Summary
이 방법은 세포 부착의 초기 역학을 정량화하고 앵커리지 의존적 세포를 섬유넥틴상으로 확산시키는 데 유용하다. 더욱이, 이 분석은 세포 확산 및/또는 세포 부착 관련 세포 내 신호 경로에 변경된 산화배 항상성의 효력을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Abstract
세포 외 매트릭스 (ECM)에 세포의 접착 그리고 퍼짐은 유기체 발달 도중 및 성인 조직의 항상성에 대한 필수적인 세포 과정입니다. 흥미롭게도, 산화 스트레스는 이러한 과정을 변경할 수 있습니다., 따라서 전이성 암 같은 질병의 병 리 생리학에 기여. 따라서, 세포가 산화되는 동안 ECM에 부착되고 퍼지는 방법의 메커니즘을 이해하면 정상 및 질병 상태에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 아래에 기재된 단계별 프로토콜은 면역형광계 분석기를 사용하여 시험관내 섬유넥틴(FN)에 불멸의 섬유아세포 세포의 세포 부착 및 확산을 구체적으로 정량화하는 것이다. 간략하게, 앵커리지 의존성 세포는 산성 스트레스를 유도하기 위해 ATM 키나제 억제제 Ku55933에 노출되고 현탁액에 보유된다. 세포는 FN 코팅 된 표면에 도금되고 소정의 기간 동안 부착 할 수 있습니다. 부착된 상태로 남아 있는 세포는 부착(예를 들어, paxillin) 및 확산(예를 들어, F-액틴)의 형광 계 항체 마커로 고정및 표지된다. 데이터 수집 및 분석은 epifluorescence 현미경 및 자유롭게 사용할 수 있는 피지 소프트웨어를 포함하여 일반적으로 이용 가능한 실험실 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 절차는 매우 다재다능하고 다양한 세포주, ECM 단백질, 또는 억제제에 대해 광범위한 생물학적 질문을 검사하기 위해 변형될 수 있다.
Introduction
세포 매트릭스 접착 (즉, 초점 접착)은 세포 접착 및 확산을 중재하는 크고 역동적 인 다분자 단백질 복합체입니다. 이러한 프로세스는 조직 개발에 대 한 중요 한, 유지 보수, 그리고 생리 기능. 국소 유착은 세포외 기질 (ECM)에 세포골격 액틴을 연결하는 스캐폴딩 단백질뿐만 아니라 인테그린과 같은 막 결합 수용체로 구성된다1. 이러한 복합체는 다양한 신호 전달 경로의 활성화를 통해 세포 외 환경에 존재하는 물리 화학 적 단서에 반응 할 수있다. 이와 같이, 초점 유착은 지시된 이동, 세포 주기 규칙, 분화 및생존을포함하는 다수의 세포 과정으로 세포 외 기계적 단서를 전파하는 신호 센터로서 역할을 한다1,2. 초점 유착을 조절하고 상호 작용하는 신호 분자의 한 그룹은 작은 GTPases의 Rho 가족의 구성원을 포함합니다. Rho GTPases는 그들의 특정 spatiotemporal 활성화3를 통해 세포 이동 및접착 역학을 통제하는 중요한 단백질입니다. 당연히, Rho 단백질 기능의 dysregulation는 전이, 혈관 신생 및 그 외와 같은 인간적인 병리의 수에서 연루되었습니다. 특히, 세포 산화 상태는 세포 이동 및 접착의 변조에 지배적 인 역할을한다. 반응성 산소 종(ROS)의 증가와 같은 레독스 항상성의 변화는 다수의 세포 유형 및 인간 질병에서 로단백질 활성뿐만 아니라 유착을 조절하는 것으로 입증되었다4,5,6 ,7,8. 예를 들어, DNA 손상 수리 세린/트레오닌 키나아제 A-T 돌연변이(ATM)의 돌연변이에 의해 야기되는 신경장애 운동실조-말실증(A-T)을 앓고 있는 개인은 전이성 암의 위험이 증가합니다9. 10. 이러한 환자와 세포주에서 ATM 키나아제 활성의 손실은 유전적 돌연변이 또는 화학적 억제를 통해, 펜토스 인산통로의 기능 장애로 인한 높은 수준의 산화 스트레스를 초래한다7,11, 12. 더욱이, 실험실에서 최근 연구는 시험관에서 Rho 가족 GTPases를 활성화의 직접적인 결과로 세포골격 역학 (즉, 접착 및 확산)을 변경하여 A-T에서 ROS에 대한 병리생리학적 역할을 강조했다5. 궁극적으로, 로가족 활성화에 의한 세포골격역학의 이러한 변화는 A-T 환자5,13에서언급한 전이성 암의 위험 증가로 이어질 수 있다. 따라서 산화 스트레스 동안 세포 매트릭스 상호 작용 간의 상호 작용을 이해하면 접착 및 확산 의 조절에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이러한 연구는 또한 이러한 신호 프로세스에서 Rho 가족 GTPases에 대 한 가능한 역할에 대 한 추가 조사를 위한 무대를 설정할 수 있습니다.
본원에 기재된 프로토콜은 ATM 키나아제 활성의 억제에 의해 야기된 산화 스트레스 동안 유착 어셈블리 및 확산의 초기 세포 역학을 연구하는 프로토콜이다. 이러한 분석은 ECM 단백질 피브로넥틴(FN)에 대한 앵커리지 의존성 세포의 잘 특성화된 기전을 기반으로 한다. 현탁액에서 유지되는 세포가 FN 상에 도금되면, 몇몇 Rho GTPases는 액틴 시토스켈레탈 리모델링3,14의제어를 조정한다. 형태학적 변화는 세포가 원형과 원형의 원형에서 평평해지고 팽창하는 것으로 이동함에 따라 관찰됩니다. 이러한 관찰과 수반되는 것은 ECM과 수많은 매트릭스 유착의 개발이다. 이러한 변화는 세포가 15,16을부착하고 확산함에 따라 첫 번째 시간 동안 Rac1을 가진 RhoA의 양면 활성화에 기인합니다.
