Her præsenterer vi let at bruge protokoller til fremstilling og rensning af isomere metabolitter gennem kombinatorisk ekspression af biosyntetiske enzymer i Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, efterfulgt af kromatografisk produkt Rensning. De resulterende metabolitter er egnede til forskellige undersøgelser, herunder molekylær struktur karakterisering, enzym funktionelle undersøgelser, og Bioaktivitet assays.
Diterpenoider danner en mangfoldig klasse af små molekyle naturlige produkter, der er bredt fordelt på tværs af livets riger og har kritiske biologiske funktioner i udviklingsmæssige processer, interorganismal interaktioner, og miljøtilpasning. På grund af disse forskellige bioaktiviteter er mange diterpenoider også af økonomisk betydning som lægemidler, fødevaretilsætningsstoffer, biobrændstoffer og andre bioprodukter. Avancerede genomforskning og biokemiske tilgange har muliggjort en hurtig stigning i kendskabet til diterpenoid-metaboliske gener, enzymer, og veje. Men den strukturelle kompleksitet af diterpenoider og den snævre taksonomiske fordeling af individuelle forbindelser i ofte kun en enkelt art er fortsat begrænsende faktorer for deres effektive produktion. Tilgængeligheden af en bredere vifte af metaboliske enzymer giver nu ressourcer til at producere diterpenoider i tilstrækkelige titre og renhed for at lette en dybere undersøgelse af denne vigtige metabolit gruppe. Ved at trække på etablerede værktøjer til mikrobielt og plantebaseret enzym-Co-ekspression præsenterer vi en let betjent og tilpasselig protokol til enzymatisk produktion af diterpenoider i enten Escherichia coli eller Nicotiana benthamiana, og rensning af ønskede produkter via silica-kromatografi og semi-præparativ HPLC. Ved hjælp af gruppen af majs (Zea mays) dolabralexin diterpenoider som et eksempel, vi fremhæver, hvordan modulære kombinationer af diterpenforbindelser syntase (ditps) og cytochrom P450 oxygenase (P450) enzymer kan bruges til at generere forskellige isomere stilladser. Rensede forbindelser kan anvendes i forskellige downstream-applikationer, såsom metabolit strukturelle analyser, enzym struktur-funktion undersøgelser, og in vitro og i planta Bioaktivitet eksperimenter.
Diterpenoider omfatter en kemisk forskelligartet gruppe på mere end 12.000 overvejende polycykliske 20-kulstof naturprodukter, der spiller en kritisk rolle i mange organismer1. Svampe og planter producerer den største mangfoldighed af diterpenoider, men bakterier har også vist sig at danne bioaktive diterpenoider (Se anmeldelser2,3,4,5). Diterpenoider har rødder i deres enorme strukturelle mangfoldighed og tjener et væld af biologiske funktioner. Et par diterpenoider, såsom Gibberellin væksthormoner, har væsentlige funktioner i udviklingsmæssige processer5. Men de fleste diterpenoider tjener som mæglere i kemisk forsvar og interorganismal interaktioner. Blandt disse er diterpenharpiks syrer i skadedyrs-og patogen forsvaret af nåletræer og artsspecifikke blandinger af antimikrobielle diterpenoider i større fødevareafgrøder såsom majs (Zea mays) og ris (Oryza sativa) i vid udstrækning blevet har studeret6,7. Disse bioaktiviteter giver en rig kemisk repository til kommercielle applikationer, og vælg diterpenoider anvendes som vigtige lægemidler, tilsætningsstoffer, klæbemidler, og andre bioprodukter i hverdagen moderne liv8,9 ,10. For at fremme forskningen i diterpenoider ‘ naturlige mangfoldighed og biologiske funktioner og i sidste ende promovere bredere kommercielle anvendelser er det nødvendigt med værktøjer til omkostningseffektiv tilberedning af rene forbindelser. Storstilet isolation fra plantemateriale er blevet etableret for nogle få isomere bioprodukter, såsom diterpenforbindelser harpikssyrer, der produceres som et biprodukt af papirmasse-og papirindustrien8. Akkumulering af diterpenoider i kun specifikke væv og under stram regulering af miljømæssige stimuli begrænser imidlertid ofte isolering af tilstrækkelige produktmængder fra den naturlige producent2. Desuden hæmmer den strukturelle kompleksitet af diterpenoider deres produktion gennem kemisk syntese, selv om sådanne tilgange har været vellykkede i flere tilfælde11,12. Med tilgængeligheden af avancerede genomiske og biokemiske teknologier har enzymatiske produktionsplatforme fået stigende opmærksomhed for at producere en række isomere forbindelser (Se anmeldelser13,14, 15,16,17,18).
