渦を混ぜないでください。無菌フィルターは、使用前に0.22 μMシリンジフィルターを使用して、新しい滅菌容器に溶液をフィルタリングします。4 °Cで保存します。
- 1x PBSの100 mLにパラホルムアルデヒドの3.7gを溶解することにより、3.7%のパラホルムアルデヒド溶液を作ります。穏やかな熱と攪拌を使用して、パラホルムアルデヒドを溶液に入れます。
注:パラホルムアルデヒド溶液は光に敏感であり、光から保護する必要があります。4°Cで保存すると最大1週間に適しています。
注意:パラホルムアルデヒドは、有毒、可燃性、腐食性および健康上の危険である。使用前にパラホルムアルデヒドの材料安全データシートを確認してください。アイシールド、フェイスシールド、フルフェイスパーティクル人工呼吸器、手袋、ラボコートなどの取り扱いには、適切な個人用保護具を使用してください。 - 0.2%の非イオン界面活性剤を1x PBS(v/v)で含む透過化溶液を調製する。100 mLの場合は、攪拌しながら、1x PBSの100 mLにトリトンX-100の0.2 mLをゆっくりと追加します。
- 2.5%BSA、5%ヤギ血清、および0.05%非イオン界面活性剤(w/v/v)を1x PBS溶液に溶解した免疫蛍光遮断バッファーを作ります。100 mLの場合は、ヤギの血清5mL、BSAの2.5g、トリトンX-100の0.05 mLを~95mL 1x PBSで加え、撹拌しながら加えます。
- DMEMでREF52細胞を10cm2(またはその他の容器サイズ)細胞培養処理プレートで37°Cおよび5%CO2で増殖させる。
2. 細胞外マトリックスタンパク質フィブロネクチンを用いる細胞培養プレート
注:BSL-2認定層流フードに無菌技術と滅菌試薬を使用してこのセクションを実行します。開始前の主要な手順の概要については、図 1Aを参照してください。
- 24ウェルプレート認定の組織培養を使用して、各ウェルにガラスカバースリップ(12-Cir-1)を1枚置きます。図 1B に従ってプレートにラベルを付けます。
- 25 μg/mL FN溶液のピペット500 μLを24ウェルプレートの各ウェルに。
- 各カバーの上に溶液をピペットは、コーティングと完全な浸漬を確保するために数回スリップします。蓋をプレートの上に戻します。
- 37°Cおよび5%CO2で細胞培養インキュベーターでプレートを1時間インキュベートする。
注:または、4°Cで一晩インキュベートします。 - 1時間後、インキュベーターからプレートを取り出し、井戸からFN溶液を吸引します。
- 1x PBSの500 μLでウェルを3回洗浄します。1x PBSの最終洗浄を吸引する。
- 0.5%dlBSA溶液の500 μLでウェルをブロックし、37 °Cおよび5%CO2で最低15分間のウェルをブロックします。
- 以下のステップ3で細胞をめっきする前にdlBSA溶液を吸引する。
注:プレートを保存する場合は、dlBSA溶液の吸引後に各カバースリップに1x PBSの500 μLを追加します。プレートは、最大1週間4°Cで保つことができます。
3. 接着アッセイのためのアンカレッジ依存細胞の準備
注:BSL-2認定層流フードに無菌技術と滅菌試薬を使用してこのセクションを実行します。
- 細胞めっきの少なくとも30分前に、次の解決策を事前に温めます:DMEM完全培地、dlBSA溶液、1x PBS、0.5%トリプシン-EDTA溶液、および37°C水浴中のトリプシン中和血清(TNS)。
- 10cm2皿のREF52細胞のコンフルエント単層から始まり、6 mLの温かい1x PBSで細胞を2回洗浄する。血清は、37°Cおよび5%CO2で温暖なdlBSA溶液の6 mLで少なくとも1時間(細胞タイプに応じて)細胞を飢えさせる。
- 温めた1x PBSの6 mLで細胞を洗浄し、PBSを吸引し、1.5mLの温かい0.5%トリプシン-EDTA溶液を加えます。
- 細胞培養インキュベーターに37°C、CO2を5%~2分間置きます。
- 小顕微鏡下で細胞を観察し、剥離が完了していることを確認します。ベンチ上部のプレートをタップした後も細胞が付着している場合は、37°Cインキュベーターに戻り、必要に応じて2分間細胞をトリプシン化します。