세포 확산뿐만 아니라 접착 형태및 역학을 검사하기 위해 다양한 방법이 활용되었습니다. 그러나, 이 방법은 정교한 장기, 살아있는 화상 진찰 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 공초점 현미경 검사법에 의존합니다. 따라서 사용자는 특수 장비 및 소프트웨어에 액세스할 수 있어야 합니다. 또한, 이러한 바이오 이미징 시스템에 필요한 설정 시간은 특히 여러 억제제 또는 치료 조건을 동시에 테스트할 때 초기 접착 이벤트를 포착하는 데 어려움을 겪고 있습니다.
본 명세서에서 상세한 방법은, 접착 어셈블리및 시험관 내 확산을 제어하는 파라미터를 평가하는 간단하고 경제적이면서도 정량적인 방법을 제공한다. 프로토콜은 상피 현미경 및 CCD 카메라와 같은 일반적으로 이용 가능한 실험실 장비를 사용하여 수행됩니다. 이 분석법은 ATM 키나아제 활성의 화학적 억제에 의한 산화 스트레스의 기간 후에 FN 코팅 된 표면에 앵커리지 의존 세포를 적용하는 것을 포함하며, 이는 이전에 입증된5. 도금 후, 셀은 지정된 시간 동안 부착및 부착할 수 있습니다. 부착되지 않은 세포는 부착된 세포가 부착의 마커(예를 들어, paxillin) 및 확산(예를 들어, F-액틴)에 형광계 항체로 고정및 표지되는 동안2,5. 이 단백질은 그 때 epifluorescence 현미경을 사용하여 구상되고 기록됩니다. 후속 데이터 분석은 자유롭게 사용할 수있는 피지 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 더욱이, 이 방법은 다양한 ECM 단백질, 다양한 산화제/세포 배양 조건 또는 다양한 앵커리지 의존성 세포주를 포함하는 광범위한 조건 하에서 접착 역학을 검사하는 데 적용될 수 있다. 생물학적 질문.
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Protocol
1. 준비
참고: 아래에 설명된 프로토콜은 REF52 세포 및 ATM+/+ 또는ATM-/- 인간 섬유아세포와 함께 사용하기 위해 최적화되었습니다. 다른 세포 유형은 아래 노트 및 문제 해결 섹션에 설명된 대로 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
- REF52 세포에 대한 완전한 세포 배양 배지의 500 mL를 만드십시오. Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM)를 포함하는 고혈당 500 mL에 10 % FBS, 2 mM L-글루타민 및 100 단위 / mL 페니실린 스트렙 토마이신을 추가합니다.
- 멸균 1x 인산완충 식염수(PBS), pH 7.4의 12 mL에 1 mg/mL FN 용액 300 μL을 추가하여 피브로넥틴(FN)의 25 μg/mL 용액을 준비합니다. 잘 섞으세요.
- 혈청 프리 DMEM 세포 배양 배지에서 0.5% (w/v) 탈립(즉, 지방산 불포함) 소 혈청 알부민(dlBSA) 용액을 준비한다. 0.5 g의 dlBSA를 100 mL의 혈청 프리 DMEM 배지에 추가합니다. 용액을 잘 섞지 만 소용돌이를하지 마십시오. 사용하기 전에 0.22 μM 주사기 필터를 사용하여 용액을 새로운 멸균 용기에 걸링합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 1x PBS의 100 mL에 파라포름 알데히드 3.7 g을 용해시킴으로써 3.7 % 파라 포름 알데히드 용액을 만듭니다. 부드러운 열과 교반을 사용하여 파라포름알데히드를 용액으로 넣습니다.
참고: 파라포름 알데히드 용액은 빛에 민감하며 빛으로부터 보호되어야 합니다. 4 °C에서 보관하면 최대 1 주일 동안 좋습니다.
주의: 파라포름알데히드는 독성, 인화성, 부식성 및 건강상의 위험이 있습니다. 사용하기 전에 파라포름알데히드에 대한 재료 안전 데이터 시트를 검토하십시오. 아이 쉴드, 페이스 쉴드, 전면 입자 호흡보호구, 장갑 및 실험실 코트를 포함하여 취급할 때 적절한 개인 보호 장비를 사용하십시오. - 1x PBS (v /v)에서 0.2 % 비 이온 계면 활성제를 함유하는 투과 솔루션을준비하십시오. 100 mL의 경우, 교반하면서 트리톤 X-100 ~ 100 mL의 0.2 mL를 천천히 추가합니다.
- 1x PBS 용액에 용해된 2.5% BSA, 5% 염소 혈청 및 0.05% 비이온 계면활성제(w/v/v)를 함유하는 면역형 광차단 완충제를 만든다. 100 mL의 경우, 교반하면서 염소 세럼 5 mL, BSA 2.5 g, 트리톤 X-100 0.05 mL을 95 mL 1x PBS에 넣습니다.
- 37°C 및 5%CO2에서세포 배양 인큐베이터에서 10cm2(또는 임의의 다른 용기 크기) 세포 배양 플레이트에서 DMEM 완전 배양 배지에서 REF52 세포를 성장시다.
2. 세포 외 매트릭스 단백질 피브로넥틴으로 세포 배양 판을 코팅
참고: BSL-2 인증 층류 후드에서 무균 기술과 멸균 시약을 사용하여 이 섹션을 수행합니다. 시작하기 전에 주요 단계에 대한 개요는 그림 1A를 참조하십시오.