Alle terpenoider, herunder diterpenoider, er afledt af to isomeriske isoprenoide prækursorer, isopentenyldiphosphat (IPP) og dimethylallyldiphosphat (DMAPP)19 , der til gengæld dannes gennem mevalonat (MVA) eller methylerythritol-5-fosfat (MEP) pathway. Terpenoid biosyntese fortsætter gennem MEP-stien i bakterier og MVA-vejen i svampe, hvorimod planterne besidder en cytosolisk MVA og en plastidial MEP-pathway, hvor sidstnævnte er den primære vej mod isomere dannelse20. Kondensation af IPP og DMAPP ved prenyl transferaser giver den centrale 20-Carbon forløber til alle diterpenoider, geranylgeranyl diphosphat (GGPP)20. Downstream af ggpp formation, to enzym familier, terpen synthaser (tpss) og cytochrom P450 monooxygenaser (P450s) stort set kontrollere dannelsen af den store kemiske mangfoldighed af terpenoid metabolisme21,22. Diterpenforbindelser synthases (ditpss) katalyserer den engagerede kulhydrat-drevne cyklisering og omorganisering af ggpp til dannelse af forskellige stereo specifikke bi-, poly-eller makrocykliske diterpenstilladser1,3,23, 24. Iltning og yderligere funktionel dekoration af disse stilladser er derefter lettet af P450 enzymer og vælge andre enzym familier22,25. TPSs og P450s findes almindeligvis som artsspecifikke, multi-gene familier, der kan danne modulære biosyntetiske netværk, hvor kombinationen af forskellige enzym moduler langs en fælles plan muliggør dannelsen af en bred vifte af forbindelser2, 26. den hurtige opdagelse af funktionelt adskilte enzymer, der opererer i modulære terpenoide veje i de seneste år, har givet udvidede muligheder for deres anvendelse som en alsidig Reservedelsliste til metabolisk manipulation af delvise eller komplette veje i både mikrobielle og plantebaserede produktionsplatforme. For eksempel, gær (Saccharomyces cerevisiae) er blevet anvendt med succes til at ingeniør multi-enzym veje til fremstilling af terpenoid bioprodukter, såsom malaria medicin artemisinin27, sesquiterpenoid biobrændstoffer bisabolene og farnesen28, men også vælge diterpenoider29,30,31. Ligeledes er der konstrueret Escherichia coli -platforme til industriel fremstilling for nogle få isomere-metabolitter, herunder taxolprækursor taxadien, der anvendes som et anti-cancer-lægemiddel, og diterpen-alkoholen, sclareol , der anvendes i duft industrien13,32,33,34. Fremskridt inden for genteknologi og Transformations teknologier har også gjort plante værtssystemer stadig mere levedygtige til produktion af plante naturprodukter9,14,35,36. Især den tætte tobak relative, Nicotiana benthamiana, er blevet et meget anvendt chassis til terpenoid pathway analyse og ingeniørarbejde, på grund af den lethed af Agrobacterium-medieret omdannelse af flere gene kombinationer , effektiv biosyntese af endogene prækursorer og høj biomasse14,35,36.
Tegning på disse etablerede platforme for terpenoid biosyntese, vi beskriver her let at bruge og omkostningseffektive metoder til enzymatisk produktion af diterpenoider og oprensning af enkelte forbindelser. De præsenterede protokoller illustrerer, hvordan E. coli og N. benthamiana platforme udviklet til forbedret isomere forløber biosyntese kan udnyttes til kombinatorisk ekspression af forskellige ditpss og P450 enzymer til at generere ønskede isomere-forbindelser. Anvendelsen af denne protokol til at fremstille og rense strukturelt forskellige diterpenoider er vist ved eksempel på specialiserede diterpenoider fra majs (Zea mays), kaldet dolabralexiner, endogene biosyntese, hvoraf rekrutter to ditps og en P450 Enzym. Rensning af forskellige dolabralexiner, der spænder fra olefiner til oxygenholdige derivater, opnås derefter ved at kombinere separatoriske tragt ekstraktion med stor skala silica-kolonne kromatografi og præparativ højtryksvæskekromatografi (HPLC). De beskrevne protokoller er optimeret til produktion af diterpenoider, men kan også let tilpasses til relaterede terpenoid klasser, samt andre naturlige produkter, for hvilke enzym ressourcer er til rådighed. Forbindelser fremstillet ved hjælp af denne metode er velegnede til forskellige downstream-anvendelser, herunder, men ikke begrænset til, strukturel karakterisering via nuklear magnetisk resonans (NMR) analyse, anvendelse som substrater for enzym funktionelle undersøgelser og en række Bioaktivitet assays.