- ピペット1.5mLの温かいトリプシン中和液(TNS)を皿に入れ、トリプシン化を停止し、剥離細胞を回収する。プレートの底面に溶液を何度も上下にピペットし、残りの付着細胞をすべて除去します。細胞が不器用に見える場合は、皿の背面を上下にゆっくりとピペッティングして、さらに細胞懸濁液をトリプします。
- トリパンブルーの排除と小顕微鏡下のヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。または、自動セル カウンタを使用します。
- 適切な量の細胞を取り出し、15 mL円錐管内のdlBSAの5 mLで1.0- 3.0 x 104セル/mL細胞懸濁液を作成します。
- テーブルトップ遠心分離機内の固定角度ローターを用いて5分間~300xgの遠心分離機を用いた。
- 細胞ペレットから上清を吸引し、合計7mLの温発性dlBSA溶液で細胞を再停止する。カバースリップメッキの際に細胞が過度に結合することを許さず、少数の細胞が互いに接触して均等に分布する。
- 細胞懸濁液を2つの15mL円錐管に均等に分割し、1つは車両単独制御(DMSO)用、もう1つはKu55933(ATMキナーゼ阻害剤、酸化剤)5.各チューブにセルサスペンションの3.5 mLが含まれていることを確認します。
- チューブローターを使用して、細胞培養インキュベーターで90〜120分間37°Cでチューブを回転させます。
- めっきの30分前に、各チューブに10 μM Ku55933およびDMSO(1:1,000)の最終濃度を加えます。セルサスペンションをローターに戻し、残りの時間を使用します。
- 細胞をめっきする直前に、インキュベーターから24ウェルプレートを取り出し、dlBSA溶液を吸引する。
- 90〜120分間細胞懸濁液を回転させた後、各処置群から500μLの細胞懸濁液を取り出し、図2のステップ2から24ウェルプレートに1つのFNコーティングカバースリップを加える(図1B)。プレートを37°Cおよび5%CO2細胞培養インキュベーターに戻し、細胞懸濁液を回転に戻します。
- FNカバーカバーリップに細胞懸濁液をめっきした後、細胞が所望の時間(例えば、10分、15分、20分、30分)に付着し、直ちにステップ4に進みます。
4. 免疫蛍光に対する細胞固定と抗体染色
注:以下の手順は、特に断りのない限り、非滅菌条件下および室温で行われます。
- 接着のための所望の時間が経過した後、プレート内の各カバースリップから細胞溶液を吸引する。
- ウェルの側面を使用して、各カバースリップに3.7%パラホルムアルデヒド溶液の500 μLを静かに分配し、10〜15分待ちます。
- パラホルムアルデヒド溶液を取り出し、各カバースリップを1x PBSの500 μLで合計2回洗浄します。
注:施設の環境保健安全計画に従って、責任を持ってパラホルムアルデヒド廃棄物を処分する。 - PBSを吸引し、各カバースリップの細胞を透過し、室温で10〜15分間1x PBS(v/v)で0.2%トリトンX-100の500 μLで透過します。
- 各カバースリップを1x PBSの500 μLで3回洗います。
- 5%ヤギ血清を含む500μLの免疫蛍光遮断バッファーを有する各カバースリップ上のブロック細胞、2.5%BSAおよび0.05%トリトンX-100を30〜60分間1x PBS溶液に溶解した。
- ブロッキングバッファー内の一次抗パキシリン抗体(1:250)を希釈する。よく混合し、各カバースリップに抗体溶液の200 μLを追加します。室温で少なくとも1時間インキュベートする。
注:あるいは、一次抗体溶液を4°Cで一晩インキュベートすることができる。接着複合体とその後のFA分析の染色に使用できる多くの一般的な焦点接着マーカーがあります。これらには、以下のタンパク質に対する抗体が含まれます:インテグリンサブユニット(β1、α5、またはαV)、タリン、またはビンクリン2。 - 抗体溶液を吸引し、各カバースリップを1x PBSの500 μLで10分間10分間3回洗浄する。この時点から前方に光からサンプルを保護します。