- 조직 배양 인증 24웰 플레이트를 사용하여, 각 우물에 유리 커버슬립 1개(12-Cir-1)를 놓습니다. 그림 1B에따라 플레이트에 라벨을 붙입니다.
- 25 μg/mL FN 용액의 피펫 500 μL을 24웰 플레이트의 각 웰에.
- 코팅과 완전한 침수를 보장하기 위해 각 커버에 용액을 몇 번 슬립합니다. 뚜껑을 접시에 다시 놓습니다.
- 플레이트를 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 배양한다.
참고: 또는 4°C에서 밤새 배양하십시오. - 1 시간 후, 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에서 FN 용액을 흡인한다.
- 1x PBS의 500 μL로 우물을 세 번 씻으소서. 1x PBS의 최종 세척을 흡인합니다.
- 37°C 및 5%CO2에서최소 15분 동안 0.5% dlBSA 용액의 500 μL로 웰을 차단합니다.
- 아래 3단계에서 도금 전지를 하기 전에 dlBSA 용액을 흡인한다.
참고: 플레이트를 보관하는 경우 dlBSA 용액을 포위한 후 각 커버슬립에 500 μL의 1x PBS를 추가하십시오. 플레이트는 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
3. 부착 분석에 대한 앵커리지 의존적 세포 준비
참고: BSL-2 인증 층류 후드에서 무균 기술과 멸균 시약을 사용하여 이 섹션을 수행합니다.
- 셀 도금 전에 적어도 30 분, 다음 솔루션을 미리 따뜻하게 : DMEM 완전한 매체, dlBSA 용액, 1 x PBS, 0.5 % 트립신 - EDTA 솔루션, 37 ° C 수조에서 트립신 중화 혈청 (TNS).
- 10cm2 접시에 REF52 세포의 결합 단층으로 시작하여 따뜻한 1x PBS 6 mL로 세포를 두 번 씻으하십시오. 혈청은 37°C 및 5%CO2에서6 mL의 따뜻한 dlBSA 용액에서 적어도 1 시간 동안 (세포 유형에 따라 다름) 세포를 굶어.
- 6 mL의 따뜻하게 한 1x PBS로 세포를 세척하고 PBS를 흡인하고 따뜻한 0.5 % 트립신 -EDTA 용액 1.5 mL을 추가하십시오.
- 세포를 37°C및 5%CO2에서 ~2분 동안 세포 배양 인큐베이터에 놓는다.
- 가벼운 현미경으로 세포를 관찰하여 분리가 완료되었는지 확인합니다. 세포가 벤치 상판에 플레이트를 두드린 후에도 여전히 부착되어 있는 경우, 37°C 인큐베이터로 되돌려 추가로 2분 간. 필요에 따라 적은 시간 동안 세포를 트립시니화한다.
- 파이펫 1.5 mL의 따뜻한 트립신 중화 용액 (TNS)을 접시에 트립시니화를 중지하고 분리 된 세포를 수집합니다. 용액을 플레이트 바닥상에서 여러 번 파이펫하여 남은 모든 부착 셀을 제거합니다. 세포가 덩어리로 나타나면 접시 뒤쪽에서 부드럽게 위아래로 파이펫팅하여 셀 현탁액을 삼각화하십시오.
- 경현미경으로 트립판 블루 배제 및 혈세포계를 사용하여 세포를 카운트합니다. 또는 자동화된 셀 카운터를 사용합니다.
- 15 mL 원엽 튜브에서 dlBSA의 5 mL에서 1.0 - 3.0 x 104 세포 /mL 세포 현탁액을 생성하기 위해 적절한 양의 세포를 제거합니다.
- ~ 300 x g에서 5 분 동안 테이블 탑 원심 분리기에서 고정 각도 로터를 사용하여 원심 분리기 세포.
- 세포 펠릿으로부터 상월체를 흡인하고, 총 7 mL의 따뜻한 dlBSA 용액에서 세포를 재중단시켰다. 커버슬립 도금 시 세포가 지나치게 동조되는 것을 허용하지 말고, 서로 접촉하는 세포가 거의 없는 균등하게 분포한다.
- 세포 현탁액을 2개의 15 mL 원뿔형 튜브로 균등하게 나누고, 하나는 비히클 단독 제어(DMSO)와 Ku55933(ATM 키나제 억제제, 산화제)에 대해 하나5. 각 튜브에 3.5 mL의 셀 현탁액이 포함되어 있는지 확인하십시오.
- 튜브 회전기를 사용하여, 세포 배양 인큐베이터에서 90-120분 동안 37°C에서 튜브를 회전한다.
- 도금 30분 전에 각 튜브에 10 μM Ku55933 및 DMSO(1:1,000)의 최종 농도를 추가합니다. 셀 서스펜션을 남은 시간 동안 회전자 위에 다시 놓습니다.
- 세포를 도금하기 직전에, 인큐베이터로부터 24웰 플레이트를 회수하고 dlBSA 용액을 흡인한다.
- 세포 현탁액을 90-120분 동안 회전한 후, 각 처리군으로부터 500 μL의 세포 현탁액을 제거하고 24-웰 플레이트에서 1개의 FN 코팅 커버슬립을 2단계로부터 첨가하였다(도1B). 플레이트를 37°C 및 5%CO2 세포 배양 인큐베이터로 되돌리고 세포 현탁액을 다시 회전한다.
- FN 커버슬립상에 셀 현탁액을 도금한 후, 세포가 원하는 시간(예를 들어, 10분, 15분, 20분, 30분)동안 부착되도록 한 다음 즉시 4단계로 진행한다.
4. 면역 형광을 위한 세포 고정 및 항체 염색
참고: 다음 단계는 달리 명시되지 않는 한 비멸균 조건 및 실온에서 수행됩니다.