Bredere undersøgelse og anvendelse af isomere naturlige produkter nødvendiggør enkle, billige protokoller til at syntetisere og rense tilstrækkelige mængder af ønskede forbindelser. Den hurtige stigning i antallet af tilgængelige diterpenoid-metaboliske enzymer fra en bred vifte af arter giver nu en ekspansiv opgørelse for den enzymatiske produktion af diterpenoider ved hjælp af mikrobielle og plantebaserede værtssystemer. Derudover gør den modulære arkitektur af mange diterpenoide veje det muligt at bruge enzymer fra samme eller forskellige arter i ‘ plug & play ‘ kombinatoriske ingeniør tilgange til at generere en række naturlige og nye naturlignende isomere natur produkter2,14,26,35.
E. coli er en foretrukken mikrobiel vært for naturligt produkt biosyntese på grund af sin robusthed, lethed af skalerbarhed, begrænset kemisk kompleksitet for reduceret biprodukt forurening, og den rigdom af tilgængelige værktøjer til DNA-samling og udtryk Optimering. Det er vores erfaring, at platformen beskrevet her er velegnet til fremstilling af produkt udbytter på op til flere hundrede mg diterpenforbindelser olefiner og alkoholer, som er egnet til mange downstream-anvendelser, herunder dem, der foreslås her. Selv om det ikke opfylder industriel skala, kan den produktionsplatform, der er beskrevet her, fungere som et fundament for yderligere pathway, Host og fermenterings optimering, som det med succes er påvist for beslægtede diterpenoider som taxadien og sclareol33 ,34. Over-ekspression af rate-begrænsende MVA eller MEP pathway gener er blevet etableret med succes for at overvinde udbytte-begrænsende faktorer for isomere biosyntese, såsom utilstrækkelig forløber levering og forløber flux i konkurrerende veje13, 32,33,39. Selvom bevist succes i flere undersøgelser, dårlig ekspression og katalytisk aktivitet af terpenoid-metaboliske eukaryote P450s og andre membran-bundne enzymer i E. coli er en sandsynlig begrænsende faktor33,39 ,48,49,50,51,52. Brug af codon-optimerede sekvenser og protein modifikationer, såsom fjernelse af endoplasmatiske reticulum signal peptid eller indførelse af et plastidial signal peptid, har vist sig nyttigt at øge opløseligt P450-udtryk14,38 ,49,50,53. Sådanne ændringer var også anvendt til det mikrobielle Co-ekspression af majs CYP71Z1839 , der anvendes som et eksempel på en vej i denne undersøgelse. De beskrevne protokoller er baseret på anvendelse af plasmider, der transporterer et eller to gener pr. konstruktion, alt sammen under den samme inducerbare promotor. Hvor der ønskes større gene kombinationer, er det tilrådeligt at bruge forskellige tilgængelige multi-gen-kassetter eller genstablings systemer for at afbøde reduceret Transformations effektivitet og vækst i kulturen på grund af brugen af flere plasmider og antibiotika13 .
Med den bredere tilgængelighed af genetik og genomforskning ressourcer, anlæg værtssystemer også bliver stadig mere egnet til fremstilling af naturlige produkter. Fordele omfatter evnen af planter til at producere de nødvendige naturlige prækursorer drives af fotosyntese, dermed muliggør produkt dannelse uden behov for at supplere prækursorer molekyler54,55. N. benthamiana anvendes allerede i vid udstrækning til in vivo funktionel karakterisering og kombinatorisk ekspression af terpenoid og andre naturlige produkt veje14,35,36,40 . Bemærkelsesværdige fordele ved at bruge N. benthamiana som værtssystem omfatter den endogene produktion af diterpenoide prækursorer, brug af indfødte gensekvenser, forenklet ekspression af eukaryote P450s, let kombinatorisk gen-transformation (som separate antibiotika er ikke påkrævet for forbigående Co-transformation), og enkel ekstraktion af målprodukter fra blad materiale. Hvor det er nødvendigt, kan isomere produktion forbedres gennem Co-ekspression af centrale MEP-pathway gener for at øge prækursorer36,41. Begrænsninger for skalerbar isomere produktion i N. benthamiana er mere komplekse sammenlignet med flydende mikrobielle kulturer på grund af behovet for at generere tilstrækkelig plantebiomasse, mere arbejdskraftintensiv produkt rensning fra kemisk komplekse plante væv, og mulig uønsket metabolisering af målprodukter gennem, for eksempel, oxidation, glykosylering eller defosforylering af endogene enzymer36,43,44,45 ,46,47. Men, denne procedure kan skaleres op til mg produktmængder ved at øge antallet af planter, der anvendes til agroinfiltration56.