- 赤色蛍光Alexa 594色素(1:1000)およびヤギ抗マウス488蛍光二次抗体(1:400)を同じブロッキングバッファー溶液中に結合したファロイジンF-アクチンプローブを希釈する。よく混合し、30分間、各カバースリップに抗体溶液の200 μLを追加します。
注:他の種からの蛍光共役二次抗体も同様に使用されてもよい。しかしながら、他の種からの抗体の使用は、ブロッキングバッファー血清の改変を必要とする。 - 抗体溶液を吸引し、各カバースリップを1x PBSの500 μLで10分間10分間3回洗浄する。
- 1x PBSを吸引し、dIH2Oの500 μLで1回すすいで下します。
- マウントは、DAPIを含むアンチフェードマウント媒体を使用して顕微鏡スライドにカバースリップします。
- 顕微鏡スライドを残し、室温で暗闇の中で一晩設定します。
- 顕微鏡スライドを4°Cで暗く保存し、長期保存およびイメージングまで保存します。
注:標準的な免疫蛍光技術を用いて画像。セルエッジの焦点接着や周辺フリルに注意するのに十分な解像度を確保するために、高出力オイル浸漬60x対物レンズを使用することをお勧めします。各治療条件と時間の下で各カバースリップのための複数の視野で20-30細胞の画像を取得します。組み合わせた反復から、統計分析を実行するために少なくとも 60 セルが生成される必要があります。蛍光画像を保存してエクスポートします。300 dpi 以上の解像度を持つ TIFF ファイル。
5. 応力繊維、細胞循環、焦点接着形成の定量化
注:以下の画像解析は、オープンソースイメージング処理パッケージフィジーイズジャストイメージJ(フィジー)の最新バージョンを使用して行われ、(http://fiji.sc/)で無料でダウンロードできます。
- 一般的な画像処理
注: すべての画像は、以下の手順 5.1.1-5.1.5 を実行して計算分析用に準備する必要があります (図 2)。その後、その後の定量手順の一部またはすべてが選択されてもよい。- を開きます。フィジーを用いてTIFF蛍光画像。イメージが 8 ビットグレースケールであることを確認します。
- [画像調整ウィンドウ/レベル]を選択し、[自動](図2A)を選択します。
- 背景蛍光を減算するには、[バックグラウンドを減算する]を選択します。スライド放物線をチェックし、50ピクセルのローリングボール半径のオプションを選択します(図2B)。
注: ローリング ボール半径の適切なサイズを確認するには、[ライン ツール]を選択し、画像内の最大の接着に半径を描画します。[測定]を選択して、描画された線の長さを確認します。半径の値が大きすぎると、画像内で接着を含むフィーチャが失われます。半径が小さすぎると、バックグラウンド ノイズが原因で処理されたイメージ内のアーティファクトが発生します。 - [画像調整 - 明るさ/コントラスト]を選択して、背景上の接着の強度を確認します。必要に応じて調整します。
注:明るさ/コントラストを最適化し、信号を飽和させないようにするには、画像のルックアップ ツールを使用してヒストグラムを調べて明るさ/コントラストを調整します。 - [解析設定測定値:面積、平均グレー値、形状記述子、および統合密度] で次のパラメータを選択します。
- 応力繊維形成解析
注:応力繊維は表現型に応じて複数の方法で定量することができます。- 応力繊維を持つセルの数を、セルの合計数に対するパーセンテージとしてカウントします。この分析は、異なる実験条件下で形成される応力繊維の数に視覚的な違いがある場合に最適です。
- セルを横切る応力繊維の数をカウントします。この分析により、細胞あたりに形成された応力繊維の数を比較することができます。
- 細胞17、18当たりのファロイジン(例えば、F-アクチン)染色によって与えられた総蛍光強度を測定する。この方法は、F-アクチン染色による蛍光強度の大幅な増加/減少を強調します。
- 上記のステップ 5.1.5 で測定パラメータを設定します。
- フィジーツールバーでフリーハンドツールを選択し、目的のセルを手動でトレースします。[分析メジャー]を選択します。選択した測定パラメータを示す新しいウィンドウが表示されます。