- 접착이 필요한 시간이 경과한 후, 플레이트의 각 커버슬립에서 셀 용액을 흡인한다.
- 우물의 측면을 사용하여 각 커버 슬립에 3.7 % 파라 포름 알데히드 용액 500 μL을 부드럽게 분배하고 10-15 분 기다립니다.
- 파라포름알데히드 용액을 제거하고 각 커버슬립을 500 μL의 1x PBS로 총 2회 세척합니다.
참고: 기관의 환경 보건 및 안전 계획에 따라 파라포름 알데히드 폐기물을 책임감 있게 폐기하십시오. - PBS를 흡인하고, 실온에서 10-15분 동안 1x PBS(v/v)에서 0.2% 트리톤 X-100의 500 μL로 각 커버슬립에 세포를 투과시한다.
- 각 커버슬립을 1x PBS의 500 μL로 3회 세척합니다.
- 5% 염소 혈청, 2.5% BSA 및 0.05% 트리톤 X-100을 함유하는 면역형광 차단 완충액500 μL로 각 커버슬립상의 세포를 1 x PBS 용액에 30-60분 동안 용해시블한다.
- 차단 완충제에서 1차 항팍실린 항체(1:250)를 희석한다. 잘 섞어서 각 커버슬립에 항체 용액200 μL을 추가합니다. 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양하십시오.
참고: 대안적으로, 1차 항체 용액은 4°C에서 하룻밤 동안 배양될 수 있다. 염색 복합체 및 후속 FA 분석에 사용될 수 있는 많은 일반적인 초점 접착 마커가 있습니다. 이들은 인테그린 소단위 (β1, α5, 또는 αV), 탈린, 또는 vinculin2:다음 단백질에 대하여 항체를 포함합니다. - 항체 용액을 흡인하고, 각 커버슬립을 1x PBS의 500 μL로 각각 10분 동안 3회 세척한다. 이 지점에서 앞으로 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.
- 동일한 차단 완충액에서 적색 형광 알렉사 594 염료(1:1000) 및 염소 항 마우스 488형광이차 항체(1:400)에 공액화된 팔로이드 F-액틴 프로브를 희석한다. 잘 섞어서 각 커버슬립에 200 μL의 항체 용액을 30분 동안 넣습니다.
참고: 다른 종으로부터형광성으로 공액된 이차 항체도 사용될 수 있다. 그러나, 다른 종으로부터항체의 사용은 차단 완충제 혈청의 변형을 요구할 것이다. - 항체 용액을 흡인하고, 각 커버슬립을 1x PBS의 500 μL로 각각 10분 동안 3회 세척한다.
- 1x PBS를 흡인하고 dIH2O의 500 μL로 한 번 헹구는다.
- DAPI를 포함하는 안티 페이드 장착 매체를 사용하여 현미경 슬라이드에 전표를 장착합니다.
- 현미경 슬라이드를 두고 실온에서 어둠 속에서 하룻밤 을 설정합니다.
- 현미경 슬라이드를 4 °C에서 어두운 환경에서 저장하여 장기간 보관하고 이미징이 끝날 때까지 보관하십시오.
참고 : 표준 면역 형광 기술을 사용하여 이미지. 고출력 오일 침지 60배 대물 렌즈를 사용하여 셀 가장자리의 초점 접착력과 주변 주름을 기록할 수 있는 충분한 해상도를 확보하는 것이 좋습니다. 각 치료 조건 및 시간에 따라 각 커버슬립에 대해 여러 시야에서 20-30개의 셀 이미지를 수집합니다. 결합된 복제본에서 통계 분석을 수행하려면 최소 60개의 셀을 생성해야 합니다. 형광 이미지를 로 저장하고 내보내기. 최소 300dpi 해상도의 TIFF 파일.
5. 응력 섬유, 세포 순환 및 초점 접착 형성 정량화
참고 : 다음 이미지 분석은 (http://fiji.sc/) 무료로 다운로드 할 수있는 피지 그냥 이미지 J (피지)의 최신 버전을 사용하여 수행됩니다.
- 일반 이미지 처리
참고: 모든 이미지는 아래 5.1.1-5.1.5 단계를 수행하여 계산 분석을 위해 준비해야합니다(그림 2). 그 후, 모든 후속 정량화 절차를 선택할 수 있다.- 을 엽니다. 피지를 사용 하 여 TIFF 형광 이미지입니다. 이미지가 8비트 및 그레이스케일인지 확인합니다.
- 이미지 조정 창/레벨을 선택하고 자동(그림 2A)을선택합니다.
- 배경 형광을 빼려면 프로세스 빼기 배경을 선택합니다. 포물선 슬라이딩을 선택하고 롤링 볼 반지름 50픽셀(그림2B)의옵션을 선택합니다.
참고: 롤링 볼 반지름에 적합한 크기를 확인하려면 선 도구를 선택하고 이미지에서 가장 큰 접착력에 반지름을 그립니다. 측정을 선택하여 그려진 선의 길이를 확인합니다. 반지름 값이 너무 크면 이미지에서 접착을 포함한 피쳐가 손실됩니다. 반지름이 너무 작으면 배경 잡음으로 인해 처리된 이미지에서 아티팩트가 발생합니다. - 이미지 조정- 밝기/대비를 선택하여 배경에 접착강도를 확인합니다. 필요한 경우 조정합니다.
참고: 밝기 / 콘트라스트를 최적화하고 신호를 포화하지 않으려면 이미지의 조회 도구를 사용하여 히스토그램을 검사하여 밝기 / 대비를 조정하십시오. - 분석-세트 측정:면적, 평균 회색 값, 모양 설명자 및 통합 밀도에서 다음 매개변수를 선택합니다.