De produkt ekstraktions-og rensnings protokoller, der er beskrevet her, er kompatible med E. coli og N. benthamianasamt S. cerevisiae og andre plante-eller mikrobielle værtssystemer og giver en omkostningseffektiv tilgang, der er let at oprettet i både biologi og kemilaboratorier og kræver ikke dyre rensningsanlæg. Metabolitten ekstraktion ved hjælp af en skilletragt er velegnet til effektiv ekstraktion og faseadskillelse før kromatografisk rensning. Tragt størrelser kan let justeres for at give mulighed for større kultur mængder og reducere eksperimentel tid, der kræves for at udtrække fra store kulturer. Vi fandt brugen af en hexan/ethylacetat gradient til at være ideel til udvinding diterpenoider af forskellig polaritet som påvist her for gruppen af dolabralexiner, der omfatter både kulbrinte og oxygenerede forbindelser (figur 3). Afhængigt af egenskaberne for målprodukterne kan andre opløsnings blandinger være fordelagtige. Opløsningsmidler må dog ikke være blandbare med vand for at sikre en vellykket ekstraktion og faseadskillelse ved hjælp af den separatoriske tragt teknik. Desuden skal der tages hensyn til produkttab ved fordampning ved anvendelse af denne metode til fremstilling af flygtige organiske forbindelser (VOC), såsom lavmolekylære mono-og sesqui-terpenoider og andre VOC. Kromatografisk adskillelse af diterpenoider af forskellige niveauer af iltning ved hjælp af en større skala (~ 2 L) silica kolonne har været fordelagtigt i vores erfaring, da det giver forbedret produkt adskillelse og minimerer behovet for iterativ rensning trin, når du bruger mindre kolonne volumener. Kolonne volumener og matricer kan justeres efter behov for den ønskede kultur mængde og typen af naturprodukt. Renheden af målprodukter, der kan opnås ved hjælp af denne protokol, er velegnet til mange downstream-anvendelser, såsom bioaktivitets analyser eller til brug i enzym aktivitetsanalyse. Hvis der er behov for højere renhedsgrad, såsom strukturelle analyser via NMR, kan produktets renhed dog forbedres effektivt ved yderligere rensning ved hjælp af (semi) præparativ HPLC.
Denne protokol, der er beskrevet her, er blevet optimeret til produktion af isomere naturlige produkter, men kan også let tilpasses til beslægtede mono-, sesqui-og Tri-terpenoider, samt andre naturlige produktklasser blot ved at generere det ønskede enzym moduler til kombinatorisk udtryk14,57. Der skal dog tages hensyn til ændringer af procedurerne for produkt udvinding og-rensning for forbindelser med større volatilitet, såsom mono-og sesqui-terpenoider, eller højere polaritet og funktionel modifikation som eksemplificeret ved glykosylering af mange triterpenoider, phenylpropanoider og andre naturlige produktklasser.
Selv om industrielle platforme til fremstilling af naturlige produkter er tilgængelige, de protokoller, der er beskrevet her, tilbyder et billigt, tilpasselig værktøj, som let kan oprettes i de fleste laboratorier. Som det fremgår af produktionen af majs dolabralexiner her og andetsteds39, er de produktmængder og den renhed, der kan opnås ved hjælp af denne metode, typisk tilstrækkelige til at lette forskellige downstream-analyser og-anvendelser, herunder, men ikke begrænset til, forskellige bioaktivitets undersøgelser, analyse af interaktioner mellem organismer, samt til anvendelse som enzym substrater eller som udgangsmateriale til semi-syntese tilgange.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender taknemmeligt Dr. Reuben Peters (Iowa State University, USA) for at levere de pIRS og pGGxZmAN2 konstruktioner. Finansiel støtte til dette arbejde af NSF Plant-Biotic interaktioner program (Grant # 1758976 til P.Z.), DOE Early karriere Research program (Grant # DE-SC0019178 til P.Z.), DOE joint Genome Institute community Science program (Grant # CSP2568 til P.Z.), NSF Graduate Research Fellowship Program (til K.M.M.), og en UC Davis Deans mentorordning Award Fellowship (til K.M.M.) er taknemmeligt anerkendt.