- フィジー ツールバーでフリーハンド ツールを選択し、セルが存在しない空のスペースを手動でトレースします。[分析メジャー]を選択します。この測定は、背景蛍光として機能します。
- 以下の式を使用して、細胞あたりの F-アクチン蛍光の合計を決定します。
注:得られた測定は、細胞当たりのF-アクチン蛍光を与えるために、他の細胞と正規化し、比較することができます。
- 細胞循環解析
注:細胞領域(時間の経過とともに細胞が広がる指標)に関する情報だけでなく、循環性も記録することができる。この測定は、それぞれ円高に細長い細胞を定量化する方法として0対1の比率として与えられる。- フィジー ツールバーでフリーハンド ツールを選択し、個々のセルをトレースします。[画像測定]を選択し、各セルのセル面積と周囲の測定値を記録します。各セルに対してこの手順を繰り返します。
注: [測定の設定]機能では、形状記述子の測定として円形が提供されます (ステップ 5.1.5)。 - 図 3および図 4に示すように、セルあたりのアクチンエンリッチラッフルまたは突起を手動でカウントします。
- フィジー ツールバーでフリーハンド ツールを選択し、個々のセルをトレースします。[画像測定]を選択し、各セルのセル面積と周囲の測定値を記録します。各セルに対してこの手順を繰り返します。
- 焦点接着解析
注:焦点接着解析を実行する前に、フィジーの最新バージョンにメキシコのハットフィルタプラグインをインストールしてください。以下のプロトコルは、以前の研究19、20、21から変更されています。- ブロック サイズ 19、ヒストグラム ビン 256、最大勾配 6 を使用して[プロセス-エンハンス ローカル コントラスト(Clahe)]を選択します。(図 2C)
- シグマ(半径)を 2.0 のプロセスフィルタ - ガウス ブラーを選択して、イメージをフィルタリングします (図2D)。
- 半径が 2.0 (図 2E)のプラグイン-メキシコのハット フィルタ (Mhf)を選択します。
- しきい値を実行し、しきい値方法としてHuangまたはIsodataのいずれかを使用して[暗い背景]と[オーバー/アンダー]を選択します。[自動しきい値]を選択します。
注: この手順により、接着が強調表示されますが、互いに異なります。 - 次のパラメータを選択したパーティクルの解析と解析を選択します: size=20、ピクセル無限大、円形=0.00~0.99。アウトラインを確認して、焦点接着の適切な検出と分離を確認します。
注:これらの結果は、個々の焦点接着の数、面積、および形状の説明を得る。
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Representative Results
実験セットアップの一般的なスキーマ
図1は、REF52細胞の血清飢餓から始まり、後天蛍光画像の計算解析で終わる細胞接着および拡散プロトコルの一般的なスキーマを表す。プロトコルの主要な手順は、タイムラインに示されています。なお、プロトコルのステップ2は、FNコーティングされたカバーリップの調製について説明し、これはステップ3と同時に行われるべきである:血清飢餓REF52細胞を懸濁液に入れる前に(図1A)。蛍光顕微鏡検査用試料の固定前の治療群および細胞接着期間を示す模擬標識24ウェルプレートの一例(図1B)。
焦点接着定量のための免疫蛍光画像処理
REF52細胞を90分間懸濁して保持し、FN上でメッキし、さらに15分間付着させた。抗パキシリン抗体による固定および染色後、細胞の蛍光8ビットグレースケール画像を取得した。画像処理解析は、ステップ5で描かれたプロトコルに従って行った。元の画像(図2A)を含む各異なる処理ステップの代表的な画像と、背景減算(ポストローリングボール)(図2B)、CLAHE(図2C)、ガウスブラー(ガウスブラー(図 2D)およびメキシコのハット フィルタ (ポスト MHF) (図 2E)フィルタリングステップ。すべての画像処理ステップを完了した後、個々の焦点接着が目立ち、焦点を合わせ、互いに容易に区別できる必要があります(図2E)。画像をフィルタリングした後、焦点接着を定量し、その面積を測定することができます(ステップ5.1および5.4)。