- 응력 섬유 형성 분석
참고: 응력 섬유는 표현형에 따라 여러 가지 방법으로 정량화될 수 있습니다.- 총 셀 수에 대한 백분율로 응력 섬유가 있는 셀 수를 계산합니다. 이 분석은 서로 다른 실험 조건 하에서 형성된 응력 섬유의 수에 시각적 차이가 있는 경우에 가장 좋습니다.
- 셀을 가로대하는 응력 섬유의 수를 계산합니다. 이 분석은 세포 당 형성된 응력 섬유의 수를 비교하는 것을 허용합니다.
- 세포 당 염색된 플라할로이드(예를 들어, F-액틴)에 의해 주어진 총 형광 강도를측정한다 17,18. 이 방법은 F-액틴 염색으로 인한 형광 강도의 급격한 증가/감소를 강조합니다.
- 위의 5.1.5단계에서 측정 파라미터를 설정합니다.
- 피지 도구 모음에서 자유형 도구를 선택하고 관심 있는 셀을 수동으로 추적합니다. 분석 측정을선택합니다. 선택한 측정 매개 변수를 보여주는 새 창이 나타납니다.
- 피지 도구 모음에서 자유형 도구를 선택하고 셀이 없는 빈 공간을 수동으로 추적합니다. 분석 측정을선택합니다. 이 측정은 배경 형광으로 작용합니다.
- 아래 방정식을 사용하여 세포당 총 F-액틴 형광을 결정합니다.
참고: 생성된 측정은 세포당 F-액틴 형광을 주기 위해 다른 세포와 비교하여 정규화될 수 있습니다.
- 세포 순환성 분석
참고 : 세포 영역에 대한 정보 (시간이 지남에 따라 퍼지는 셀의 지표) 뿐만 아니라 원형도 기록 할 수 있습니다. 이 측정은 각각 둥글게 길쭉한 셀을 정량화하는 방법으로 0에서 1 사이의 비율로 제공됩니다.- 피지 도구 모음에서 자유형 도구를 선택하고 개별 셀을 추적합니다. 이미지 측정을 선택하고 각 셀의 셀 면적 및 둘레 측정값을 기록합니다. 각 셀에 대해 이 절차를 반복합니다.
참고: 설정 측정 기능에서 원형은 모양 설명자 측정(5.1.5 단계)으로 제공됩니다. - 그림 3 및 그림 4에 설명된 대로 셀당 액틴이 풍부한 주름 또는 돌출부를 수동으로 계산합니다.
- 피지 도구 모음에서 자유형 도구를 선택하고 개별 셀을 추적합니다. 이미지 측정을 선택하고 각 셀의 셀 면적 및 둘레 측정값을 기록합니다. 각 셀에 대해 이 절차를 반복합니다.
- 초점 접착 분석
참고 : 초점 접착 분석을 수행하기 전에, 피지의 최신 버전에 멕시코 모자 필터 플러그인을 설치합니다. 다음 프로토콜은 이전 연구19,20,21에서수정되었습니다.- 블록 크기 19, 히스토그램 저장소 256, 최대 경사 6을 사용하여 마스크없이 빠르지 않은 최대 경사를 사용하여 프로세스 향상 로컬 대비(Clahe)를 선택합니다. (그림2C)
- 프로세스 필터- 시그마(반지름)가 2.0인 가우시안 블러를 선택하여 이미지를 필터링합니다(그림2D).
- 반경이 2.0인 플러그인-멕시코 모자 필터(Mhf)를 선택합니다(그림2E).
- 임계값을 실행하고 황 또는 Isodata를 임계값 방법으로 사용하여 어두운 배경 및 오버/언더를 선택합니다. 자동 임계값을선택합니다.
참고: 이 단계를 수행하면 유착이 강조 표시되고 서로 구별됩니다. - 다음 매개변수를 선택한 파티클 분석(크기=20, 픽셀 무한대 및 원형=0.00-0.99)을 선택합니다. 윤곽선을 확인하여 초점 접착을 적절히 감지하고 분리합니다.
참고: 이러한 결과는 개별 초점 접착의 수, 면적 및 모양 설명을 생성합니다.
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Representative Results
실험 설정의 일반적인 스키마
도 1은 REF52 세포의 혈청 결치로 시작하여 후천형광이미지의 전산분석으로 끝나는 세포 부착 및 확산 프로토콜에 대한 일반적인 스키마를 나타낸다. 프로토콜의 주요 단계는 타임라인에 나와 있습니다. 참고로, 프로토콜의 2단계는 FN 코팅 커버슬립의 제조를 기술하며, 이는 3단계와 동시에 수행되어야 한다: 혈청 을 분주하게 하는 REF52 세포는 현탁액에 배치하기 전에(도 1A). 형광 현미경 검사법에 대한 샘플의 고정 전에 치료 군 및 세포 접착 기간을 나타내는 모의 표지 24 웰 플레이트의 예(도 1B).
국소 접착 정량화를 위한 면역형광 이미지 처리
REF52 세포는 90분 동안 현탁액으로 유지되었고, FN에 도금되고, 추가로 15분 동안 부착하도록 하였다. 안티 팍실린 항체로 고정 및 염색 한 후, 세포의 형광 8 비트 그레이 스케일 이미지를 획득하였다. 이미지 프로세싱 분석은 5단계에서 설명된 프로토콜에 따라 수행되었다. 원본이미지(그림 2A)를포함한 각 고유 처리 단계의 대표 이미지및 배경 감산(포스트 롤링 볼)(그림 2B),CLAHE(그림 2C),가우시안 블러 ( 그림 2D)및 멕시코 모자 필터(POST-MHF)(그림 2E)필터링 단계. 모든 이미지 처리 단계를 완료한 후에는 개별 초점 접착력이 눈에 띄고 초점이 맞춰져야 하며 서로 쉽게 구별할 수 있어야합니다(그림 2E). 이미지를 필터링한 후 초점 유착을 정량화하고 해당 영역을 측정할 수 있습니다(단계 5.1 및 5.4).