1020 Trays | Greenhouse Megastore | CN-FLHD | |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Sigma | M8250-500g | MES |
4" Tech Square Pot | McConkey Wholesale Grower's Supply | JMCTS4 | |
5977 Extractor XL MS | Agilent | – | |
7890B GC | Agilent | – | |
Acetonitrile | Sigma | 271004 | |
Agar | Fisher | BP1423-2 | |
Bacterial yeast extract | Fisher | BP9727-2 | |
Beaker | CTechGlass | BK-2001-015B | |
Cap, 9 mm blue screw, PFTE | Agilent | 5185-5820 | GC vial cap |
Carbenicillin | Genesee | 25-532 | Carb |
Chloramphenicol | Fisher | 50247423 | Chlor |
Chromatography column | CTechGlass | CL-0015-022 | |
Clear humidity dome | Greenhouse Megastore | CN-DOME | |
ColiRollers Plating Beads | Sigma | 71013 | Glass beads |
CoorsTek Porcelain Mortars | Fisher | 12-961A | mortar |
CoorsTek Porcelain Pestles | Fisher | 12-961-5A | pestle |
Delta-Aminolevulinic acid hydrochloride | Sigma | 50981039 | Aminoleuvolinic acid |
Ethanol | Fisher | A962-4 | EtOH |
Ethyl acetate | Fisher | E1454 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | Falcon tubes |
Fisherbrand Disposable Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | cuvette |
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher | FB0875713 | petri dish |
Fisherbrand Polypropylene Microtube Storage Racks | Fisher | 05-541 | microtube rack |
Glucose | Sigma | G7021 | |
Glycerol | Fisher | G33-500 | |
Hexanes | Fisher | H292-4 (CS) | |
HP-5MS | Agilent | 19091S-433 | GC column |
Inlet adapter | CTechGlass | AD-0006-003 | glass inlet adapter |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher | BP1755-100 | IPTG |
Kanamycin | Fisher | BP9065 | Kan |
KIM-KAP Caps, Disposable, Polypropylene, Kimble Chase | VWR | 60825-798 | breathable test tube lids |
Magnesium chloride | Acros | 223210010 | MgCl2 |
Magnesium sulfate | Sigma | M7506-500g | MgSO4 |
Miracle-Gro Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2756810 | |
Mixer Mill MM 200 | Retsch | 20.746.0001 | tissue mill |
Nalgene Fernbach culture flask | Sigma | Z360236 | 2.8 L flask |
New Brunswick I26 | Eppendorf | M1324-0000 | Shaking incubator |
Nicotiana benthamiana seed | USDA Germplasm Repository | Accession TW16 | N. benthamiana |
OverExpress C41(DE3) Chemically Competent Cells | Lucigen | 60442 | C41-DE3 cells |
Parafilm M wrapping film | Fisher | S37440 | Parafilm |
Potassium chloride | Sigma | P-9541 | KCl |
Potassium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | P288-3 | Dipotassium phosphate |
Potassium phosphate monobasic | Monopotassium phosphate | ||
Pyrex disposable culture tubes, rimless | Sigma | CLS9944516 | test tubes |
Pyruvate Acid Sodium Salt | Fisher | 501368477 | Sodium pyruvate |
Retort Ring Stands | CTechGlass | ST00 | ring stand |
Riboflavin | Amresco | 0744-250g | |
Rifampicin | Sigma | R7382 | Rif |
Rotovap | |||
Sand, 50-70 mesh particle size | Sigma | 274739-1KG | |
Silica | Fisher | AC241660010 | silica gel |
Sodium chloride | Fisher | 5271-3 | NaCl |
Sodum hydroxide | Fisher | SS266-1 | NaOH |
Spectinomycin | Fisher | 501368607 | Spec |
Squibb Separatory Funnel | CTechGlass | FN-1060-006 | Separatory funnel |
Sunshine Mix #1 | Sungro Horticulture | Potting soil | |
Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Fisher | 21-402-902 | microtube |
Triangle funnel | CTechGlass | FN-0035 | funnel |
Tryptone | Fisher | BP14212 | |
Vial, screw, 2 mL, amber, WrtOn | Agilent | 5182-0716 | GC vial |
visible spectrophotometer, V-1200 | VWR | 634-6000P | spectrophotometer |
ZORBAX Eclipse XDB-C18 | Agilent | 990967-202 | HPLC column |
ZORBAX Eclipse XDB-CN | Agilent | 990967-905 | HPLC column |