細胞接着の可視化と酸化ストレス後のFN上での広がり
KU55933(ク55933の有無にかかわらずFN上でめっきした後のREF52細胞の抗パキシリン(焦点接着マーカー)(図3、トップパネル)とファロイジンF-アクチンプローブ染色(図3、下パネル)の代表的なグレースケール蛍光画像(ROS誘導剤)治療。アッセイに先立ち、REF52細胞は1時間血清飢餓した。血清飢餓に続いて、細胞は、酸化ストレスを誘発するために、車両単独または10μM Ku55933のいずれかで処理されている間、懸濁液中に保持された。細胞をFNコーティングされたカバーリップ上にメッキし、指定された時間に固定し、F-アクチンタンパク質を検出するために焦点接着およびファロイジンに対する抗体で染色した。顕著な焦点接着および応力繊維は、FN上で20〜30分間付着させられた後、REF52細胞で容易に見えるべきである。明確で明確なセルエッジと、個々のセルが広がるスペースに注目してください (図 3)。細胞膜の前縁にあるF-アクチン濃縮フリルが目に見え、矢印で示される(図3、下部パネル)。
ストレス繊維の定量蛍光画像のグラフィカル表現と細胞拡散の程度
応力繊維を有する細胞の割合と、接着後の様々な時間におけるKu55933処理の有無にかかわらず広がる細胞の程度を表す棒グラフ形態で表示される定量画像の例。ファロイジンF-アクチンプローブおよび抗パキシリン染色の蛍光画像は、図3に示す画像と同様に、画像解析手順を用いてストレス繊維および細胞拡散(すなわち循環指数)の割合について分析した。プロトコルの手順 5 で説明します。特に、酸化剤処理は、調べた全ての接着時間点におけるストレス繊維形成の有意な増加を引き起こし(図4A)、FNへの細胞接着の15分後に細胞が広がる減少を引き起こした(図4B)。
合流性上の細胞による非定量化性免疫蛍光画像
血清飢餓REF52細胞を90分間懸濁液中に保持し、その間に10μM Ku55933で処理し、ROS形成を誘導した。その後、細胞をFN上でめっきし、20分間付着させ、その後、抗パキシリンまたはファロイジン-Alexa 594 F-アクチンプローブで固定して染色した。より高い細胞密度でのめっきは細胞の混雑を引き起こし、合流過剰のために細胞が完全に広がることを禁止する。セルのエッジは、隣接するセル (黄色の矢印) と区別がつきません (図 5A)。その結果、個々の細胞の定量が排除され、円周の広がりを正確に特定することができません。図5Bでは、別個の細胞株であるマウス胚線維芽細胞(MEF)を懸濁液中に保持し、次いでFN上で30分間メッキした。次いで細胞を固定し、抗パキシリン抗体で染色した。焦点外のセルは赤い矢印で示されます (図 5B)。さらに、細胞破片(青い矢印)を用いた抗パキシリン抗体の交差反応性は、定量画像解析(第5部)中に閾値を変化させ、分析に含めるべきではない(図5B)。
図1:プロトコルの時間ラインと例の24ウェルプレートセットアップ。
(A)時間ラインは、細胞接着および拡散手順の重要なステップを強調表示します。(B)代表的な標識24プレートは、細胞接着のための治療群および時間を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:画像処理後の代表的な免疫蛍光画像の例。
REF52細胞を90分間懸濁液中に保持し、FN上でめっきし、15分間付着させた。(A)オリジナル画像と画像以下の (B) 背景減算 (ポストローリングボール), (C) CLAHE, (D) ガウスブラーと (E) メキシコの帽子フィルター (ポスト MHF) フィルタリング手順。バー、20 μmこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:FN上でめっきされたREF52細胞を染色した抗パキシリンおよびファロイジンF-アクチンプローブの代表的な免疫蛍光画像。