산화 스트레스 후 FN에 세포 접착 및 확산의 시각화
Ku55933의 유무에 관계없이 FN에서 도금 한 후 REF52 세포의 대표적인 그레이스케일 형광 이미지 (국소 접착 마커)및파할로이드 F-액틴 프로브 염색(그림 3,하단 패널) ROS 유도제) 치료. 분석전에, REF52 세포는 1시간 동안 배기혈청을 하였다. 혈청 기아 후, 세포는 산화 스트레스를 유도하기 위해 차량 단독으로 또는 10 μM Ku55933으로 처리되는 동안 현탁액에 보관되었다. 세포는 F-액틴 단백질을 검출하기 위해 FN 코팅 커버슬립에 고정, 고정, 고정, 및 초점 유착 및 남근에 대한 항체로 염색하였다. 눈에 띄는 초점 유착및 응력 섬유는 FN에 20-30 분 동안 부착되도록 허용 된 후 REF52 세포에서 쉽게 볼 수 있어야합니다. 명확하고 뚜렷한 셀 가장자리와 개별 셀이 퍼질 수 있는 공간을확인합니다(그림 3). 세포막의 앞가장자리에 있는 F-액틴 농축 주름이 보이고 화살표로표시됩니다(그림 3,하단 패널).
응력 섬유의 정량화 형광 이미지의 그래픽 표현과 세포 확산 정도
응력 섬유가 있는 세포의 백분율과 접착 후 다양한 시간에 Ku55933 처리 없이 퍼지는 세포의 정도를 나타내는 바 그래프 형태로 표시되는 정량화된 이미지의 예. 그림 3에나타난 이미지와 유사한 남근화 F-액틴 프로브 및 안티 팍실린 염색의 형광 이미지는 이미지 분석 절차를 사용하여 응력 섬유 및 세포 확산(즉, 원형 지수)의 백분율을 분석하였다. 프로토콜의 5단계에서 설명합니다. 특히, 산화제 처리는 모든 접착 시점에서 응력 섬유 형성의 현저한 증가를 야기하였다(도4A)FN에 대한 세포 접착 15분 후 세포 확산의 감소(도4B).
비정량화 가능한 면역 형광 이미지 로 인해 세포 이상 합류
혈청이 부족한 REF52 세포를 90분 동안 현탁액으로 유지하였고, 이 동안 ROS 형성을 유도하기 위해 10 μM Ku55933으로 처리하였다. 세포는 FN에 도금하고 20 분 동안 부착 할 수 있었고, 그 후 안티 팍실린 또는 팔로이드 알렉사 594 F-액틴 프로브로 고정및 염색되었습니다. 더 높은 세포 밀도에 도금은 세포 혼잡으로 이끌어 냅니다, 이는 과잉 confluency 때문에 세포가 완전히 퍼지는 것을 금지합니다. 공지 셀 가장자리는 인접한 셀(노란색 화살표)과 구별할 수없습니다(그림 5A). 그 결과, 개별 세포의 정량화는 배제되고, 퍼짐 둘레는 정확하게 결정될 수 없다. 도 5B에서, 별도의 세포주, 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 현탁액으로 유지한 다음 FN상에서 30분 동안 도금했다. 세포는 그 후 항파실린 항체로 고정및 염색하였다. 초점 외 셀은 빨간색 화살표로표시됩니다(그림 5B). 더욱이, 세포 파편(파란색 화살표)을 가진 항파실린 항체의 교차 반응성은 정량적 영상 분석 동안 임계값을 변화시킬 것이다(Part 5)분석(도 5B)에포함되지 않아야 한다.
그림 1: 프로토콜의 타임 라인 및 예제 24 웰 플레이트 설정.
(A)타임라인은 세포 접착 및 확산 절차의 주요 단계를 강조합니다. (B)대표적인 24 플레이트, 세포 부착에 대한 처리 군 및 시간을 예시하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 화상 처리 에 따른 대표적인 면역형광 이미지의 예.
REF52 세포를 90분 동안 현탁액으로 유지시키고, FN상에서 도금하고, 15분 동안 부착하도록 허용하였다. (A)원본 이미지와 이미지 다음(B)배경 빼기 (포스트 롤링 볼),(C)CLAHE,(D)가우시안 흐림 및(E)멕시코 모자 필터 (포스트 MHF) 필터링 단계. 바, 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: FN 상에서 도금된 REF52 세포를 염색한 항파실린 및 파할로이드 F-액틴 프로브의 대표적인 면역형광 이미지.
분석전에, REF52 세포는 1시간 동안 배기혈청을 하였다. 혈청 기아 후, 세포는 산성 스트레스를 유발하기 위해 차량 단독으로 또는 10 μM Ku55933으로 처리하면서 현탁액으로 유지되었다. 세포는 F-액틴 단백질을 검출하기 위해 FN 코팅 커버슬립에 고정및 초점 유착 및 남근에 대한 항체로 염색된 시간 동안 포면에 도금하였다. 세포막의 선두 가장자리에 있는 F-액틴 농축 주름은 화살표로 표시됩니다. 바, 40 μm. 이 그림은 Tolbert 등에서 수정되었습니다.5이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 면역 형광 이미지의 정량화.
그래프(A)응력 섬유를 나타내는 세포의 백분율 및(B)세포 순환도 측정을 예시한 그래프. 세포 순환성은 셀 둘레로 나눈 셀 영역으로 정의되었다. 값은 각각 길쭉하거나 둥근 형태를 나타내는 0-1.0범위입니다. 오류 막대는 S.E.M. 학생의 t-검정쌍을 이룬 샘플*p&0.01을 트리플리케이트에서 수행한 실험에서 나타냅니다. 이 그림은 Tolbert 등에서 수정되었습니다.5이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 비정량화 성 면역 형광 이미지.