アッセイに先立ち、REF52細胞は1時間血清飢餓した。血清飢餓の後、細胞は、酸化ストレスを引き起こすために、車両単独または10μM Ku55933のいずれかで処理しながら懸濁液中に保持された。細胞をFNコーティングされたカバーリップ上にめっきし、F-アクチンタンパク質を検出するために、焦点接着およびファロイジンに対する抗体で固定および染色した。細胞膜の前縁にあるF-アクチン濃縮フリルは矢印で示される。バー、40 μmこの図は Tolbert et al.5から変更されています。
図4:免疫蛍光画像の定量化。
(A)応力繊維を示す細胞の割合および(B)細胞循環測定を示すグラフ。細胞の円形性は、細胞周積で割った細胞領域として定義された。値の範囲は 0 ~ 1.0 で、それぞれ細長い形態または丸みを帯びた形態を示します。誤差バーは、S.E.M. 学生の対になったサンプルのt-testを示します *p<0.01 三元的に行われた実験から.この図は Tolbert et al.5から変更されています。
図5:非定量化性免疫蛍光画像。
(A)血清飢餓REF52細胞を90分間懸濁液中に保持し、10μM Ku55933で処理した。細胞をFN上でめっきし、20分間付着させて、細胞を固定し、抗パキシリンまたはファロイジン-アレクサ594 F-アクチンプローブで染色した。セルのエッジは黄色の矢印で表示されます。(B)MEF細胞を懸濁液中に保持し、次いでFN上で30分間メッキした細胞を固定し、抗パキシリン抗体で染色した。焦点外の細胞は赤い矢印で示され、細胞破片を持つ抗パキシリン抗体の交差反応性は青い矢印で示される。バー、30 μmこの図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、細胞拡散中の動的細胞骨格リモデリングのための多数のアンカレッジ依存性細胞型を迅速にスクリーニングする汎用性と経済的な方法である。特に、この方法は、細胞がFNに付着した場合の酸化ストレス時の応力繊維および焦点接着形成を定量的に調べる(図1A)。さらに、これらの細胞型は、細胞の付着および15、16、22の間に役割を文書化しているので、小さなGTPasesのRhoファミリーのメンバーに対する調節的役割を示唆する可能性がある。しかし、GTP結合、活性Rhoファミリータンパク質の関与の可能性を同定するには、追加の生化学的技術が必要となる。
提示されたプロトコルは、F-アクチンおよびパクシリンの免疫蛍光検出を利用して、ATMキナーゼ阻害によって誘発された酸化ストレス後のFN上の細胞接着および拡散を特異的に調べる(図2、図 3 および図 4)。しかし、この手順は、他のECMタンパク質および/または他の付着細胞タイプでの使用に適合させることもできます。他の細胞株に適応する場合、特に細胞数/密度、血清飢餓時間、ECMタンパク質濃度、酸化ストレス治療条件など、実験条件を最適化することが重要です。未知の刺激が接着および拡散ダイナミクスに及ぼす影響をテストする場合、アッセイが正しく機能していることを確認するために、負のコントロールサンプルと陽性の両方のコントロールサンプルを含める必要があります。陰性対照サンプルは未処理または車両のみのサンプルを含むことができ、正の対照は酸化ストレスを誘発する必要があります(例えば、H2 O2)。さらに、ここでは議論しないが、適切な抗体制御を利用することも重要である。各抗体の特異性を検証し、潜在的な蛍光出血を同定するために、各抗体に対して3つの別々のコントロールを使用することをお勧めします23,24.これらには、1)一次抗体を抗原に対する特異的結合を確実にし、使用される固定条件下で抗原結合が起こることを確認するための一次抗体制御、2)二次抗体制御(非二次共役抗体用))は、一次抗体に特異性を示し、および3)フルオロフォが添加されることを保証する蛍光素コントロールは、他の抗体からの内因性蛍光またはブリードスルーの結果ではないことを保証する。
このアッセイは、接着アセンブリと広がりの初期運動事象を分析するのに有用であるが、接着分解または接着強度および細胞補強の詳細な検査には適していない。後者は、長期イメージングバイオステーションまたは単一細胞力分光法の使用を必要とする。後者の技術は、原子力顕微鏡、光ピンセット、ビンクリン25またはタリン26、27、および3D力顕微鏡28などの接着タンパク質のテンションセンサを含む。
プロトコルの重要なステップは、FNで徹底的にコーティングカバーリップを含みます。これは、細胞の均一な拡散と接着のために必要です。したがって、インキュベーションの前に複数回カバーリップの上にFN溶液を上下にピペットすることが重要です。カバースリップは、インキュベーション時間中にFN溶液中に完全に水没したままでなければなりません。FNコーティングされたカバーリップは4°Cで2週間まで貯えることができる。
細胞密度も重要であり、あまりにも密にめっきされた細胞は最大広がる円周を達成しない。さらに、個々の細胞に対して個々の焦点接着または細胞フリルを区別することはできないであろう。したがって、細胞を懸濁液に入れる前に、血球計または自動細胞カウンタを使用して細胞を数える必要がある。REF52細胞に対して細胞密度の推定値が提供されますが、これは研究対象の他の細胞に対して経験的に決定される必要があります。細胞は、少数の細胞が重なり合うほどまばらにめっきされ、完全に広がるようにする必要があります(図5)。
考慮すべきプロトコルの他の重要なステップは、蛍光共役ファロイジン-Alexa 594 F-アクチンプローブおよび二次抗体が光感受性である。したがって、試薬の適用後、サンプルは最小限に光にさらされる必要があります。さらに、酸化ストレスを誘発する多くの薬剤は、短い半減期を有する。したがって、ピーク活性を達成するために最適な用量および暴露時間のために選択された酸化剤を試験する必要がある。
以下のセクションでは、FN濃度、血清飢餓状態、および細胞剥離方法論に関するトラブルシューティングのヒントを含みます。これらのヒントは、他の細胞ラインや治療条件にプロトコルを適応させる場合に役立ちます。
一貫したFA分析のためには、ECMリガンドによって異なる最適な取り付けおよび拡散条件が必要です。FNの場合は、10~30 μg/mLのダイナミックレンジの使用を開始します。FNの高濃度では、細胞の付着にほとんど違いがない。しかし、一部の細胞型は、ECMの高濃度で効率的に広がらない。
各細胞タイプは、血清飢餓の条件に異なる反応を示します。REF52細胞は、生存率を失うことなく一晩で簡単に飢餓することができますが、これはすべての細胞株に当てはまるわけではありません。したがって、研究中の細胞株が血清飢餓に耐えられる程度を決定する必要がある。
アッセイを広めるためには、細胞を再現可能な結果29のためにできるだけ少ない時間でトリプシン化する必要がある。トリプシン化による細胞剥離に続いて、細胞表面受容体、そのコグネイトリガンド、およびRho GTPase活性は、定常状態レベル14、15に戻るために回復期間を必要とする。このプロトコルで概説されたトリプシン化手順は、細胞が細胞表面FN結合受容体29の大部分を保持することを可能にするべきである。しかし、特定の細胞型は、細胞表面受容体の消化を完全に防ぐために、細胞剥離の代替方法を必要とするかもしれません。これらの方法は、EDTAベースの溶液(例えば、Versene)または穏やかな酵素解離溶液(例えば、Accutase)を用いたキレート細胞を含む。これらの解離溶液を使用して、細胞接着をそのまま残し、細胞塊を生じさせる。したがって、実験的な再現性を確保するために、個々の細胞を完全に再中断することが重要です。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
著者たちは、スコット・R・ハットン博士とメーガン・S・ブラックレッジ博士に原稿の批判的なレビューに感謝しています。この研究は、ハイポイント大学の研究とスポンサープログラム(MCS)とノースカロライナ州立大学のバイオテクノロジープログラム(MCS)によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
References
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