(A)혈청이 부족한 REF52 세포를 10 μM Ku55933으로 처리하면서 90분 동안 현탁액을 유지하였다. 세포는 FN상에서 도금하고 20분 동안 부착하도록 허용하였다. 셀 가장자리는 노란색 화살표로 표시됩니다. (B)MEF 세포를 현탁액으로 유지한 다음 FN상에서 30분 동안 도금하였다. 초점 세포밖으로 는 적색 화살표로 표시되고 세포 파편을 가진 반대로 paxillin 항체의 교차 반응성은 청색 화살표로 표시됩니다. 바, 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 설명된 프로토콜은 세포 확산 동안 동적 세포골격 리모델링을 위한 다수의 앵커리지 의존성 세포 유형을 신속하게 스크리닝하는 다목적및 경제적인 방법입니다. 특히, 이 방법은 세포가 FN에 부착될 때 산화 스트레스 동안 응력 섬유 및 국소 접착 형성을 정량적으로 검사한다(도1A). 더욱이, 이들 세포 표현형은 세포 부착 및 확산15,16,22동안 역할을 문서화했기 때문에 작은 GTPases의 Rho 가족의 구성원에 대한 규제 역할을 제안할 수 있다. 그러나, 추가적인 생화학 기술은 GTP 결합, 활성 Rho 가족 단백질의 가능한 관여를 확인하기 위하여 요구될 것이다.
제시된 프로토콜은 F-액틴과 팍실린의 면역형광 검출을 활용하여 ATM 키나아제 억제에 의해 유도된 산화 스트레스 후 FN상에서 불멸의 섬유아세포 세포의 세포 부착 및 확산을 구체적으로 검사한다(도2, 그림 2) 도 3 및 도 4. 그러나, 이 절차는 또한 그밖 ECM 단백질 및/또는 그밖 부착세포 모형을 위해 사용을 위해 적응될 수 있습니다. 다른 세포주에 적응할 때, 특히 세포 수/밀도, 혈청 기아 시간, ECM 단백질 농도 및 산화 스트레스 치료 조건과 같은 실험 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. 유착 및 확산 역학에 대한 알려지지 않은 자극의 효과를 테스트할 때, 분석이 올바르게 작동하는지 확인하기 위해 음의 및 양성 대조군 샘플을 모두 포함해야 합니다. 음성 대조군 샘플은 처리되지 않은 또는 비히클 전용 샘플을 포함할 수 있으며, 양성 대조군은 산화 스트레스를 유도해야 한다(예를 들어,H2O2). 더욱이, 여기서 논의되지는 않았지만, 적절한 항체 조절을 활용하는 것도 필수적이다. 각 항체에 대해 3개의 개별적인 대조군을 사용하여 그 특이성을 확인하고 잠재적인 형광 출혈을 식별하기 위해23,24를사용하는 것이 좋습니다. 이들은: 1) 1 차적인 항체 대조군항원에 대한 1차 항체의 특이적 결합을 보장하고 사용된 고정 조건 하에서 항원 결합이 발생한다는 것을 확인하기 위해, 2) 이차 항체 제어(비이차 공액-항체용) ) 1차 항체에 특이성을 나타내고, 3) 불소 첨가를 보장하는 형광공 조절은 다른 항체로부터 내인성 형광 또는 출혈의 결과가 아니다.
이러한 분석은 접착 조립 및 확산의 초기 운동 적 사건을 분석하는 데 유용하지만, 접착 분해 또는 접착 강도 및 세포 보강의 상세한 검사에는 적합하지 않습니다. 후자는 장기 적인 화상 진찰 bio-stations 또는 단세포 힘 분광학 기술의 사용을 요구합니다. 후자의 기술은 원자력 현미경 검사법, 광학 핀셋, 빈쿨린25 또는 탈린26,27,및 3D-힘 현미경 검사법28과같은 접착 단백질의 장력 센서를 포함한다.
프로토콜의 중요한 단계에는 FN으로 철저하게 코팅 된 커버립이 포함됩니다. 이것은 세포의 균일 한 확산 및 접착에 필요합니다. 따라서 인큐베이션 전에 FN 용액을 커버슬립 위로 여러 번 파이펫하는 것이 중요합니다. 커버슬립은 인큐베이션 시간 동안 FN 용액에 완전히 잠긴 상태로 유지되어야 합니다. FN 코팅 커버슬립은 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있다.
너무 조밀하게 도금된 세포가 최대 확산 둘레를 달성하지 못하기 때문에 세포 밀도도 중요합니다. 또한, 각 개별 세포에 대한 개별 초점 유착 또는 세포 주름을 구별하는 것은 불가능합니다. 따라서 세포를 현탁액에 배치하기 전에 혈세포계 또는 자동화 된 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산해야합니다. REF52 세포에 대한 세포 밀도의 추정치가 제공되지만, 이것은 연구 중인 다른 세포에 대해 경험적으로 결정되어야 할 것이다. 세포는 몇몇 세포가 완전히 퍼지도록 허용하는 몇몇 세포가 겹치는 충분히 희소하게 도금되어야 합니다(그림 5).
고려해야 할 프로토콜의 다른 중요한 단계는 형광적으로 공액화된 팔로이드-알렉사 594 F-액틴 프로브 및 이차 항체가 빛에 민감하다. 따라서 시료는 이러한 시약을 적용한 후 빛에 최소한으로 노출되어야 합니다. 또한, 산화 스트레스를 유도 하는 에이전트의 수는 짧은 반감기. 그것은, 따라서, 최적의 복용량 및 노출 시간에 대 한 선택된 산화 를 테스트 하는 데 필요한 피크 활동을 달성 하기 위해.
다음 섹션에는 FN 농도, 혈청 기아 조건 및 세포 분리 방법론과 관련하여 문제 해결 팁이 포함되어 있습니다. 이러한 팁은 다른 세포 라인 및/또는 치료 조건에 대한 프로토콜을 조정할 때 유용합니다.
일관된 FA 분석을 위해서는 ECM 리간드에 따라 달라질 수 있는 최적의 부착 및 확산 조건이 필요합니다. FN의 경우 10-30 μg/mL의 동적 범위를 사용하기 시작합니다. FN의 높은 농도에서, 세포 부착에 약간의 차이가 있다. 그러나, 몇몇 세포 모형은 ECM의 고농도에서 능등하게 퍼지지 않습니다.
각 세포 모형은 혈청 기아의 조건에 다르게 반응합니다. REF52 세포는 생존력의 손실없이 하룻밤 동안 쉽게 굶어 수 있지만, 이것은 모든 세포주에 대해 사실이 아닙니다. 따라서 연구 중인 세포주가 혈청 기아를 견딜 수있는 정도를 결정할 필요가 있습니다.
분석 분석 퍼짐을 위해, 세포는 재현 가능한 결과를 위해 가능한 한 적은 시간 동안 trypsinized 될 필요가29. 트립시네화에 의한 세포 분리, 세포 표면 수용체, 그들의 동족 리간드, 및 Rho GTPase 활성에 따라 정상 상태수준14,15로복귀하기 위해 회복 기간이 필요하다. 이 프로토콜에 설명된 트립시니화 절차는 세포가 그들의 세포 표면 FN 결합수용체(29)의대부분을 유지하는 가능하게 한다. 그러나, 특정 세포 모형은 세포 표면 수용체의 소화를 완전히 방지하기 위하여 세포 분리의 대체 방법을 요구할 수 있습니다. 이러한 방법은 EDTA 기반 용액 (예를 들어, Versene) 또는 온화한 효소 해리 솔루션 (예를 들어, Accutase)을 사용하여 세포를 킬레이트화하는 것을 포함한다. 이러한 해리 용액의 사용은 세포 덩어리의 결과로 세포 세포 유착을 그대로 남길 수 있습니다. 따라서 실험 재현성을 보장하기 위해 개별 세포를 완전히 다시 중단하는 것이 중요합니다.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자들은 스콧 R. 허튼 박사와 메건 S. 블랙레지 박사가 원고에 대한 비판적 검토에 감사를 표한다. 이 작품은 하이 포인트 대학의 연구 및 후원 프로그램에 의해 투자되었다 (MCS) 노스 캐롤라이나 주립 대학에서 생명 공학 프로그램 (MCS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life Technologies | 25300-054 | cell dissociation |
| 10 cm2 dishes | Cell Treat | 229620 | sterile, tissue culture treated |
| 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Corning Cellgro | 21-031-CV | PBS, sterile, free of Mg2+ and Ca2+ |
| 24-well cell culture treated plates | Fisher Scientific | 07-200-740 | sterile, tissue culture treated |
| 4°C refrigerator | Fisher Scientific | ||
| Mouse IgG anti-paxillin primary antibody (clone 165) | BD Transduction Laboratories | 610620 | marker of focal adhesions |
| Aspirator | Argos | EV310 | |
| Biosafety cabinet | Nuair | NU-477-400 | Class II, Type A, series 5 |
| Delipidated Bovine Serum Albumin (Fatty Acid Free) Powder | Fisher Scientific | BP9704-100 | dlBSA |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | organic solvent to dissolve Ku55933 |
| Dulbecco's Modified Eagle Media, High Glucose | Fisher Scientific | 11965092 | REF52 base cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | 16000044 | certified, cell culture medium supplement |
| Fiji | National Institutes of Health | http://fiji.sc/ | image analysis program |
| Filter syringe | Fisher Scientific | 6900-2502 | 0.2 µM, sterile |
| Glass coverslips (12-Cir-1.5) | Fisher Scientific | 12-545-81 | autoclave in foil to sterilize |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | fluorescent secondary antibody, light sensitive |
| Goat Serum | Gibco by Life Technologies | 16210-064 | component of blocking solution for immunofluorescence |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 22-600-107 | for cell counting |
| Human Plasma Fibronectin | Gibco by Life Technologies | 33016-015 | FN |
| IX73 Fluorescence Inverted Microscope | Olympus | microscope to visualize fluorescence, cell morphology, counting and dissociation | |
| Ku55933 | Sigma-Aldrich | SML1109-25MG | ATM kinase inhibitor, inducer of reactive oxygen species |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | cell culture medium supplement |
| Monochrome CMOS 16 bit camera | Optimos | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | PFA, fixative for immunofluorescence |
| Penicillin-streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | P/S, antibiotic solution for culture medium |
| Alexa Fluor 594 phalloidin (F-actin probe) | Invitrogen | A12381 | marker of F-actin, light sensitive |
| ProLong Gold Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36941 | cover slip mounting media including nuclear dye DAPI, light sensitive |
| REF52 cells | Graham, D.M. et. al. Journal of Cell Biology 2018 | ||
| Stir plate with heat control | Corning Incorporated | PC-420D | |
| Syringe | BD Biosciences | 309653 | 60 mL syringe |
| Tissue culture incubator | Nuair | ||
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergent used to permeabilize cell membranes |
| Trypan Blue Solution | Fisher Scientific | 15-250-061 | for cell counting |
| Trypsin Neutralizing Solution (1x) | Gibco by Life Technologies | R-002-100 | TNS, neutralizes trypsin instead of fetal bovine serum |
| tube rotator | Fisher Scientific | 11-676-341 | |
| water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 |
References
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